METODOLOGÍA GENERAL PARA EL ESTUDIO DE

MICROORGANISMOS MICROORGANISMOS

MEDIOS DE CULTIVO

DEFINICIÓN

Es una preparación artificial, sólida, semisólida o líquida que suministra los requerimientos nutricionales y energéticos a los suministra los requerimientos nutricionales y energéticos a los microorganismos para su crecimiento y multiplicación, y se debe aproximar lo más posible a su habitat natural o nicho ecológico.

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Y ENERGÉTICOS DE LOS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Y ENERGÉTICOS DE LOS

MICROORGANISMOSMICROORGANISMOS

FUENTE ENERGÍA: ATP y poder reductor (NADH, NADPH)

Fototrofos: luz

Quimiotrofos: reacciones de oxido-reducción de compuestos orgánicos e inorgánicos

FUENTE DE CARBONO : moléculas con destino a estructuras, multiplicación, etc

Autotrofos: CO2

Heterotrofos: moléculas orgánicas (azúcares, ác. grasos, aminoácidos, etc)

ELECTRONES: para reducir la fuente de carbono

Litotrofos: compuestos inorgánicos reducidos

Organotrofos: compuestos orgánicos reducidos

Microorganismos Fuente de Fuente de Ejemplos de

energía carbono microorganismos

________________________________________________________________________

Fotolitotrofos o luz CO2 Algas, bacterias

Fotoautotrofos verdes y azules

cianobacterias

Fotoorganotrofos o luz comp orgánicos Bacterias verdes y

Fotoheterotrofos simples rojas

Quimiolitotrofos o redox CO2 Bacterias y Archeae

Quimioautotrofos

Quimioorganotrofos redox comp orgánicos Hongos, Bacterias

o quimioheterottrofos protozoos, Archeae

complejos

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1.- ELEMENTOS ENERGÉTICOS Y CONSTITUTIVOS

1.1.- MACRONUTRIENTES (carbono, nitrógeno, P, S, Ca, Mg, K, Na)

1.2.- MICRONUTRIENTES

-Frecuentemente esenciales: Mn, Fe, Co y Cu-Frecuentemente esenciales: Mn, Fe, Co y Cu

-Esenciales en casos especiales: B, Al, Si, V, Ni, Se

- Inhibidores de crecimiento: As, Au, Pb, Cr, Ag

1.3.- FACTORES DE CRECIMIENTO

2.- AGENTES SOLIDIFICANTES: agar, silicagel, agarosa, gelatina, albúmina de

huevo, suero

3.- AGUA DESTILADA

4.- CONDICIONES FÍSICAS: temperatura, oxígeno, pH, presión osmótica,

humedad, luz

Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 10ª ed.

Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 10ª ed.

FACTORES DE CRECIMIENTOFACTORES DE CRECIMIENTO

�� Compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas Compuestos orgánicos específicos requeridos en muy bajas concentracionesconcentraciones

�� La célula no los puede sintetizarLa célula no los puede sintetizar�� La causa del problema: mutaciones afectan las vías de síntesis del La causa del problema: mutaciones afectan las vías de síntesis del

compuesto.compuesto.INDISPENSABLES: deben ser adicionados al medio de cultivoINDISPENSABLES: deben ser adicionados al medio de cultivoINDISPENSABLES: deben ser adicionados al medio de cultivoINDISPENSABLES: deben ser adicionados al medio de cultivo

Ej. * vitaminas del grupo BEj. * vitaminas del grupo B* algunos aminoácidos* algunos aminoácidos* purinas y pirimidinas* purinas y pirimidinas

Gen1 Gen2 Gen1 Gen2

S1 S2 S3 S1 S2 S3

MEDIOS DE CULTIVO: CLASIFICACIÓN

A. BACTERIAS

1.- SEGÚN SU CONSISTENCIAa.- Líquidos: ej. caldo nutritivo, caldo tioglicolat o, agua peptonada

b.- Sólidos

agar ej. agar nutritivo

sílicagel coloniaalbumosos:

huevo ej. Lowestein Jensen

suero

c.- Semisólidos ej. agar blando

agar SIM

Hugh y Leifson

COLONIA: población de bacterias que provienen de una única célula madre, todas con el mismo genotipo y fenotipo. Cada colonia tiene morfología específica.

colonia

2.- Según su composición

a.- Medios comunes

b.- Medios enriquecidos

3.- Según su origen

a.- Medios s intéticos ( o definidos)

b.- Medios c omplejos (o naturales)

4.- Según su función

► Medios de conservación y transporte

► Medios de enriquecimiento

► Medios selectivos

► Medios diferenciales

EJEMPLOS DE MEDIOS DE CULTIVO PARA MICROORGANISMOS CON REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES SIMPLES Y COMPLEJOS

Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ª ed. 2009

MEDIOS DE CULTIVO

B.- Para RICKETSIAS Y CLAMIDIAS

a.- Cultivo celular (células animales)

b.- Cultivo en embrión de pollo

C.- PARA VIRUS

a.- Cultivo celularb.- Cultivo en embrión de polloc.- Cultivo en bacterias (bacteriófagos)

D.- MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOSE.- MEDIOS DE CULTIVO PARA PROTOZOOSF.- MEDIOS DE CULTIVO PARA ALGAS

MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOS:

-Agar Sabouraud glucosa

- Agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura (OGY)

- Agar Czapek Dox

- Agar-patata-glucosa

Agar OGY

Agar Sabouraud Glucosa

QUÉ ES UNA BACTERIA ANAEROBIAQUÉ ES UNA BACTERIA ANAEROBIA??

Es una bacteria que carece de sistema respiratorio aerobio, no puede utilizar Es una bacteria que carece de sistema respiratorio aerobio, no puede utilizar oxígeno como aceptor final de electrones.oxígeno como aceptor final de electrones.

Zona óxica

Zona anóxica

Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ª ed. 2009

POR QUÉ EL OPOR QUÉ EL O22 ES LETAL PARA LOS ANAEROBIOS ?ES LETAL PARA LOS ANAEROBIOS ?

ReducciónReducción deldel oxígenooxígeno hastahasta aguaagua mediantemediante lala incorporaciónincorporaciónsecuencialsecuencial dede electroneselectrones

Todos los compuestos intermediarios que se forman son altamente reactivos y tóxicos para la célula.

ENZIMAS QUE DESTRUYEN FORMAS TÓXICAS DERIVADAS DEL ENZIMAS QUE DESTRUYEN FORMAS TÓXICAS DERIVADAS DEL OXÍGENO: sólo presentes en microorganismos aerobiosOXÍGENO: sólo presentes en microorganismos aerobios

LOS MICROORGANISMOS ANAEROBIOS CARECEN DE ESTAS ENZIMAS.

MEDIOS DE CULTIVO PARA BACTERIAS ANAEROBIASMEDIOS DE CULTIVO PARA BACTERIAS ANAEROBIAS

No selectivos

Sólidos: Agar sangre (AS)

Agar infusión cerebro corazón (BHI)

Agar tripticase soja (TSA)Agar tripticase soja (TSA)

Líquidos: Caldo Tioglicolato

Carne picada (para aislar Clostridium,

conservar cultivos)

Recomendación: trabajar con medios de cultivo frescos, recién preparados.

Selectivos

► agar sulfito-polimixina-sulfadiacina (SPS)

► agar sangre paramomicina-vancomicina

desarrollan anaerobios obligados Gram –

inhibe Gram + (vancomicina) - Inhibe facultativos Gr am –

► agar sangre vancomicina-canamicina

desarrollan anaerobios obligados Gram –

inhibe Gram + (vancomicina) – Inhibe facultativos Gr am –

► agar yema de huevo neomicina

ayuda al aislamiento de especies de Clostridium por las reacciones : lipasa y

lecitinasa – inhibe algunas bacterias facultativas G ram -

SI NO DISPONE DE UN MEDIO DE CULTIVO PRAS, QUE SI NO DISPONE DE UN MEDIO DE CULTIVO PRAS, QUE PRECAUCIÓN DEBE TENER EN CUENTA ANTES DE SEMBRAR PRECAUCIÓN DEBE TENER EN CUENTA ANTES DE SEMBRAR

UN ANAEROBIO?UN ANAEROBIO?

Hervir a Baño María durante 15 minutos antes de sembrar para eliminar el oxígeno disuelto en el medio de cultivo y enfriar rápidamente bajo canilla para evitar que se reoxigene. Sembrar rápidamente bajo canilla para evitar que se reoxigene. Sembrar inmediatamente.

TÉCNICAS PARA GENERAR ANAEROBIOSIS (o condiciones TÉCNICAS PARA GENERAR ANAEROBIOSIS (o condiciones anóxicas)anóxicas)

●● Jarra anóxica con generador de Gas PakJarra anóxica con generador de Gas Pak●● Evacuación y reemplazo (ER)Evacuación y reemplazo (ER)●● Sistema de Bio Bag (sobre generador de COSistema de Bio Bag (sobre generador de CO 22))●● Medios preMedios pre--reducidos anaeróbicamente esterilizados (PRAS) reducidos anaeróbicamente esterilizados (PRAS) ●● Cámara anóxicaCámara anóxica●● Cámara anóxicaCámara anóxica●● Capa de vaselina Capa de vaselina –– parafina (3:2)parafina (3:2)●● Sistemas comerciales: Anaerocult ASistemas comerciales: Anaerocult A

Anaerocult PAnaerocult PAnaerocult CAnaerocult C

Vas-Par

JARRA ANÓXICA (TÉCNICA DE GAS PAK)JARRA ANÓXICA (TÉCNICA DE GAS PAK)

TABLETA 1:TABLETA 1:BHBH44Na+ HNa+ H22O HO H22

TABLETA 2:TABLETA 2:CC66HH88OO77 + HCOO+ HCOO33Na + HNa + H22O COO CO22CC66HH88OO77 + HCOO+ HCOO33Na + HNa + H22O COO CO22

¿Cómo consume el O¿Cómo consume el O22? ?

HH22 + O+ O22 Paladio HPaladio H22OO

JARRA ANÓXICAJARRA ANÓXICA

JARRA ANÓXICAJARRA ANÓXICA

POR QUÉ PUEDE FRACASAR GAS PAK?POR QUÉ PUEDE FRACASAR GAS PAK?

► Catalizador no activo

► Generador de gas defectuoso

► Mal mecanismo de cierre de la tapa de la jarra

► Que el agua no llegue a las tabletas del sobre

generador de gas pak

Evacuación – Reemplazo (ER)

Cámara anóxica

Desecador

Anaerocult

Sistema Bio-Bag

Cámara anóxica

Vaselina-parafina

VAS-PAR

(3:2)

ANAEROCULTANAEROCULT

COMPOSICIÓN

Polvo de hierro

Ácido cítrico

Sodio carbonato

Tierra silícea

La adición de agua en el interior de la plancha inicia la reacción:

Fe 2+ O2 Fe 3+

ANAEROCULT

CONSERVACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS

LOS TRES OBJETIVOS PARA UNA CORRECTA CONSERVACIÓN:

1.- Que el cultivo se mantenga puro ( PUREZA)

2.- Que el cultivo se mantenga viable ( VIABILIDAD)2.- Que el cultivo se mantenga viable ( VIABILIDAD)

3.- Que el cultivo este genéticamente estable ( ESTABILIDAD)

MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOSMÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

A.- Métodos de conservación a largo plazo

- congelación

- liofilización

B.- Métodos alternativos

- Conservación por transferencia periódica

- Conservación por suspensión en agua destilada estéril

Conservación de los microorganismos por congelación

Las células se congelan en suspensión en un líquido con un agente crioprotector

y, se almacenan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados (de – 70 a

196º C).

Los factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células:Los factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células:

□ Edad de las células

□ Velocidad en la congelación y descongelación

□ Temperatura de almacenamiento

□ Acondicionamiento de los microorganismos

□ Empleo de crioprotectores

AGENTES CRIOPROTECTORESAGENTES CRIOPROTECTORES

Características

- No tóxico para la célula

Ejemplos

-Glicerol (10 -20%)

Estos solutos penetran dentro de las células y las protegen de los

efectos de la deshidratación (el agua disponible es ta congelada), a la

vez que evitan la formación de cristales de hielo.

- No tóxico para la célula

-Penetrar fácilmente en la membrana celular

-Unirse a los electrolitos o a las moléculas de agua

-Glicerol (10 -20%)

-Leche descremada

- Dimetilsulfóxido (DMSO)

-Inositol

-Glucosa

-Lactosa

-Sacarosa

Tubos crioprotectores por duplicado

CONSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS POR CONSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS POR LIOFILIZACIÓNLIOFILIZACIÓN

- Es un método de conservación a largo plazo.

-Se basa en la paralización del metabolismo celular por

falta de agua: congelación y deshidratación (al vac ío).

Congelar el agua libre de las células

Eliminación del agua por vacío

Agua congelada Vapor de agua

1ra.fase de la desecación 2da. fase de la

desecación

SUBLIMACIÓN

Apto para envío de cepasApto para envío de cepas

Tema: Cultivo celular. CTema: Cultivo celular. C ultivoultivo de de ricketsiasricketsias , clamidias y virus. , clamidias y virus.

Inoculación en embrión de pollo. Inoculación en embrión de pollo. Animales de experimentación.Animales de experimentación.

ObjetivosObjetivos

�� Definir y caracterizar cada tipo de cultivo celular, Definir y caracterizar cada tipo de cultivo celular, obtención, requerimientos y aplicaciones.obtención, requerimientos y aplicaciones.

�� Caracterizar el uso de células de embrión de pollo para Caracterizar el uso de células de embrión de pollo para el cultivo el cultivo de Clamidiasde Clamidias, , RikettsiasRikettsias y virus. y virus. el cultivo el cultivo de Clamidiasde Clamidias, , RikettsiasRikettsias y virus. y virus.

�� Establecer los conceptos básicos del uso de animales de Establecer los conceptos básicos del uso de animales de experimentación en el laboratorio.experimentación en el laboratorio.

CULTIVO DE RICKETSIAS, CLAMIDIAS y VIRUS

Debido a que estos microorganismos son parásitos intracelulares obligados , es necesario cultivarlos en células vivas.

-- cocos o bacilos cocos o bacilos GramGram ––--Fiebre Moteada y del tifus Fiebre Moteada y del tifus

(Artrópodos) (Artrópodos)

Rickettsias Clamidias-Cocos Gram --Patógenos del aparato respiratorio y de transmisión sexual

PAP al microscopio mostrando Chlamydia en Rickettsias creciendo dentro de las células hospedadoras vacuolas. Rickettsias creciendo dentro de las células hospedadoras

Las células se lavan, se

Se obtienen por separación quirúrgica aséptica y disgregación

enzimática

CULTIVO PRIMARIO:

cultivo celular establecido a partir de un tejido u órgano animal o

humano.

Las células se lavan, se cuentan en cámaras cuenta

glóbulos (tipo Neubauer) y se siembran

- Se siembran en tubos, botellas , placas o policubetas de vidrio o de plástico estériles

-Se cubren con medio de cultivo nutritivo con antibióticos a 37°C en cámara de cultivo celular

Cultivos primarios

Incubadoras para cultivo celular

CULTIVOS PRIMARIOSCULTIVOS PRIMARIOS

-Las células sedimentan, se adhieren y se multiplican formando islotes que van

cubriendo toda la superficie: monocapa

-Cuando dos islotes se unen se inhibe su crecimiento: inhibición

Cultivos en monocapa

Monocapa epitelial del embrión o de riñón de mono verde africano.Monocapa epitelial del embrión o de riñón de mono verde africano.

Epitelial (poligonales)

inhibe su crecimiento: inhibición por contacto

Los medios de cultivo se deben cambiar 2 o 3 veces por semana.

Fibroblastico (irregular)

Obtener nuevos cultivos: pasaje o subcultivo

Infección con virus

CULTIVO PRIMARIO:

Fibroblastos de riñón de mono, células embrionarias de pollo o de

riñon humano o células amnióticas.

Crecimiento limitado: al cabo pocos pasajes (cultivos secundarios) las células

mueren y se debe obtener un nuevo cultivo primario (costoso)

Fibroblastos de riñón de mono

nuevo cultivo primario (costoso)

CULTIVO CELULAR PRIMARIO:

CEPA DE CÉLULAS DIPLIODES :

Seleccionar células con morfología intacta, numero diploide de cromosoma y capacidad de crecimiento limitado

MRC-5: riñon de mono Rhesus Pasajes: 50 a 100Sin perder la sensibilidad

Envejecen y muerenVacunas

Sin virus latentes

MRC-5: riñon de mono Rhesus Wi 38 (Winster Institute) de humanoAislamiento de citomegalovirus, varicela y rinovirus

CULTIVO CELULAR PRIMARIO:

LINEAS CELULARES:

Características similares: tipo epitelial

Numero de cromosomas es variable (aneuploídia)

Origen normal: Vero, fibroblastos de riñón de mono africano, LLC-MK 2 de riñón de mono, BHK de riñón de hamster o las RK

de riñón de conejo

Origen neoplásico: Hela, carcinoma de

adaptar célula a crecer in vitro durante un numero ilimitado de pasajes

Se repican un numero ilimitado, por múltiples pasajes: líneas inmortales

Aislamiento del virus sinsitial respiratorio, herpes, rubeola,

poliovirus, adenovirus etc.

Origen neoplásico: Hela, carcinoma de cervix , las HEP-2 de un carcinoma de

laringe.

Una de las primeras líneas celulares humanas, obtenida de Henrietta Lacks, quien falleció de cancer de útero a partir del cual se obtuvieron estas células. El cultivo de célulasHeLa que se muestra en la imagen fue teñido con Hoeschtque se une al ADN coloreando de azul el núcleo.

LÍNEAS CELULARES continuas inmortales LÍNEAS CELULARES continuas inmortales neoplasicasneoplasicas

Características de las células transformadas

• Independencia de sustrato

• Pérdida de inhibición por contacto (multicapas)

Pierden funciones

Inmortales

Patología

Transformación : cambio en el genotipo celular:-Virus transfomante-Sust cancerigena-Espontanea

•Alta eficiencia de plaqueo: capacidad de formar clones

• Bajo requerimiento de suero

•Corta tasa de duplicación

•Aneuploidía y heteroploidía

• Tumorigenicidad

ABAC ABAC -- Asociación Banco Argentino de Células Asociación Banco Argentino de Células

Línea Celular Descripción Especie Tipo celular Origen

BHK-21 Riñón de hamster dorado HamsterMonocapa de fibroblastos

ATCC

CHO-K1 Ovario de hamster chinoHamster chino

Monocapa epitelial ATCC

MRC-5Pulmón fetal humano(diploide)

HombreMonocapa de fibroblastos

ATCC

Wish Amnion humano Hombre Monocapa epitelialATCC

Hep-2Carcinoma humano(órgano)

Hombre Monocapa epitelial ATCC

Vero C-76Riñón de mono verde africano

MonoMonocapa de fibroblastos

ATCC

Vero E-6Riñón de mono verde africano

MonoMonocapa de fibroblastos

ATCCafricano fibroblastos

L-929 Tejido conectivo de ratón RatónMonocapa de fibroblastos

ATCC

MDBK Riñón bovino Vaca Monocapa epitelialATCC

RK13 Riñón de conejo Conejo Monocapa epitelialATCC

CRFK Riñón de gato GatoMonocapa de fibroblastos

ATCC

HeLaCarcinoma de cervix humano

Hombre Monocapa epitelial ATCC

RajiLinfoma de Burkitt humano

HombreLinfoblastos en suspensión

ATCC

IIBMel J Melanoma humano Hombre ARGENTINA

T24Carcinoma de vejiga humano

Hombre Monocapa epitelial ATCC

E. Derm Dermis de caballo CaballoMonocapa de ATCC fibroblastos

ATCC

3T3 L1 Embrión de ratón RatónMonocapa de fibroblastos

ATCC

- Medios de cultivo frescos y de composición adecuad a.

- Permitir el intercambio gaseoso

-Cantidad de suero en el medio, pH, temperatura opt ima, cantidad de células sembradas, etc.

Requerimientos del crecimiento celular

Requerimientos nutricionales Requerimientos fisiológicosRequerimientos nutricionales

-Aminoácidos-Carbohidratos-Vitaminas -Iones inorgánicos-Antibióticos-Suero-Indicador de pH

Requerimientos fisiológicos

-Temperatura: 37°C- pH: 7,2-7,4. Buffer-Tensión de dióxido de carbono: > 5%Presión osmótica: 7.6 atmosferas. ClNaHumedad del incubador

Ejm: MEM: medio esencial mínimo

Dubelco’s MEM

MEDIOS DE CULTIVO CELULARES

Cuando es necesario de un cambio en el medio de cul tivo?

-Caída del pH: < 6,5, pierden viabilidad

-Alta concentración celular

-Característica celular : las células transformadas deben ser subcultivadas con mayor frecuencia

-Morfología celular: deterioro celular, granulación perinuclear, vacuolas citoplasmaticas etc .

Como se conservan las líneas celulares? Como se conservan las líneas celulares?

- En glicerol y dimetil sulfóxido en ampollas cerradas herméticamente en estado de congelación

. Pueden mantenerse en nitrógeno liquido durante años

DETECCIÓN DE LA REPLICACIÓN DE LOS VIRUS

1.- Por su acción citopática (ECP): o acción citopat ogénica (ACP):

redondeamiento celular, con desprendimiento de la monocapa y

liberación de las células alteradas al medio

EFECTO CITOPÁTICO

Tinciones histológicas o métodos inmuno histoquímicas

Virus sincitial respiratorio : proteínas de fusión

Herpes virus y polovirus

DETECCIÓN DE LA REPLICACIÓN DE LOS VIRUS

2.- Por la aparición de componentes del virus en el medio de cultivo, en especial de hemaglutininas o de antígenos fijado res de complemento .

3.- Por inmunofluorescencia, detectando la presencia de virus o sus

antígenos en las células mediante el empleo de un s uero inmune

marcado con sustancias fluorescentes.

Aplicaciones

Productos biotecnológicos

1-Producción de virus

VacunasAntígenos virales para diagnosticoVirus entomopatógenos para plagas

Tecnología del ADN recombinante en cultivo celular

enzimas, hormonas, anticuerpos mononoclonales, interleucinas, linfoquinas y agen

tes anticancerígenos. Eritropoyetina

Activador tisular del plasminogeno

2- Produccion de moléculas bioactivasTerapéutica y en el diagnosticoAnticuerpos monoclonalesFármacos naturales (Interferon alfa) Fármacos recombinantes

Evaluaciones toxicológicasinfecciosas y nutricionales

Otras aplicaciones :

linfocito aislados del bazo o médula ósea de

un ratón inmunizado

Generación de hibridomas

Se fusionan células normales con una línea celular inmortalizada.

anticuerpos monoclonales.

Los hibridomas productores del anticuerpo deseado se seleccionan a

partir de grupos hasta llegar a colonias individuales.

una línea celular de mieloma inmortalizada (células del linaje B) solo las células fusionadas

sobreviven

-Fuente de tejido vivo fácil de manipular y económica, estéril, posee escasos virus latentes y no posee respuesta inmunitaria.

-Mayor susceptibilidad para aislamiento y propagación de ciertos virus. Ejm: virus de la gripe

-Detección y cuantificación de anticuerpos neutralizantes y producción de vacunas y antígenos de diagnostico.

HUEVOS EMBRIONADOS

HUEVOS EMBRIONADOS

Selección y cuidados de los huevos antes de la inoculación:Selección y cuidados de los huevos antes de la inoculación:

-- Edad: huevos viables jóvenes, recogidos inmediatamente después de Edad: huevos viables jóvenes, recogidos inmediatamente después de su postura.su postura.

-- Almacenamiento a 10 Almacenamiento a 10 °°C (estado estacionario), por no mas de una C (estado estacionario), por no mas de una -- Almacenamiento a 10 Almacenamiento a 10 °°C (estado estacionario), por no mas de una C (estado estacionario), por no mas de una semana antes de incubar (fertilidad).semana antes de incubar (fertilidad).

-- Huevos blancos (Huevos blancos (transiluminacióntransiluminación) y de cáscara integra, provenientes ) y de cáscara integra, provenientes de gallinas que carecen de enfermedades y de anticuerpos con dieta de gallinas que carecen de enfermedades y de anticuerpos con dieta equilibrada y exenta de antibióticos.equilibrada y exenta de antibióticos.

-- IncubadoresIncubadores de laboratorio o de laboratorio o incubadoresincubadores automáticos de criaderos de automáticos de criaderos de pollos.pollos.

HUEVOS EMBRIONADOS

Condiciones de incubación

-- Temperatura y tiempo de incubación: Temperatura y tiempo de incubación: 3737°°C, 60% de humedad, OC, 60% de humedad, O22: 21% y CO: 21% y CO22: : 0.5%. 0.5%.

-- Extremo abultado hacia arriba. Extremo abultado hacia arriba.

Examen visual de HUEVOS EMBRIONADOS: Examen visual de HUEVOS EMBRIONADOS:

Antes de la inoculación: determinación de su desarr ollo normalAntes de la inoculación: determinación de su desarr ollo normalLuego de la inoculación: comprobar su supervivencia Luego de la inoculación: comprobar su supervivencia

Trasluz Ovoscopio

Ovoscopio industrial

HUEVOS EMBRIONADOS: examen visualHUEVOS EMBRIONADOS: examen visual

Huevos fértiles, mas de 4 días: Vasos sanguíneos (telaraña)

Movimiento intermitente de punto negro (ojo)

Embrión: sombra móvil (a parte superior)Vena umbilical

Embriones muertos

Vías de inoculación: Vías de inoculación:

-Membrana corioalantoidea-Cavidad anmiotica-Cavidad alantoidea-Saco vitelino

Selectividad de virus por determinados tejidos

Intraperitonial o intracerebral

A través de un orificio en la cascara, previa antisepsia y se inyecta el inoculo con aguja

y jeringa, luego se tapa el orificio y se incuba.

Como se realiza la inoculación :

Uso de colorantes

Cantidad y dilución del inoculo: depende del tipo de virus

Con medidas de bioseguridad adecuadas y personal entrenado: mascaras, guantes, ropa protectora, gabinetes de seguridad

biológica II y III, acceso restringido y corrientes de aire controladas.

Cavidad alantoideaCavidad anmióticaCavidad anmiótica

Saco vitelino Membrana corioalantoidea

-Herpes virus o poxvirus producen pústulas (cuantificación)

-Aislamientos de virus (viruela)

--Virus de la gripeVirus de la gripe

Vademecum 2013 Influvac

Antígenos inactivados del virus de la Influenza (hemaglutininas y

neuraminidasas propagadas huevos fertilizados de gallina de pollos sanos.

-Virus de la Influenza y el virus de la parotiditis

Se necesita una gran cantidad de virus: vacunas o antígenos

Cultivo de clamidias y ricketsias

Corpúsculos y cuerpos de inclusión

El desarrollo del virus se detecta por:El desarrollo del virus se detecta por:

- Muerte del embrión: desaparecen los vasos sanguíneos y embrión inmóvil (herpes y parotiditis)

-Daño de las células del embrión o

lesiones focalizadas (poxvirus y herpes virus)

-Formación de típicas pústulas (herpes virus) o lesiones en las membranas del huevo.

-No inducir lesiones aparentes, con producción de antígenos virales (hemaglutininas).

ANIMALES DE EXPERIMENTACIONANIMALES DE EXPERIMENTACION

Las pruebas biológicas se deben realizar según normas éticas del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio (CICUAL-UNSL) y legislación de SENASA, ANMAT, CDC/NIH, FDA, EPA, y OMS para evitar que padezcan dolores o sufrimientos innecesarios.

cualquier especie animal que se mantiene bajo condiciones determinadas y se utiliza con fines científicos, con el correcto cumplimiento de los principios éticos y de

bienestar animal.

o sufrimientos innecesarios.

EL PRINCIPIO DE LAS 3 R

RREEMPLAZO : : sustitución de animales vivos por métodos alternativos como modelos matemáticos, simulación en computadora, tests serológicos, cultivos celulares, etc. .

REDUCCIÓN : usar el mínimo número de animales necesario para obtener resultados válidos.

REFINAMIENTO: incluye todos los procedimientos para minimizar y eliminar el dolor, así como todos los métodos para asegurar el bienestar animal.

Animales de experimentación:

Factores que influyen en la experimentación animal:-Instalaciones y condiciones ambientales-Nutrición -Comportamiento y bienestar animal: homeostasis y estrés.- Patología y control sanitario.-Diseño experimental

BIOTERIOAlojamiento cómodo, higiénico y de dimensiones

suficientes, así como agua y comida de buena calidad y en cantidad suficiente.

-Diseño experimental-Estandarización genética de la especie:Cepas endocriadas: generaciones consecutivas de cruza hermano x hermana.Estos animales se caracterizan por:

- idéntico perfil genético- estables por largos periodos de tiempo;-fenotípicamente uniformes.

Ejm: en ratones: BALB/c , en ratas: Wistar

-obtención de suero, plasma, tejidos

-estudio de enfermedades infecciosas y de otros tipos:

Propósitos generales para la utilización de animales de experimentación:

-estudio de enfermedades infecciosas y de otros tipos: metabólicas, tumorales, etc.

-desarrollo de vacunas

- estudios bioquímicos, farmacológicos, inmunológicos, toxicológicos, nutricionales.

ANIMALES DE LABORATORIOANIMALES DE LABORATORIO

Animales más frecuentemente empleados:

- Rata blanca- Ratón-Hámster-Cobayo-Conejo-Cabras-Aves-Aves-Artrópodos

Con fines seroterápicos:- caballo- oveja- bovino

Principales vías de inoculación

Vía enteral: vía oral/intragastrica

Vía parenteral: -Intramuscular (IM)-Endovenosa (EV)-Subcutánea (SC)-Intraperitoneal (IP)-Intradérmica (ID)

Otras vías:

IMVO

IVIP SC

Otras vías:-Vía tópica-Vía inhalatoria--Via retroorbital

Se han logrado animales sanitariamente definidos:

-animales libres de gérmenes (axénicos)

-con flora bacteriana o vírica conocida (gnotobióticos)

-libres de gérmenes patógenos específicos

controlar y estandarizar las experiencias

1-aislamiento del gen de interés (transgén): clonado y manipulado para que pueda ser expresado por el organismo blanco.

2-Dicho gen se inyecta en un embrión en estadio de cigoto.

3-Se implanta el embrión en un animal

Animales transgénicos

3-Se implanta el embrión en un animal receptivo, que actúa como madre (fertilización in vitro).

Vacas Pampa: que producen en su leche hormona de crecimiento humano

Conducen a la expresión de un nuevo gen o a

la sobre-expresión de un gen ya existente.

Ratones knockout

Son ratones en los que se inactiva un gen determinado en el genoma

(deleción) analizando el fenotipo que resulta de la pérdida de su función.

“gene targeting”:los genes modificados se introducen en las células madre

embrionarias del ratón. embrionarias del ratón.

Ratones knockin:

Un gen es reemplazado por una versión modificada del mismo, que produce

una variación en su función.

Algunas publicaciones actuales donde se utilizan animales de experimentación para estudios microbiológicos:

-Cerdos desafiados con Mycoplasma en vías aéreas (Wodley y col. 2013)

-Hámsters inoculados por vía intrahepática con Entamoebadispar (Guzmán-Silva y col. 2013)dispar (Guzmán-Silva y col. 2013)

-Ratones para caracterización de variantes de priones (Takeuchi y col. 2013)

-Conejos tratados con distintos antimicrobianos por meningitis causada experimentalmente por Staphylococcus

aureus meticilino resistente (Tas y col. 2013).

NIVELES DE BIOSEGURIDAD PARA TRABAJAR CON ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

1 Acceso restringido, ropa y guantes protectores

2

Procedimientos del NBSA-1, más señales de advertenc ia del riesgo. CSB de clase I o II para las actividade s que producen aerosoles. Descontaminación de desechos y

2producen aerosoles. Descontaminación de desechos y jaulas antes del lavado.

3Procedimientos del NBSA-2, más acceso controlado. CSB y ropa protectora especial para todas las actividades.

4

Procedimientos del NBSA-3, más acceso estrictamente restringido. Muda de ropa antes de entrar. CSB de c lase III o trajes de presión positiva. Ducha a la salida . Descontaminación de todos los desechos antes de su salida de las instalaciones.