Pérez García CC, Diez Prieto MI, García Partida P.INTRODUCCIÓN A LA EXPERIMENTACIÓN Y PROTECCIÓN ANIMAL

León: Univ. León, 1999: 215-223, ISBN: 84-7719-708-3

Métodos alternativos y complementarios enexperimentación animal

E de la Peña de Torres. A Guadaño Larrauri y G Repetto Kuhn

Introducción

El libro de Rusell y Burch (1959) ThePrincipies of Human ExperimentalTechnique fue el inicio de la búsquedade nuevos métodos que permitieranun menor uso de animales de experi-mentación en la investigación básica yaplicada. Otros elementos de grantrascendencia y que actuaron comomotores dinamizadores para eldesarrollo de métodos alternativos ycomplementarios a la experimenta-ción animal fueron: a) la Directiva delConsejo 86/609/CEE, que fue trans-puesta en España en el Real Decreto223/1988, de 14 de marzo de 1988, b)la Directiva sobre Cosméticos, c) lacreación del Centro Europeo deValidación de Métodos Alternativos(ECVAM), d) la publicación del libroIn Vitro Alternatives to Animal Phar-

maco-Toxicology de Castell y Gómez-Lechón (1992). y e) la creación,dentro de la Asociación Española delexicología, del Grupo de TrabajoEspecializado en MétodosAlternativos (GTEMA), coordinadopor el Dr. Guillermo Repetto.

La presión social ha motivado que lacomunidad científica se haya intere-sado en el constante desarrollo denuevos métodos alternativos muchomás refinados que emplean un menornúmero de animales en la investiga-ción toxicológica y farmacológica denuevas sustancias.

En el congreso celebrado en honor aClaude Bernard en Lyon en 1978 seelaboró un decálogo con los principioséticos de la experimentación animal;la versión en castellano fue publicadapor el Comité Español delICLAS/CSIC en 1983 (Figura 1).

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MÉTODOS ALTERNATIVOS Y COMPLEMENTARIOS EN EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS

International Council for Laboratory Animal Science

COMITÉ ESPAÑOL DEL KLAS/CSIC/CICyT

PRINCIPIOS ÉTICOS DE LA EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

Principios básicos

Artículo 1. Los progresos del conocimiento humano, son necesarios y sobre todo los de labiología, de la medicina del hombre y de los animales.

Artículo 2. El hombre tiene necesidad de utilizar el animal en la búsqueda del conocimientohumano igual que para alimentarse, vestirse y trabajar. De ahí el deber de respetar elanimal, entre auxiliar y ser viviente común a él.

Artículo 3. Toda persona que emplee animales con fines experimentales debe tener presenteque están dotados de sensibilidad y memoria y son susceptibles al dolor y sufrimiento.

Responsabilidades del experimentador

Artículo 4. El experimentador es moralmente responsable de sus actos en el marco de laexperimentación animal.

Artículo 5. Las experiencias concernientes a los seres vivos y las extracciones de tejidos asujetos vivos con fines de investigación deben ser realizados por un científico cualificado obajo su control directo. Las condiciones de conservación de los animales enexperimentación deben ser definidas y controladas por un veterinario o por un científicocompetente.

Artículo 6. En los estudios sobre la utilización de animales deben existir una probabilidadrazonable para que estos estudios contribuyan de manera importante a la adquisición deconocimientos que desembocaran eventualmente en la mejora de la salud y del bienestardel hombre y de los animales.

Articulo 7. Los métodos estadísticos, los modelos matemáticos y los sistemas biológicos invttro deben ser utilizados cuando sean apropiados para completar la experimentaciónanimal y para reducir el número de los sujetos utilizados.

Artículo S. El experimentador debe utilizar el animal mejor adaptado a su investigación y teneren cuenta también los grados sensoriales y psíquicos propios de cada especie. Losanimales en peligro de extinción no deberán ser utilizados más que en circunstanciasexcepcionales muy definidas. Mientras sea posible, los animales utilizados en el laboratorioprovendrán de crías especializadas para asegurar las mejores condiciones de equilibriobiológico.

Artículo 9. El experimentador debe velar porque las condiciones de conservación del animal delaboratorio sean las mejores posibles y aportar los cuidados necesarios antes, durante ydespués de las intervenciones.

Artículo 10. El experimentador tiene el deber de ahorrar al animal todo sufrimiento físico opsíquico inútil. Debe poner en marcha los métodos que permitan limitar el sufrimiento y losdolores en el caso o casos que sean inevitables.

Edita Comité Español del ICLAS/CSIC y Consejos Generales de Farmacéuticos,Médicos y Veterinarios

Figura 1. Principios éticos de experimentación animal (tomado de De la Peña, 1995).

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Clasificación de los ensayosalternativos

La Figura 2 muestra la clasificaciónde los diferentes procedimientos parala disminución del uso de animales deexperimentación, que incluyedesde evitar la repetición deexperimentos innecesarios, lamejora en el diseño, estudiosen humanos, empleo de técni-cas in vitro, el uso de modelosteóricos y modelos matemáti-cos, hasta el empleo de mode-los visuales y de realidad vir-tual.

sido homologadas por la OCDE y laCEE. métodos que han sido contras-tados eficazmente por el gran desa-rrollo de los métodos utilizados en laevaluación mutagénica de las sustan-cias químicas.

Métodos alternativos invitro

El desarrollo de las técnicas invitro ha sido espectacular enestos últimos tiempos, tantopor la evolución de métodosmoleculares como por las faci-lidades parar el uso de cultivoscelulares y cultivos de tejidos.

La OCDE tiene una serie demétodos de ensayo homologa-dos y de los que deseamos des-tacar los ensayos de genotoxi-cidad, dado que a lo largo delos años han sido perfecta-mente contrastados y cuya va-lidez y valor predictivo haquedado bien demostrado.

La Figura 3 muestra la clasifi-cación de las técnicas de geno-toxicidad in vitro, que han

1. Evitar la repetición innecesaria de experimentos

Protocolos de ensayo y estudios previos:disponibilidad de la información

2. Mejoras de diseño en la experimentación animal

Reducción en el número de animales usados

Refinamiento: disminución del estrés y sufrimiento

3. Estudios en humanos

Epidemiológicos

Toxicovigilancia

Voluntarios

4. Técnicas in vitro

Cultivos de Embriones

Cultivo y baños de órganos

Órganos perfundidos

Explantes. Cultivos organotípicos

Cultivos de reagregados celulares

Cultivo de células dispersadas

Cultivo de líneas celulares. Clones celulares

Modelos libres de células

Organismos inferiores: bacterias, algas, etc.

5. Modelos teóricos de predicción

Relación estructura química-actividad (QSAR)

Farmaco-toxicocinética (PB-PK)

6. Modelos en la enseñanza

Modelos mecánicos

Sistemas audiovisuales

Simulaciones por ordenador

Realidad virtual

Figura 2. Procedimientos para la disminución del uso deanimales de experimentación.

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MÉTODOS ALTERNATIVOS Y COMPLEMENTARIOS EN EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

Tipo de Ensayo

Mutaciones

génicas

Aberraciones

cromosómicas

Efectos sobre

elADN

Tipo de electo y Organismo

Ensayo de mutación reversa de Salmonella typhimuríum

Ensayo de mutación reversa de Escherichia coi

Mutación génica en cultivos celulares de mamífero

Ensayo letal recesivo ligado en Drosophila

Mutación génica en Saccharomices cerevisiae

Ensayo citogenético in vitro de mamifero

Ensayo citogenético in vitro en médula ósea

Ensayo de micronúcleos

Ensayo de letal dominante

Ensayo de translocación hereditaria

Ensayo citogenético en células germinales de mamífero

Síntesis no programada de ADN in vitro

Recombinación mitótica en Saccharomyces cerevisiae

Ensayo de intercambio de cromátidas hermanas in vitro

N°UE

471

472

473

477

480

473

475

474

478

485

483

482

481

479

Figura 3. Ensayos de genotoxicidad de la OCDE (1993).

Substratos biológicosempleados in vitro

La alternativas biológicas al uso deanimales son muy variadas y para ellovamos a considerar la descripción quese hace en Repetto y Repetto (1995)(Figura 4).

1. Cultivos de embriones

Se utilizan embriones (pre o postim-plantados) de roedores o embriones deaves (huevos fecundados) para exami-nar las alteraciones en el desarrollo yla diferenciación, se caracterizan pormantener intacto su metabolismo yseguir su desarrollo e interaccionescelulares fisiológicas. Además puedenutilizarse en cualquier etapa del desa-

rrollo embrionario. Sin embargo esuna técnica muy especifica y que pre-senta dificultades para visualizar latoxicidad a nivel celular y molecular.

2. Cultivo y baños de órganos

Se utilizan hígado, cerebro, hipófisis,íleon., que se mantiene, tanto íntegroscomo en láminas, en baños o en culti-vos. Han de iniciarse a partir de ani-males más maduros (al menos reciénnacidos) y se conservan las relacionesespeciales entre los distintos tipos decélulas. Presentan problemas de hi-poxia en el centro del órgano y difi-cultades para la visualización de lascomunicaciones intercelulares.

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3. Órganos perfundidos

Determinados órganos como hígado,riñon y páncreas pueden mantenerseen óptimas condiciones mediante sis-temas de perfusión continua. Aunquees una técnica muy sofisticada, facilitalos estudios toxicocinéticos de capta-ción y secreción de sustancias

4. Explantes. Cultivosorganotípicos

Los explantes son pequeñas piezas detejido, tomadas de animales de cual-quier edad, cuyas células interaccio-nan entre sí y crecen en cultivo du-rante semanas o meses manteniendola estructura típica del órgano. Susinconvenientes son la dificultad en lavisualización de células individuales yla baja reproducibilidad bioquímicadebido a la complejidad técnica querequiere su preparación.

5. Cultivos de reagregadoscelulares

Cuando las células procedentes de te-jidos fetales se disocian y cultivan enun medio sometido a agitación cons-tante, éstas tienden a reagruparseformando microagregados en los que,en gran parte, se restaura la arquitec-tura tridimensional original.

6. Cultivos de célulasdispersadas

Las células se siembran tras ser diso-ciadas enzimáticamente o mecánica-mente, obteniéndose un cultivo pri-mario se produce en monocapa. Las

1. Cultivo de embriones

2. Cultivo y baños de órganos

3. Órganos perfundidos

4. Explantes. Cultivos organotípicos

5. Cultivos de reagregados celulares

6. Cultivo de células dispersadas

7. Cultivo de líneas celulares. Clonescelulares

8. Modelos libres de células

Figura 4. Substratos biológicos empleados m\ritro.

características histoquímicas se man-tienen en parte, y pueden visualizarsefácilmente. La reproducibilidad de losestudios electrofisiológicos, morfoló-gicos y bioquímicos es mayor y puederealizarse sobre células individualesdurante largo tiempo. El inconve-niente es que la estructura al ser bi-dimensional pierde una gran propor-ción de la arquitectura tisular origi-nal.

7. Cultivo de líneas celulares.Clones celulares

Se utilizan células de origen animal ohumano que se han adaptado a viviren cultivo por el proceso denominadotransformación, que puede ocurrir es-pontáneamente o puede ser inducidopor un compuesto químico, radiacio-nes o virus. Las células pasan a tenervida infinita convirtiéndose en unalínea celular establecida. Por vida in-finita se entiende la capacidad de és-tas células de multiplicarse in vitrodurante periodos prácticamente ilimi-tados.

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MÉTODOS ALTERNATIVOS Y COMPLEMENTARIOS EN EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

Este tipo de líneacélulas tiene la ven-taja de suministrargran cantidad ho-mogénea de unmismo tipo celular,siendo muy ade-cuada para estudiosbioquímicos cuanti-tativos.

8. Modeloslibres de células

Este modelo esta ba-

1

2

3

4

5

6

7

Morfología celular y tisular

Viabilidad celular

Proliferación celular

Actividad Metabólica

Membranas Celulares

Comunicación intercelular

Indicadores específicos

Técnicas no invasivas

Técnicas invasivas

Sustancias reguladoras

Uso de la energía, enzimas

Síntesis de macromoléculas

Inducción selectiva de proteínas

Composición y estabilidad

Permeabilidad iónica

Sistemas de transporte

sado en los diferen-tes componentescelulares que sepueden separar me-diante técnicas de centrifugación.

La experimentación con una fracciónsubcelular presenta la gran ventaja deevitar interacciones tisulares, celula-res y con otros organillos y enzimas.

Las fracciones subcelulares más em-pleadas son la fracción completa uhomogeneizado total, la soluble, lapostmitocondrial, la microsomal, lanuclear, la sinaptosomal, la fracciónde membrana plasmática y los dife-rentes componentes purificados.

9. Organismos inferiores:bacterias, algas, etc

En este apartado entran de lleno losmétodos de la clasificación de laOCDE y que han sido homologadospor la Unión Europea, donde podemosincluir los métodos de genotoxicidadreseñados en la Figura 3 de ensayos.

Figura 5. Indicadores de toxicidad in vitro (tomado de Repetto yRepello, 1995).

Dentro de éstos destacamos el ensayode Salmonella typhimurium por seruno de los ensayos mas utilizados enel mundo y con el que se han eva-luado un elevado número de sustan-cias químicas, por encima de 12.000productos químicos. No obstante en laactualidad se cuestiona el valor pre-dictivo de los resultados obtenidos condicho ensayo, dada su baja concor-dancia con los ensayos in vivo.

A la vista de lo descrito podemosapreciar el elevado número de ensayosque se están realizando en los que nose emplean animales, siendo en la ac-tualidad de máxima transcendencia laaceptación de dichos resultados porlas autoridades.

Indicadores de toxicidad

En la Figura 5 se exponen los diferen-tes tipos de indicadores de toxicidad

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E DE LA PEÑA DE TORRES, A GUADAÑO URRAURI Y G REPETTO KUHN

in vitro, siendo la morfología celular ytisular. la viabilidad celular, prolifera-ción celular, actividad metabólica,membranas celulares, comunicaciónintercelular y los indicadores específi-cos los principales indicadores em-pleados.

Coordinación de actividades:posibilidades de colaboración

La necesidad de desarrollar y validarnuevos métodos lleva implícito ungran coste económico y la cooperaciónde grupos de diferentes países. Parafacilitar este proceso, la Unión Euro-pea ha creado el Centro para la Vali-dación de Métodos Alternativos(ECVAM) y en USA han constituidoun Comité Interagencias (ICCVAM).

A continuación relataremos breve-mente las principales actividades lle-vadas a cabo recientemente por algu-nos grupos de trabajo de nuestro país.

Actividades del Grupo deTrabajo de MétodosComplementarios de ICLAS(WGCM-ICLAS)

Tras la creación del WGCM-ICLASen septiembre de 1994 en Hyderabad(India), en 1995 se celebró en Tala-vera de la Reina (27-30 de Abril,1995) el Grupo de trabajoICLAS/CSIC sobre Métodos Com-plementarios, publicando posterior-mente la monografía: ICLAS/CSICWortong Group on Complementar)/Methods (de la Peña et al., 1995);

todo ello ha sido un constante fer-mento para el desarrollo y practica delos métodos alternativos. Como coor-dinador de este Grupo, el Dr. de laPeña ha venido colaborando con elDr. Repetto, de GTEMA, para la or-ganización de reuniones encaminadasal desarrollo de los métodos comple-mentarios y alternativos a la experi-mentación animal.

El próximo año, durante la celebra-ción de la Reunión ICLAS-FELASAdel 22-28 de Mayo, en Palma de Ma-llorca, se celebrará una reunión delcitado Comité de ICLAS sobre Méto-dos Complementarios.y Alternativos ala Experimentación Animal.

Actividades del Grupo deTrabajo Especializado enMétodos Alternativos de laAsociación Española deToxicología

La creación, dentro de la AsociaciónEspañola de Toxicología, del Grupode Trabajo Especializado en MétodosAlternativos (GTEMA), que coordinael Dr. Guillermo Repetto, hareactivado las actividades en relacióncon los métodos alternativos,trabajando para coordinar losesfuerzos de los diferentes grupos deinvestigación españoles interesados enellos. El GTEMA dispone de una Redde Intercomunicación Electrónicamediante la cual se distribuye por co-rreo electrónico información puntualsobre los proyectos de validación,ayudas de investigación, congresos,

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MÉTODOS ALTERNATIVOS Y COMPLEMENTARIOS EN EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

actividades del GTEMA, ECVAM.ICCVAM, etc. Sobre sus actividadespuede obtenerse más información eninternet en la http://www.ua.es/nq/aet/. El GTEMA ofrece incluirgratuitamente en su red a losinvestigadores que lo soliciten,especialmente a los colegas sudameri-canos. Para ello, se ruega enviar unmensaje electrónico solicitándolo alCoordinador del GTEMA, Dr Gui-llermo Repetto, del Instituto Nacionalde Toxicología de Sevilla (E-mail:Repetto@cica.es).

Durante el año 1997 se han celebradolas siguientes reuniones: 1) en mayo,el Seminario sobre "Avances en laAplicación de los Métodos Alternati-vos in vitro en la Evaluación de Me-dicamentos, Cosméticos y ProductosQuímicos", organizado por GTEMA/AET y la empresa Smithkline-Bee-cham. en su Centro de InvestigaciónBásica de Tres Cantos, Madrid; 2 ) enseptiembre, dentro del XII CongresoEspañol de Toxicología, la Mesa Re-donda sobre "Los Métodos In Vitro enla Investigación Básica y Aplicada"; y3 ) en octubre, la "Reunión para elDesarrollo y la Coordinación conECVAM de los Grupos Españoles In-teresados en los Métodos Alternati-vos". Estas reuniones han sido coor-dinadas y moderadas por los Dres.Repetto, coordinador de GTEMA/AET, y de la Peña, coordinador delICLAS Working Group on Comple-mentary Methods; ambos colaboramosen el Seminario Internacional Com-plutense titulado "Uso y Abuso de laExperimentación Animal- Conside-

raciones Eticas" organizada en laUniversidad Complutense de Madridy en la Mesa Redonda celebrada den-tro del I Congreso Ibérico de Conta-minación y Toxicología Ambientales(CICTA), celebrado en Junio enLeioa, en la Universidad del PaisVasco.

Actividades de la JuntaPromotora de REMA

Durante la celebración de la Reuniónpara el Desarrollo y la Coordinacióncon ECVAM de los Grupos EspañolesInteresados en los Métodos Alternati-vos, celebrada en el Centro de GlaxoWellcome S A, el 21 de Octubre de1997, bajo la Presidencia de Honor deSM la Reina, se designó una Comi-sión coordinadora para el desarrollode una Red Española para el desarro-llo de Métodos Alternativos a la Es-perimentación Animal (REMA), queha redactado un documento tras lacelebración de dos reuniones en eneroy abril de 1998. Este ocumento es po-sible consultarlo en Internet(http://toxi.umh.es/aet/rema). Todaslas ideas y sugerencias son bienveni-das, ello permitirá el desarrollo de losmétodos alternativos. Los interesadospueden enviarlas a la Secretaria de laComisión (Sita. Gema M3 Castro, e-mail: gmc@glaxowellcome.co.uk).

Agradecimientos

Queremos expresar nuestro agrade-cimiento a los Directores del V Cursode Introducción a la Experimentación

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y Protección Animal (Facultad de Ve-terinaria. Cursos de Verano. Univer-sidad de León, celebrado del 22 al 26de Septiembre 1997) Dres InmaculadaDiez Prieto y Carlos César PérezGarcía por invitarnos a participar enel mismo, al Prof. Paulino GarcíaPartida por sus comentarios, y a D2.Antonia Martínez López, AyudanteDiplomada de Investigación delCSIC, por su eficaz ayuda.

Repetto M. Toxicologia fundamental. 3a ed.Madrid: Díaz de Santos, 1997.

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