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biotecnologia-ufg-2011
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Aula profª Mara -UFG
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3/3/2010
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Universidade Federal de GoiásInstituto de Ciências BiológicasDepartamento de Morfologia
Disciplina: Biologia Celular
MÉTODOS DE ESTUDO DAS CÉLULAS
Profa. Mara Rubia Marques
2010
MICROSCOPIA
Microscópio é um instrumento que produz imagensampliadas de objetos de tal ordem pequenos que nãopodem ser vistos a olho nu.
Tipos de microscopia:
Microscopia de Luz - o espécime é atravessado por feixes de luz.
Microscopia Eletrônica - o espécime é atravessado por elétrons.
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PODER DE RESOLUÇÃO
0,2 µm
Menor distância entre duas partículas para que sejam vistas como unidades separadas.
3 nm
ML MET
PODER DE RESOLUÇÃO
Célula animal típica: 10 a 20 µm(1/5 da menor partícula visível a olho nu).
1 cm = 10-2 m1 mm = 10-3 m1µm = 10-6 m1 nm = 10-9 m1 Å = 10-10 m
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MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
• Varredura • Transmissão
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA
http://universoemequilibrio.blogspot.com/2009_02_01_archive.html
http://www.ufmt.br/bionet/conteudos/01.09.04/varredura.htm
É uma técnica que permite avisualização das superfícies deespécimes não seccionados. A amostraé fixada, dessecada e revestida com acamada fina de um metal pesado. Amicrografia obtida tem um aspectotridimensional.
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MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
DE TRANSMISSÃO
MICROSCOPIA DELUZ
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1 – Condensadora
2 – Objetiva
3 – Ocular
4 – Fonte luminosa
5 – Platina
6 – Charriot
7 – Macro e micromanipuladores4
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MICROSCÓPIO DE LUZ MODERNO
Várias lentes na objetiva e na ocular
MODALIDADES DE OBSERVAÇÃO NA MICROSCOPIA DE LUZ
1. Campo claro 2. Campo escuro 3. Contraste de fase 4. Contraste interferencial 5. Polarização 6. Fluorescência 7. Microscópio invertido 8. Microscópio estereoscópico (lupa) 9. Confocal a laser
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Campo claro Campo Escuro
A luz atravessa o material analisado. Um sistema especial de condensadorfaz com que a luz fique de tal formainclinada que não atravessa omaterial. Apenas os feixes desviadospelo objeto são observados.
Contraste de fase Contraste Interdiferencial(Normarski)
Anéis na lente condensadora eobjetivas promovem retardo ópticono caminho do feixe luminoso.
Prismas ópticos no caminho da luzmodificam a fase de onda luminosa.
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Polarização
Côndilo mandibular e disco articular. Corante: Picrossírus
Dois filtros (polarizador e analisador) que selecionam apenas um plano de direção de vibração da luz: plano de luz polarizada (PPL).
Fluorescência
Células cancerosas coradas com Orange deacridina.
RNA – vermelhoDNA - amarelo
As substâncias absorvem a luz emum comprimento de onda eemitem luz com comprimentosmaiores.•Fonte luminosa: luz de mercúrio•Filtros: De excitação / barragem.
Componentes autofluorescentes:colageno, lignina, clorofila,elastina.Fluorocromos – permitem
localização de estruturas.
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Confocal a laser
Cortesia de M. F. Santos
Microscópio invertido
O microscópio invertido tem o sistema de iluminação acima do estágio e o sistema de lentesembaixo. Permitem a visualização através de espécimes espessos, como placas de cultivo decélulas, pela proximidade da lente ao fundo da placa.
Sans e Quevedo, 2007
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Microscópio estereoscópico
Observação de objetos opacos por onde a luz não passa, tais como: cristais, fósseis e moedas.
TIPOS DE PREPARO HISTOLÓGICOTIPOS DE PREPARO HISTOLÓGICO
Preparos a fresco (temporário) – vantagens / desvantagens
Preparos permanentes – vantagens / desvantagens.
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1. COLETA DO MATERIAL 2. FIXAÇÃO3. DESIDRATAÇÃO4. DIAFANIZAÇÃO5. INCLUSÃO/EMBEBIÇÃO6. MICROTOMIA7. COLORAÇÃO
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE ESTUDO
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE ESTUDO
http://www.icb.ufmg.br/mor/biocelch/metodos_estudo/Figura%202.jpg
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COLETACOLETA
Tipos de coleta: Biópsia cirúrgica
Biópsia endoscópica
Biópsia por agulha
Cirurgias amplas
Necrópsia
Tamanho do material: A amostra deve ser fragmentada a fim de permitir
a penetração do fixador por toda sua extensão. De 0,5 a 1 cm.
FIXAÇÃO FIXAÇÃO
A fim de conservar as células ou tecidos no estado em que se
encontravam em vida. O volume do fixador deve ser no mínimo 10X o
volume do material fixado.
Qualidades dos fixadores:
1. Alto poder de penetração
2. Manter as características do tecido e conservar os detalhes estruturais
da célula
3. Favorecer a observação das estruturas
4. Conservar ou aumentar a afinidade dos tecidos pelos corantes.
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FIXAÇÃOFIXAÇÃO
• Formol 10% – fixador mais comum na MO.
Tempo de fixação: conforme tamanho e natureza da peça. Em geral de
12 a 24 horas.
PROCESSAMENTO PROCESSAMENTO
Inclusão da amostra em um material que permita a realização de cortes
finos desta amostra. Geralmente em Parafina ou seus derivados.
- Desidratação ( Álcool)
- Diafanização (Xilol)
- Inclusão (parafina líquida a 58-600C)
ÁLCOOL
DESIDRATAÇÃO
XILOL
DIAFANIZAÇÃO
PARAFINA
INCLUSÃO
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MICROTOMIAMICROTOMIA
Micrótomo rotativo tipo Minot Espessura de 3 a 7 µm
CONFECÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOSCONFECÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOS
Distensão do corte em água fria
Distensão do corte em água quente ±400 C
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PROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃOPROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃO
1. DESPARAFINIZAÇÃO: Retirada da parafina do material
•Xilol I ... 20 min
• Xilol II ... 20 min
• Xilol III ... 20min
2. HIDRATAÇÃO
• Álcool a 100% I ... 1 min
• Álcool a 100% II ... 1 min
• Álcool a 100% III ... 1 min
• Álcool a 95% ... 1 min
• Álcool a 70% ... 1 min
• Álcool a 50% ... 1 min
• Dois banhos em água destilada de 05 min cada.
PROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃOPROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃO
3. COLORAÇÃO
Hematoxilina e eosina (HE) é o corante de rotina
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4. MONTAGEM DA LÂMINA
• Álcool a 95% ... 1 min
• Álcool a 100% I ... 1 min
• Álcool a 100% II ... 1 min
• Álcool a 100% III ... 1 min
• Xilol I ... 1 min
• Xilol II ... 1 min
• Xilol III ... 1 min – iniciar a montagem.
• Proteção por Lamínulas de vidro
• Meios de montagem: Bálsamo do canadá, Permount, Entelan
PROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃOPROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃO
CULTURA DE CÉLULAS
Forma de estudo das células mantendo-as isoladas, fora do
organismo de origem, sem perder suas características naturais.
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CULTURA DE CÉLULAS
Cultura primária – tecidos obtidos diretamente do animal e tratados com
enzimas (tripsina) que dissocia as células que serão cultivadas em placas com
meio de cultivo especial.
Cultura secundária – obtida de uma cultura primária tratada enzimaticamente e
cultivada em outra placa.
Linhagem celular – As células podem proliferar indefinidamente devido às
características cancerosas. Linhagens amplamente usadas:
HeLa – obtida a partir de carcinoma humano
L – embrião de rato
3T3 - embrião de rato
BHK – rim de Hamster reçém nascido
CHO – ovário de Hamster adulto
TIPOS DE CULTIVO CELULAR
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CITOQUÍMICA
Usada para identificar, in situ, diferentes compostos químicos das células.
Reações químicas ajudam a mostrar estruturas intracelulares com colorações
específicas. Podem ser usadas amostras frescas.
Colorações mais usadas:
Azul da prússia – identificação de ferro (ferritina/hemossiderina)
Peroxidase – detecção da enzima mieloperoxidase distinção entre células de
origem mielóide e linfóide.
Sudan Black B – revelação de lipídios
Ácido Reativo de Schiff (PAS) – evidenciação de carboidratos
Fosfatase alcalina – neutrófilos maduros, osso, fígado, rins, placenta. Ajuda a
determinar a atividade da célula.
Hemossiderina evidenciada por Azul da Prússia (Pearls)
Células tumorais (*Astrócitos).
http://anatpat.unicamp.br/nptganglioglioma7a.html
Células sanguíneas
Peroxidase evidenciada em neutrófilos
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Leucemia crônica
Lipídios evidenciados por Sudan Black
Glândulas intestinais
Carbohidratos evidenciados por PAS
Osso
Evidenciação de ions cálcio
Músculo esquelético
Evidenciação de mATPase
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http://fotos.sapo.pt/tw3PfHMLey2fi8BjuDAT
Raiz de cebola
Evidenciação DNA por Feulgen
Peciolo de Geranium dissectum
Fluorescência natural da clorofilawww.milcores.pt
Uso de anticorpos acoplados a marcadores visíveis ao microscópio.
• HIQ direta• HIQ indireta
Receptor de laminina
Desmina
IMUNOCITOQUÍMICA
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FRACIONAMENTO CELULAR E
MOLECULAR
Frações:
1. Nuclear – núcleos e citoesqueleto2. Mitocondrial – mitocôndrias, peroxissomos, lisossomos3. Microssômica – RE, CG, membranas4. Solúvel – ribossomos, macromoléculas, vírus
(ultracentrífuga analítica)
ULTRACENTRIFUGAÇÃO ANALÍTICA
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ELETROFORESE
Separação de moléculas por diferençade potencial.
Gel de AgaroseGel de Poliacrilamida
Visualização com brometo de etídio.
CROMATOGRAFIA
Método físico-químico de separação de proteínas.Baseia-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura entre umafase fixa (papel filtro, resinas carregadas, líquido depositado num sólido inerte)e outra móvel (solvente).
Maior quantidade de proteínasMenor pureza
Tipos:Cromatografia de filtração por gelCromatografia de intercâmbio iônicoCromatografia de afinidade.