Metodos IEF

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Fundamentos de Inmunología Básica y ClínicaIván Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Sepúlveda C.,

Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C.Editorial Universidad de Talca, 2002

Capítulo 40

MÉTODOS INMUNOQUÍMICOS

Darwins Castillo A. y Carolina Valenzuela B.

1. Introducción2. Inmunoanálisis

2.1.Inmunoanálisis con reactivos no mar-cados

2.1.1. Reacción de precipitación2.1.1.1. Reacción de precipitación en medio líquidoa) Precipitación en tubo b) Floculaciónc) Turbidimetríad) Nefelometríae) Precipitación de complejos inmu-

nes solubles

2.1.1.2. Reacción de precipitación en gela) Inmunodifusión doble b) Inmunodifusión radialc) Inmunoelectroforesisd) Inmunofijacióne) Contrainmunoelectroforesisf) “Rocket” inmunoelectroforesisg) Inmunoelectroforesis cruzada o

bidimensional de Laurell2.1.2. Reacción de aglutinación

a) Aglutinación directa b) Aglutinación indirecta

c) Aglutinación pasiva2.1.3. Reacción con participación del

complementoa) Fijación del complemento b) Actividad hemolítica del complemento

2.2. Inmunoanálisis con reactivos marcados2.2.1. Inmunoanálisis fluorescente

a) Microscopía inmunofluorescente b)Inmunoanálisis de fluorescencia

polarizadac) Inmunoanálisis de fluorescencia

unida a enzima

d)Citometría de flujo2.2.2. Enzimainmunoanálisis (EIA)a) EIA homogéneo b) EIA heterogéneoc) Electroinmunotransferencia o

“Western blot” o “Immunoblotting”2.2.3. Radioinmunoanálisis (RIA)

a) RIA en fase soluble b)RIA en fase sólidac) Detección inmunorradiométrica

para antígeno2.2.4. Quimiluminiscencia2.2.5. Bioluminiscencia

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RESUMEN

La base de los métodos inmunoquímicos es la unión del antígeno y/o hapteno con el anti-cuerpo, es una reacción específica, de alta afinidad y reversible. Está definida por una constantede equilibrio o de asociación intrínseca (K) que es una medida de fuerza de la interacción de lareacción para formar complejos estables.

Los anticuerpos son proteínas relativamente estables, y sus reacciones con haptenos oantígenos pueden ser estudiados en un amplio rango de condiciones. Las modificaciones en laconstante de asociación inciden en las fuerzas que estabilizan los complejos antígeno-anticuerpo(Ag-Ac). La reacción es dependiente de algunos parámetros como: temperatura, pH y fuerzaiónica del medio que deben considerarse al llevar a cabo un inmunoanálisis.

Los inmunoanálisis pueden ser divididos en métodos que requieren de sistemas Ag-Ac nomarcados y marcados. La mayoría de los inmunoanálisis no marcados se basan en reaccionesinmunes secundarias (precipitación). Los inmunoanálisis marcados se basan en reacciones in-

munes primarias (inmunoanálisis fluorescentes).En el inmunoanálisis con reactivos no marcados, la interacción de antígenos solubles

macromoleculares y anticuerpos específicos llevan a la formación de complejos, que en unarelación molar equivalente precipitan en solución (precipitación). Existe una reacción anómalallamada floculación, en que la precipitación se observa sólo en un rango muy estrecho de la proporción Ag/Ac. La interacción de antígenos particulados con sus anticuerpos específicos pro-ducen aglutinación. La turbidimetría y nefelometría determina niveles de antígeno o de anti-cuerpo en baja concentración, formando pequeños agregados que producen una turbidez que puede ser medida por disminución y dispersión de la luz incidente, respectivamente.

Los métodos de precipitación en gel detectan la presencia y/o concentración de antígenosy/o anticuerpos por la formación de bandas, anillos o arcos de precipitado que corresponden acomplejos antígeno-anticuerpo en la zona de equivalencia (inmunodifusión doble,inmunodifusión radial, inmunoelectroforesis, inmunofijación, contrainmunoelectroforesis,“rocket” inmunoelectroforesis e inmunoelectroforesis cruzada).

El inmunoanálisis con reactivos marcados se clasifica en homogéneo o heterogéneo y puede ser de dos tipos competitivo y no competitivo. El inmunoanálisis fluorescente incluye lamicroscopía inmunofluorescente que corresponde a la tradicional inmunofluorescencia (IF)que es una técnica inmunohistoquímica o inmunocitoquímica que permite la localización deantígenos en células ó tejidos, y la detección y titulación de anticuerpos específicos; elinmunoanálisis de fluorescencia polarizada (FPIA) que es homogéneo y competitivo; elinmunoanálisis de fluorescencia unida a enzima (ELFIA) que es heterogéneo y puede ser competitivo o no competitivo; y la citometría de flujo que permite medir la cantidad de anti-cuerpo monoclonal fluorescente unido en cada célula que atraviesa un láser e identificarla segúnsu tamaño y granularidad de acuerdo a la forma que deflecta o dispersa la luz del láser.

El enzimainmunoanálisis (EIA) se basa en dos fenómenos biológicos: reaccióninmunológica (unión Ag-Ac) y la amplificación por reacciones químicas (enzima que actúa sobre el sustrato). Se dispone de EIA homogéneo representado por el “enzyme-multiplied

immunoassay technique” (EMIT) que además es competitivo y de EIA heterogéneo, como el"enzyme-linked inmunosorbent assay" (ELISA) y el "microparticle enzyme immunoassay"(MEIA) que además son no competitivos. La electroinmunotransferencia combina laelectroforesis en gel SDS-poliacrilaminada y el enzimainmunoanálisis. El radioinmunoanálisis(RIA) utiliza antígeno o anticuerpo, generalmente marcados con isótopos como 125I o, eventual-mente, 131I y este inmunoanálisis puede llevarse a cabo en fase soluble o sólida.

Finalmente existe el inmunoanálisis quimiluminiscente que utiliza la emisión de luz pro-ducida en ciertas reacciones químicas de oxidación, como por ejemplo, la oxidación del luminoly el inmunoanálisis bioluminiscente que se basa en un sistema natural la D-luciferina/luciferasa,en que la luciferasa cataliza la oxidación de la D-luciferina en presencia de ATP y Mg+2 aoxiluciferina, con emisión de luz a 546 nm.

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1. INTRODUCCIÓN

La unión del antígeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) es una reacción fundamental en la meto-dología inmunoquímica. En general, la mayoríade los antígenos son macromoléculas, especial-mente proteínas con una estructura completamenteestablecida en que regularmente no conocemos laidentidad, ni la conformación del determinanteantígénico que reacciona con el anticuerpo, ni elnúmero por molécula de Ag. Para comprender lareacción Ag-Ac y evitar reacciones complicadascon Ags macromoculares, en adelante se van aconsiderar reacciones de Acs específicos con mo-léculas de haptenos (Hp) simples.

La producción de Acs contra Hp se obtienegeneralmente inmunizando animales con el Hp

unido covalentemente a una proteína. La forma-ción de complejos específicos Hp-Ac puede ser examinados en detalle con sistemas relativamen-te simples y los anticuerpos que reaccionan sonfácilmente aislados e identificados.

Como se ha señalado, la base de los métodosinmunoquímicos es la unión del antígeno y/ohapteno con el anticuerpo. Esta reacción se carac-teriza por ser específica, de alta afinidad y rever-sible. Está definida por una constante de equili-

brio o de asociación intrínseca (K) que es unamedida de la fuerza de interacción de la reacción

para formar un complejo estable. k

Hp + Ac [Hp Ac] (1) k'

k [Hp Ac]K= = (2)

k' [Hp] [Ac]

k : constante de asociaciónk': constante de disociación

K representa la afinidad intrínseca de un sitioactivo representativo del anticuerpo por un haptenoo ligando en término de concentración enequilibrio, que puede calcularse midiendo laconcentración de hapteno o ligando libre.

Existen varios métodos para distinguir hapteno libre (Hp) de hapteno unido (Hp-Ac),

como ultracentrifugación, "quenching" fluores-centes, y otros. Pero, el método que se utilizacorrientemente es el equilibrio de diálisis.

En forma práctica, en el laboratorio se calculala constante de asociación intrínseca promedio(Ko) obtenida a través de la ecuación de Scatchard,que se define por la concentración de hapteno oligando libre requerida para ocupar la mitad delos sitios activos o de unión de los anticuerpos.De acuerdo a esta premisa, en la ecuación 2:

[Hp Ac] = [Ac], por lo tanto,

1Ko=

[Hp]

La unidad de Ko es el recíproco de la concentra-ción, es decir, litro/moles.

Los anticuerpos son proteínas relativamenteestables y sus reacciones con haptenos o antígenos

pueden ser estudiados en un amplio rango decondiciones. Las modificaciones que se producenen la constante de asociación inciden en las fuerzasque estabilizan los complejos Ag-Ac. Por lo tanto,las características de la reacción es dependiente

de varios parámetros como: temperatura, pH yfuerza iónica del medio. Por ejemplo, un aumentode la temperatura puede afectar la interacción delanticuerpo con hapteno o antígeno que puededisminuir o no la constante de asociación y, por lotanto, modificar la afinidad. Sin embargo, la

prác ti ca gene ra l es incuba r la mezc la deanticuerpos y antígenos a 37ºC o a temperaturaambiente (aproximadamente 22º C).

La unión del hapteno p-aminobenzoato conel anticuerpo anti-p-aminobenzoato disminuyetanto con la reducción de pH de 7 a 4, como con elaumento de la concentración de cloruro de sodio

(NaC1) desde 0,1 a 1 M. Sin embargo, idénticoscambios no afectan a la unión del hapteno 2,4-dinitroanilina (DNP) a su anticuerpo anti-DNP. Laexplicación se debería probablemente a que elgrupo COO- del benzoato interactúa con un grupocargado positivamente del sitio de combinaciónde los anticuerpos y que en cambio, en el grupoDNP las interacciones iónicas no son importantes

para la unión con el sitio de su anticuerpo.

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2. INMUNOANÁLISIS

Los inmunoanálisis son actualmenteherramientas de amplio uso en los laboratorios

para medir diferentes analitos biológicos, debidoa su facilidad de trabajo, como en la obtención deresultados sensibles y específicos.

Los inmunoanálisis pueden ser divididos enmétodos que requieren de sistemas Ag-Ac nomarcados y marcados. La mayoría de losinmunoanálisis no marcados se basan enreacciones inmunes secundarias, como por ejemplo, precipitación y aglutinación. Se miden

por métodos cuya base es la dispersión de la luz o po r recuen to de pa rt ículas o cé lu la s Losinmunoanálisis marcados se basan en reaccionesinmunes primarias, como por ejemplo, inmunoa-

nálisis fluorescente y enzimainmunoanálisis.

2.1. Inmunoanálisis con reactivos no marcados

La interacción de antígenos solublesmacromoleculares (polivalentes) y anticuerposespecíficos llevan a la formación de complejos

(Ag-Ac) con relación variable de Ag o de Ac, quefrecuentemente llegan a ser insolubles y precipitanen solución. Esta se conoce como reacción deprecipitación que es dependiente de la relaciónmolar Ag y Ac. La formación de complejos dehaptenos o de pequeños antígenos univalente consus anticuerpos son solubles. La interacción deantígenos particulados, como microorganismo océlulas con sus anticuerpos específicos producenla reacción de aglutinación. En la tabla 40-1 semuestran los métodos de inmunoanálisis conreactivos no marcados.

2.1.1. Reacción de precipitación

2.1.1.1. Reacción de precipitación en mediolíquido

a) Precipitación en tubo. La precipitación en tuboes un procedimiento que no se usa corrientementeen el laboratorio, pero que es necesario conocer

para apreciar las características generales de lareacción de anticuerpo con antígeno de alto pesomolecular en medio líquido. En forma práctica se

Tabla 40-1. Inmunoanálisis con reactivos no marcados

Reacción de precipitaciónEn medio líquidoPrecipitación en tuboFloculaciónTurbidimetría

NefelometríaPrecipitación de complejos inmunes solubles

En gelInmunodifusión dobleInmunodifusión radialInmunoelectroforesisInmunofijación

Contrainmunoelectroforesis“Rocket” inmunoelectroforesisInmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell

Reacción de aglutinaciónAglutinación directaAglutinación indirectaAglutinación pasiva

Reacción con participación del complementoFijación del complementoActividad hemolítica del complemento

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realiza en una batería de tubos que contienen unvolumen fijo de antisuero (concentración fija deanticuerpo) a los que se les añade diferentesconcentraciones de antígeno, midiendo la proteínatotal del precipitado formado y detectando elexcedente de Ac o de Ag en el sobrenadante.

Como se muestra en la figura 40-1, a unaconcentración definida de anticuerpos, la cantidadde complejo Ag-Ac precipitado aumenta con lacantidad de antígeno añadido hasta un valor máximo, que sobrepasándolo lleva a unadisminución progresiva de la precipitación. Se

produce precipitación de una cantidad máxima deanticuerpos por una cantidad óptima de antígeno.

Figura 40-1. Curva de precipitación para un complejo específico Ag-Ac.

En la curva de precipitación se encuentra unazona de exceso de anticuerpos, el sobrenadantecontiene anticuerpo libre, una zona de exceso deantígeno, el sobrenadante contiene antígeno librey una zona de equivalencia o punto de equivalen-

cia, el sobrenadante está libre de anticuerpo yantígeno libre.Es importante tener presente que en las zo-

nas de exceso de anticuerpos y de antígenos sedetectan complejos inmunes solubles. En la zonade exceso de antígeno los sobrenadantes contienencomplejos solubles de varias composiciones comoAg4 Ac3, Ag3 Ac2 y Ag2 Ac. En el extremo deesta zona los complejos que principalmente seforman son Ag2 Ac que se atribuye a los dos sitiosactivos o a la divalencia de la molécula de anti-cuerpo IgG. Este fenómeno es explicado de

acuerdo a la teoría del enrejado (“lattice theory”)de Heidelberger, Kendall y Marrack. Ellossugirieron que la precipitación puede ser consecuencia del crecimiento del agregadoantígeno-anticuerpo de tal manera que la moléculadel antígeno se une a más de una molécula deanticuerpo y cada molécula de anticuerpo se unea más de una de antígeno en que participanactivamente interacciones Fc-Fc, de manera quecuando el agregado excede un volumen crítico,

precipita espontáneamente.El precipitado formado puede disociarse y

volver al equilibrio con adición de Ag fresco. Cuandose produce un exceso suficiente se forman pequeños

complejos solubles y el precipitado se solubiliza.

b) Floculación. La floculación es una reacción de precipitación anómala, donde la precipitación seobserva solamente en un rango muy estrecho de la

proporción Ag/Ac. Los agregados insolubles seforman en una relativa gran cantidad de Ag. Estasreacciones se dan sólo con algunos antisueros, como

por ejemplo, sueros de caballos antitoxina diftérica,antitoxina tetánica y antitoxinas estreptocócicas ysuero humano anti-tiroglobulina. Es posible que losantisueros que floculan contengan algunosanticuerpos no precipitantes de alta afinidad quedeben ser previamente saturados con el antígeno.

c) Turbidimetría. La turbidimetría cuantifica lanubosidad o turbidez de una solución en que

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reacciona el antígeno con el anticuerpo en bajaconcentración. El fotodetector está en línea a laluz incidente y la solución, en ángulo de 0° o 180°y mide una disminución de la señal o reducciónen la intensidad de la luz que ocurre comoresultado de la combinación de la reflexión,absorción o dispersión de la luz incidente.

d) Nefelometría. La nefelometria es una técnicaque permite determinar niveles de antígeno o deanticuerpo en soluciones a muy baja concen-tración. La nubosidad o turbidez que producen los

pequeños inmunocomplejos es medida por la luzque se dispersa (“scattered light”), a través de unfotodetector que está en un ángulo diferente a lafuente de luz incidente (30° a 90°). Se puedeobtener una gran sensibilidad usando luz

monocromática de un rayo láser y por adición de polietilenglicol que aumenta el tamaño de losagregados. En el laboratorio clínico se está usandomasivamente por sus ventajas en la cuantificaciónde proteínas, como: rápido, altamente automa-tizado, simple de operar, usa pequeños volúmenesde muestra y reactivo, alta sensibilidad (menor que1 ng/litro) y excelente precisión.

e) Precipitación de complejos inmunes solubles.Existen algunas situaciones que hacen necesario

precipitar complejos inmunes solubles para

identificar el antígeno o determinar el contenido deanticuerpos, que se lleva a cabo modificando lasolubilidad del complejo con polietilenglicol al 2%o sulfato de amonio al 50% o por adición de unreactivo anti-inmunoglobulinas (anticuerpos anti-inmunoglobulinas o proteína A de estafilococo).

2.1.1.2. Reacción de precipitación en gel

Los métodos de precipitación en gel permiten detectar la presencia y/o concentraciónde antígenos y/o anticuerpos presente, por laformación de bandas opacas de precipitado quecorresponden a complejos antígenos-anticuerposen la zona de equivalencia.

a) Inmunodifusión doble. La inmunodifusióndoble fue desarrollada principalmente por Ouchterlony en Suecia. Se basa en la difusión delAg y el Ac en un medio semisólido (gel de agar),formando bandas de precipitación donde losreactantes están en proporciones equivalentes.Estos complejos son insolubles y pueden ser analizados visualmente.

La técnica se basa en preparar un gel uniformede agar en una placa Petri o portaobjeto. En el agar se practica perforaciones de un diámetro y esquema

previamente establecidos. Las soluciones quecontiene el antígeno y el anticuerpo se colocan en

perforaciones adyacentes y se deja difundir hastaformar líneas o bandas de precipitación. Laintensidad, nitidez y posición de estas bandas esdependiente de la concentración del Ag y Ac.

La inmunodifusión doble se utiliza para análisisde antígenos y anticuerpos. Permite determinar larelación inmunoquímica entre dos antígenos a través

de componentes idénticos o de reactividad cruzada.Se distinguen tres patrones de reactividad: reacciónde identidad, de no identidad y de identidad parcialo cruzada (figura 40-2). También, puede utilizarse

para determinar monoespecificidad de un antisueroy para conocer el título de los anticuerpos.

Figura 40-2. Inmunodifusión doble. Reacciones de precipitación en agar que ilustran reacciones de identidad, identidad parcialy no identidad.

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La figura 40-3 muestra la utilidad de lainmunodifusión doble en la detección de antígenos

proteicos en orina.

b) Inmunodifusion radial. La inmunodifusiónradial es una técnica de precipitación en gel, enque el agar se ha mezclado con un antisuero mono-específico sobre un portaobjeto o placa de Petri.Se hacen perforaciones cilíndricas que se llenancon volúmenes fijos de soluciones de referenciade antígeno para el cual el antisuero es específicoy con soluciones o muestras problemas. Ladifusión del Ag en el agar permite la formaciónde anillos de precipitación, cuya área es

proporcional a la concentración inicial del Ag. Altérmino de 16 a 48 horas de difusión en cámara

Figura 40-3. Inmunodifusión doble de una muestra de orina. Se observa un elevado nivel de albúmina y ausencia de IgG, loque indica un posible daño inicial del glomérulo.

húmeda y temperatura constante, se leen losdiámetros del halo de precipitación. Se construyeun gráfico o se obtiene la ecuación de la recta conlas concentraciones de referencias versus área odiámetro del anillo y se interpola la lectura de lamuestra problema.

Este procedimientos ha sido ampliamenteadaptado para medir muchos antígenos, como por ejemplo, inmunoglobulinas en diversos líquidos

biológicos y su sensibilidad puede llegar a 0,1 mg/ml y su coeficiente de variación es menor al 20%(figura 40-4).

c) Inmunoelectroforesis. La inmunoelectroforesis(IEF) desarrollada por Grabar y Williams, es unatécnica cualitativa que permite la identificación

Figura 40-4. Cuantificación de IgG humana por Inmunodifusión radial. Curva de referencia IgG (pocillos 1 al 4) y muestrasde suero de pacientes (pocillos 5 al 8).

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de diferentes antígenos en mezclas complejas, que pueden tener semejante movilidad electroforéticay peso molecular, pero diferentes determinantesantigénicos.

Esta técnica se realiza en geles de agar oagarosa y se distinguen dos etapas: (1) la soluciónde proteínas se somete a separación electroforéticay (2) terminada la electroforesis, las proteínas sonanalizadas con antisueros poli o monoespecíficosen el agar en un canal paralelo al eje de migración.Luego de un período de difusión en cámarahúmeda, se observan arcos de precipitación cuyaforma y posición dependen de las característicasinmunoquímicas y de la concentración de cadaantígeno.

La IEF es de gran utilidad para el análisis eidentificación de componentes monoclonales que

caracterizan las enfermedades asociadas congammapatías monoclonales (figura 40-5).

d) Inmunofijación. La inmunofijación es un procedimiento que utiliza, en una primera etapa,la electroforesis de proteína en gel de agarosa yluego, la inmunoprecipitación. Sobre la placa deagarosa en que se han separado las proteínas por

Figura 40-5. Electroforesis e inmunoelectroforesis del suero de un paciente (p) con gammapatía monoclonal IgG, . Suerocontrol (c), suero anti-IgG (), suero anti IgA humana (), suero anti-IgM humana (m), suero anti-kappa libre humana () y sueroanti-lambda libre humana ().

electroforesis se aplican antisueros monoespe-cíficos y la presencia del antígeno complementarioforma complejos antígeno-anticuerpo que

precipitan. La formación de un precipitado estableantígeno-anticuerpo fija la proteína en el gel(figura 40-6). Se utiliza esencialmente en lacaracterización de inmunoglobulinas mono-clonales.

La inmunofijación y la inmunoelectroforesisson técnicas complementarias en la identificaciónde una gamapatía monoclonal. La inmunofijacióndebiera ser utilizada frente a proteínas anómalasque son difíciles de caracterizar por inmuno-electroforesis.

e) Contrainmunoelectroforesis. La contrain-munoelectroforesis se realiza en gel agar, donde

el pH del tampón de electroforesis permite que elanticuerpo de cargue positivamente y el antígenonegativamente. La sensibilidad del método esaproximadamente 20 veces mayor que la dobledifusión. Actualmente el uso más importante esen el diagnóstico de enfermedades infecciosascuyos antígenos migran hacia el polo positivo enel agar (figura 40-7).

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Figura 40-6. Electroforesis e inmunofijación del suero de un paciente (p) con gammapatía monoclonal IgG, . Suero anti-IgG humana (), suero anti-IgA humana (), suero anti-IgM humana (m), suero anti-kappa libre humana () y suero anti-lamddalibre humana ().

Figura 40-7. Contrainmunoelectroforesis para la determinación de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. Pocillosa: Suero de conejo anti-antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. Pocillos b: Sueros humanos positivos y negativos a

antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.

f) “Rocket” Inmunoelectroforesis. El “rocket”inmunoelectroforesis es la combinación de laelectroforesis y la inmunodifusion radial que han

proporcionado un método rápido para medir concentración de antígenos. El Ag migra por electroforesis (aplicado en un pequeño pozo) en unagar que contiene antisuero (anticuerpos en exceso).El tiempo requerido para la precipitación es de

aproximadamente 2 horas. La altura de la zona de precipitación que tiene la forma de un “rocket” es proporcional a la concentración de antígeno.

El antígeno debe migrar hacia el polo positivoen la electroforesis, por tanto, es conveniente paraalbúmina, transferrina y ceruloplasmina, pero parainmunoglobulina es más conveniente lainmunodifusión radial (figura 40-8).

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g) Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensio-nal de Laurell. La inmunoelectroforesis cruzadarequiere inicialmente la separación electroforéticade una mezcla de antígeno en una dirección per-

pendicular al fenómeno final de precipitación ode etapa “rocket”. Esta es capaz de resolver mezclade antígenos altamente complejas y cuantificar cada uno de ellos (figura 40-9). Por ejemplo, se

ha utilizado para estimar el grado de conversiónde tercer componente del complementario (C3) ala forma inactivada C3c.

Figura 40-8. "Rocket" inmunoelectroforesis para la determinación de albúmina humana. Concentraciones de referencia

de albúmina (pocillos 1 al 3) y muestras de pacientes (pocillos 4 al 7).

2.1.2. Reacción de aglutinación

Los antígenos particulados, como microorga-nismos y suspensiones celulares son corrientementeaglutinados cuando se mezclan con sus antisueros.Los anticuerpos son dirigidos contra determinantesantigénicos de superficie que permiten un adecuadoentrecruzamiento con el Ag particulado permitiendo

la reacción de aglutinación. Los principios de laaglutinación son los mismos descritos para lasreacciones con antígenos solubles.

Las reacciones de aglutinación se utilizan preferentemente para identificar bacteria y tipificar glóbulos rojos, es llevada a cabo, generalmenteen solución fisiológica (NaCl 0,15 M; pH 7,0) yes ampliamente utilizada en determinacionessemicuantitativas.

En las reacciones de aglutinación se debeconsiderar el fenómeno de prozona que consiste enque algunos sueros dan una efectiva reacción deaglutinación solamente cuando están francamente

diluidos. Sueros no diluidos o diluidos levemente noreaccionan visiblemente con el Ag. Actualmente seconoce que en la prozona existen anticuerposabsorbidos en la superficie celular y el fenómeno seexplica por el exceso de anticuerpos y a la presenciade anticuerpos conocidos como bloqueadores oincompletos que corresponden a anticuerposunivalentes (Acs con un solo sitio activo).

a) Aglutinación directa. La aglutinación directase utiliza cuando el antígeno particulado posee

Figura 40-9. Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensionalde Laurell. Primera dimensión. El pocillo contiene suerohumano. Segunda dimensión: el gel de agar contiene unantisuero oligoespecífico. Los precipitados o "rocket"corresponden a las siguientes proteínas: (1) transferrina, (2)alfa 2-macroglobulina, (3) ceruloplasmina, (4) alfa 1-antitripsina, (5) alfa 1-glicoproteína ácida.

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suficientes determinantes antigénicos en susuperficie permitiendo que el antisuero (Ac)correspondiente produzca espontáneamente elfenómeno de aglutinación. Se usa regularmenteen la serotipificación bacteriana.

b) Aglutinación indirecta. La aglutinaciónindirecta se utiliza para células que tienen unnúmero reducido de determinantes antigénicos oque existe una cantidad insuficiente de anticuerposque dificultan el procedimientos de aglutinación,

para lo cual es necesario disponer de otro reactivoque es el anticuerpo anti-inmunoglobulinas. Por ejemplo, determinación del antígeno D (Rh) delos glóbulos rojos.

c) Aglutinación pasiva. La aglutinación pasiva

se utiliza para antígenos solubles que se absorbenen forma covalente a la superficie de las partículas.Se han usado partículas como glóbulos rojos(hemaglutinacion pasiva) o polímeros sintéticostal como el poliestireno o un coloide mineral comola bentonita. La determinación del factor reumatoídeo utiliza partículas de poliestireno deaproximadamente 0.20 a 0.25 mm de diámetrorecubiertas con gammaglobulina humana.

La aglutinación es considerada más sensibleque la precipitación para detectar anticuerpos,debido básicamente a que grandes partículas

cubiertas con Ag sirven para amplificar la reacción.2.1.3. Reacción con participación del com-

plemento

a) Fijación del complemento. La fijación delcomplemento permite detectar anticuerpos por laformación de complejos inmunes que fijancomplemento por la vía clásica y que por unareacción secundaria, lisis de un sistema indicador glóbulos rojos-anti glóbulos rojos permitedeterminar la cantidad de antígeno o de anticuerpo

presente en la reacción.

b) Actividad hemolítica del complemento(CH50). La determinación de la actividadhemolítica del complemento (CH50) permiteconocer la actividad funcional del sistemacomplemento y se basa en determinar la cantidadmínima de suero (complemento) que lisa el 50%de glóbulos rojos indicadores que han sido

previamente sensibilizados en forma óptima con suanticuerpo (hemolisina). La hemólisis se produce

por la activación de la vía clásica del complemento.

2.2. Inmunoanálisis con reactivos marcados

Los inmunoanálisis con reactivos marcadosse clasifican en: homogéneos y heterogéneos yexisten dos tipos básicos: competitivo y nocompetitivo.

El inmunoanálisis homogéneo no requiereseparación física del antígeno unido, del libre.Considera las diferencias fisicoquímicas (tamañoo cambios conformacionales) entre el antígenolibre y el acomplejado al anticuerpo, siendo estehecho el que caracteriza la señal de respuesta. Lasensibilidad puede verse afectada debido a que nohay separación de la muestra del paciente con laseñal de detección final, facilitando interferencias.A veces se recomienda tratamiento previo de la

muestra para eliminar estas interferencias. Suautomatización es fácil y se utiliza preferentementeen la detección de drogas y hormonas.

El inmunoanálisis heterogéneo contempla laseparación del antígeno unido del libre, conside-rando las diferencias físicas, químicas o inmuno-lógicas (tamaño, carga, adsorción a superficiesólida). Permite eliminar la mayoría de las interfe-rencias de la muestra, mejorando la sensibilidadde la determinación. Su automatización es comple-

ja y se aplica en la determinación de anticuerpos

específicos, marcadores tumorales y hormonas.El inmunoanálisis competitivo se basa en lacompetencia entre el antígeno de interés (analito)y una cantidad constante del antígeno similar marcado por una cantidad fija y limitada deanticuerpo específico. En este caso esta marcadoel analito.

El inmunoanálisis no competitivo usa un excesode anticuerpo específico marcado contra elantígeno o analito de interés. En este caso estámarcado el reactivo.

En la tabla 40-2 se muestra los métodosinmunoquímicos que utilizan reactivos marcados.

2.2.1. Inmunoanálisis fluorescente

a) Microscopía inmunofluorescente. Lamicroscopía inmunofluorescente incorpora elconcepto tradicional de inmunofluorescencia (IF)que básicamente es una técnica inmunohisto-química o inmunocitoquímica que permite lalocalización de antígenos en células y tejidos y la

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Tabla 40-2. Inmunoanálisis con reactivos marcados

Inmunoanálisis fluorescenteMicroscopía inmunofluorescente

Inmunofluorescencia directaInmunofluorescencia indirecta

Inmunoanálisis de fluorescencia polarizada (“FPIA”)Inmunoanálisis de fluorescencia unida a enzima (“ELFIA”)Citometría de flujo

Enzimainmunoanálisis (EIA)EIA homogéneo. “EMIT”EIA heterogéneo. “ELISA”, “MEIA”Electroinmunotransferencia o “Western blot” o “Immunoblotting”

Radioinmunoanálisis (RIA)RIA en fase solubleRIA en fase sólidaDetección inmunorradiométrica para antígeno

Quimiluminiscencia

Bioluminiscencia

detección y titulación de anticuerpos específicos.La fluorescencia es un fenómeno producido

por moléculas excitadas que emiten radiación,energía o luz que cesa inmediatamente después

que se retira la luz excitante. Las moléculas quetienen esta característica se llaman fluorocromos.Los fluorocromos o fluoróforos son sustanciascoloreadas que absorben radiación y luego sonexcitadas emitiendo máxima energía a unadeterminada longitud de onda.

Para obtener un máximo rendimiento de laIF es necesario conocer los “peak” de excitacióny de emisión del fluorocromo en uso que permitaseleccionar adecuadamente la fuente de luz y lacombinacion de filtros (primarios y barrera) delmicroscopio de fluorescencia. El “peak” de

excitación es la longitud de onda a la que elfluorocromo absorbe radiación con una máximaeficiencia. El “peak” de emisión es la longitud deonda a la que la energía fluorescente resultante esmáxima.

Los fluorocromos más utilizados son elisotiocianato de fluoresceina (FITC), rodamina By ficoeritrina. Los anticuerpos con uno o dosresiduos de fluorocromo por molécula sonintensamente fluorescentes y mantienen suactividad específica. Existen dos procedimientosde inmunofluorescencia que se utilizan

regularmente en el laboratorio: directa e indirecta.

a.1) Inmunofluorescencia directa (IFD) . La IFDutiliza un anticuerpo específico conjugado con el

fluorocromo que se aplica directamente sobre elsustrato (tejido, célula, u otro) permitiendoidentificar la estructura responsable de laespecificidad. Se utiliza preferentemente paraidentificar microorganismo y tipificar células (por ejemplo: linfocitos).

a.2) Inmunofluorescencia indirecta (IFI). La IFIes una técnica de doble capa, en que un anticuerposno marcado se aplica directamente sobre el sustratoy se visualiza la reactividad con un conjugado anti-inmunoglobulinas-fluorocromo. Se utiliza

preferentemente para la detección de autoanti-cuerpos (figura 40-10).En la inmunofluorescencia se puede aumentar

la sensibilidad con el sistema avidina(estreptavidina)-biotina que tiene una alta afinidad,que utiliza primariamente un conjugadoanticuerpo-biotina y luego conjugado avidina-fluorocromo.

b) Inmunoanálisis de fluorescencia polarizada.El inmunoanálisis de fluorescencia polarizada(“fluorescence polarization immunoassay"; FPIA)

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es un inmunoanálisis homogéneo y competitivoque usa un antígeno marcado con un fluoróforo y

polarizado, y su sistema de detección está basadoen la fluorometría. Es fácilmente automatizado yse utiliza para medir pequeñas moléculas comodrogas y hormonas.

c) Inmunoanálisis de fluorescencia unida aenzima. El inmunoanálisis de fluorescencia unidaa enzima (“enzyme-linked fluorescence immu-

noassays", ELFIA) es un inmunoanálisisheterogéneo y puede ser de tipo competitivo o nocompetitivo, en que el inmunorreactante marcadocon enzima está en combinación con un sustratofluorogénico que permite la detección por fluorometría. El ELFIA está automatizado y es unode los métodos más sensibles hoy en día en ellaboratorio clínico. Utiliza preferentemente comoenzima marcadora fosfatasa alcalina y comosustrato fluorogénico el 4 metil umbeliferona(4MUP).

d) Citometría de flujo. La citometría de flujo permite medir la cantidad de anticuerpo mono-clonal fluorescente unido a cada célula en formaindividual, facilitando la identificación y tipifica-ción de diferentes subgrupos de poblacionescelulares con una extraordinaria sensibilidad,eficiencia y rapidez.

En el citómetro de flujo las células atraviesanun rayo láser y son analizadas individualmente.Las células deflectan o dispersan la luz de un láser de una forma estrechamente relacionada con sutamaño y granularidad que es registrada en un

Figura 40-10. Detección de anticuerpos antinucleares porinmunofluorescencia indirecta. Se usa células HEp-2. En estecaso se observa un patrón homogéneo.

detector (ver capítulo 43). La molécula defluorocromo unida al anticuerpo monoclonalabsorbe luz del rayo láser y emite luz en otralongitud de onda, en que su intensidad es captada

por otro detector que está en ángulo recto al rayo.Ambos fenómenos facilitan la correctaidentificación de las poblaciones celulares.

2.2.2. Enzimainmunoanálisis

El enzimainmunoanálisis (EIA) ha reempla-zado a muchas técnicas tradicionales en eldiagnóstico clínico e investigación biológica desdeque se introdujo en 1966 por Avrameas y Uriel.Este método se basa en dos fenómenos biológicos:alta especificidad del anticuerpo por un antígeno(reacción inmunológica) y la amplificación por

reacciones químicas llevadas a cabo por enzimasque actúan sobre sustratos que originan productoscoloreados (reacción indicadora).

La técnica de EIA es utilizada rutinariamente para localización de antígeno o anticuerpo sobretejidos o células, para la detección de antígeno oanticuerpos inmovilizados en una fase sólida, parala titulación de anticuerpo y para la medición deantígeno. Los antígenos pueden ser medidos por

procedimientos inmunoenzimáticos homogéneoso heterogéneos.

Las enzimas que se utilizan corrientemente

para marcar anticuerpo o antígeno son: fosfatasaalcalina, cuyo sustrato es el p-nitrofenil-fosfato yla lectura de absorbancia se lleva a cabo a 405nm; peroxidasa que puede utilizar tres sustratosdiferentes: o-fenilendiamina (oPD)/H

20

2; 3,3',5,5'-

tetrametilbenzidina (TMB)/H20

2 y 2,2'-di-azino(3-

etilbenzotiazolina 6-ácido sulfónico (ABTS)/H20

2

con lecturas de densidad óptica a 492, 450 y 415nm respectivamente y beta-galactosidasa, cuyosustrato es el o-nitrofenil-beta-D-galactopira-nósido (oNPG) y la lectura se realiza 420 nm.

En los EIA automatizados se usa corriente-mente la fosfatasa alcalina como enzima marca-

dora y como sustrato el 4-metilumbeliferil fosfato(MUP). El MUP es catalizado a un productofluorescente (metilumbeliferona) que es medido

por fluorometría.El EIA, también puede ser amplificado

utilizando la interaccion avidina (estreptavidina)- biotina. Se utiliza los conjugados anticuerpos- biotina y avidina-enzima.

a) EIA homogéneo. El “enzyme-multiplied im-munoassay technique” (EMIT) es un EIA

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homogéneo y competitivo que usa una enzimamarcadora y el sistema de detección esespectrofotométrico. La enzima marcadora esunida covalentemente al antígeno en una posicióncercana al sitio activo de la enzima. Durante lareacción inmunológica, cuando el antígenomarcado con la enzima se une al anticuerpo, elsitio activo de la enzima es bloqueado físicamentey la enzima es inhibida funcionalmente. En laforma libre del antígeno marcado con la enzima,la enzima permanece activa funcionalmente yactuará sobre el sustrato que se añade generandoun producto coloreado. El cambio de color resultante es proporcional a la cantidad de antígenomarcado libre disponible y debido a la naturalezacompetitiva del inmunoanálisis, será proporcionala la cantidad de analito (antígeno) presente en la

muestra. El EMIT se ha automatizado fácilmentey es usado principalmente en la detección dedrogas.

b) EIA heterogéneo. Los procedimientos EIAheterogéneos son en general más sensibles que loshomogéneos.

El "enzyme-linked inmunosorbent assay"(ELISA) se realiza sobre una fase sólida (placasde poliestireno u otro similar) y es un EIAheterogéneo, no competitivo y su detección

preferentemente es por espectrofotometría (figura

40-11). Es ampliamente utilizado en el laboratorioclínico en la detección y medición de autoan-ticuerpos y varias otras proteínas. Existe unavariedad que se realiza sobre papel de nitrocelulosaque se ha llamado inmunofijacion en punto o"immuno blot, "dotimmunobinding" o "dot"(figura 40-12).

El "microparticle enzyme immunoassay"(MEIA) es un método heterogéneo, no competitivoy de tipo “sandwich”. Utiliza una enzimamarcadora y el sistema de detección es por fluorometría o espectrofotometría. Incorporamicropartículas que permiten aumentar el área en

la cual ocurre la reacción antígeno-anticuerpofacilitando la cinética de la reacción ydisminuyendo el tiempo de incubación. Ha sidoautomatizado permitiendo cuantificar una grancantidad de moléculas, incluyendo hormonas ymarcadores tumorales.

c) Electroinmunotransferencia ("Western blot"o "Immunoblotting"). La electroinmuno-transferencia combina la electroforesis en gel SDS-

poliacrilamida y la alta sensibilidad del enzi-

Figura 40-11. Esquema de enzimainmunoanálisis en fasesólida (ELISA) para detección y cuantificación de

anticuerpos específicos. En el esquema el antígeno se ha unidoa un soporte sólido; luego el anticuerpo (Ac primario) a pesquisar (suero del paciente) reconoce el antígeno. Posteriormente elconjugado anticuerpo secundario-enzima se une al Ac primario,evento que es reconocido con la adición del sustrato quecatalizado por la enzima forma productos coloreados cuyadensidad óptica se lee a una determinada longitud de onda.

Figura 40-12. Inmunodifusión en punto o "dotimmunobinding". Enzimainmunoanálisis sobre papel denitrocelulosa para detección de anticuerpos específicos. Los puntos coloreados indican positividad.

mainmunoanálisis para originar una poderosaherramienta que permite estudiar cualitativa ycuantitativamente las reacciones antígeno-anticuerpo. Los antígenos son separados en gelSDS-poliacrilamida y transferidos a una mem-

brana de nitrocelulosa uniéndose inespecífica-mente e identificados con procedimientosinmunoenzimáticos. Debido a que existe un

proceso de denaturación de los antígenos por los

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detergentes utilizados se recomienda utilizar antisueros policlonales en el análisis ("blotting")

para aumentar la probabilidad de detectar epítoposo determinantes antigénicos que no se han alterado

por la denaturación.La electroinmunotransferencia se utiliza en

el diagnóstico viral (confirmacion de anticuerposanti-HIV), tipificación de bacterias ( Neisseriameningitidis), detección de autoanticuerpos(anticuerpos anti-antígenos nucleares extrac-tables), etc.

2.2.3. Radioinmunoanálisis

El radioinmunoanálisis (RIA) utiliza antígenoo anticuerpo generalmente marcados con isótoposcomo, 125I o eventualmente 131I. Este inmunoa-

nálisis puede llevarse a cabo en fase soluble osólida.

a) RIA en fase soluble. El RIA en fase soluble permite determinar la capacidad de unión de unanticuerpo, por adición de un moderado excesode antígeno marcado a un antisuero, losanticuerpos forman complejos solubles y se

precipitan por los procedimientos ya indicados.En el precipitado se mide la radiactividad dandouna estimación de la capacidad de unión delanticuerpo específico por su antígeno. Este

inmunoanálisis en fase soluble, también permitedeterminar antígeno (RIA clásico) por adición deun antígeno marcado a una cantidad fija y limitadade anticuerpo, cuya unión puede ser parcialmenteinhibida por la adición de antígeno no marcado.La extensión de esta inhibición puede ser usadacomo una medida del antígeno no marcado. Sedebe realizar la medición de la radiactividad delantígeno radiomarcado libre, que debe estar separado de los otros constituyentes del sistema.

b) RIA en fase sólida. El RIA en fase sólida permite medir un anticuerpo a través de su

capacidad de unión al antígeno que ha sidoinsolubilizado por adsorción física a un soporte

plástico. La inmunoglobulina unida puede ser estimada por la adición de un anticuerpo anti-inmunoglobulinas radiomarcada producida en otraespecie. Este procedimiento se ha utilizado en la

prueba RAST ("radioallergosorbent test") para ladeterminación de IgE específica en pacientesalérgicos. En este caso, el alergeno escovalentemente unido a un soporte y que luego esincubado con el suero del paciente. La cantidad

de IgE específica unida al soporte es estimada por la adición de un anticuerpo anti-IgE radiomarcado.

c) Detección inmunorradiométrica paraantígenos. En las pruebas inmunorradiométricasel reactivo marcado es utilizado en exceso. Parala determinación de antígeno, los anticuerpos estánabsorbidos sobre un soporte sólido al que se leagrega la solución de antígeno. Luego el soportees lavado y la cantidad de antígeno unido puedeser estimado por la adición en exceso de unanticuerpo radiomarcado. La prueba muestra unamayor especificidad cuando los anticuerposutilizados reconocen diferentes epítopos delantígeno. La aplicación clásica de esta prueba esel RIST ("radioimmunosorbent test") para ladeterminación de IgE total, donde el anticuerpo

anti-IgE se ha unido covalentemente amicrocristales de celulosa y se le adiciona el suerodel paciente y los sueros controles. La IgE totalunida es medida por la adición de un anticuerpoanti-IgE radiomarcado.

2.2.4. Quimiluminiscencia

La quimiluminiscencia es la emisión de luz producida en ciertas reacciones químicas deoxidación. La mayoria de las reaccionesquimiluminiscente son de oxidación debido a que

la producción de luz visible requiere reaccionesaltamente energéticas. La reacción quimilumi-niscente más estudiada ha sido la oxidación delluminol. Los marcadores más populares son losderivados de isoluminol y ésteres de acridina. Paradetectar un marcado quimiluminiscente se usa unaamplia variedad de luminómetros que miden laemisión de luz.

En este último tiempo se está usando comomarcador la fosfatasa alcalina que reacciona consustratos basados en el adamantil 1,2-dioxetanoaril fosfato, que los desfoforila para producir unfenóxido intermediario y éste al descomponerse

produce emisión de luz a 470 nm. Actualmente,los inmunoanálisis quimiluminiscentes sonutilizados por varios analizadores automatizados.En ellos se determinan drogas, hormonas,marcadores tumorales y otras proteínas.

2.2.5. Bioluminiscencia

La bioluminiscencia es un fenómeno natural quese encuentra en muchas formas inferiores de vida.Un sistema natural es la D-luciferina/luciferasa,

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en que la luciferasa cataliza la oxidación de la D-luciferina en presencia de ATP y Mg +2 aoxiluciferina, con emisión de luz a 546 nm. Enlos inmunoanálisis bioluminiscentes se estáutilizando conjugado anticuerpo-fosfatasa alcalinao conjugado analito-fosfatasa alcalina quereacciona con la D-luciferina-o-fosfato liberandoD-luciferina. La D-luciferina es oxidada por laluciferasa con emisión de luz. Aún no estádisponible inmunoanálisis bioluminiscente paraaplicación rutinaria en el laboratorio.

LECTURAS SUGERIDAS

Avrameas, S., “Amplification systems inimmunoenzymatic techniques”, J Immunol. Meth.,

150: 23-32, 1992.

Chan, D. and Sokoll, L., “Immunoassays automa-tion at the millenium”, Editorial, J. Clin. Ligand

Assay , 22(1), 1999.

Diamandis, E. and Christopoulos, T., Immunoas-say, Academic Press. U.S.A.,1996.

Eisen, H., Immunology, Harper and Row Pub-lishers, U.S.A., capítulo 16, pp. 297-336, 1980.

Kemeny, D., “Titration of antibodies”, J. Immunol Meth., 150: 50 76, 1992.

MacCrindle, C., Schwenzer, K. and Jolley, M.,“Particle concentration fluorescence immunoas-say: A new immunoassay technique for quantifi-cation of human immunoglobulins in serum”, Clin.Chem., 31/9:1487-1490, 1985.

Porstmann, T. and Kiessig, A., “Enzymes immu-noassay techniques. An overview”, J. Immunol.

Meth., 150: 5-21, 1992.

Roitt, I., Essential Immunology, chapter 5,Blackwell Scientific Publications, London, 1991.

Slagle, K. and Ghosn, S., “Immunoassays. Toolsfor sensitive, specific and accurate test results”,

Lab. Medicine, 27: 177-183. 1996.

Volland, H.; Vulliez Le Normand, B.; Mamas, S.;Grassi, J.; Créminon, C.; Ezan, E. and Pradelles,P., “Enzyme immunometric assay for leukotrieneC4”, J. Immunol. Meth., 175: 97, 1994.

Wild, D., The Immunoassay Handbook ,Segunda Edición, CPL Scientific Publishing,Hardback, U.S.A., 2000.

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Fundamentos de Inmunología Básica y ClínicaIván Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Sepúlveda C.,

Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C.Editorial Universidad de Talca, 2002

Capítulo 41

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAINMUNIDAD CELULAR

Jorge González C. y Pilar Vega C

1. Introducción2. Preparación y aislamiento de dife-

rentes poblaciones celulares2.1. Métodos de purificación tradicio-

nales2.2. Separación inmunomagnética

3. Estudio de la respuesta inmune ce-lular específica3.1. Estudio de las subpoblaciones de

linfocitos3.2. Estudio de las funciones de inmu-

nidad celular específica3.3. Estudio de la síntesis de citoqui-

nas y sus receptores3.4. “DNA microarrays”3.5. Pruebas para evaluar reacciones

de hipersensibilidad retardada(RHR)

3.6. Estudios de la especificidad decélulas T

3.7. Detección de células T precursoras

4. Estudio de la inmunidad celularinespecífica4.1. Ensayos funcionales de neutró-

filos4.2. Ensayos funcionales de eosinó-

filos4.3. Ensayos funcionales de monoci-

tos y macrófagos5. Evaluación de laboratorios del pa-

ciente infectado con el virus de lainmunodeficiencia humana. Un mo-

delo del estudio de las deficienciasen la respuesta celular5.1. Estudio fenotípico de linfocitos5.2. Estudio de la respuesta prolife-

rativa5.3. Estudio de la respuesta citotóxica5.4. Evaluación de los niveles de

citoquinas y subpoblaciones delinfocitos T

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RESUMEN

La respuesta inmune celular del hombre debe ser evaluada mediante pruebas de laborato-rio, no sólo frente a la sospecha de estados inmunes alterados, sino también frente a tratamientoscon modificadores biológicos de la respuesta y en eventuales estudios de vacunación. Frente acualquiera de estas situaciones, la respuesta inmune celular puede ser evaluada tanto in vivocomo in vitro. Las respuestas in vivo, se evalúan únicamente mediante pruebas cutáneas, llama-das reacciones de hipersensibilidad.

Por otro lado, un vasto arsenal de pruebas in vitro, están disponibles, para evaluar la respuesta celular y la factibilidad de su uso dependen tanto del nivel de equipamiento de cadalaboratorio como de la formación de sus recursos humanos. No obstante, de manera generalningún ensayo aislado es suficiente para un adecuado diagnóstico; una visión adecuada delfuncionamiento de la respuesta celular puede obtenerse por la combinación e interpretación devarios métodos y parámetros.

Especial cuidado debe tenerse en el análisis, manejo e interpretación de los resultados.Debe considerarse que los resultados obtenidos podrían variar dependiendo de la metodologíaempleada, del background genético de los diferentes individuos e incluso dentro de un mismoindividuo. Por ello resulta de especial valor que cada laboratorio determine y maneje con propie-dad los parámetros normales para cada prueba, pudiendo así acceder a interpretacioneslaboratoriales más adecuadas.

El desarrollo de ensayos sensibles para analizar la respuesta inmune celular tanto en elhombre como en modelos experimentales ha llevado a importantes descubrimientos tanto eninmunología básica como clínica.

En el futuro, el empleo de métodos más sensibles y específicos, sumados a la utilización detecnologías emergentes como los “DNA microarrays” y el estudio de proteínas (proteomica), permitirá mejorar el diagnóstico y el pronóstico de las diferentes enfermedades infecciosas y de base inmunólogica

1. INTRODUCCIÓN

La rama celular de la respuesta inmune, con-fiere inmunidad mediante la generación de célu-las efectoras. Aunque en estos mecanismos, pue-den además participar tanto anticuerpos como fac-tores del complemento, éstos juegan un papel se-

cundario. Por ello, tanto células específicas comono específicas estimuladas para un mismo antígenocontribuyen a la respuesta inmune mediada por células.

Las células específicas, corresponden a lasdiferentes subpoblaciones de linfocitos T CD4+ yCD8+, mientras que en las células no específicasse incluye a macrófagos, neutrófilos, eosinófilosy células "natural killer" (NK). No obstante, laactividad de ambos tipos de células depende delas concentraciones locales de citoquinas, que sonmediadores solubles secretados por diferentes

poblaciones celulares. De esta forma, mientras larespuesta humoral, permite controlar y eliminar microorganismos extracelulares y neutralizar sus

productos, la respuesta celular es responsable delcontrol de microorganismos intracelulares, la des-trucción de células infectadas por virus, célulastumorales y el rechazo a injertos. De esta forma

se puede afirmar que la respuesta celular está adap-tada para reconocer y eliminar células alteradas,sean éstas infectadas por patógenos intracelulareso que expresen antígenos tumorales.

La importancia de la inmunidad mediada por células, resulta evidente cuando el sistema es de-fectuoso. Por ejemplo, en niños con síndrome deDi George, quienes nacen sin timo y por ende sondeficientes en células T, generalmente controlan

pa tógenos ex tracelul ares , pe ro no as í lo sintracelulares (ver capítulo 29). Esta falla funcio-nal en la respuesta inmune mediada por células,

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resulta en infecciones a repetición por diferentes patógenos intracelulares, donde incluso vacunasatenuadas pueden producir estados infecciosos.

La evaluación de la respuesta inmune celular permite, en pacientes, conocer de manera cualitati-va y cuantitativa la funcionalidad de células y me-diadores de esta rama de la respuesta inmune, demanera de determinar en correlación con los ante-cedentes clínicos, el estado inmune del paciente.La detección de estados alterados puede corres-

ponder a las llamadas inmunodeficiencias las cua-les pueden ser congénitas o adquiridas (ver capítu-los 29 y 30). Por otro lado, también se consideranestados de inmunidad alterada la reactividad con-tra antígenos propios conocida como autoin-munidad (ver capítulo 23) y la hiperreactividad pro-

pia de la alergia (ver capítulo 22).

De igual forma, el monitoreo de los nivelesde productos de la función celular como citoquinasy monoquinas, puede ser de utilidad clínica en es-tudios frente a modificadores de la respuesta bio-lógica (MRB). En el ámbito de la investigación

biomédica, ya sea en modelos animales, como en personas, permite conocer y definir de maneraexperimental las características de la respuestainmune celular posibilitando la identificación deantígenos protectores tanto frente a patógenoscomo frente a tumores, en eventuales estudios devacunación.

En este capítulo se describe los principalesmétodos diagnósticos que permiten evaluar el es-tado de la rama celular de la respuesta inmune.Muchas de las pruebas que permiten la evalua-ción de la respuesta inmune celular han sido utili-zadas por muchos años. Otras son de incorpora-ción más reciente al arsenal de pruebas de labora-torio. Algunas de ellas son de reciente aplicaciónen el ámbito de la inmunología y aunque no siem-

pre podrían ser factibles de aplicar de maneramasiva en los laboratorios, es necesario conocer la existencia de ellas y sus posibles proyecciones.

2. PREPARACIÓN Y AISLAMIENTO DEDIFERENTES POBLACIONES CELU-LARES

El estudio de la respuesta inmune celular re-quiere, en algunos casos, disponer de poblacionescelulares puras o enriquecidas que permitan la eva-luación de diferentes parámetros. Se puede utili-zar métodos de purificación tradicionales y basa-dos en separación inmunomagnética.

2.1. Métodos de purificación tradicionales

Utilizan soluciones de ficoll-hipaque o percoll en diferentes densidades, las que median-te centrifugación permiten la separación de las di-ferentes poblaciones celulares, basándose en susdiferencias de tamaño y densidad.

2.1.1. Separación de linfocitos

Para ello la sangre total es diluida en buffer fosfato salino en proporción 1:1, depositándolasobre ficoll-hipaque a densidad de 1,077. Luegode centrifugar, en la interfase entre el plasma di-luido y la solución de ficoll, se forma un anillo

blanco rico en leucocitos, mientras que en el pelletse encuentran los eritrocitos y los polimor-

fonucleares (PMN).

2.1.2. Separación de polimorfonucleares ylinfocitos

La sangre heparinizada se mezcla con unasolución de dextrano al 6% y se deja sedimentar atemperatura ambiente. De esta manera, se obtieneun plasma rico en PMN, monocitos y linfocitos

pero libre de eritrocitos (figura 41-1).

2.1.3. Separación de linfocitos y PMN

Una buena separación de linfocitos y PMNse consigue a partir del plasma obtenido por sedi-mentación con dextrano al 6%. Esta se obtienemediante centrifugación diferencial sobre ficoll-hipaque con densidad 1,077, observándose en lainterfase un anillo blanco que contiene loslinfocitos mientras que el pellet contiene loseritrocitos (figura 41-1).

En todos los casos los procedimientos de pu-rificación deben ser monitoreados mediante frotisy evaluación morfológica de las células recupera-das. La confirmación del tipo celular recuperado

se puede realizar mediante inmunofluorescenciautilizando anticuerpos monoclonales contra mar-cadores de superficie. El control de la viabilidadde estas células debe realizarse mediante pruebasde exclusión con azul tripan, o mediante métodosfluorescentes utilizando ésteres de acetoxymetilcalceína (calceína-AM).

2.1.4. Aislamiento de monocitos humanos

Gradientes de ficoll-hipaque han sido

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Figura 41-1. Separación de PMN y linfocitos. Utilizando dextrano 6% se pueden separar los PMN y linfocitos de los glóbulosrojos y a la vez los dos primeros se pueden separar usando ficoll hipaque 1.077 o bien una gradiente doble de ficoll hipaque.

rutinariamente utilizadas para inicialmente aislar células mononucleares, de las cuales entre 10-20%corresponden a monocitos. Para aislar losmonocitos, se usa su capacidad de adherir al plás-tico, luego de incubación por 1 h a 37 °C. El pro-cedimiento de aislamiento se desarrolla en esteri-lidad, a temperatura ambiente, utilizando mediosy material de vidrio o plástico que estén libres deendotoxinas, debido a que endotoxinas bacterianascomo el lipopolisacárido (LPS) son potentesactivadores de monocitos y macrófagos.

2.1.5. Aislamiento de eosinófilos

El bajo número de eosinófilos en sangre periférica de individuos normales ha hecho relati-vamente difícil obtener preparaciones en númeroy pureza apropiadas para estudios funcionales.Para ello, protocolos basados en la separación deeosinófilos de neutrófilos la principal célula con-taminante, mediante densidad han sido utilizados

por largo tiempo. Estas técnicas resultan en célu-las de alta viabilidad, no obstante posean bajorendimiento y grados de pureza variable. Más aúnla mayoría de los eosinófilos son de alta densidad(1095-1100 g/mL), por lo que presumiblementerepresentarían poblaciones no activadas. Recien-temente, se ha introducido la selección negativa,

basada en la remoción de neutrófilos por mediode separación celular magnética usando perlasrecubiertas de anticuerpo monoclonal anti-CD16.Este método aumenta la recuperación y pureza delos eosinófilos con respecto a las técnicas que uti-lizan gradiente de densidad. No obstante, estas pre-

paraciones difieren de las obtenidas por gradiente,ya que contienen además los eosinófilos

hipodensos. Debe tenerse en mente que diferen-cias funcionales han sido observadas dependien-tes del método utilizado en la purificación. Apa-rentemente, eosinófilos purificados mediante se-

paración celular magnética son menos respon-dedores a lípidos quimiotácticos que las célulasobtenidas por gradiente.

2.1.6. Aislamiento de basófilos

Los basófilos son los leucocitos de menor abundancia en sangre humana y por ende su puri-

ficación es relativamente difícil. Los procedimien-tos basados en centrifugación por gradiente per-miten enriquecer las preparaciones de basófiloshasta en un 50%, pero contienen una significativacontaminación con otros tipos celulares especial-mente linfocitos. Durante cualquier procedimien-to de enriquecimiento deberá tenerse presente en

prevenir su estimulación y degranulación.

2.2. Separación celular inmunomagnética

Recientemente han sido utilizadas técnicas basadas en la separación inmunomagnética deneutrófilos, usando perlas magnéticas recubiertasde anticuerpo monoclonal anti-CD16. Aunque elmarcador CD16 no es exclusivamente expresado

por neutrófilos (también está presente en algunoseosinófilos y en algunas células mieloides precur-soras), el aislamiento inmunomagnético a partir de sangre periférica permite obtener preparacio-nes enriquecidas de neutrófilos con más de 99%de pureza (figura 41-2). De igual manera, usando

perlas sensibilizadas con anticuerpos anti-CD14es posible separar monocitos humanos, mientras

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que perlas magnéticas con anticuerpos CD4 y CD8 permiten separar estas poblaciones linfocitarias.

3. ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNECELULAR ESPECÍFICA

La evaluación de la respuesta inmune celu-lar específica, requiere conocer tanto el númerode células como su capacidad funcional. De igualmanera, hoy es necesario conocer su capacidad

Figura 41-2. Separación inmunomagnética de neutrófilos,utilizando anticuerpo monoclonal CD16 unido a partículasmagnéticas.

para secretar algunos mediadores biológicos comoson las citoquinas. Entonces, es necesario cono-cer los niveles de linfocitos T (LT), tanto CD4+como CD8+ y sus propiedades funcionales eva-luando las principales citoquinas secretadas por éstos. De igual manera es importante ensayar tan-to la especificidad de estos linfocitos, basándoseen aspectos estructurales, como también detectar células T precursoras en poblaciones que prolife-ran en respuesta a un antígeno. En todos los ca-sos, la hipótesis diagnóstica permite orientar la in-vestigación de laboratorio, así como los resulta-dos del laboratorio deben ser interpretados a laluz de los hallazgos clínicos.

3.1. Estudio de las subpoblaciones de linfocitos

El estudio de la competencia celular debe co-menzar por determinar los niveles de las célulasque participan en esta respuesta. Por ello, el nú-mero y capacidad funcional de los leucocitos cir-culantes en sangre periférica refleja el estado ge-neral de competencia inmune de un determinadoindividuo. De esta manera en una variedad de si-tuaciones clínicas, la evaluación del número y fun-ción de linfocitos, granulocitos y monocitos hancomenzado a ser rutinarias tanto en el diagnósticode diferentes patologías como en el monitoreo detratamientos con inmunosupresores o inmuno-

rrestauradores.Inicialmente, la determinación en el labora-torio de linfocitos T y B, se realizó, mediante lautilización de eritrocitos de cordero y la forma-ción de rosetas. Los linfocitos T poseen la capaci-dad de unirse a los eritrocitos de cordero, forman-do un complejo en el que estas células están ro-deadas de eritrocitos, de manera semejante a unaflor, denominada roseta E (eritrocito). La evalua-ción de rosetas se realiza mediante lectura micros-cópica. De igual manera, linfocitos B, polimor-fonucleares y macrófagos poseen receptores desuperficie para fragmentos Fc de IgG y para com-

plemento. Por ello, en presencia de anticuerpos yel factor C3b del complemento, forman las rosetasEAC (eritrocito, anticuerpo-complemento), lascuales son también evaluadas mediante micros-copía óptica (figura 41-3).

3.1.1. Determinación del fenotipo inmunológicomediante citometría de flujo

En los últimos años, el uso de las pruebas decitometría de flujo (ver capítulo 42) en la deter-

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Figura 41-3. Determinación de linfocitos por formación de Rosetas E y Rosetas EAC . La roseta E se produce por unión delglóbulo rojo al receptor CD2 del LT. La roseta EAC se produce por interconexión entre el receptor para C3b del LB y la unión deC3B al fragmento Fc de IgG. También pueden haber uniones de Fc al receptor que tiene LB humano.

minación de las diferentes subpoblaciones delinfocitos, se ha transformado en un importantemétodo tanto en el diagnóstico como en el pro-nóstico de varias entidades clínicas, incluyendola evaluación de las inmunodeficiencias y los des-órdenes inmunológicos.

La citometría de flujo, permite la enumera-ción de diferentes tipos de linfocitos, los cualesdifieren en sus propiedades funcionales, su linaje

y su estado de maduración. Entonces mediante estatécnica es posible determinar los diferentes tiposde linfocitos mediante el uso de anticuerposmonoclonales marcados con substanciasfluorescentes, que reconocen sus marcadores desuperficie (figura 41-4). Desde la invención delos anticuerpos monoclonales, miles de ellos hansido generados contra determinantes de superfi-cie de células hematopoyéticas. Inicialmente, gru-

pos de estos anticuerpos que demostraron propiedades semejantes en cuanto a su ligación y dis-tribución tisular fueron designados como "clusters

differentiation" o antígenos CD (ver capítulo 45).La identificación de estos CD en la superfi-cie celular de los linfocitos, mediante anticuerposmonoclonales, ha sido esencial en delinear loscomponentes del sistema inmune. Estosanticuerpos son ahora rutinariamente usados enla identificación, recuento y separación de dife-rentes subpoblaciones de leucocitos y en la clasi-ficación de afecciones malignas de estosleucocitos.

Los anticuerpos monoclonales usados parareconocer LT totales están dirigidos contra los

antígenos CD45 y CD3, mientras que lassubpoblaciones de LT “helper” son reconocidos

por los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4. Lassubpoblaciones de LT citotóxicos y supresores sedefinen con los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD8,mientras que los linfocitos B presentan el marca-dor CD19. Por otro lado, las células NK, se defi-nen por el fenotipo CD3-, CD16+ o CD56+. Noes posible identificar células NK mediante un úni-

co antígeno, no obstante, el fenotipo CD3-/CD56+,incluye la mayoría de las células NK. Por ello serequiere marcación con dos fluorocromos, siendoque existe un porcentaje de LT que son CD3+/CD56+. En esta perspectiva, el uso de anti-CD3marcado con fluoresceína y anti-CD16 y anti-CD56 marcados con otro fluorocromo (ficoeritrinao texas red) es recomendable para determinar endefinitiva el fenotipo de las células NK.

3.1.2. Determinación de subpoblaciones delinfocitos mediante inmunofluorescencia

La determinación de subpoblacioneslinfocitarias, es también posible mediantemicroscopía de fluorescencia utilizandoanticuerpos anti-CD, marcados con compuestosfluorescentes. Para ello, luego de purificar loslinfocitos, se confecciona un frotis con las célulasfijadas, las que se incuban con los respectivosanticuerpos. Al microscopio, se cuentan a lo me-nos 250 células, determinando su fenotipo, me-diante la marcación del anticuerpo. Este método

permite calcular el porcentaje de un determinado

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fenotipo. Mediante un procedimiento un tanto mássofisticado, como es la microscopía confocal, estambién posible utilizar dos o tres diferentesanticuerpos marcados con diferentes fluoro-cromos.

3.2. Estudio de las funciones de inmunidad ce-lular específica

Es aceptado que las características fenotípicasde las células del sistema inmune no proveen in-formación sobre su actividad. Por ello, aunque elanálisis funcional es algo más complejo por re-querir experiencia y adecuados controles de cali-

dad para así lograr una apropiada interpretaciónde los resultados, resulta importante evaluar estos

parámetros funcionales. La importancia del aná-lisis funcional resalta porque cada vez son másfrecuentes sus aplicaciones en el diagnóstico ymonitoreo de pacientes con síndrome deinmunodeficiencia adquirida (SIDA), cáncer, en-fermedades autoinmunes y en casos de pacientesque requieren trasplantes de órganos. De igualmanera, el uso de inmunomoduladores y MRBsen estudios clínicos precisa de un monitoreoconfiable del sistema inmune por parte del labora-torio clínico. Entonces, hoy es posible medir unamplio espectro de parámetros funcionales que in-

Figura 41-4. Identificación de células “natural killer” mediante citometría de flujo. Para la identificación, separación y recuento deestas células se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra sus antígenos marcadores de superficie CD16 y CD56. Uno de estosanticuerpos está marcado con fluoresceína y el otro con rodamina por lo que emiten fluorescencia en diferentes longitudes de onda.

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cluyen desde la activación, proliferación y produc-tos de síntesis hasta la función de células efectoras.Más aún, considerable progreso se ha obtenido enla separación y aislamiento de varias subpobla-ciones de células del sistema inmune. Sin embar-go, no sólo los ensayos funcionales pueden ser deutilidad sino que también los estudios estructuralesy la detección de células T precursoras.

Así, con un arsenal considerable de ensayosde laboratorio y opciones de evaluar diferentes fun-ciones, la elección de las pruebas más apropiadas

permitirá al inmunólogo clínico disponer de lainformación que permita conocer el estado de larespuesta inmune celular del paciente.

3.2.1. Activación de Linfocitos T

La activación de linfocitos T es un procesocaracterizado por una compleja cascada de even-tos bioquímicos y moleculares, cuyo resultado fi-nal es la producción de citoquinas, la expresiónde receptores, la proliferación y en algunas célu-las la expresión de citotoxicidad. En condicionesfisiológicas, este fenómeno se inicia con la pre-sentación antigénica en el contexto de moléculasdel Complejo Principal de Histocompatibilidad(MHC) clase I o II e involucra complejos meca-nismos de señalización con participación dequinasas, fosfatasas y segundos mensajeros (ver

capítulo 10).Indicaciones clínicas. La activación de células T,debe evaluarse frente a la sospecha de desórdenesinmunológicos congénitos o adquiridos. Dentro deéstos se incluyen la inmunodeficiencia combinadasevera (falla en el desarrollo de células B y T), elsíndrome de Di George (falla en el desarrollo deltimo), síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome deChediak-Higashi (inmunodeficiencia por ataxiatelangiectasia con albinismo parcial), inmuno-deficiencias variables comunes y frente a infeccio-nes recurrentes por virus, parásitos y hongos.

Las disfunciones de células T, predisponen ainfecciones virales por Herpes simplex, Varicella-

zoster y Cytomegalovirus. De igual manera lacandidiasis mucocutánea recurrente es frecuente-mente asociada con disfunción de células T. Den-tro de las infecciones por protozoos, Pneumocystiscarinii y Toxoplasma gondii a menudo complicanel curso de pacientes con SIDA, en los cuales lasubpoblación de linfocitos CD4+ es deficiente.

La activación de células T, también puedemonitorearse, para evaluar el tratamiento mediante

terapias inmunomoduladoras y para detectar lamemoria inmunológica frente a diferentesantígenos como: derivado de proteína purificada(PPD), streptoquinasa, Candida, tetanus y difte-ria.

Ciertos desórdenes inmunológicos comoLupus eritematoso sistémico se manifiestan conmúltiples disfunciones de células T. Por ello, cuan-tificar la activación de células T es también útil

pa ra moni to rear el ef ec to de la s te rapi asinmunomoduladoras.

Interpretación de los datos. La capacidad delinfocitos para proliferar, in vitro, en respuesta alectinas mitogénicas como fitohemaglutinina(FHA) y concanavalina A (Con A), es el métodomás común para evaluar la inmunidad mediada

por células. La proliferación celular es ensayada72 horas después, evaluando la incorporación de3H timidina en el DNA recientemente sintetizado

por la célula T. Métodos de más reciente aplica-ción permiten evaluar eventos tempranos del pro-ceso de activación, tales como la elevación de cal-cio intracelular, la activación de proteína quinasaC (PKC) o eventos que ocurren en las primeras24 h, tales como la síntesis de IL-2 y la expresiónde su receptor IL-2R. Estos últimos son losabordajes más directos y presentan varias venta-

jas técnicas, como el hecho de requerir un peque-

ño número de células mononucleares de sangre periférica (CMSP), no necesitan enriquecer loslinfocitos T de CMSP, su ejecución requiere me-nos tiempo y realizada en serie resulta de más bajocosto. Desde este punto de vista resulta apropiadoevaluar la síntesis de IL-2 y su receptor, IL-2R, yaque la síntesis de éstos muestra además que lasvías en que participa fosfoinositol/Ca++ y PKC,están intactas.

La IL-2 es evaluada en sobrenadantes de cul-tivo de CMSP, luego de la estimulación conmitógenos por 24 h. La cantidad de IL-2 produci-da por CMSP normales en cultivo, depende del

estímulo, las condiciones de cultivo y del métodoempleado en su cuantificación. La activación decélulas T puede ser inducida utilizando diferentesagonistas tales como lectinas, anticuerpos anti-re-ceptor, ionóforos y forbol ésteres. Lectinas comoFHA y Con A pueden adicionarse directamente alos cultivos de CMSP. En presencia de monocitosque secretan IL-1, las células T producirán IL-2 ydesarrollarán una enérgica respuesta proliferativacon "peak" a las 72 h. Las ventajas de usar mitógenos son su estabilidad, bajo costo y fácil

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uso. Agonistas específicos como anticuerposmonoclonales contra el receptor CD3 pueden usar-se para activar células T y permiten evaluar la ca-

pacidad del receptor para iniciar la traducción deseñales por la vía fosfoinositol/Ca++/PKC.

Una disminución en la producción de IL-2es asociada con una disminución en la expresiónde IL-2R. La disminución en la síntesis de IL-2 yen la expresión de IL-2R sugiere un defecto en lavía fosfatidilinositol/Ca2+/PKC. Entonces para de-terminar si esta vía de señalización no es funcio-nal, la medición de Ca2+ y de la actividad de PKC

pueden ser de utilidad. La determinación de Ca2+

en células T puede realizarse usando algunosindicadores fluorescentes como Fura 2 o Quin 2.Por otro lado los ensayos para PKC son sensiblesy específicos, no obstante requieren poblaciones

enriquecidas en células T. En este tipo de ensayolas células T deben ser activadas por un agonista,

para luego preparar un extracto celular en el cualse evalúa la incorporación de P32ATP en unsubstrato peptídico sintético o en histonas. Es cla-ro que ambos ensayos requieren personal entre-nado y algunas condiciones del laboratorio por loque no se realizan de manera rutinaria.

3.2.2. Estudio de proliferación de linfocitos

El reconocimiento entre receptores de super-

ficie de linfocitos y determinados ligandos, iniciauna cascada de señales intracelulares que inclu-

Figura 41-5. Estudio de la proliferación de linfocitos T, mediante la incorporación de 3H-timidina al ADN. Se miden lascuentas por minuto (cpm) incorporadas al DNA de los linfocitos T que proliferan luego del estímulo mitogénico.

yen interacciones de membrana con citoesqueleto,influjos de Ca2+, activación de fosfolipasa C, libe-ración de Ca2+ inducida por inositol-trifosfato yactivación de genes (ver capítulo 10). Las señalesde transmembrana causan cambios significativosen el linfocito como ser la redistribución de recep-tores, secreción de citoquinas y anticuerpos, movi-lidad celular, reconocimiento entre células o ini-ciación de la proliferación celular. Entonces, la ca-

pacidad de un linfocito para responder a un ligan-do, es utilizada tanto en investigación básica comoclínica, evaluando la proliferación. Como ya sedescribió, diferentes lectinas, anticuerpos y com-

puestos químicos pueden estimular la proliferaciónde linfocitos. La respuesta proliferativa puede en-tonces ser evaluada en cultivos de sangre total, oen células mononucleares aisladas y en diferentes

subpoblaciones de linfocitos. No obstante, debeconsiderarse que en muchos casos se requiere másde un tipo celular para responder a un determinadoligando. Frecuentemente, además de las células T,se requiere la participación de células accesoriasque expresen asociadas a su membrana moléculasMHC clase II, como monocitos y macrófagos.

De manera sucinta, un ensayo de prolifera-ción debería medir el número de células sobrevi-vientes y aquellas generadas como consecuenciadel estímulo. Esto comúnmente se evalúa de ma-nera indirecta por medio de la incorporación de

un nucleótido radiactivo (

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H-timidina) en el DNAsintetizado (figura 41-5).

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Indicaciones clínicas. Parece claro que los ensa-yos de proliferación o blastogénesis poseen am-

plias aplicaciones clínicas. El ensayo es utilizado pa ra es tu diar al te raciones de rivadas deinmunodeficiencias congénitas, así como tambiénaquellas secundarias derivadas de enfermedadesinfecciosas, cáncer, desnutrición, cirugías y enfer-medades autoinmunes. Dentro de las inmuno-deficiencias congénitas se incluye la inmunode-ficiencia combinada severa, caracterizada por unamarcada deficiencia en las funciones de células By T (ver capítulo 29). Entonces la utilidad clínicade este ensayo radica en proveer información dela capacidad funcional de linfocitos de sangre

periférica. Esta información es de valor para co-nocer el estado del sistema inmune del paciente ycomo indicador del progreso de una terapia.

La aparición del SIDA, atrajo nuevamente laatención a la investigación clínica de lasinmunodeficiencias y reafirmó la importancia delas determinaciones in vitro de las funciones dela inmunidad celular. Por ejemplo, una disminu-ción en la respuesta proliferativa a Phytolaccaamericana (una lectina que actúa comoestimulador de células B y T) o frente a algunosantígenos de memoria tales como Cándidaalbicans o toxoide tetánico, tiene valor pronósti-co, por ser la capacidad de proliferar un indicador

precoz del deterioro de la función inmune en per-

sonas infectadas con el virus de lainmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1), en pe-ríodos de la infección en que los niveles de CD4+están aún dentro de límites normales.

De igual manera, el ensayo de proliferación puede ser utilizado para definir otras inmunode-ficiencias adquiridas, como el síndrome de fatigacrónica (SFC), que frecuentemente se acompañacon reactivación frente a virus de alta prevalenciacomo Epstein-Barr o virus Herpes. Por ejemplo,la respuesta proliferativa a PWM estuvo bajo lamedia de los controles normales en el 95% de pa-cientes con SFC. De igual manera, la habilidad de

linfocitos estimulados con mitógenos a producir IFN, generalmente se puede correlacionar con res-

puesta proliferativa.Los antígenos de potencial uso en clínica son

numerosos y deben ser escogidos con cuidado deacuerdo al problema a investigar. Para evaluar res-

puesta frente a antígenos en los cuales altos por-centajes de la población están expuestos, (marca-dores generales de inmunocompetencia celular),Cándida albicans y toxoide tetánico deberían uti-lizarse.

La reacción mixta de linfocitos (RML) esuna respuesta proliferativa a dos poblaciones decélulas T alogénicas cultivadas en conjunto. Enotras palabras, se usa para conocer la reactividadde la población de linfocitos de un paciente frentea las células de otro individuo. El principal estí-mulo en este tipo de reacciones son los antígenosdel MHC, presentados en la membrana de loslinfocitos T. Esta es sin duda la técnica de másamplio uso para estudiar la respuestainmunológica de los linfocitos. En esta reacciónse verifican tres eventos principales: síntesis demacromoléculas, transformación blástica y pro-liferación. Las células respondedoras en RML son

principalmente linfocitos CD4+. Éstas recono-cen moléculas de MHC clase II por lo queantígenos de Clase II son sus principales

estimuladores. Además de poder determinar losniveles de la respuesta de linfocitos, esta reac-ción sirve para demostrar la compatibilidad deMHC. Se conoce dos tipos de RML, launidireccional y la bidireccional. En launidireccional, una población celular sirve comoantígeno (también conocidas como célulasestimuladoras) y es usada sólo después de lainhibición de su propia proliferación. Entoncessólo se determina la respuesta proliferativa de lasegunda población celular (también llamadas cé-lulas respondedoras). En la RML bidireccional

la respuesta proliferativa de ambas poblacionescelulares es evaluada ya que ninguna poblacióncelular es inhibida en su división. Si existe reco-nocimiento o reactividad de los linfocitos habrá

proliferación e incorporación de 3H-timidina (fi-gura 41-6).

Esta reacción ha sido usada para evaluar losdefectos de la respuesta inmune. No obstante, suaplicación más importante es en el área detipificación de tejidos y trasplante de órganos ycélulas.

Interpretación, rangos normales y control de

calidad. La utilidad clínica del ensayo de proli-feración depende de la habilidad del inmunólogoclínico para interpretar de manera adecuada losresultados. Esto requiere conocer de maneraexacta la respuesta a esperar en individuosinmunocompetentes, para poseer los adecuadoscontroles. Esto implica, además, que cada labo-ratorio debiera poseer sus propios rangos de va-lores normales para la respuesta a cadainmunógeno, tomando en consideración aspec-tos como edad, sexo y grupo étnico.

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3.2.3. Estudio de la citotoxicidad celular

La citotoxicidad celular es una de las funcio-nes más importantes de esta rama de la respuestainmune. La citotoxicidad se entiende como la ca-

pacidad de una célula de atacar o ser tóxica para

otra célula blanco. Esta propiedad la poseen losLT citotóxicos (LTc), las células NK y aquellostipos celulares que participan de fenómenos decitotoxicidad dependientes de anticuerpos(ADCC) (ver capítulo 19).

De manera general las células citolíticasefectoras se pueden dividir en dos grupos: aquellasque requieren sensibilización previa con un antígenoy reconocen en el contexto de moléculas de HLA yaquellas que no requieren sensibilización previa,ya que poseen reactividad espontánea, su respuestano está restringida a HLA y son activadas por citoquinas. La mayor parte de las células T CD8- yCD4-, no actúan restringidas a HLA, pero lassubpoblaciones (tanto CD4+ como CD8+) puedenser restringidas a HLA. De igual manera las célu-las T L/B (células TCR2+) pueden mediar ambostipos de citotoxicidad, donde la expresión de lamolécula CD56 permite separar ambassubpoblaciones. La restricción de HLA parece ser más bien relativa que una propiedad constante delos linfocitos T citolíticos. Esto podría depender dela naturaleza y presentación del antígeno, implican-do que una célula efectora tiene potencial para ex-

presar diferentes tipos de estructuras de reconoci-miento y mediar más de un tipo de citotoxicidad.

Las células citolíticas efectoras humanas com- prenden diferentes tipos celulares los cuales depen-diendo de su microambiente difieren en número,estado de activación y en el mecanismo utilizado

en reconocimiento y muerte de la célula blanco.Luego del reconocimiento y el contacto de superfi-cie, la célula citolítica efectora activa una cascadade señales, desencadenando una acción irreversi-

ble y letal hacia la célula blanco. La célula efectora,generalmente puede asociarse a nuevas células blan-co en dos o tres ocasiones sin necesitar de reactivar su cascada de señales. En el capítulo 19 se descri-

ben los diferentes mecanismos de citotoxicidad que presenta los LTc y células NK.

Significancia clínica e interpretación de los re-sultados. La evaluación de las funciones citolíticas

provee una medida eficaz para evaluar la eficien-cia de las diferentes subpoblaciones celulares enestados de salud y de pérdida de ella.

Estos ensayos constituyen una parte sustan-cial de la evaluación clínica de pacientesinmunocompetentes. Las células citolíticasefectoras parecen jugar un importante papel en unavariedad de enfermedades del hombre. Por un lado,una función citotóxica ausente o disminuida, alanálisis in vitro de células citolíticas, se observaen pacientes con inmunodeficiencias como SIDA,

Figura 41-6. Cultivo mixto de linfocitos. Las células no respondedoras (irradiadas) presentan sus antígenos de superficie a lascélulas respondedoras, que como respuesta entran a división celular e incorporan 3H-timidina en el DNA.

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en pacientes con cáncer, en infecciones crónicas por virus y hongos y en ciertas enfermedadesautoinmunes. Por otro lado, la activación de lafunción citolítica se observa en pacientesinmunodeficientes que reciben una terapia e

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