DOUGLAS DE OLIVEIRA LUCIANO

MÉTODOS MOLECULARES PARA ANÁLISE DO

DNA

CENTRO UNIVERSITÁRIO DA FUNDAÇÃO DE ENSINO OCTÁVIO BASTOS

SÃO JOÃO DA BOA VISTA, SP, 2004

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DOUGLAS DE OLIVEIRA LUCIANO

MÉTODOS MOLECULARES PARA A ANÁLISE DO

DNA

Nome do orientador: Maurício Bacci Júnior

Monografia apresentada como requisito da

Disciplina de Estágio supervisionado do Curso de

Ciências Biológicas

CENTRO UNIVERSITÁRIO DA FUNDAÇÃO DE ENSINO OCTÁVIO BASTOS

SÃO JOÃO DA BOA VISTA, SP, 2004

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PÁGINA DE APROVAÇÃO

Autor: Douglas de Oliveira Luciano

Título da monografia: Métodos moleculares para a análise do DNA

Monografia aprovada em________ de ______________de ______________, pela

banca examinadora.

________________________________Orientador: Prof. Dr. Maurício Bacci Júnior

________________________________Biólogo Joaquim Martins Júnior

_______________________________Farmacêutica Danyelle Cristine Marini

________________________________Douglas de Oliveira Luciano

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DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho de conclusão de curso a minha mãe Oneide e ao meu

pai José Mário pelo amor, dedicação, amizade e apoio. A eles muito devo e espero

que esta monografia seja-lhes motivo de orgulho, por ser mais uma realização e

mais uma etapa que concluir em minha vida.

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AGRADECIMENTO

Para realizar um trabalho como este, foi necessária a ajuda de muitas

pessoas. Agradecê-las é somente uma das formas de mostrar-lhes minha gratidão.

Deixo meus agradecimentos aos meus amigos Joaquim e “Dani” que

colaboraram imensamente com a realização desta monografia.

Agradeço ainda a todos os amigos do laboratório da UNESP (CEIS) pelo

apoio e companheirismo ao longo dessa pesquisa.

Agradeço, em especial, ao professor Dr. Maurício Bacci Júnior, não somente

por ter sido o orientador desta monografia, mas também por sua amizade e por tudo

que fez para me ajudar na concretização deste trabalho.

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RESUMO

O seqüenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos, moléculas que constituem o DNA. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens. O processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser seqüenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa”. O método pode ser automatizado através de seqüenciador automático gerenciado por computadores com softwares que analisam seqüencialmente e identificam os produtos. Isto permitirá executar o processo em grande escala. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmenta, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseados na diferença de comprimento de onda. Quando os fragmentos gerados numa reação de seqüenciamento são separados por eletroforese, os fragmentos menores vão à frente, seguidos dos demais, sendo à distância entre as bandas aproximadamente iguais, pois representa sempre a diferença de uma base a mais ou a menos.

Palavras-chave: DNA, seqüenciamento, fluorescência, métodos, fluorescente.

** - colocar sobre extração, purificação, e outros.

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ABSTRACT

The sequencing of DNA is a process that determines the order of the nucleotideos, molecules that constitute the molecule of DNA in a sample. Some methods available each one presents advantages and disadvantages. The process is carried through from a simple chain (not double) of the DNA to be sequenced; this will serve of form to generate to another complementary half of the double helix. That is gotten for the denaturation of molecule native. The method can be automat zed through would it schemes appropriate managed for computers with softs that

they to read sequentially and they identify the products. This will allow executing the large-scale process. The distinguishing fluorescent signal emitted by each fragment, after illumination with a laser beam, will identify the products based in the difference of wavelength. When the piece generated in a sequence reaction are separate for electrophoreses, the lesser fragment go to the front, followed of excessively, being in

the distance enter the bands approximately equal, therefore it always represents the difference of a base more or less.

Keywords: DNA, sequence, fluorescence, methods, electrophoreses.

*** não colocar para traduzir em site ou em programas.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura química dos quatro nucleotídeos.......................................12

Figura 2 - (a) Modelo simplificado da estrutura helicoidal do DNA, mostrando as pontes de hidrogênio que unem as bases purínicas Adenina (A) e Guanina (G) às bases purimidínicas Timina (T) e Citosina (C), respectivamente; b) Estrutura tridimensional da dupla hélice de DNA, com suas fitas de polaridade inversa, tendo uma o sentido 3’ 5’ e outra o sentido 5’ 3’ e c) Visão esquemática da dupla hélice do DNA formadas por nucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster e pelas bases nitrogenadas ligadas por pontes de hidrogênio, de forma que A se liga à T por 2 pontes de hidrogênio e G e C são ligadas por 3 pontes de hidrogênio..........................................................................................................13

Figura 3 - Thomas D. Brock no Lago do “Yellowstone National Park”............24

Figura 4- Termocicladores..............................................................................25

Figura 5 - Representação esquemática de algumas etapas da técnica PCR....................................................................................................................26

Figura 6 - Esquema para a obtenção de plasmídeos recombinantes...............36

Figura 7 – Processo conhecido com réplica.......................................................38

Figura 8 - Seqüenciamento...............................................................................41

Figura 9 - DNA ligase catalisa a junção de duas fitas de DNA que são partes da molécula da dupla-hélice....................................................................43

Figura 10 - Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem

ser transformadas em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T)......................44

Figura 11. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas....................45

Figura 12 - A reação de síntese.........................................................................47

Figura 13 - Terminadores..................................................................................48

Figura 14 - Autoradiograma..............................................................................49

8

Figura 15 - Fragmentos de diferentes comprimentos.......................................52

Figura 16 -Os fragmentos de diferentes comprimentos que migram no gel......53

Figura 17- Eletroferograma parcial de uma sequência de DNA........................54

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO........................................................................................11

1 ESTRUTURA E FUNÇÃO DO DNA........................................................11

1.1 EXTRAÇÃO DE DNA..............................................................................13

1. Eletroforese em Gel de Agarose.............................................................16

2. Espectrofotometria..................................................................................20

3. Fluorometria............................................................................................20

2 AMPLIFICAÇÃO......................................................................................24

2.1 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)....................................24

3 PURIFICAÇÃO DA AMPLIFICAÇÂO......................................................27

4 CLONAGEM............................................................................................30

4.1 CLONAGEM DE DNA.............................................................................30

4.2 CICLO CELULAR....................................................................................31

4.3 ESTIMATIVA DE CONCENTRAÇÃO DE DNA.......................................32

4.4 PREPARAÇÃO DO PLASMÍDEO (PREP)........................................................33

4.4.1 Clonando DNA de um Plasmídeo...................................................................35

5 REAÇÃO DE SEQÜENCIAMENTO..............................................................39

5.1 Seqüenciamento Automático...................................................................40

6 PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO.......................................................................42

6.1 DNA LIGASE...........................................................................................43

6.1.1 Tipos de Fragmentos de DNA que são ligados pela DNA Ligase...........43

7 SEQÜENCIAMENTO DE DNA.....................................................................46

7.1 PRODUÇÃO DE UM DNA PARA SEQÜENCIAMENTO E A TÉCNICA

DIDEOXI..................................................................................................49

CONCLUSÃO....................................................................................................54

REFERÊNCIAS..................................................................................................55

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RELATÓRIO DE ESTÁGIO.................................................................................61

INTRODUÇÃO

Todos os seres vivos são formados de células e as formas mais simples de

vida são células individualizadas, que se propagam por cissiparidade. Porém,

organismos superiores, como vegetais e animais, são constituídos de grupos

celulares que têm tarefas especializadas e são ligadas por um complexo sistema de

comunicações.

As células são constituídas de moléculas e ocupam um ponto intermediário na

escala da complexidade biológica. O estudo das moléculas e a compreensão do

funcionamento delas revelam a maneira pela qual a cooperação intercelular origina

os organismos mais complexos.

Milhares de reações diferentes e intimamente coordenadas são realizados

simultaneamente por uma célula e uma variedade de mecanismos-controle regulam

as atividades de enzimas-chave em respostas a mudanças de condições da célula.

A evolução de grandes animais e plantas dependeu da evolução de muitos

tipos de células especializadas, assim como de uma maior coordenação entre elas,

refletindo um crescente e elaborado sistema de controle da expressão gênica nas

células individuais.

Na maioria dos seres vivos as informações genéticas são transportadas na

seqüência linear de nucleotídeos no DNA, com exceção de alguns vírus, cujo

material genético é o RNA. Cada molécula de DNA é uma dupla-hélice formada por

duas fitas complementares de nucleotídeos unidas por pontes de hidrogênio entre os

pares de bases G-C (citosina e guanina) e A-T (adenina e timina). A duplicação da

informação genética ocorre pela polimerização de uma nova fita complementar de

cada uma das fitas originais da dupla-hélice, durante a replicação de DNA.

Até o inicio da década de 70, o DNA era a molécula celular mais difícil de ser

analisada pelo bioquímico. Extremamente longa e quimicamente monótona, a

seqüência de nucleotídeos do DNA somente podia ser estudada através de

11

abordagens indiretas, como seqüenciamento de proteínas ou RNA ou por analise

genética. Atualmente é possível manipular uma região especifica do DNA, produzir

um numero virtualmente ilimitado de copias da mesma e determinar a sua seqüência

nucleotídica num ritmo bastante acelerado. Variações das mesmas técnicas

permitem que um gene isolado seja alterado (engenharia do DNA) de acordo com o

interesse e, posteriormente, reintroduzido em célula de cultura. Com um pouco mais

de dificuldade, é possível inserir um gene modificado na linhagem germinativa de um

animal ou de um vegetal, de modo que ele se torne funcional e que seja herdado

como parte do genoma do organismo que o recebeu.

Estes estudos levaram à descoberta de novas classes de genes e proteínas,

e revelaram que muitas proteínas foram altamente conservadas ao longo do

processo evolutivo, num grau bem maior do que se suspeitava anteriormente.

O DNA então, tornou-se a molécula mais fácil de ser analisada, sendo

possível isolar regiões específicas, obtê-las em grande quantidade e determinar a

sua seqüência numa velocidade de milhares de nucleotídeos por dia.

**A capacidade das células de manter a ordem em um universo caótico

depende da informação genética que é expressa, mantida, replicada e,

ocasionalmente, melhorada, através dos processos genéticos básicos: síntese de

RNA e de proteínas, reparação do DNA, replicação do DNA e recombinação

genética.

Genética é o estudo dos genes em todos os níveis, desde as moléculas até

as populações. Os primórdios desta disciplina datam da década de 1860, com o

trabalho de Gregor Mendel, que formulou a idéia da existência dos genes

(chamados por ele de partículas ou fatores). Hoje sabemos que os genes

correspondem a regiões específicas da longa molécula de DNA que constitui a

estrutura fundamental do cromossomo.

12

1 ESTRUTURA E FUNÇÃO DO DNA

A vida depende da capacidade das células de armazenar, resgatar e traduzir

as instruções genéticas necessárias para fazer e manter um organismo.

No início do século XX, reconheceu-se que os genes estão nos

cromossomos, estruturas então conhecidas como filamentos no núcleo de uma

célula. Análises bioquímicas mostraram que os cromossomos continham DNA e

proteína.

Conduzindo seus experimentos com linhagens virulentas e não-virulentas da

bactéria Streptococcus pneumoniae, Frederick Griffith, em 1928, demonstrou que o

DNA é o princípio transformante. A demonstração de que o DNA é o princípio

transformante foi à primeira de que os genes são compostos por DNA.

Os biólogos da década de 40 tinham dificuldades em aceitar que o DNA era o

material genético devido à sua simplicidade química, frente à enorme diversidade de

características apresentadas pelos organismos. Porém, em 1952 Allfred Hershey e

Martha Chase, a partir de seus experimentos com bactérias Escherichia coli

infectadas por fagos T2, apresentaram argumentos conclusivos de que o DNA era o

material genético.

A estrutura física do DNA ainda não era conhecida, mas os “blocos

estruturais” (as quatro moléculas básicas, conhecidas por nucleotídeos, contendo

um fosfato, uma pentose e uma das quatro diferentes bases nitrogenadas: Adenina,

Citosina, Guanina e Timina) já eram conhecidos (Figura 1). Entretanto, a

compreensão ainda era difícil, pois os conceitos sobre o código genético ainda não

estavam estabelecidos.

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Figura 1 - Estrutura química dos quatro nucleotídeos que formam os blocos estruturais do DNA. Cada nucleotídeo é constituído por um fosfato, uma pentose (desoxirribose) e uma base nitrogenada, que podem ser purínicas (guanina e adenina) ou pirimidínicas (citosina e timina). (Griffiths et al., 2000).

No início da década de 50, Rosalind Franklin e Maurice Wilkins examinaram

pela primeira vez a molécula de DNA por difração de raio X, uma técnica que

permite determinar a estrutura atômica tridimensional de uma molécula. Os

resultados indicaram que DNA era composto de duas fitas enroladas em uma hélice.

Erwin Chargaff, por sua vez, estabelecera regras empíricas sobre as quantidades de

cada componente do DNA, a qual definia que a quantidade total de nucleotídeos

pirimidínicos (T+C) é sempre igual à quantidade total de nucleotídeos purínicos

(A+G).

Em 1953, James Watson e Francis Crick deduziram e propuseram, a partir

destas informações, a estrutura de dupla hélice do DNA, onde cada hélice é uma

cadeia de nucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster e cujas hélices estão ligadas

por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas, por pareamento específico

entre uma base purínica com uma base pirimidínica. Estabeleceram também que

apenas os pareamentos T-A e C-G tinham complementaridade tipo “chave-

fechadura”, necessária para um pareamento eficiente por pontes de hidrogênio

(Figura 2).

O modo como as subunidades de nucleotídeos estão ligadas dá à fita de DNA

uma polaridade química que caracteriza uma extremidade como 3’ e a outra como

extremidade 5’, esta convenção é baseada nos detalhes da ligação química entre os

nucleotídeos.

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Figura 2 - (a) Modelo simplificado da estrutura helicoidal do DNA, mostrando as pontes de hidrogênio que unem as bases purínicas Adenina (A) e Guanina (G) às bases purimidínicas Timina (T) e Citosina (C), respectivamente; b) Estrutura tridimensional da dupla hélice de DNA, com suas fitas de polaridade inversa, tendo uma o sentido 3’ 5’ e outra o sentido 5’ 3’ e c) Visão esquemática da dupla hélice do DNA formada por nucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster e pelas bases nitrogenadas ligadas por pontes de hidrogênio, de forma que A se liga à T por 2 pontes de hidrogênio e G e C são ligadas por 3 pontes de hidrogênio. (Extraído de Griffiths et al., 2000).

O gene é uma região do DNA que controla uma característica hereditária

específica. A seqüência especifica das bases que compõe o gene geralmente

corresponde a uma única proteína ou RNA complementar.

1.1 EXTRAÇÃO DE DNA

Para o isolamento e purificação de ácidos nucléicos, é necessário separá-los

efetivamente dos outros constituintes celulares. No caso especial dos ácidos

nucléicos, também é fundamental manter a integridade das moléculas, que devem

permanecer inalteradas durante o procedimento de extração, pois as informações

contidas no DNA/RNA dependem da seqüência diretamente. Alguns protocolos

resultam na quebra dos polímeros de DNA ou RNA, causando a perda de

informações. Portanto, é extremamente importante que os ácidos nucléicos sejam

extraídos num estado mais intacto e inteiro possível. Para DNA, teoricamente, a

extração de moléculas do tamanho de cromossomo seria ideal. Apesar de ser

possível, especialmente para algumas aplicações, tais como eletroforese de campo

pulsado (“Pulsed Field Gel Electrophoresis”), as quantidades obtidas não são

suficientes para a maioria dos usos. Existe, portanto, um balanço entre a qualidade e

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praticidade. Existem vários métodos descritos na literatura, e a escolha depende do

balanço entre a praticidade, qualidade e a finalidade de uso do acido nucléico. De

modo geral, os métodos e extração consistem dos seguintes passos:

a) ruptura dos tecidos através da trituração de tecidos congelados na presença de

nitrogênio liquido ou gelo seco.

b) liberação de componentes celulares num tampão de lise da membrana com

detergentes (SDS, sodium dodecil sufato; ou CTAB, cetiltrimetilamonio brometo).

O tampão de extração deve possuir Ph entre 8,0 e 9,0, desfavorável à ação de

nuclease.

c) inativação de nuclease por esses detergentes e agentes quelantes (EDTA,

ethilenodiamonotetraacetato). Este agente quelante imobiliza cátion de Mg, que

são cofatores para varias endonucleases. A emulsificação da mistura de tampão

e tecido com fenol ou clorofórmio leva a desnaturação das proteínas. Na

extração de DNA de plantas, utiliza-se o PVP (polivinilpirrolidona) por possuir

efeito antioxidante, e é adicionado para evitar a oxidação de polifenóis. O agente

redutor β-mercaptoetanol inibe a atividade de peroxidases e polifenoloxidases.

d) remoção dos resíduos celulares e precipitação das proteínas por centrifugação.

A desproteinização é obtida através de um tratamento com fenol ou clorofórmio,

pois esses solventes orgânicos desnaturam as proteínas e enzimas, e são

separadas após centrifugação, permanecendo na interface entre a fase aquosa

(superior) contendo os ácidos nucléicos e a fase orgânica (inferior). Alguns

protocolos incorporam proteases (proteína K) para facilitar a separação do DNA

das proteínas da cromatina.

e) recuperação dos ácidos nucléicos totais por precipitação em álcool (etanol ou

isopropanol).

f) eliminação do RNA por digestão com RNAse, ou separação de RNA e DNA por

solubilidade diferencial em sais. Sob condições de alta concentração de sais (Ex:

7,5 M de Acetato de Sódio), DNA e os RNA pequenos (principalmente Trna)

permanecem em solução, enquanto que RNA (> que 60 bases) precipita.

Os ácidos nucléicos são poliânions solúveis em água. Os sais de sódio e

potássio de ácidos nucléicos são solúveis na maioria dos solventes orgânicos,

incluindo numa mistura de etanol e água, mas eles não são desnaturados por

solventes orgânicos. O detergente catiônico CTAB solubiliza membranas celulares, e

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dependendo da concentração de NaCl no tampão, CTAB forma um complexo com o

DNA, e é utilizado para precipitar DNA seletivamente.

Para analise de DNA, utilizando a digestão por enzimas de restrição (Ex:

RFLP), existe a necessidade de obter-se DNA de boa qualidade. Contaminantes

(polifenóis e polissacarídeos) interferem na atividade dessa enzima, reduzindo a

eficiência. A contaminação por polissacarídeos consiste na principal contaminação

afetando a pureza do DNA extraído de plantas. Esses carboidratos podem inibir a

atividade de várias enzimas usadas em manipulações biológicas de DNA, tas como,

ligase, polimerase, e enzimas de restrição. A maioria dos métodos de extração

empregada não separa eficientemente o DNA dos polissacarídeos, provavelmente

devido à similaridade estrutural entre esses dois tipos de polímeros. A contaminação

por polissacarídeos depende da espécie, tecido e condições fisiológicas da planta

amestrada. Certas espécies “produzem” um DNA muito contaminado por

polissacarídeo, tornando difícil a ressuspensão do pelet. Vários métodos têm sido

propostos tentando superar esse problema. A contaminação por fenóis, e a

conseqüente oxidação do DNA, pode ser evitada agregando PVP, β-mercaptoetanol

ao tampão de extração. Em casos extremos, o composto dietilditiocarbonato (0,1 M)

pode ser adicionado.

Os métodos de extração de DNA mais antigos empregavam gradientes em

CsCl, que produzem DNA de alta qualidade, mas são caros e trabalhosos,

requerendo uma ultracentrífuga. Soluções com alta concentração de cloreto de césio

(5M) formam um gradiente de densidade sob alta centrifugação, e o sal de césio de

DNA possui uma densidade intermediária entre os extremos de concentração (e,

portanto de densidade) desse gradiente. É possível a separação de RNA do DNA,

assim como espécies de DNA com densidade diferente devido a composição de

bases e estrutura terciária. Esses métodos de extração de DNA necessitam maiores

quantidades de tecido, um problema quando se trabalha com um grande número de

indivíduos em análises genéticas. Mais recentemente, com o advento do PCR,

vários métodos foram propostos, que utilizam pouca quantidade de tecido na

extração, resultando num DNA com qualidade inferior, mas bem aceitáveis. A maior

parte dos protocolos de extração disponíveis deriva basicamente do método descrito

por Dellaporta et al. (1983) e aqueles que utilizam o detergente CTAB (brometo de

hexadeciltetrametilamônio), onde o DNA é solúvel sob altas concentrações de sal.

17

1.1.1 Eletroforese em Gel de Agarose

Sob influência de uma diferença de potencial elétrico, átomos, moléculas e

partículas com carga, em solução aquosa, migram na direção do eletrodo com carga

oposta. Como as moléculas têm cargas e massas variáveis, a migração em um meio

de viscosidade definida se dará em diferentes velocidades, com separação das

várias frações de uma mistura.

A mobilidade eletroforética, que é a velocidade de migração por unidade de

campo elétrico, é um parâmetro característico da molécula em um determinado meio

de eletroforese. Este parâmetro depende da densidade de cargas da molécula e do

seu tamanho. Depende, portanto, do pH do grupo ionizável e do pH do tampão que

dissolve a amostra. Como a viscosidade do gel determina o atrito, limitando a

velocidade de propagação, a mobilidade eletroforética será dependente da

temperatura. O que normalmente analisamos é a mobilidade eletroforética relativa

da molécula, comparando-se as distâncias de migração com as de uma substância

padrão, aplicada na mesma corrida eletroforética. Estas substâncias constituirão

marcadores que tornam a avaliação da separação eletroforética relativamente

independente de variações na diferença de potencial elétrico e do tempo de

eletroforese.

As amostras para eletroforese não poderão conter partículas grandes ou

gotículas de óleo em suspensão, pois estas interferem com a separação por

bloquear os poros da matriz de eletroforese. Pode-se centrifugar as soluções antes

de colocá-las no gel.

Separar substâncias que têm ou cargas positivas ou cargas negativas, como

os ácidos nucléicos, que só têm cargas negativas, não constituem, em geral,

problema. As moléculas como as proteínas cuja carga resultante dependente do pH

do meio terão as migrações eletroforética fortemente influenciadas pelo pH do

tampão.

A força iônica (concentração total de íons) do tampão utilizado deve ser tão

baixa quanto possível (o mínimo que garanta um pH constante), reduzindo-se, desta

forma, as correntes iônicas que fluem pelo gel e a dissipação térmica excessiva

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(lembrar que os íons que constituem o tampão também migram eletroforeticamente,

contribuindo para a corrente total).

Para se avaliar o progresso da separação e reconhecer o fim da corrida,

corantes com alta mobilidade eletroforética são adicionados juntamente com a

amostra.

A matriz do gel de eletroforese deve ter poros de tamanhos regulares e

ajustáveis, deve ser quimicamente inerte. A eletro-osmose, que é o arraste do

solvente pela migração eletroforética do soluto, quando os poros são pequenos, não

deve ocorrer, pois alteraria a mobilidade dos íons.

Os géis de agarose, um polissarídeo extraído de algas marinhas, são

adequados para separar moléculas com diâmetro igual ou superior a 10 nm. Com a

remoção da agaropectina, se obtêm tipos de agarose com diferentes graus de

pureza e de eletrosmose. As diferentes agaroses se caracterizam pelo seu ponto de

fusão (melting point), que pode variar entre 35oC e 95oC e pelo grau de eletrosmose

(mr), que depende do número de grupos polares que persistem após a purificação.

O tamanho dos poros depende da concentração de agarose. A concentração

em geral é dada como peso de agarose por volume de água. Em geral, géis a 1%

têm poros em torno de 150 nm e géis a 0,16% têm poros em torno de 500 nm. A

agarose é dissolvida em água fervendo e forma um gel quando esfria. Durante esse

processo há formação de duplas hélices que se juntam lateralmente, de modo a

formar filamentos finos. Durante a geleificação há formação de polímeros.

Eletroforese em gel de agarose é o método de escolha para separação,

purificação e identificação DNA e RNA. São utilizados, para isso, géis horizontais,

submarinos: o gel fica diretamente mergulhado no tampão. O gel de agarose tem

menor resolução que o de acrilamida (que veremos posteriormente), mas tem uma

faixa de separação maior (entre 200 pb e cerca de 50 kpb).

A eletroforese em gel de agarose consiste no método padrão usado para

separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A

eletroforese em gel de acrilamida é usada em menor escala. A técnica é simples,

rápida e capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não podem ser

separados por outros métodos, tais como centrifugação com densidade de gradiente

ou por velocidade de sedimentação. A localização do DNA no gel pode ser

determinada diretamente. As bandas no gel são coloridas principalmente por

Brometo de Etídeo a baixa concentração, que colore por intercalar-se na dupla fita

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de DNA. Concentrações de até 1 ng de DNA podem ser visualizadas por exame

direto de gel na luz ultravioleta.

Uma molécula de DNA, quando exposta a um campo elétrico, migra para o

eletrodo na velocidade ou mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e

a carga líquida da molécula. A mobilidade eletroforética é também inversamente

proporcional ao coeficiente friccional da molécula, que, por sua vez é função do

tamanho e forma da molécula e da viscosidade do meio. Portanto, uma mistura de

moléculas diferentes pode ser separada eletroforeticamente com base em:

a) tamanho da molécula

b) forma ou conformação da molécula

c) magnitude das cargas elétricas líquidas na molécula

Quando aplicadas na mesma posição num campo elétrico, as moléculas

serão separadas em bandas e migrarão a velocidades diferentes para posições

diferentes no meio.

Sob condições fisiológicas, os grupos fosfatos dos ácidos nucléicos

encontram-se ionizados. Cadeias de polinucleotídeos de DNA e RNA são

chamadas de poliânions e migram para o eletrodo POSITIVO (anodo) quando

colocados em campo elétrico. Devido à natureza repetitiva dos fosfatos, o DNA

dupla fita possuem aproximadamente a mesma relação de massa e carga líquida.

Ajustando a viscosidade do meio, entretanto, os efeitos da fricção e o formato das

moléculas podem ser usados permitindo separar os ácidos nucléicos

eletroforeticamente por tamanho. A viscosidade do meio pode ser determinada pelo

tamanho dos poros do meio através da concentração de agarose ou poliacrilamida.

Portanto, a taxa de migração de DNA através de gel de agarose é

dependente de quatro parâmetros:

1. Tamanho da molécula de DNA: uma molécula linear de DNA dupla fita move-se

através da matriz de agarose numa taxa inversamente proporcional ao log10 do

seu peso molecular (ver figura).

2. Concentração de Agarose: O fragmento de DNA de um determinado peso migra

em velocidade distinta através de géis de diferentes concentrações de agarose.

Existe uma relação linear entre o logaritmo da mobilidade eletroforética do DNA e

a concentração do gel

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3. Conformação de DNA: DNA circular fechado e tenso “supercoiled” (Forma I),

circular relaxado com corte “nick” (Forma II), e linear (forma III) com o mesmo

peso molecular migra através de géis a velocidades diferentes. A mobilidade

relativa das três formas depende primeiramente da concentração de agarose no

gel, mas também é influenciada pela voltagem aplicada, a força iônica do

tampão, e a densidade de torção do DNA na Forma I. Sob algumas condições, a

Forma I migra mais rapidamente que a Forma III; e sob outras condições, a

ordem é invertida.

4. Corrente aplicada: Sob baixa voltagem, a taxa de migração de fragmentos de

DNA linear é proporcional à voltagem aplicada. Entretanto, com um aumento no

campo de força aplicado, a mobilidade de fragmentos de alto peso molecular

aumenta diferencialmente. Portanto, a faixa efetiva de separação por gel de

agarose decresce com um aumento na voltagem. Para obter a maior resolução

de fragmentos de DNA, os géis não devem ser submetidos a voltagens maiores

que 5 V/cm.

5. Composição de Bases e Temperatura: O comportamento eletroforético de DNA

em géis de agarose (em contraste a géis de poliacrilamida) não é muito afetado

tanto pela composição de bases do DNA, nem pela temperatura em que o gel é

corrido. Portanto, a mobilidade eletroforética relativa de fragmentos de DNA em

géis de agarose não é muito afetada por temperaturas entre 4 e 30oC. De modo

geral, géis de agarose são corridos na temperatura ambiente. Entretanto, géis

contendo menos de 0,5% de agarose são muito frágeis e devem ser corridos a

4oC, para terem maior rigidez.

1.1.2 Espectrofotometria

Nessa prática utilizou-se o espectrofotômetro, gel de agarose, fluorômetro e

placa de Petri com padrão.

1. Ligar o espectrofotômetro 15 minutos antes. Colocar o comprimento de

onda para 320 nm.

21

2. Fazer uma solução diluída em água da amostra de DNA (1:100, 1: 500, ou

até 1: 1000).

3. Zerar o instrumento com água em Abs320nm.

4. Fazer leituras de Abs230nm, AbS260nm, Abs280nm e Abs320nm

5. Estimar a concentração de DNA pela fórmula

(Abs260nm – Abs320nm) x 50 x fator de diluição = [DNA] em mg ml-1

Obs. Existe um superestimativa da concentração por espectrofotômetro

devido a impurezas na solução.

6. Fazer um estoque de trabalho com a concentração de 5 ng ml-1

1.1.3 Fluorometria

O equipamento que usamos foi o Hoefer DyNA Quant 200, que é um fotômetro

com filtro de fluorescência com uma fonte fixa de passagem de excitação a 365 nm

e um filtro de passagem de emissão a 460 nm. Ele foi desenhado para a

quantificação de baixas concentrações de DNA usando o corante chamado de

Hoechst 33258, também chamadao de bisbenzimida. O corante Hoechst 33258

apresenta alterações nas características de fluorescência na presença de DNA, que

permite a estimativa da concentração na solução. Na ausência de DNA, o espectro

de excitação do corante Hoechst 33258 possui um pico a 356 nm e o espectro de

emissão possui um pico fraco a 492 nm. Quando Hoechst 33258 liga-se ao DNA,

esses picos movem-se para 365 nm de excitação e 458 nm de emissão. No poço da

cuveta, a amostra é exposta a luz filtrada (365 nm + 7 nm) de uma lâmpada de

mercúrio. Essa luz excita o complexo corante-DNA, causando a luz a emitir um pico

a 458 nm. O filtro de emissão colocado em frente ao fotodetector, permite apenas

fluorescência de 460 + 15 nm ser detectada. Portanto, a fluorescência medida é um

indicador direto da concentração de DNA. A medida de fluorescência não é uma

unidade absoluta e sim relativa a um branco e a um padrão com concentração

conhecida.

a) Preparar as soluções necessárias para o ensaio e a solução DNA padrão

(“calf thymus” DNA)

SOLUÇÕES ESTOQUES

22

Tampão 10 x TNE Solução Estoque

(100 mM Tris, 10 mM EDTA, 2 M NaCl, 100 ml)

Tris base (PM = 121,14) 1,211 g

EDTA, sal dissódico, dihidratado (PM = 372,20) 0,372 g

NaCl 11,689 g

Completar volume até 70 ml com água mQ

HCl concentrado até pH 7,4

Completar volume até 100 ml

Filtrar antes do uso (0,45 µm). Armazenar a 4oC por até 3 meses.

Solução de Corante Hoescht 33258 ( 1mg/ml)

USE MÁSCARA E LUVAS

Hoescht 33258 10 mg

Água mQ 10 ml

Não filtrar. Armazenar a 4oC por até 6 meses protegendo da luz.

Padrão de DNA “calf thymus” (100 mg/ml)

Solução estoque 1 mg/ml de padrão 100 ml

10 x TNE 100 ml

Água mQ 800 ml

Solução de Trabalho 1 x TNE Baixa concentração (A)

(concentração final do DNA a medir entre 10 a 500 ng/ml)

0,1 mg/ml de H 33258 em 1 x TNE (0,2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA,

pH 7,4)

solução estoque de H 33258 10 ml

10 x TNE 10 ml

Água mQ destilada 90 ml

b) Zerar o instrumento. Prepare um branco usando 2 ml da solução de

trabalho A (baixa concentração). Seque o lado da cubeta com lenço de

23

papel. Insira a cubeta no poço, feche a tampa, e aperte o botão <ZERO>.

Depois que aparecer 0 no display, remova a cubeta.

c) Calibrar o instrumento. Aplique 2 ml da solução de DNA padrão nos 2 ml

de Solução de Trabalho A. Misture com pipetagem várias vezes. Coloque a

cubeta no poço, feche a tampa e aperte o botão <CALIB>. Digite 100 e

aperte <ENTER>. Depois que o valor aparecer no display, remova a cubeta.

d) Zerar o instrumento. Retire a cubeta, esvazie e rinse. Seque a cubeta

sobre lenço de papel. Adicione 2 ml da solução de trabalho A (baixa

concentração) .Insira a cubeta no poço, feche a tampa, e aperte o botão

<ZERO>. Depois que aparecer 0 no display, remova a cubeta.

e) Ler a amostra. Adicionar 2 ml da amostra e misture bem. Coloque a cubeta

no poço, feche a tampa e registre a leitura.

f) Ler as amostras subseqüentes. Repetir os passos 4 e 5 para cada

amostra.

Importante:

- ligue o instrumento 15 minutos para estabilizar a lâmpada antes de medir

- use luvas pois o corante pode ser mutagênico.

- Toda as soluções devem estar à temperatura ambiente antes de medir a

fluorescência

- Preparar solução de trabalho fresca para uso do dia

- Filtrar o tampão TNE antes de acrescentar o corante

24

2 AMPLIFICAÇÃO

2.1 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

A técnica reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain

Reaction), foi concebida por Kary Mullis em meados da década de 80. Desde a sua

concepção causou uma verdadeira revolução nas pesquisas. O impacto da PCR e

seus métodos derivados deram a Kary Mullis o prêmio Nobel.

Reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica que envolve a síntese

in vitro de milhões de cópias de um segmento de DNA na presença da enzima DNA

polimerase

Um importante avanço técnico no processo surgiu com a descoberta da Taq

polimerase oriunda da bactéria Thermus aquaticus a qual vive em fontes de água à

temperatura de 75ºC encontrada no do “Yellowstone National Park” (figura 3).

Figura 3 - Thomas D. Brock no Lago do “Yellowstone National Park”

A enzima tem uma temperatura ótima de ação a 72ºC, mas permanece

razoavelmente estável mesmo a 94ºC e com isto, a enzima ‘e adicionada uma única

25

vez. Devido a este fato, foi possível a automatização do processo nos chamados

termocicladores (figura 4).

Figura 4- Termocicladores

A maior aplicação desta metodologia é a possibilidade de se amplificar numa

determinada seqüência do DNA sem a necessidade do uso das tradicionais técnicas

de clonagem molecular. Uma simples copia de um gene especifico dentro de um

genoma pode ser amplificada para alguns microgramas, partindo-se de quantidades

mínimas como picogramas de DNA total. A condição básica para a aplicação da

técnica, depende da construção de oligonucleotidoes iniciadores (primers) os quais

são complementares as duas fitas opostas do DNA e que estejam flanqueando a

seqüência a ser amplificada.

Como podemos ver, no processo basicamente ocorre em 3 fases:

desnaturação, anelamento e extensão, os quais, constituem um ciclo de reação de

amplificação.

O processo inicia-se com a desnaturação da dupla fita do DNA que contém a

seqüência a ser amplificada. Geralmente, a desnaturação é realizada a uma

temperatura de 94ºC durante 5 minutos, onde nesta temperatura as duas fitas do

DNA separam-se (figura 5).

26

Figura 5 - Representação esquemática de algumas etapas da técnica PCR, mostrando a ligação dos iniciadores (primers) ao segmento de interesse e a amplificação em progressão geométrica dos fragmentos a cada ciclo. (Griffiths et al., 2000).

O passo seguinte consiste em baixar a temperatura de acordo com o primer

especifico (usualmente 5ºC abaixo do TM real dos primers), permitindo que os

oligonucleotideos iniciadores anelem-se especificamente nas extremidades

flanqueadas da seqüência alvo e nas fitas opostas.

Finalmente, no terceiro passo a temperatura é elevada para

aproximadamente 72ºC e nesta temperatura, há incorporação de 35 a 100

nucleotideos por segundo, dependendo da enzima, do tampão, do pH, da

concentração de sal e da natureza do DNA-template e com isto a polimerase copia a

seqüência alvo a partir dos oligonucleotideos iniciadores é a fase de extensão.

27

3 PURIFICAÇÃO DA AMPLIFICAÇÂO

Qualquer análise em genética molecular requer, obviamente, o estudo do

DNA ou do RNA, pelo que o primeiro passo em qualquer técnica genética consiste

no isolamento e purificação de uma ou mesmo das duas espécies de ácidos

nucléicos.

Para o isolamento e purificação dos ácidos nucléicos, encontram-se

disponíveis várias técnicas alternativas as quais originam DNA ou RNA com

diferentes graus de pureza e de integridade física. Na maioria dos casos, estas

técnicas iniciam-se com o processo de libertação dos ácidos nucléicos, o que

envolve a lise das células a estudar, seguida de ataques enzimáticos e/ou químicos

para destruir os componentes protéicos da mistura. Já no que diz respeito ao

processo de purificação dos ácidos, várias alternativas se encontram disponíveis. O

processo de purificação mais econômico e simples é denominado de salting-out e

consiste na insolubilização dos longos filamentos de DNA por ação da concentração

salina da solução . Neste método, o DNA obtido é de baixa pureza, sendo recolhido

por suave enrolamento com uma vareta de vidro após adição de um sal. O DNA

assim preparado necessita depois de ser submetido a um longo processo de

ressolubilização, após o que se encontra pronto para ser estudado. Note-se que

apesar do baixo custo envolvido, este é um processo muito ineficiente devido á

baixa pureza do DNA obtido, ao elevado teor de mão de obra necessário, e ao longo

tempo de preparação que envolve. O processo tradicional de preparação de DNA de

elevada pureza e integridade fisica é denominado de fenol-clorofórmio.Este

processo deve o seu nome ao fato de envolver o ataque químico de proteínas e

outros compostos celulares por ação do fenol dissolvido em clorofórmio. Esta

mistura contém ainda habitualmente δ-hidroxiquinelona como corante (facultativo) e

álcool isoamilico como regulador da densidade. Neste processo, após a libertação

dos ácidos nucléicos, a solução aquosa é misturada com igual volume de solução de

fenol/clorofórmio, e após homogeneização suave, é centrifugada. Como as soluções

aquosa (contendo o DNA) e orgânica (contendo o fenol) são imiscíveis, após a

centrifugação podemos facilmente recolher a fase aquosa (no topo do tubo) e rejeitar

a fase orgânica (no fundo do tubo) e a interfase contendo um anel esbranquiçado

28

proteínas oxidadas e precipitadas. Note-se que a remoção da fase aquosa deve ser

executada com muito cuidado, para que a alta viscosidade não acarrete o

arrastamento de interfase protéica. O processo repete-se ciclicamente até não ser

observável a presença de interfase protéica. No final, o DNA é precipitado com a

adição de um sal e um álcool, e depois de centrifugados e secos brevemente é

então redissolvido. Este processo, apesar de permitir obter DNA de elevada pureza,

concentração e integridade física, tem como o salting out a desvantagem de ser

exigente do ponto de vista da mão-de-obra e do

tempo de execução, envolvendo ainda a manipulação de compostos tóxicos

como o fenol e o clorofórmio, o que exige condições não facilmente compatíveis com

um laboratório de rotina de análises clinicas.

PROTOCOLO

Segue abaixo o protocolo de purificação de DNA ULTRACLEAN PCR CLEAN UP

KIT da MO BIO Laboratories, Inc.:

1. Adicione a solução SpinBind na reação de PCR na proporção de 5:1. Exemplo: se

sua reação de PCR for de 100ul, adicione 500ul da solução.

2. Misture muito bem. Se você utilizar óleo mineral, verá duas camadas, sendo a

superior correspondente ao óleo.

3. Transfira então a reação para o filtro, evitando pegar a fase de óleo.

4. Centrifugue de 10 - 30 segundos a no mínimo 10.000g

5. Remova o filtro e descarte o filtrado do microtubo. Coloque o filtro de volta

neste mesmo tubo.

6. Adicione 300 µl da solução SpinClean buffer no filtro.

7. Centrifugue de 10 - 30 segundos a no mínimo 10.000g

29

8 . Remova o filtro e discarte o filtrado que esta no microtubo e coloque o filtro

novamente no mesmo tubo.

9. Centrifugue novamente de 30 - 60 segundos a 10.000g, no mínimo

10. Transfira o filtro para um novo tubo que acompanha o Kit.

11. Adicione 50ul de Elution Buffer (10mM Tris) que acompanha o kit ou então água

milli Q autoclavada no centro do filtro. Recomenda o uso do tampão fornecido com o

kit.

12. Centrifugue de 30 - 60 segundos a no mínimo 10.000g

13. Descarte o filtro. Armazene o tubo com DNA em freezer -20°C ou -80°C

30

4 CLONAGEM   

                     

 Clone é o organismo ou grupo de organismos que derivam de outro através

de um processo de reprodução assexuada. O termo tem sido aplicado tanto a

células quanto a organismo, de modo que um grupo de células que procedem de

uma célula única também recebe este nome. Em geral, os clones têm características

hereditárias idênticas, ou seja, os seus genes são iguais. Por exemplo, os gêmeos

idênticos são parte de um clone, os procariontes,   a maioria dos protozoários e

algumas leveduras reproduzem-se por clonagem.

 Devido aos recentes progressos da engenharia genética, os cientistas podem

isolar um gene individual (ou grupo de genes) de um organismo e implantá-lo em

outro de uma espécie diferente.

Na década de 90, cientistas começaram a clonar organismos inteiros. O

primeiro deles foi uma ovelha, que ficou conhecida como Dolly, clonada a partir de

uma célula mamária de outra ovelha. No final de 1998, cientistas japoneses

anunciaram êxito numa experiência de clonagem de vacas.

 

4.1 CLONAGEM DE DNA

Produção de cópias exatas (clones) de um gene em particular ao conjunto de

genes utilizando técnicas de engenharia genética. O DNA contendo os genes "alvo"

é dividido em fragmentos utilizando enzimas de restrição.

Estes fragmentos são inseridos em vetores de clonagem, que transferem o

DNA recombinante para as células receptoras. Alternativamente o DNA pode ser

diretamente adquirido pelas células receptoras do meio (método menos eficaz do

que utilizando vetores).

Dentro da célula receptora o DNA recombinante sofre replicação. Assim, a

célula receptora vai dar origem a uma colônia de células contendo o gene alvo

clonado. Podem ser usados vários métodos para identificar essas colônias,

permitindo a sua seleção e cultura.

31

A clonagem de DNA facilita a seqüenciação; também permite que grandes

quantidades de uma proteína desejada sejam produzidas (exemplo: insulina

humana)

 

CICLO CELULAR

Período que compreende todo o tempo da vida de uma célula, desde a sua

formação, à sua subdivisão em células filhas.

A  duração do ciclo celular varia de células para células, mas é constante em

células do mesmo tipo.

 a) enzima de restrição

Enzima que percorre a molécula de DNA, fragmentando-a sempre que

reconhece seqüências de bases específicas.

São já bem conhecidas mais de 100 enzimas de restrição e cada uma

delas corta o DNA quando reconhece determinada seqüências de bases.

 

b) Vetor de clonagem

É o "veículo" utilizado na clonagem de DNA para introduzir o fragmento

de DNA estranho no genoma da célula receptora (por exemplo: plasmídeos ou

fagos)

 

c) Quiescência

É o estado no qual as funções mais básicas de uma célula ou conjunto

de células deixam de se realizar. É normalmente uma resposta a uma

condição ambiental desfavorável, tal como a falta de alimento. A célula torna-

se dormente até que o seu ambiente se torna favorável. Neste estado os

genes que definem a função da célula diferenciada encontram-se desativado o

que torna a célula propicia para a transferência nuclear.

 

d) Transferência nuclear

O núcleo de um ovócito é removido e introduz-se nesta célula o núcleo

de uma célula corporal preparada especialmente. A fusão entre o núcleo e o

32

ovócito anucleado é provocado por um impulso elétrico ou introdução de

químicos, o que provoca o início do desenvolvimento do ovo. Este processo

ainda não é muito bem conhecido e muitas tentativas falham logo ao início.

       

e) "Gene targeting"

As técnicas da biologia molecular moderna fornecem-nos uma

ferramenta capaz de efetuar mudanças muito precisas na informação

genética de uma célula. Isso pode envolver remoção, substituição ou adição

de uma seqüência de DNA. O que pode ser útil para modificar as

características de uma célula para ser usada num processo de transferência

nuclear.

4.3 ESTIMATIVA DE CONCENTRAÇÃO DE DNA

A estimativa da concentração de DNA depende do tipo e quantidade de

amostra disponível. Para amostras com certo grau de pureza, com baixo nível de

contaminação por proteínas, fenóis, polissacarídeos, álcool, ou outros ácido

nucléicos, a estimativa por espectrofotômetro, medida pela absorbância das bases a

260 nm consiste num método simples, rápido e com certa precisão. Para

quantificação de DNA, as leituras devem ser feitas entre 230 nm até 320 nm. A

leitura a A260nm permite o cálculo da concentração da ácidos nucléicos na amostra.

Uma DO (Densidade óptica) de l corresponde aproximadamente a 50 mg ml-1 para

DNA dupla fita, 40 mg ml-1 para DNA e RNA fita simples, e cerca de 20 mg ml -1 para

oligonucleotídeos. A relação entre A260nm e A280nm (DO260/DO280) fornece uma

estimativa da pureza dos ácidos nucléicos. Soluções puras de DNA e RNA

possuem valores de DO260/DO280 entre 1,8 e 2, respectivamente. Se existe

contaminação com fenol ou proteínas, a relação DO260/DO280 será muito menor, e a

precisão nas quantidades de ácidos nucléicos será baixa.

O uso de protocolos de extração de DNA simplificados, que utilizam pouco

material de origem, ou possuem poucos passos de purificação, tendem a produzir

ácidos nucléicos com maior contaminação. Em plantas tropicais, existe um grande

problema de contaminação com polifenóis e polissacarídeos. Nesses casos, a

estimativa por espectrofotometria não permitem uma determinação acurada da

33

concentração de DNA. Nesse caso, o método de escolha consiste na fluorometria.

A amostra de DNA a ser estimada é tratada com um corante específico para DNA

dupla fita (ex. Hoechst 33258), e esse corante é excitado a um comprimento de onda

(365 nm) e com emissão a 460 nm proporcional a concentração de DNA. RNA,

proteínas e nucleotídeos não afetam as leituras. (FERREIRA E GRATTAPAGLIA,

1995: 124-125).

Outros métodos empregados utilizam a característica da fluorescência em

ultravioleta induzida pela intercalação de brometo de etídeo na dupla fita de DNA. A

fluorescência é proporcional à concentração de DNA, e pode-se determinar a

quantidade de DNA numa amostra por comparação com padrões conhecidos. A

comparação de fluorescência pode ser feita num mini-gel, que permite também a

separação de DNA do RNA. Uma outra possibilidade é aplicar a amostra numa

placa de petri com 1% agarose contendo brometo de etídeo (0,5 mg ml -1), e

comparar com padrões. Manter a placa a 37ºC por cerca de 30 minutos e observar

no transiluminador (usar 0,5 g de agarose 1% em 50 ml de tampão TAE, adicionar 5

µl de brometo de etídeo 10 mg/ml e analisar alíquotas de 2 µL).

4.4 PREPARAÇÃO DO PLASMÍDEO (PREP)

O desenvolvimento de terapias moleculares como a terapia gênica e as

vacinas de DNA levaram ao aumento da necessidade de obtenção de grandes

quantidades de plasmídeos puros. Embora existam diversos métodos para purificar

plasmídeos, baseados nos procedimentos utilizados em biologia molecular, a maior

parte não é adequada para utilização em larga escala. Além disso, estes utilizam

geralmente reagentes tóxicos impossibilitando a sua utilização na purificação de

produtos terapêuticos. Nos últimos anos foram feitos alguns progressos nesta área

tendo-se desenvolvido novos métodos cromatográficos. Contudo existem ainda

algumas metodologias a serem exploradas. Uma das mais promissoras parecem ser

os sistemas de duas fases aquosas (SDFA). Estes se formam quando dois

polímeros ou um polímero e um sal se misturam em água acima de uma

determinada concentração crítica. As duas fases que se formam têm diferentes

características físico-químicas o que permite a separação de componentes de uma

mistura complexa. A variação dos parâmetros do sistema como o pH, a

concentração, peso molecular e tipo de polímeros e sais permitem a definição de

34

condições para a purificação do composto pretendido. As suas condições suaves,

simplicidade técnica, baixo custo, não toxicidade dos reagentes, facilidade de

aumento de escala e operação em contínuo torna-os adequados para a purificação

de biomoléculas em larga escala.

********Este projeto pretende desenvolver um processo de purificação de

plasmídeos baseado em SDFA contendo polímeros catiônicos. Sendo o DNA um

poliânion em solução é esperado que nestes sistemas os plasmídeos sejam

extraídos para a fase em que o polímero catiônico se acumula. Embora existam

outras espécies aniônicas na preparação impura de plasmídeo o teste de diversos

sistemas e condições permitirão a seleção das condições apropriadas para a sua

purificação. Vários SDFA serão testado para avaliar a sua capacidade para purificar

o plasmídeo modelo pVax1LacZ um vector utilizado para a produção de vacinas de

DNA.

Antes deste estudo os sistemas serão caracterizados pela determinação do

seu diagrama de fases. Os polímeros catiônicos serão utilizados como polímero

dominante numa das fases e também adicionados em pequenas quantidades a

sistemas polímero-polímero de modo a atuarem como ligados de afinidade e

direcionarem a partição do plasmídeo para uma das fases.

Em ambos o caso é esperado que o plasmídeo condense com o polímero

catiônico formando um poliplexo. Estes poliplexos serão depois isolados utilizando

métodos cromatográficos. Serão testadas a cromatografia de troca aniônica, de

exclusão molecular e de interação hidrófoba previamente utilizado para purificar os

plasmídeos e selecionado o melhor método. Os polímeros catiônicos utilizados

serão a polietileneimina, o poli-L-lisina e polímeros de poliamidoamina. Estes

polímeros têm sido referidos como eficientes vectores na terapia gênica e deste

modo o desenvolvimento deste procedimento permitirá a definição de um processo

fácil de produção de agentes para terapia molecular.

4.4.1 Inserindo DNA num Plasmídeo para clonagem 

 Finalmente podem-se discutir as bases da clonagem de DNA. Para

exemplificar o procedimento empregou-se um plasmídeo como vetor de clonagem e

cortou-se o plasmídeo e o DNA a ser clonado com uma enzima de restrição que

forma extremidades coesivas. É preciso ter em mente, contudo, que existem vários

outros vetores de clonagem e diferentes formas de fragmentar e clonar o DNA (com

35

enzimas de restrição que deixam extremidades cegas, com ou sem posterior

encaudeamento, com nebulização e com prensa francesa).

O processo se inicia pela extração do DNA das células doadoras e do

plasmídeo (neste exemplo, um plasmídeo pequeno, de aprox. 2,5 kpb, da bactéria E.

coli). A extração de DNA não é um processo complexo: resumidamente, as células

são lisadas com um detergente, os restos celulares e boa parte das proteínas

precipitadas por centrifugação em presença de uma concentração elevada de sal

(em geral acetato de potássio) e o sobrenadante, transferido para outro tubo, é

misturado com isopropanol. O DNA não é solúvel neste álcool, mesmo diluído com

água, e tende a precipitar. Para acelerar o processo centrifuga-se o material a

13.000 rpm por alguns minutos e o precipitado é ressuspenso em água ou num

tampão adequado. O DNA que se obtém desta forma não é muito limpo, mas serve

para uma boa parte das aplicações corriqueiras de laboratório. Atualmente kits

comerciais permitem a extração rápida de DNA de praticamente qualquer tipo de

célula, em quantidades e grau de pureza que satisfaçam ao mais exigentes

pesquisadores.

             A extração do plasmídeo é semelhante à descrita acima, mas é preciso

usar um estratagema para separar o plasmídeo do DNA bacteriano. O DNA

plasmidial é muito menor que os fragmentos de DNA cromossômico bacteriano. O

truque então consiste em adicionar à solução de lise uma certa quantidade de álcali.

O pH alto desnatura o DNA. Logo em seguida adiciona-se ácido acético glacial e

acetato de potássio: o ácido neutraliza o álcali e os DNAs tendem a renaturar.

Porém, a presença de sal provoca a precipitação de todas as moléculas que não

forem muito solúveis em água. O DNA desnaturado é pouco solúvel em água e

precipita. É o caso dos fragmentos grandes de DNA cromossômico, que não

conseguem se renaturar e precipitam (por centrifugação), junto com as proteínas da

bactéria e restos celulares. O DNA plasmidial, ao contrário, renatura-se rapidamente

e torna-se muito solúvel em água, não podendo ser precipitado. Assim, recolhendo o

sobrenadante, teremos essencialmente DNA plasmidial, com uma contaminação

pequena de DNA cromossômico bacteriano.

             Uma vez com os dois DNAs disponíveis (doador e plasmidial), resta cortá-

los com a enzima de restrição escolhida e misturar os dois DNAs. A tendência será

parear as extremidades coesivas, formando construções híbridas, ou quimeras. A

adição de ligase completa a cadeia fosfodiéster em cada uma das fitas de DNA. Este

passo está representado na parte superior da (figura 6).

36

Figura 6 - Esquema para a obtenção de plasmídeos recombinantes, a partir do uso de uma enzima de restrição que cria extremidades coesivas. Para maiores detalhes veja o texto acima.

            Ao menos 5 produtos distintos podem ser formados a partir desta mistura. O

produto 1 é o desejado, no qual um inserto (verde) foi clonado no plasmídeo

(vermelho). Mas, lamentavelmente, outras construções também aparecem: o

produto 2 é o mais danoso ao processo, pois se trata do plasmídeo vazio, fechado

sem inserto. Ele é perfeitamente funcional e não pode ser descartado do processo.

O produto 3 é a circularização de vários fragmentos de DNA do doador, numa ordem

qualquer. Este "lixo" não é problemático, porque não contém uma origem de

replicação bacteriana. É um DNA que será perdido ao longo do tempo. O produto 4

é a união de dois (ou mais) plasmídeos e não se replica tão rápido quando o

plasmídeo vazio ou carregado com apenas um inserto, de forma que acaba

desaparecendo ao longo do tempo. O último "lixo" é o plasmídeo carregado com

vários insertos concatenados (ligados em cadeia) ou com um inserto muito grande.

É uma construção instável, também, e tende a desaparecer. Assim, excetuando o

plasmídeo vazio, todos as outras quimeras "lixo", uma vez na bactéria, tendem a

desaparecer e não são problemas para o experimentador.

             Uma vez ligado o inserto com o plasmídeo (e produzidos os vários possíveis

lixos, também), é preciso introduzir estas construções na bactéria hospedeira. Isto é

feito pela entrada passiva de DNA através da membrana de bactérias previamente

tratadas com uma solução de cloreto de cálcio, ou ativamente, através de choques

elétricos, num processo chamado eletroporação. A eficiência de transformação

37

(entrada de DNA na bactéria) é bastante baixa (10-3 a 10-8), mas os transformantes

terão o plasmídeo dentro deles, o que lhes deve conferir propriedades novas, que

permitam uma seleção positiva. De fato, os plasmídeos têm um gene que confere à

bactéria a resistência a um certo antibiótico (suponhamos, ampicilina), de forma que

basta adicionar ampicilina ao meio e eliminaremos rapidamente todas as bactérias

que não tiverem plasmídeo (vazio ou carregado).

O plasmídeo vazio confere a mesma resistência ao antibiótico que o

plasmídeo carregado. Entretanto, é possível averiguar ao menos se, no conjunto de

plasmídeos formados, a maior parte está carregada (com inserto) ou, ao contrário,

vazia. Para tal os plasmídeos de clonagem têm uma segunda marca de resistência a

antibióticos (em geral, tetraclina), que é perdida quando o plasmídeo é aberto e o

inserto é clonado. Significa dizer que o sítio de clonagem é interno ao gene para a

resistência à tetraciclina. Significa também dizer que as bactérias que têm

plasmídeos vazios são resistentes a ampicilina e tetraciclina, enquanto as que têm

plasmídeos com inserto só mostram resistência a ampicilina. O procedimento

baseia-se na obtenção de uma réplica de uma placa de Petri contendo colônias

crescidas em presença de ampicilina, que é então carimbada sobre uma nova placa

de Petri contendo tetraciclina. As colônias que crescerem também em tetracilcina

não interessam, mas podem ser contadas. A figura 7 mostra esquematicamente o

procedimento, desenvolvido para outros fins, há quase 50 anos, por Joshua

Lederberg, que também recebeu o Prêmio Nobel pelos seus estudos (Joshua

Lederberg, George Beadle e Edward Tatum receberam o prêmio Nobel de Fisiologia

ou Medicina em 1958. Lederberg provou a existência da recombinação genética em

bactérias e contribuiu de forma importante para o conhecimento da organização

gênica de microrganismos. Beadle e Tatum mostraram que os genes agem

regulando eventos químicos definidos).

38

Figura 7 - O processo conhecido como réplica, na qual um carimbo de veludo estéril, facilmente improvisado sobre um cilindro de madeira, serve para transferir um pouco de bactérias de cada colônia de uma placa para outra. Após 24 horas o crescimento na nova placa é avaliado. Neste caso a primeira placa contém meio de cultura adicionado de ampicilina, enquanto na segunda o meio contém tetraciclina. Da figura pode-se concluir que a maior parte das bactérias da amostra é sensível à tetraciclina e alberga, portanto, plasmídeos recombinantes (quiméricos, ou com inserto).

5 REAÇÃO DE SEQÜENCIAMENTO

O método de Seqüenciamento do DNA mais utilizado no momento foi

desenvolvido por Sanger e colaborador (1979), conhecido também como método do

término do crescimento.

O seqüenciamento do DNA através deste método exige a clonagem do

fragmento de DNA e de seus subfragmentos a serem seqüenciados em vetores

apropriados como os da serie M13mp os quais têm sido largamente utilizado parra

esta finalidade.

O principio do método baseia-se na capacidade da DNA polimerase copiar

uma fita de DNA a partir do molde na presença de um iniciador. A reação de

seqüenciamento consiste na hibridização de um oligonucleotídeo sintético

39

(iniciador), com uma região conhecida do vetor (M13), imediatamente adjacente ao

inserto a ser seqüenciado.

A seguir, promove-se a síntese da fita complementar empregando o

fragmento Klenow da DNA polimerase I e uma mistura de deoxinucleotídeos (dNTP),

sendo um deles marcado com 32P ou 35S.

No processo são realizadas quatro reações independentes, sendo que em

cada uma delas é adicionado um tipo de dideoxinucleotídeos (ddNTP). Em cada

reação, uns números muito grandes de moléculas de fita complementar estão sendo

copiados simultaneamente. No entanto, em um dado momento da extensão, uma

pequena porcentagem de moléculas ira incorporar um ddNTP e neste caso a reação

de alongamento da cadeia será automaticamente interrompida naquele sitio, devido

a ausência do grupamento 3’OH do ddNTP. Por outro lado, em outras moléculas a

reação de extensão continua a ocorrer até que um ddNTP seja incorporado.

Sendo assim, em cada uma das quatro reações, haverá fragmentos de todos

os tamanhos sendo que todos eles têm inicio comum, ou seja, adjacente ao

iniciador.

Uma vez terminada as reações de extensão, cada fragmento recém-

sintetizado é separado em gel desnaturado de poliacrilamida-uréia e a seguir

autoradiografado. Como este tipo de gel tem alto poder de resolução, é possível

então visualizar na auto-radiografia cada um dos fragmentos sintetizados como uma

banda especifica. Desta forma, é possível analisar de 200 a 300 nucleotídeos por

gel.

5.1 Seqüenciamento Automático

A utilização de seqüenciadores automáticos é essencial quando se deseja

realizar seqüenciamento em larga escala, como por exemplo, em projetos genoma.

O desenvolvimento e utilização de seqüenciadores automáticos tornam mais

eficientes e rápidos o seqüenciamento de DNA na medida em que as etapas de

leitura do gel e o processamento de seqüências são realizados através de

computadores. A reação de seqüenciamento é realizada através do método de

Sanger (1979), do mesmo modo que no seqüenciamento manual. Entretanto, no

seqüenciamento automático os nucleotídeos estão marcados com fluorocromos ao

invés de isótopos radioativos. Quatro diferentes fluorocromos são empregados e

40

uma vez excitados por um feixe de laser emitem sinais luminosos de diferentes

comprimentos de onda. É possível marcar com este fluorocromos o “primer”

universal M13 ou então cada um dos dideoxinucleotídeos (terminadores). Assim,

uma vez que em cada uma das reações (A, T, C, G) foi empregado um fluorocromo

diferente é possível juntar estes produtos às reações de seqüenciamento, marcados

com fluorocromos, ao serem submetidos à eletroforese passam pelo feixe de laser,

que promove a excitação dos fluorocromos. A luz emitida pelo fluorocromos é

detectada por um fotomultiplicador e a informação é processada através de um

computador.

No seqüenciamento de DNA, as reações com diferentes dideoxinucleotídeos

são realizadas em um plasmídeo M13, no qual encontra-se clonado o fragmento de

DNA a ser seqüenciado. Cada uma das misturas de reação contém o primer

universal M13 marcado com um fluorocromo diferente. Os produtos de reação são

agrupados e submetidos à eletroforese em uma única raia de gel de

seqüenciamento.

Figura 8 - Seqüenciamento

41

6 PURIFICAÇÃO DA REAÇÃO

No seqüenciamento de DNA várias etapas são indispensáveis para obtenção

de seqüências de qualidade. Uma delas é a purificação, empregada na remoção de

resíduos provenientes da reação em cadeia da polimerase com ddntps, restos de

primers, sais entre outros resíduos. Na transformação o DNA de interesse é

ligado ao vetor geralmente plasmídeo que é introduzido em célula hospedeira

compatível, normalmente bactéria E. coli. O arranjamento é a etapa seguinte

consistindo na separação de clones da bactéria, esses clones são distribuídos

em 96 poços da placa de cultura permanente para ser amplificado. A

minipreparação de DNA (MINIPREP) consiste na separação do DNA plasmidial

dos demais componentes bacterianos retirando sais, desnaturando e

removendo compostos celulares da bactéria, como membrana, parede celular,

entre outros compostos. A quantificação é um método de controle da

quantidade e qualidade do DNA extraído na minipreparação consiste na

confecção de um gel de agarose, onde se aplica amostras de DNA e um padrão

de concentração de DNA conhecido, um controle, onde se comparando os

mesmos avalia-se a quantidade de DNA presente. A reação em cadeia da

polimerase (PCR) é mediada por uma mistura que contém primer específico

responsável pela amplificação do DNA produzindo novas fitas, um kit Big Dye

42

Terminator, responsável pela formação fluorocromos no DNA que quando excitados

por um feixe de laser emitirão diferentes comprimentos onda capazes de serem

reconhecidos pelo seqüenciador automático. A mistura possui ainda um tampão

(save money) diluído em água em igual concentração. Normalmente a reação de

PCR produz milhões de cópias de um único fragmento de DNA, anelamento, e

formação de fluorocromos nos nucleotídeos no DNA. Antes do seqüenciamento, as

placas precisam passar por um processo de purificação onde são utilizados

isopropanol, e etanol por no mínimo duas vezes, este procedimento permite melhor

aproveitamento dos resultados já que elimina restos indesejáveis resultantes do

PCR. O seqüenciamento é mediado por uma maquinaria automatizada comandada

por softwares onde cada comprimento de onda emitido pelos fluorocromos é

captada pelo seqüenciador e processada em um computador.

6.1 DNA LIGASE

Conforme mencionada anteriormente esta enzima promove a ligação dos

fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de

restrição. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das

cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 9). A

E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA

com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactérias requer NAD+,

enquanto que a isolada do bacteriófago T4 requer ATP como cofator.

Figura 9 - DNA ligase catalisa a junção de duas fitas de DNA que são partes da molécula da dupla-hélice.

43

6.1.1 Tipos de Fragmentos de DNA que são ligados pela DNA Ligase

a) Fragmentos com extremidades coesivas

As extremidades coesivas produzidas por várias enzimas de restrição

permitem dois fragmentos de DNA ligarem-se facilmente, através da formação

de pontes de hidrogênio pela complementariedade das bases. Finalmente a

ligação covalente dos fragmentos é realizada pela DNA ligase (figura 10).

Figura 10. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas

em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T).

b) Fragmentos com extremidades não coesivas

DNAs portando extremidades não coesivas são ligados com muito

menos eficiência que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma

concentração muito maior de DNA ligase e mesmo dos DNAs envolvidos é

necessária para que as moléculas com extremidades não coesivas sofram

reação de ligação.

44

No entanto, a ligação deste tipo de fragmento é facilitada pela

transformação prévia das extremidades não coesivas em coesivas. Este

procedimento pode ser feito através de dois processos:

Adição de polidesoxi (A) na extremidade 3' de um fragmento de DNA e

polidesoxi (T) na extremidade 3' de um outro fragmento de DNA, através da

enzima desoxinucleotidil transferase terminal ou simplesmente transferase.

Esta enzima, uma DNA polimerase incomum, adiciona nucleotídeos à

extremidade 3’-OH de fragmentos fita simples proeminente de uma cadeia de

DNA. Para gerar este tipo de extremidade proeminente a molécula é tratada

previamente com uma exonuclease 5’-específica para remover alguns

nucleotídeos terminais. Após a mistura dos dois tipos de fragmentos

complementares e anelamento dos mesmos, as moléculas são unidas

preenchendo-se os espaços existentes com o auxílio da DNA pol I e selando-

os com DNA ligase (Figura 11)

Figura11. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformados em coesivas pela adição de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrição que reconhece o adaptador.

Adição de adaptadores às extremidades não coesivas.

Os adaptadores são oligonucleotídeos sintéticos e complementares

que contêm sítios de clivagem para uma ou mais enzimas de restrição.

Eles são unidos ao DNA com o auxílio da DNA ligase.

c) O terceiro método utiliza T4 ligase em concentrações que pode ligar

moléculas de DNA sem proeminências.

45

7 SEQÜENCIAMENTO DE DNA

O seqüenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos

nucleotídeos (blocos que constituem a molécula de DNA) em uma amostra. Existem

vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.

Até meados da década de 70 não era nada simples obter uma seqüência de DNA,

fosse ele fita simples ou dupla. De fato, trabalhar com DNA era muito mais

complicado do que com proteínas e o conhecimento sobre os ácidos nucléicos

avançava de forma lenta. No início da década de 80 uma técnica relativamente

rápida de seqüenciamento de DNA foi desenvolvida, que empregava a quebra de

uma cadeia de DNA com diferentes produtos químicos e a visualização dos

fragmentos gerados por eletroforese. Havia necessidade de fazer-se a marcação

radiativa das moléculas porque a quantidade de material produzida era muito

pequena e não podia ser detectada de outra forma. Mesmo com todas estas

dificuldades houve então um rápido progresso no conhecimento de seqüências de

DNA. Poucos anos depois um novo avanço tecnológico foi alcançado pela

introdução da técnica de interrupção da seqüência pela incorporação aleatória de

um nucleotídeo modificado (sem a hidroxila na posição 3´), que ficou conhecida

como técnica de didesoxi ou dideoxi. Esta técnica suplantou imediatamente a

anterior e permitiu o desenvolvimento de seqüenciadores automáticos de DNA,

sobre os quais versa este capítulo. Ainda se faz eventualmente o seqüenciamento

manual, mas é muito mais trabalhoso, caro e arriscado, pois emprega substâncias

radiativas. De uma forma geral quando se deseja saber uma seqüência de bases de

um fragmento qualquer de DNA, purifica-se o fragmento e enviamos para

seqüenciamento numa empresa prestadora deste serviço.

46

O seqüenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos

nucleotídeos (blocos que constituem a molécula de DNA) em uma amostra. Existem

vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.

Um dos mais utilizados é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de

“terminadores de cadeia” ou de “Sanger”; ele constitui a base da metodologia

empregada no seqüenciamento do genoma humano. Sua estratégia consiste em

identificar, continuamente e seqüencialmente durante o processo, o último

nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da

reação deverão também portar uma “marca” que permita detectá-los na etapa de

análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeia simples

(não dupla) do DNA a ser seqüenciado; esta servirá de molde para gerar a outra

metade complementar da dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula

nativa” (fig 12).

Figura 12 - A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de 3’-desoxinucleotídeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ou ; um dos mais utilizado é o dATP ³²P (fig 2a). Como a enzima utilisada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente são necessários também, a presença na reação, de um pequeno fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade 3’ do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no local mencionado, e fornecerão um ponto de partida para a replicação do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou “primer", quando marcado, poderá ser utilizado para rastrear o fragmento de DNA recém sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo é que ele é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de análogo, 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos (ddNTPs) (fig 2b).

47

Figura 13. Terminadores

Estes análogos conhecidos como “terminadores” quando incorporados à

cadeia nascente, por não apresentarem 3’OH que permita formar ligação com o

próximo dNTP a ser adicionado, bloquearão todo processo. Como todos os

nucleotídeos normais (dNTPs) estão presentes, o alongamento da cadeia

prosseguirá até que a enzima DNA-polimerase insira um análogo (ddNTP).

Conseqüentemente, haverá parado imediata da reação de síntese no ponto em que

seu alongamento foi interrompido: na extremidade e a molécula estará marcada com

P³². Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido,

pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por

tamanho em gel de poliacrilamida individualmente: um canal de análise para cada

reação. O gel é “transferido” para um suporte de nitrocelulose (filtro).

Após auto-radiografia a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém

sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta é complementar à da

molécula seqüenciada que serviu de “molde”. Levando estas observações em

consideração, é possível conhecer a seqüência de nucleotídeos do DNA

seqüenciado de 3’ para 5’ partindo-se da parte inferior para a superior do gel. O

resultado e as etapas do processo descrito acima, freqüentemente mostrado em

fotografias nos livros especializados, pode ser observado no esquema da Fig 14.

48

Figura 14 - Autoradiograma

O método pode ser automatizado através de “maquinaria apropriada”

gerenciada por computadores com “softs” que lêm seqüencialmente e identificam os

produtos. Isto permitirá executar o processo em grande escala. Neste caso utilizam-

se simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) marcados

por fluorescência fig 4a. Como cada reação (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo

diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um

único canal do gel de seqüenciamento fig 4b. O sinal fluorescente diferencial emitido

por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos

baseado na diferença de comprimento de onda. A luz emitida é detectada por

“escaneamento” do gel e a seqüência deduzida por computador fig 4c. Variáveis

mais modernas, conseqüentemente mais rápidas e poderosas, incluem a

robotização total do processo com a inclusão das etapas de purificação e da reação

de síntese da cadeia do DNA.

7.1 PRODUÇÃO DE UM DNA PARA SEQUENCIAMENTO E A TÉCNICA DE DIDEOXI

49

Para sequênciar uns trechos de DNA, têm que ter uma grande quantidade

dele no nosso tubo de ensaio. Duas formas corriqueiras de se obter grandes

quantidades de uma determinada seqüência de DNA são a clonagem em plasmídeo

e a PCR. Se o DNA que queremos sequênciar for o inserto de um plasmídeo, tudo o

que precisamos é crescer 200 µL da bactéria com o plasmídeo e, empregando as

técnicas já usuais de extração de DNA, obter o plasmídeo purificado, que será

empregado na reação de seqüenciamento.  Se ainda não tivermos o material

clonado, podemos empregar a PCR e amplificar o trecho a ser seqüenciado,

purificando a banda do gel e usando o material assim obtido para iniciar a reação do

seqüenciamento. Neste caso, precisamos saber apenas as seqüências das

extremidades do trecho a ser seqüenciado. 

Um didesoxinucleotídeo trifosfato, ou ddNTP.  O precursor normal da síntese

de DNA é o dNTP, ou desoxiribonucleotídeo trifosfato, que apresenta uma hidroxila

na posição 3´. É a partir desta hidroxila que a fita nascente é estendida. Um ddNTP,

entretanto, não tem esta hidroxila. Logo, se for incorporado a uma fita de DNA,

interrompe a incorporação de outros nucleotídeos a partir dele. Se o ddNTP for

marcado associado à radiação ou fluorescência, a fita interrompida ficará radiativa

ou fluorescente e poderá ser detectada mais facilmente. Para fins vamos admitir que

cada didesoxibase está marcada com uma florescência diferente. Portanto, as fitas

terminadas em A, T, G ou C vão emitir cores diferentes quando excitadas com luz de

um determinado comprimento (em geral, de um feixe laser).

Na figura 15 exemplificamos como surgem as fitas simples estendidas a partir

de um primer (seta preta pequena) que pareia com uma seqüência específica (em

vermelho) do plasmídeo (trechos em amarelo), no qual foi clonado um inserto (azul)

entre os sítios de restrição EcoRI e XhoI. Observe que o inserto pode ter um

comprimento muito variável, tipicamente entre 500 e 3000 pb (pares de base). No

exemplo estamos admitindo que, numa determinada posição na seqüência do

inserto, uma parte dele tem uma base A e outra uma base G. É o que ocorre se

clonarmos um trecho de DNA de um alelo para o qual o doador é heterozigoto. 

Observe também que, do lado direito do inserto, há uma seqüência (em verde) na

qual pode parear um outro primer, que será empregado no seqüenciamento quando

quisermos vir da direita para a esquerda sobre o inserto. Jamais, contudo, os dois

primers são empregados simultaneamente, e por isto a reação de seqüenciamento

Por isso, não temos tanta preocupação com contaminação como nas reações de

50

PCR: podemos fazer múltiplas reações de seqüenciamento, lado a lado, numa placa

de 96 micropoços e mesmo reutilizar boa parte do material plástico empregado no

preparo do DNA ou na reação de seqüenciamento, em si, bastando para isto lavar

bem o material.

Ainda na figura, podemos ver que fragmentos de diferentes tamanhos são

gerados, porém nunca (exceto no caso onde houver moldes de DNA com

polimorfismo de base, como no caso A/G mostrado) dois fragmentos de igual

tamanho terminarão em bases diferentes. Na parte de baixo da figura todos os

fragmentos representados na parte de cima estão organizados por ordem de

tamanho. Observe que:

a) podem existir muitos fragmentos (fitas simples estendidas a partir do

primer) do mesmo tamanho, mas fatalmente terminarão na mesma base (exceto no

caso do polimorfismo do DNA molde);

b) podem existir fitas terminadas na mesma base (afinal, só temos 4 opções,

A,T,G ou C), com comprimentos diferentes. Não há qualquer restrição para isto.

c) há espaços mostrados na seqüência, onde não havia nenhum fragmento

gerado do tamanho esperado. Isto só acontece quando a reação gera poucos

fragmentos, mas uma reação deste tipo gera centenas de milhares de fragmentos de

cada tamanho e é muito pouco provável que existam seqüências não representadas

de um comprimento qualquer.

d) apenas onde há polimorfismo de base do DNA molde há fragmentos do

mesmo tamanho terminando em bases diferentes (é o caso A/G).

51

Figura 15. Fragmentos de diferentes comprimentos gerados a partir do primer, interrompidos quando um didesoxinucleotídeos é incorporado na fita. Os

didesoxinucleotídeos são marcados com substâncias fluorescentes diferentes, conforme a base (A,T,G ou C).

Quando os fragmentos gerados numa reação de seqüenciamento são

separados por eletroforese, os fragmentos menores vão à frente, seguidos dos

demais, sendo à distância entre as bandas aproximadamente iguais, pois representa

sempre a diferença de uma base a mais ou a menos. A figura 8.2 mostra

esquematicamente como esta separação acontece e como a fluorescência nas

bandas é identificada, na medida em que elas atravessam um trecho do gel que é

iluminado por um feixe laser (representado pela barra verde na parte de baixo do

gel).  Observe que à distância entre as bandas é regular. Um gel pode permitir o

seqüenciamento de 600-700 bases para cada reação, e podemos correr até 96

reações por gel. Há no mercado também seqüenciadores de DNA de última geração

nos quais o gel foi substituído por um feixe de capilares, que são automaticamente

preenchidos por um polímero, ao invés de gel. Cada reação de seqüenciamento é

separada no seu capilar e a fluorescência detectada individualmente, o que evita

uma eventual confusão entre seqüências causada pelos desalinhamentos das

corridas eletroforéticas, comum nos géis. Há máquinas com feixes de 1 a 384

capilares. As maiores são capazes de produzir mais de 2 mil seqüências em 24

horas.

Figura 16. Os fragmentos de diferentes comprimentos migram no gel, os menores na frente. São iluminados por um feixe de laser e fluorescem quando atravessam a janela do feixe. Um gel pode resolver 96 seqüências simultaneamente. Os géis têm sido substituídos por capilares preenchidos de polímero nas máquinas mais modernas. As bandas pretas indicam ausência de material e são apenas uns recursos gráficos usado aqui para indicar o espaço aumentado entre bandas que aconteceria neste caso. Entretanto, isto não ocorre na reação de sequenciamento finalizada, porque o número de fragmentos gerados é muito grande e a probabilidade de uma classe de tamanho não ser representada na reação é praticamente nula.

52

A fluorescência emitida pela passagem de uma banda pela janela de

medição é registrada por um sistema de microcâmaras sensoras, que por sua vez

transforma o sinal num gráfico, conhecido como eletroferograma. Os picos

representam as bandas, e quanto mais alta e aguda mais qualidade tem, isto é,

maior será a probabilidade de que a base registrada seja correta. O valor de

qualidade é medido por um programa chamado Phred, que leva em conta vários

parâmetros (espaçamento entre bandas, largura e altura do pico, intensidade

absoluta do sinal, ruído de fundo, etc). Geralmente emprega-se como padrão

aceitável de qualidade o valor Phred 20, que corresponde a aprox. 99% de certeza

da base indicada. A figura 17 abaixo mostra um eletroferograma obtido no

seqüenciamento de um inserto de cDNA do parasita Leishmania chagasi. Observe

que, neste trecho, a qualidade do seqüenciamento é muito alta, com espaçamento

regular dos picos (que indica espaçamento regular das bandas) e picos agudos. Não

há qualquer polimorfismo de bases, nem poderia haver, pois esta seqüência foi

obtida a partir de um clone de cDNA.

Figura 17 Eletroferograma parcial de uma seqüência de DNA obtida no seqüenciador automático ABI3100 Prism, da Applied Biosystems. Observe que os picos são agudos e regularmente separados, o que indica alta qualidade do seqüenciamento neste trecho.

53

CONCLUSÃO

Nos métodos moleculares para analise do DNA são utilizados vários

processos como Extração (ruptura dos tecidos), Purificação (eliminação de resíduos

provenientes da extração ou da purificação), Amplificação ou PCR (síntese in vitro

de milhões de cópias de um segmento de DNA), Clonagem e Seqüenciamento e

podem ser aplicado em todos os organismos vivos, com plantas e animais podendo

ou não ser o estudo direcionado à filogenia.

As implicações deste procedimento sempre serão de analisar e caracterizar

cada função e localização do gene, comparação filogenética, identificação de um

organismo, clonagem de DNA e em futuras pesquisas um melhoramento genético

em humanos para que possam viver mais e sem doenças hereditárias e resistentes

a outras patogenias.

Estes procedimentos exigem uma enorme responsabilidade, além de ter

equipamentos caros, qualquer erro pode ser crucial para a analise e a perda de

semanas de trabalho duro em laboratório. Com estas técnicas para se chegar ao

seqüenciamento de DNA pode ser usado em varias áreas de estudo para

identificação filogenética de organismos vivos.

Em toda essas pesquisas de analisar e sequênciar o DNA tem seus pontos

positivos e negativos. Os positivos são que em futuro próximo iremos saber

corretamente o local e qual a função de cada gene e sim uma possível precaução

contra doenças hereditárias e outras doenças sem cura. Os negativos é que com

essas técnicas muitos cientistas irão utilizar para transformar o ser humano em uma

máquina, ou seja, com as melhores características que um ser humano possa

adquirir.

54

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Estágio Supervisionado - 2004

Curso de Ciências Biológicas

Formulário para descrição de atividades de estágio

Aluno: Douglas de Oliveira LucianoEntidade/Empresa/Instituição onde realizou os estágio: UNESP – Rio Claro – Laboratório CEIS (Centro de Estudos de Insetos Sociais)

Responsável/Orientador do estágio: Maurício Bacci JúniorPeríodo (mm/aaaa): Março de 2004 a Setembro de 2004Tempo total do estágio (horas): 540 horas

Relato das atividades desenvolvidas:

As atividades desenvolvidas no Laboratório do CEIS (Centro de Estudos de Insetos

Sociais) junto ao orientador Maurício Bacci Júnior, foram direcionadas ao estudo de filogenia

das espécies de formigas Atta sexdens e Atta cephalote (Formiga Saúva).

As coletas foram obtidas de vários locais de amostragem, como nos Estados Unidos,

Brasil e Colômbia. Depois de coletadas as amostras eram levadas ao laboratório para que

fossem analisadas geneticamente.Com os métodos moleculares de análise de DNA foi

conferida sua filogenia de acordo com os estudos sobre o trabalho desenvolvido por outros

pesquisadores.

O método de extração de DNA é realizado para extraí-lo através da ruptura dos

tecido e depois é necessário quantificar para verificar se há presença de DNA, para isso

usamos os métodos de Gel de Agarose, Fluometria e Espectofotometria.

Após a extração faz-se uma amplificação do mesmo pelo método de reação em

cadeia de polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) que é uma técnica que envolve a

síntese in vitro de milhões de copias de um segmento do ácido desoxirribonucléico na

presença da enzima DNA polimerase.

O passo seguinte é feito uma clonagem do material, ou seja, produção de cópias

idênticas de uma única célula. Feita a clonagem é necessário aplicar a técnica de

purificação de DNA para remover resíduos provenientes da Reação em cadeia (PCR) como

ddntps, restos de primers, sais entre outros resquícios.

Feito todos os procedimentos de métodos moleculares é preciso sequenciar a

amostra, e este processo é feito através de aparelho chamado seqüenciador, que pode ser

por Gel de poliacrilamida ou por Capilar, ambos com o mesmo efeito.

Com os dados obtidos faz-se uma comparação com dados obtidos com

pesquisas de diferentes pesquisadores do assunto e verificar a relação filogenética

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entre as espécies coletadas em diversos locais do mundo e saber sua posição

geográfica no globo terrestre.

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