Mtodos para la obtencin de animales transgnicosEl impacto que
los animales transgnicos y genoprivos oknockouthan tenido en las
biociencias es innegable, en particular para el estudio de la
funcin y la regulacin de los genes, y para la simulacin de
enfermedades humanas, con la consiguiente bsqueda de nuevas
teraputicas.En la actualidad, su uso excede ampliamente el de la
investigacin biomdica y el fruto de las investigaciones que los
tuvieron como centro de atencin ya se reflejan en la produccin de
protenas recombinantes de alto valor biolgico en la leche de
animales transgnicos y en su uso como eventual fuente de rganos
para xenotrasplantes. A continuacin se comentar algunas de las
tcnicas ms comnmente utilizadas para la generacin de animales
transgnicos y animales genoprivos o Knock-out. MicroinyeccinEn este
mtodo de obtencin de animales trangnicos se aplica a una gran
variedad de animales, esta metodologa de produccin se induce la
sobreovulacin de las hembras, los vulos son fecundadosin vitro, se
inyecta el gen extrao en el ncleo del vulo y posteriormente los
mismos son introducidos nuevamente en el cuerpo de las hembras,
dando lugar finalmente a cras que contienen el nuevo gen, esto es,
crastransgnicas. Hace ya 30 aos, Gordon y cols. Describieron una
tcnica en la cual un ADN (cido desoxirribonucleico) forneo se
microinyectaba en el proncleo de un ovocito de ratn recientemente
fertilizado, que luego era transferido a una hembra
receptora.Bsicamente, primero se produce una construccin en donde
el gende inters se coloca bajo el control de un promotor de quien
depender la cronoespecificidad y la histoespecificidad de la
expresin del gen. Si se desea, se puede evaluar esta expresin
temporoespacial del gen mediante el uso de "genes reporteros" bajo
el control del mismo promotor. Un gen reportero es aquel que al
expresarse, transforma al organismo que lo porta en fcilmente
identificable (por cambiar de color frente a un sustrato en el
medio, por presentar fluorescencia, etc.).Una vez obtenida esta
construccin con el gen de inters (regin codificante y regin
reguladora), sta se microinyecta en el proncleo de un ovocito
fertilizado. El ADN extrao se insertar al azar, y generalmente en
varias copias, en el ADN del ovocito. Este ovocito fertilizado, que
ya lleva la nueva informacin gentica, se transfiere a una hembra
receptora. Si efectivamente el embrin se halla en el estado de una
clula, la integracin temprana del transgn har que el ratn que nazca
exprese el gen de inters en todas sus clulas somticas y en la lnea
germinal, de modo que puede heredarse en la descendencia de estos
animales transgnicos.
Si la insercin del transgn se produce luego de la primera
divisin celular, se obtendrn animales fundadores que presentan dos
o ms poblaciones celulares cuyas composiciones genticas difieren y
que tambin pueden transmitir el transgn a su descendencia, pero a
una frecuencia menor. La mayor complicacin de esta tcnica de
generacin de animales transgnicos es la de no poder determinar el
sitio de insercin ni el nmero de copias del transgn, ya que se
producen al azar. Algunos efectos posicionales pueden alterar la
expresin del transgn, pero, a su vez, la insercin de este gen
forneo puede afectar posicionalmente la expresin de algn gen
endgeno, pues se sabe que la posicin de un gen influye sobre su
propia actividad y la de los genes circundantes. Esta tcnica ha
permitido crear no slo ratones transgnicos, sino tambin conejos,
ovejas, cerdos, cabras y vacastransgnicas productoras de protenas
de alto valor biolgico. Electroporacin de cigoto Laelectroporacin
es una tcnica que se basa en la aplicacin de un elevado voltaje a
las clulas durante un periodo de tiempo muy corto. Durante ese
tiempo las clulas (en este caso los cigotos) despolarizan sus
membranas y se forman pequeos orificios por los que penetran las
molculas de ADN que se encuentran alrededor. La ventaja de esta
tcnica es que se aplica a varios cigotos a la vez y habitualmente
se obtienen eficiencias de entrada del ADN del 100%. Es una tcnica
que requiere su ajuste fino para cada tipo celular, a fin de
determinar las condiciones ptimas de duracin y potencia del pulso.
Se busca siempre el mejor equilibrio entre las condiciones que
aseguran la entrada en la clula y las que maximizan la viabilidad
celular. La eficiencia de la transfeccin por electroporacin esta
mediada por una serie de factores como la magnitud del campo
elctrico aplicado, la duracin del pulso elctrico, la temperatura,
la concentracin, el tipo de ADN y la composicin inica del medio
(Fig. 1.6).La electroporacin se ha usadopara transferir ADN forneo
a espermatozoides bovinos para su uso en transgnesis mediante
inseminacin artificial. A partir de 1986, la electroporacin se ha
empleado como el mtodo de eleccin para la transfeccin de clulas
embrionarias totipotentes (embryonic stem cells ES) tanto en
experimentos degene knock-out, como de reemplazamiento allico y
recombinacin de homlogos.En trminos generales la mayor desventaja
de la electroporacin es su costo, ya que la mayora de los equipos
comercialmente disponibles (electroporadores) y los accesorios como
cubetas y adaptadores tienen un precio elevado (Fig. 1.7).
Fig 1.7
Fig 1.6
BiolsticaEs un mtodo de transferencia directa degenesen una
clula, con el objetivo de crear organismostransgnicos. Es el mtodo
de transferencia directa ms utilizado para transformar las clulas
vegetales.Consiste en propulsar los genes de inters dentro de
lasclulascon la ayuda de un can de ADN, con lo cual se modifica
elADNde las clulas.Esta tcnica fue propuesta por Sanford en 1987,
para introducir material gentico en el genoma nuclear de plantas
superiores. En los ltimos aos se ha usado para transformar
bacterias, protozoos, hongos, algas, insectos y tejidos animales.
La biobalstica, utiliza microproyectiles a alta velocidad, para
introducir cidos nucleicos y otras molculas en clulas y tejidos.
Este proceso tambin se conoce con los nombres de bombardeo con
microproyectiles, gen gun (pistola gnica), aceleracin de partculas,
etc. Se utilizan micropartculas de 0,2 a 4 m de dimetro, cubiertas
con secuencias de cidos nucleicos, aceleradas a velocidades
superiores a los 1500 km/h. Estas partculas (de oro tungsteno)
penetran la pared y la membrana plasmtica, alojndose aleatoriamente
en los organoides celulares. Posteriormente, el ADN se libera de
las partculas y se integra en el genoma nuclear del organismo
receptor. Se han desarrollado varios mecanismos para lograr la
aceleracin de las micropartculas, entre los que se destaca uno que
funciona mediante la descarga de helio de alta presin. En la Figura
3 se aprecia un esquema de una pistola gnica.
Segn las especies, el perodo que ha de transcurrir antes de
obtener una raza transgnica estable puede variar de algunos das a
varios meses. Este mtodo se utiliza tambin para efectuar la
transformacin de los genomas deorgnulos,cloroplastosomitocondrias.
La transformacin por biolstica es una alternativa interesante a la
transformacin de las plantas porAgrobacterium tumefaciens, ya que
no requiere secuencias exgenas para permitir la integracin del
fragmento de ADN.
Pginas de
referencia:http://www.bioero.com/biotecnologia/como-se-obtienen-los-animales-transgenicos.htmhttp://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0325-00752010000500010
