ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE LOS ALIMENTOS

UNIDAD 2.MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

TRADICIONALES

MÉTODOS DE CULTIVO, MICROSCÓPICOS Y DE MUESTREO

Básicos en la microbiología de los alimentos, en cuanto a la presencia, tipo, número de microrganismos

4 MÉTODOS BÁSICOS.• Recuento en placa normales (SPC) para células viables.• Métodos de número más probable (NMP) para determinación

estadística de células viables.• Técnicas de reducción de colorantes para calcular el número de células

viables que poseen capacidad reductora.• Recuentos microscópicos directos (DMC) tanto para células viables

como no viables.

Una célula viable es definida como aquélla que es capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de cultivo.

VIDEO técnicas de microbiología

RECUENTO CONVENCIONAL EN PLACA NORMAL.

• Es un tipo de SPC, método más universal usado para determinar los números de células viables o ufc.

• Se mezclan y homogenizan proporciones de mezclas de alimentos

• Diluciones seriadas en un diluyente apropiado• Siembra en el espesor o sobre el medio de cultivo

adecuado, también se usa siembra en superficie• Incubación a tiempo y temperatura adecuada• Contar todas las colonias visibles mediante un

contador Quebec, electrónico o manual

Factores a considerar• Método de muestreo empleado• Distribución de los microorganismos en la muestra de alimento• Naturaleza de la flora del alimento• Naturaleza del material del alimento• Antecedentes del alimento previo al examen• Idoneidad nutritiva del medio para siembra en placa• Temperatura de incubación y tiempo.• pH, actividad acuosa y potencial oxido-reducción del medio de siembra.• Tipo de diluyente usado.• Número relativo de organismos en la muestra• Existencia de organismos competidores o antagonistas.

Consideraciones:• Siembras de muestras diluidas dobles• Homogenización adecuada manual o con varillas de vidrio.• Ventajas sobre microorganismos psicótrofos termo

sensibles, ya que no entran en contacto con el agar fundido.• Características morfológicas de las colonias como método

presuntivo.• Favorece el crecimiento de microorganismos aerobios

estrictos, los microaerobios tienden a crecer más lentamente.

• Desventaja de la técnica son los difusores y el amontonamiento de colonias (cajas inconvenientemente secas).

TOMA, PREPARACIÓN HOMOGENIZACION Y DILUCIÓN

DE LA MUESTRA

STOMACHER, Staphylococcus aureus, enterococcus fecalis y Escherichia coli.

VIDEO morfología de colonias

Streptococcus-betahemolisisMedio de cultivo agar-sangre

Klebsiella spp., en agar Mac Conkey.

Staphylococcus aureus en agar sangre.

Colonias de Bacillus sp en agar nutritivo.

Colonias de Bacillus sp en agar nutritivo.

Color verde metálico en las colonias característico de Escherichia coli en medio de cultivo EMB

Escherichia coli en agar Mac Conkey. Se logran ver colonias aisladas, son colonias medianas, circulares, convexas, bordes redondeados, lactosa positivas lo que les da coloración rosada.

Cultivo de Serratia marcescens , se observa el color rojo obscuro intenso característico de esta bacteria.

Cultivo de Serratia marcescens, se observa el color rojo intenso que es característico de esta bacteria.

Proteus mirabilis

Piocianina: azulado. Pioverdina (Fluoresceína): amarillo-verdoso.Piorrubina: roja. Piomelanina: marrón.

Pseudomonas sp

En este medio de cultivo se muestra la fluorescencia de Pseudomonas sp. esta luminosidad se manifiesta en precencia de luz uv, debido a la fluoresceina.

Crecimiento colonial bacteriano, característico de Salmonella spp, en medio de cultivo Sulfito Bismuto. Se observa un crecimiento abundante y las colonias tienen un reflejo plateado y negro

Enterobacterias comunes de la flora normal y causantes de infecciones en su mayoría oportunistas.•Escherichia coli•Klebsiella spp., •K. pneumonie, •K. oxytoca•Salmonella spp.•Yersinia spp.•Enterobacter spp.,• E. aerogenes, •E. cloacae•Citrobacter spp.,• C. freundii.•Proteus spp.• P. mirabilis, vulgaris•Morganella spp.•Shigella spp. •S. boydii, •S. dysenteriae•Yersenia spp. •Y. pestis,• Y. intermedia•Providencia spp., •P. rettegeri•Serratia spp., •S. marcences

Agar Sulfito Bismuto

Agar Salmonella-Shigella

Agar Xilosa, Lisina, Desoxicolato (XLD)

Agar Rojo de Violeta con Bilis y Dextrosa

Agar Eosina Azul de Metileno

Agar Mac Conkey

Agar verde brillante

norma oficial mexicana nom-092-ssa1-1994, bienes y servicios. método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.

norma oficial mexicana nom-113-ssa1-1994, bienes y servicios. método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9thed. Arlington, VA: AOAC.

Secretaría de Salud. NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimiento para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. México.Secretaría de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico. Norma Oficial Mexicana. México.

VIDEO técnicas básicas de

microbiología, siembra y aislamiento

Siembra de placas en espiral

El sembrador espiral Eddy Jet 2

• Automatiza, estandariza y optimiza las siembras en superficie, eliminando la posibilidad de contaminación cruzada gracias al uso de microjeringas desechables.

• Reduce el costo por prueba, los tiempos de operación y el gasto de consumibles durante las pruebas de recuento en placa

• Aumentando la productividad y rentabilidad en los laboratorios de microbiología.

• Se utiliza principalmente en laboratorios agroalimentarios, cosméticos, y farmacéuticos, cualquier laboratorio de microbiología lo puede emplear.

• Genera un gradiente de concentración sobre la placa de Petri equivalente a tres diluciones decimales, ahorrando gran número de diluciones y buena parte de las siembras en superficie con sus costos asociados en mano de obra y consumibles.

• Aparte de siembras para recuento, también dispone de aplicaciones concretas para ensayos de susceptibilidad a antibióticos y pruebas de mutagenicidad.

Características 1. El método espiral permite realizar el recuento bacteriano de una

muestra suprimiendo todas o parte de las diluciones intermedias.2. La muestra es depositada en la superficie de una placa de Petri en

rotación, siguiendo una espiral de Arquímedes logarítmicamente decreciente.

3. El volumen es calibrado y conocido en cualquier lugar de la placa.4. La lectura se realiza relacionando el número de colonias leídas en el

sector escogido con el volumen depositado en el mismo sector. 5. Toma de muestras, desinfección, aclarado 100% automatizados.6. Muestras de 250 microlitros en una sola toma, para siembra de

placas sucesivas: 4 x 50 microlitros.7. Deposición de 50 o 100 microlitros sobre una misma placa para

concentrar la muestra.

• Se usa menor cantidad de agar,• se necesitan menos placas,• menor número de blancos de

dilución,• Se pueden examinar de 3 a 4

veces más muestras por hora,• Se pueden prepara de 50 a 60

placas por hora,• Poco entrenamiento,• Solo muestras líquidas

(inconveniente).

AOAC 977.27ISO 7218

El conteo de las bacterias, se hace con un retículo especial. Dependiendo de la densidad relativa de las colonias, se cuentan las que aparecen en una o más zonas específicas del retículo.

VIDEO EDDY JET 2

VIDEO EASY SPIRAL

Características Técnicas:Controlado por microprocesador.Diámetro de las placas: de 90 a 150 mm.Volumen de siembra: de 16 a 55 microlitros.Sensibilidad en cfu/ml: de 200 a 5.106Duración de la siembra: 8 segundos.Vacío necesario: de 50 a 70 cm de Hg.Tres modos de deposición posibles: exponencial espiral, variable, constante.Numerosas seguridades: falta de toma, de desinfección.Alimentación en continuo de líquidos de desinfección.Aplicaciones: control en higiene alimentario, cinética de bactericidas, CMI, cosmética, farmacéutica….Dimensiones: 60 x 28 x 40 cms.Peso: 22 kgs.Alimentación: 220 volts, 50 ciclos, 150 VA.

FILTROS DE MEMBRANASe usan membrana de poro que retienen las bacterias (0.45 micras) pero que pueden ser atravesada}os por gua y algunos diluyentes.Una vez recogidas las bacterias por la filtracion, se coloca la placa sobre el agar específico y se inoccula a tiempo y temperaturas óptimas para su desarrollo.Despues del crecimiento se lleva acabo el conteo y tinciones apropiadas para su reconocimiento.

Técnica de la epifluorescencia sobre filtros de membrana (DEFT)

Emplea microscopia de fluorescencia y colorantes fluorescentesEl homogenizado se pasa por un filtro de nylon de 5 micrasSe usa Triton x-100 y 0.5 ml de tripsinaEncubaciónMembrana de policarbonato.El filtro se tiñe con naranja de acridinaConteo de células teñidas mediante microscopia de flourescencia.

DEFT en microcolonias

Parecidas a filtracion por memmbrana:Se utiliza para el conteo de células viablesSe utiliza el filtro de nylon de 5 micrasIncubacion: gram + 3 horasGram – 6 horasColiformes, pseudomonas y sthapylococcus, 8 horasLas muestras reciben un tratamiento enzimático y membrana de policarbonato.Se tiñen con naranja de acridina Conteo de colonias

Filtro de membrana con retículo hidrófobo.

Esta técnicaSe friltra 1 ml de muestra homogenizado a traves de una membrana de filtro.Se coloca el filtro en el agar apropiadoIncubación durante la nocheConteo de las celdillas.

Método de recuento de colonias al microscópio.

Supone el recuento de las microcolonias que se forman en capas de agar dispuestas sobre portaobjetos.

Método de gotitas de agarIncuba durante 24 horasConteo con lupa de 10 aumentos

Método peltrifilm

Son películas de medio de cultivo deshidratadas, generales o selectivos.

Método del número más probable.

Es un método estadístico para averiguar el número de organismos, presentes en las muestras. Se basa en la presuncion de que pasado cierto tiempo, se estan presentes los microorganismos que creemos la prueba sera positivo

Ventajas.

• Prácticamente sencilla• Se puede determinar un grupo

concreto de microorganismos.

Reducción de colorantes

Números de microorganismos viables en alimentosAzul de metileno y risazurina.Se añade el colorante a la muestra y se cuenta el tiempo en el que son reducidos.

Método de tubos rodantes.

Son tubos herméticamente cerrados en los que haciéndolos girar se forma una fina capa da agua, útiles para recuento de anaerobios.

Recuento microscópico directo

Contadores electrónicos de partícula (tipo coulter). Se hace pasar una suspencion microbiana por un capilar, entre los dos polos de una corriente electrica que detecta el número y tamaño de las partículas

Examen microbiológico de superficiesPlacas de superficie.

Se utilizan para determinar la calidad microbiológica de superficies planas.Presiona la placa sobre la superficie

Método del hisopo.Se debe definir el área donde se va a tomar la muestra, generalmente se usa un aplantilla de 24 y 30 cm

Otros métodos para el examen de superficie

Siembra directa en superficiePelícula pegajosa