2014-03-06

1

�Wybrane, współczesne metody badań

struktury i funkcji komórek

�Materiał do badań biologii komórek

(organizmów)

�Chemiczne składniki komórek

Metody „biologii komórki”

• Współczesne badania mikroskopowe

• Barwienia cytochemiczne

• Hodowle komórkowe

Badania biochemiczne i molekularnew biologii komórki

• Wizualizacja cząsteczek w Ŝywej komórce

2014-03-06

2

BADANIA MIKROSKOPOWE

gr. mikros = mały; gr. skopein = patrzeć

przyrządy do obserwacji pod duŜym powiększeniem

przedmiotów blisko umieszczonych

MIKROSKOPY

• świetlne

• elektronowe

• nieoptyczne np. AFM

Mikroskopy świetlnewykorzystują widzialne pasmo fal elektromagnetycznych

Zespół optyczny:

• źródło światła

• przesłona oświetlacz

• kondensor

• obiektyw

• pośrednie układy optyczne

• okular

obraz mikroskopowy:

pozorny, silnie powiększony, odwrócony

2014-03-06

3

Mikroskopy świetlne

Zespół mechaniczny:

• podstawa

• statyw

• stolik przedmiotowy

• rewolwer

• tubus

• śruba makro- i mikrometryczna

Mikroskopy świetlneZdolność rozdzielcza mikroskopu

λd = κ ---------

2 A

A = n x sin α

A = apertura numerycznaλ = długość fali światła tworzącego obrazκ = współczynnik zaleŜny od stosunku

A kondensora do A obiektywu α = kąt między osią optyczną a skrajnym

promieniem wpadającym do obiektywu n = współczynnik załamania fali

w środowisku

Ob

K2α

gdy A = 1,4 i λ = 0,45µm

d = 0,2 µm

2014-03-06

4

Kontrastowanie komórek:• barwienia• odmiany mikroskopów:

Wizualizacja komórek przejrzystych

kontrastowo-fazowe

polaryzacyjno-interferencyjne

(z układem optycznym Nomarskiego)

Mikroskop kontrastowo-fazowy Fizyk holenderski FritsZernike - opracował zasadę kontrastu-faz; 1953 - nagroda Nobla

bezpośrednie przekształcenie zmian fazowych fali świetlnej w badanym preparacie na zmiany natęŜenia światła w obrazie mikroskopowym tego preparatu

• przesłona pierścieniowa kondensora

• płytka fazowa w obiektywieUkład optyczny, który przesuniecie fazy fali świetlnej przekształca w zmianę amplitudy

2014-03-06

5

śywe komórki zwierzęce: zdjęcie spod mikroskopu: a) jasnego pola, b) kontrastu-faz,

Mikroskopy świetlnespecjalne odmiany mikroskopów

Fibroblast (HSF) z hodowli; zdjęcie spod mikroskopu: A) jasnego pola, B) kontrastu-faz, C) kontrastu róŜnicowego Nomarskiego, D) ciemnego pola

2014-03-06

6

Mikroskop fluorescencyjny

wykorzystuje zjawisko fluorescencji substancji :

•obecnych w komórce:

chlorofil, witamina A, porfiryny, lipofuscyny

• wprowadzonych(znaczniki fluorescencyjne):

fluoresceina, rodamina, oranŜ akrydyny, DAPI, Hoechst, bromek etydyny, Alexa, Cyto.....

Mikroskop fluorescencyjny

oświetlenie epi

epi fluorescencja

2014-03-06

7

Mikroskop fluorescencyjny

Wrzeciona mitotyczne w metafazie u embriona muszki owocowej Drosophila(DNA wybarwione na zielono;mikrotubule wrzeciona na czerwono).

Mitoza w komórkach płuc traszkiw hodowli(DNA wybarwione na niebiesko;mikrotubule wrzeciona na zielono).

„uniwersalny mikroskop badawczy”

wykorzystanie róŜnych

odmian mikroskopii

świetlnej przy uŜyciu

1 przyrządu

wizualizacja i analiza procesów biologicznych z

wykorzystaniem zautomatyzowanych systemów

mikroskopowych (chłodzone kamery CCD);

moŜliwości poklatkowej rejestracji obrazów;

cyfrowy zapis obrazów i analiza.

2014-03-06

8

Mikroskopy elektronowetransmisyjny mikroskop elektronowy (TME)

cewki magnetyczne

próŜnia

TME dla preparatów biologicznych:

d- 2nm, pow. do 1mln razy

Mikroskopy elektronowetransmisyjny mikroskop elektronowy

2014-03-06

9

Mikroskopy elektronoweskaningowy mikroskop elektronowy

SME dla preparatów biologicznych: d – od 3 do 20 nm

Mikroskopy elektronoweskaningowy mikroskop elektronowy

10µm

Mikrografia szczurzych fibroblastów z hodowli in vitro ( na podłoŜu plastikowym)

10µm

Mikrografia komórek droŜdŜy piekarskich

2014-03-06

10

Mikroskopy elektronoweprzygotowanie materiału do mikroskopii

1. Utrwalanie

2. Osmowanie (utrwalanie wtórne)

3. Odwadnianie

4. Zatapianie

- Ŝywice epoksydowe; Ŝywice akrylowe

5. Krojenie skrawków i nakładanie na siatki

grubość: 20 -60 nm (noŜe szklane lub diamentowe)

6. Kontrastowanie skrawków

- octan uranylu (białka, kwasy nukleinowe)cytrynian ołowiu (lipidy, wielocukry)

Wizualizacja struktury komórki

• Klasyczne barwienia cytologiczne (histologiczne)

• Metody immunocytochemiczne

• Autoradiografia

oparte na wysokiej swoistości wiązania antygenu z przeciwciałem

metoda wykrywania izotopów promieniotwórczychdzięki ich zdolności do zaczerniania emulsji światłoczułej

2014-03-06

11

Barwienia cytologiczne (histologiczne)

Komórki zbiorczego kanalika moczowego nerki

Hematoksylina (jądra)powinowactwo do struktur

zasadochłonnych, ujemnie naładowanych (DNA, RNA, kwaśne białka)

Eozyna (substancja międzykomórkowa)powinowactwo do cząsteczek kwasochłonnych

Immunocytochemia

• antygen -kaŜda substancja w komórce, która ma właściwości immunogenne

• przeciwciało- immunoglobulina skierowana przeciw danemu antygenowi

róŜnorodność

swoistość przeciwciał

Znaczniki:

• fluorochromy

• enzymy

• metale cięzkie

2014-03-06

12

Immunocytochemia

Genetyczne znakowanie białekGFP (green fluorescent protein) -zielono białko fluoryzujące (z cyklicznym trójpeptydem ser-tyr-glic )

• wprowadzanie genu kodującego GFP do komórki i łączenie z genemkodującym badane białko (technika rekombinacji DNA)

• śledzenie znakowanych białek w Ŝywych komórkach (białka fuzyjne)

Metody wizualizacji cząsteczekw Ŝywej komórce

238 aa

Aequoreavicotria

Nagroda Nobla 2008Osamu ShimomuraMartin ChalfieRoger Y. Tsien

2014-03-06

13

Materiał do badań biologii komórki

• Pobieranie materiału z organizmów

• Hodowle komórkowe

• Organizmy modelowe

Hodowla komórek i tkanek

utrzymanie przy Ŝyciu oddzielonych od organizmu komórek (w warunkach sztucznych), in vitro → hodowla

• dostarczenie wszystkich składników i odpowiednich warunków niezbędnych do wzrostu i rozwoju

- poŜywki: odpowiedni skład, pH, osmolarnośćpoŜywki naturalne (osocze, wyciągi tkankowe)poŜywki sztuczne (zdefiniowane; z dodatkiem surowicy)

- temperatura, %CO2

2014-03-06

14

• zachowanie jałowości

- jałowość całej procedury hodowli- naczynia hodowlane- antybiotyki

Hodowla komórek i tkanek

Zdj ęcie fibroblastów w hodowli

Zdj ęcie mioblastów w hodowli

Zdj ęcie komórek prekursorowych oligodendrocytów w hodowli

2014-03-06

15

Organizmy modelowew badaniach

Cecha Zalety

małe rozmiaryi proste poŜywienie

hodowla nie wymaga duŜo miejsca,jest łatwa i tania w utrzymaniu

duŜa liczba potomstwapozwala na wiarygodną analizę

statystyczną wzorów dziedziczenia

krótki cykl ŜyciowyumoŜliwia obserwację wzorów

dziedziczenia w kolejnych pokoleniach

mały genomduŜe chromosomy

mała ilość DNA do analizy;łatwiej badać chromosomy w mikroskopie

świetlnym

dostępność informacji i technik badawczych

wiele genetycznych mutantów jest dostępnych do analiz

Organizmy modelowe -Prokarionty

Escherichia coli (pałaczka okręŜnicy)

2µm; 0,8µm

1 kolista cząsteczka DNA

4,6 mln par zasad; 4300 białek

od 15 tys. do 30 tys. rybosomów

Poznanie mechanizmów replikacji, transkrypcji i

translacji

Gram-ujemna bakteriaflora bakteryjna jelita grubegosymbiont

(Enterobacteriaceae)

podział co 20min

2014-03-06

16

Organizmy jednokomórkoweSaccharomyces cerevisiae - droŜdŜe piekarskie

Poznanie mechanizmów cyklu komórkowego

komórki eukariotycznej

DNA 12,1 mln par zasad (2,5 x więcej)

6 275 genów (5800 funkcjonalnych)

23% genomu droŜdŜy - jak u ludzi

kompletna sekwencja genomu (1-szy eukariont)

Organizmy modelowe -Eukarionty

Rośliny modelowe

Arabidopis thaliana- rzodkiewnik pospolity

z 300 000 gatunków

bliskie pokrewieństwo ewolucyjne roślin kwiatowych (200mln lat)

Genom -110 mln par zasad, znana sekwencja

5-30 cm

Łatwość hodowli

w szklarniach

hydroponiczna

Badania mechanizmów rozwoju i róŜnicowania roślin kwiatowych

2014-03-06

17

Zwierzęta modelowe

Caenorhabditis elegans - nicień

959 komórek

Genom

97 mln par zasad

19 000 genów

sekwencja znana

Poznanie

mechanizmów rozwoju embrionalnego i działania wielu genów (apoptozy)

70% białek człowieka ma odpowiedniki u C. elegans

Drosophila melanogaster - muszka owocowa

Poznanie podstaw genetyki klasycznej

i mechanizmów rozwoju zarodkowego i larwalnego

genom (4 chromosomy)

185 mln par zasad

13 000 białekSamiec i samica

2014-03-06

18

Kr ęgowce modeloweDanio rerio– Danio pręgowany (ryby)

Genom

1,527,000,581par zasad

17 330 genów białek

sekwencja znana

Poznanie

mechanizmów rozwoju embrionalnego i działania wielu genów kręgowców

Szybki rozwójŁatwość uzyskiwania mutantów

Mus musculus –Mysz domowa (ssaki)

Poznanie mechanizmów działania wielu genów na

poziomie komórki i całego organizmu

Prosta i tania hodowlaDuŜa liczba potomstwaZarodki myszy moŜna łatwo hodować in vitroZarodki hodowane in vitro moŜna poddawać licznym manipulacjom np. nokauty genowe Uzyskiwanie myszy transgenicznych(z ekspresją obcego genu)Linie myszy z mutacjami genowymi lub skonstruowanymi genami Izolacja i hodowla in vitro komórek ES

Genom: sekwencja poznanamysz ma 2,7 mld par zasad, człowiek ok. 3,1 mld par zasad,mysz ma 20 par chromosomów,człowiek - 23 pary

2014-03-06

19

( defekt w genie kit - komórki barwnikowe)

PoniewaŜ geny człowieka mają ścisłe odpowiedniki u organizmów prostszych , to badania tych organizmów (modelowych) mogą być kluczem do zrozumienia jak skonstruowane są i jak funkcjonują

organizmy zwierzęce i organizm człowieka.

Homo sapiens –człowiek (ssaki)

Badania na róŜnorodnych komórkach ludzkich w hodowlach in vitro

Chemiczne składniki komórek

Zbudowane z takich samych związków jak materia nieoŜywiona

Pierwiastki chemiczne w komórkach:- makroelementy (pierwiastki biogenne)

H, O, C, N, S, PCa, Mg, K, Na, Cl >1% suchej masy

- mikroelementy Fe, Cu, Mn, Mo, B, Zn, Co, J, F0,01% - 0,00001% suchej masy

- ultraelementy

Ra, Au, Ag, Pt, Se <10-6 % suchej masy

96,5% masy komórek H, O, C i N

65%

18%

3%

2014-03-06

20

• opiera się na związkach C (związki organiczne)

• zaleŜy od reakcji przebiegających w środowisku wodnym,

wąskim zakresie temperatur

• wykazuje ogromną złoŜoność

• zdominowana przez cząsteczki polimerowe

• zachodzące reakcje są ściśle kontrolowane

(miejsce, czas)

Komórki wykorzystują prawa fizyki i chemii, aby przeŜyć

„Chemia komórki”

Chemiczne składniki komórek

jony nieorganiczne 1%małe cząsteczki organiczne 3%

makrocząsteczki

26%

DNA

RNA

białka

poli-sacharydy

ogromne zagęszczenie cząsteczek

dynamika ruchu i oddziaływań cząsteczek

2014-03-06

21

Skład chemiczny komórki bakteryjnej

% masy liczba rodzajówkomórki cząsteczek

jony nieorganiczne 1 20małe cząsteczki organiczne 3 800

cukry i ich prekursory 1 250

aminokwasy i prekursory 0,4 100

nukleotydy i prekursory 0,4 100

kwasy tłuszczowe i prekur. 1 50

inne 0,2 300

makrocząsteczki 26 3000

Małocząsteczkowe związki organiczne:

masa cząst. 100 –1000

do ok. 30 atomów C

cukry, aminokwasy, nukleotydy, kwasy tłuszczowe

ok. 1000 rodzajów cząsteczek w komórce eukariotycznej

• wolne cząsteczki w cytoplazmie

• jednostki monomeryczne makrocząsteczek

� elementy konstrukcyjne makrocząsteczek i struktur komórkowych

� źródło energii

� inne funkcje (sygnałowe)

2014-03-06

22

stereoizomeria

D- galaktoza D- glukoza

C6H12O6

n- liczba C2n - stereoizomerów

Cukry - małocząsteczkowe związki

Monosacharydy (CH2O) n n = 3 – 7

D-mannoza

izomeria optyczna

- róŜnorodność

L- glukoza D- glukoza

Monosacharydy - pochodne cukrów

glukozy

kwas glukuronowy

glukozoamina

N-acetyloglukozoamina

Disacharydy (dwucukry)- róŜnorodność

11 róŜnych disacharydów z kondensacji

2 cząsteczek glukozy

2014-03-06

23

Małocząsteczkowe związki organiczne -aminokwasy

forma niezjonizowana forma zjonizowana

20 aminokwasów – powszechnych (αααα-amiokwasów) biogennychkwaśne (Asp, Glu)zasadowe (Lys, Arg, His)polarne bez ładunku (Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr)niepolarne (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, Trp, Cys)

R –łańcuch boczny

aminokwasy

izomeria optycznaformy D- i L- aminokwasów

L- aminokwasy – białkaD- aminokwasy –ściany komórek bakterii

antybiotyki

� jednostki monomeryczne peptydów, polipeptydów, białek

D i L-alanina

2014-03-06

24

Małocząsteczkowe związki organiczne -nukleotydy

ATP

adenina

ryboza

trifosforan

adenozyna

Nukleotydy:

rybonukleotydy

deoksyrybonukleotydy

Zasady azotowe:

pirymidynowe:

cytozyna (C), tymina, (T) uracyl (U)

Purynowe:

adenina (A), guanina (G)

film

Małocząsteczkowe związki organiczne -nukleotydy

� krótkotrwałe nośniki energii chemicznej

(ATP, GTP)

� nośniki innych grup chemicznych

� cząsteczki sygnałowe (cAMP)

� połączone z innymi cząsteczki (CoA)

� monomery kwasów nukleinowych(przekaz informacji biologicznej)

2014-03-06

25

Małocząsteczkowe związki organiczne –kwasy tłuszczowe

cząsteczka amfipatyczna kwasu palmitynowego

C: 14-24

zwykle 16-18

łańcuchy nasycone

łańcuchy nienasycone (cis)

R-COOH (R oznacza łańcuch węglowodorowy),

–kwasy tłuszczowe

C 18

kwas stearynowy

kwas oleinowy

C 18; 1=

kwas linolowy

w komórkach (zwykle) :

estry lub amidy;

C 18; 2=

kwas linolenowy

C18; 3=

2014-03-06

26

H- -OH + H- - - -

H - - - - -

- H2O kondensacja

+H2O hydroliza

Ogólna reakcja uzyskiwania/degradacji makrocząsteczek

Makrocząsteczki

podjednostka - makrocząsteczka

wiązania kowalencyjne

glikozydowe

peptydowe

fosfodiestrowe

• róŜnorodność sekwencji

Białko o łańcuchu 150 aminokwasów - 20150 kombinacji

DNA o łańcuchu 10 000 nukleotydów - 410 000kombinacji

Trisacharyd - setki kombinacji (łańcuchy rozgałęzione)

Makrocząsteczki

• reakcje katalizowane przez enzymy

• łączenie podjednostek w odpowiedniej kolejności = sekwencja

• róŜnorodność konformacji (elastycznośc łańcuchów)

2014-03-06

27

unikatowy układ przestrzenny makrocząsteczek - wiązania niekowalencyjne:

wodorowejonowevan der Waalsahydrofobowe

własności biologiczne

Makrocząsteczki

wiązania niekowalencyjne-wybiórcze wiązanie innych cząsteczek

powierzchnie „nie pasują”,

ruchy termiczne rozdzielają cząsteczki

powierzchnie „ pasują”,

cząsteczki związane -wiązania niekowalencyjne

2014-03-06

28

aminokwasy - peptydy/ polipeptydy/ białka

wiązanie peptydowe

polarność strukturalna

sekwencja peptydu: Phe-Ser-Glu-Lys

α-helisa;β-harmonijka; superhelisa;

oligomeryzacja

kwasy nukleinowe

wiązaniefosfodiestrowe

peptyd G-A-T-C

DNA; RNA