MICOTOXINAS E MICOTOXICOSES EM ANIMAIS

DOMÉSTICOS

DILKIN, Paulo & MALLMANN, Carlos Augusto

LABORATÓRIO DE ANÁLISES MICOTOXICOLÓGICAS

Departamento de Medicina Veterinária Preventiva

Universidade Federal de Santa Maria

97105-900 – Campus – Santa Maria, RS.

E-mail: dilkin@lamic.ufsm.br http://www.lamic.ufsm.br

FATORES QUE INTERFEREM NA PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS

Micotoxinas são substâncias tóxicas resultantes do metabolismo

secundário de diversas cepas de fungos filamentosos. São compostos

orgânicos de baixo peso molecular e não possuem imunogenicidade. Em

climas tropicais e subtropicais, como o nosso, o desenvolvimento fúngico é

favorecido por fatores como excelentes condições de umidade e

temperatura. Os fungos crescem e se proliferam bem em cereais,

principalmente no amendoim, milho, trigo, cevada, sorgo e arroz, onde

geralmente encontram um substrato altamente nutritivo para o seu

desenvolvimento. O crescimento fúngico e produção de micotoxinas em

cereais podem ocorrer nas diversas fases do desenvolvimento, maturação,

colheita, transporte, processamento ou armazenamento dos grãos. Por isso,

a redução da umidade dos cereais através da secagem é de fundamental

importância para reduzir os níveis de contaminação. Mais de quatrocentas

micotoxinas, conhecidos na atualidade, são produzidas por

aproximadamente uma centena de fungos. As principais micotoxinas podem

ser divididas em três grupos: As aflatoxinas produzidas por fungos do gênero

Aspergillus como A. flavus e parasiticus; as ocratoxinas produzidas pelo

Aspergillus ochraceus e diversas espécies do gênero penicillium; e as

fusariotoxinas, que possuem como principais representantes os tricotecenos,

zearalenona e as fumonisinas, produzidas por diversas espécies do gênero

Fusarium (PINTO & VAAMONDE , 1996). A formação de micotoxinas é

dependente de uma série

de fatores (Figura 1), como

a umidade, temperatura,

presença de Oxigênio,

tempo para o crescimento

fúngico, constituição do

substrato, lesões à

integridade dos grãos

causados por insetos ou

dano mecânico/térmico,

quantidade de inóculo

fúngico, bem como a

interação/competição entre as linhagens fúngicas. As características

genéticas representam um fator cada vez mais decisivo na solução do

problema. Esta gama de fatores demonstra que o controle dos mesmos, no

sentido de prevenção, muitas vezes se torna, em nossas condições tropicais,

muito difícil. Por exemplo, as condições climáticas brasileiras no período de

colheita dos cereais, em função do regime pluviométrico, não favorecem a

secagem dos grãos, especialmente do milho.

O sistema de secagem e armazenagem instalado também contribuí

para a evolução do problema em nossas condições. A temperatura da massa

de grãos no interior dos silos em muitas situações ultrapassam os 18°C

recomendados, permitindo um crescimento fúngico intenso, especialmente

pela deficiente aeração forçada da maioria das unidades armazenadoras,

que mesmo existindo, pelo excesso e má distribuição das impurezas não são

efetivas no controle dos pontos de calor na massa de grãos.

Esta e muitas outras razões, explicam a alta prevalência de

micotoxinas como as aflatoxinas como contaminantes rotineiros dos cereais

no Brasil e em países de clima similar.

Quando as micotoxinas são ingeridas, os diversos efeitos se devem às

diferentes estruturas químicas das mesmas, influenciados pelo fato de

serem ingeridas por diferentes organismos animais superiores e também

pela diversidade de espécies, raça, sexo, idade, fatores ambientais, manejo, - 2 -

condições nutricionais e outras substâncias químicas. A micotoxicose implica

em enormes prejuízos de ordem econômica, sanitária e comercial,

principalmente pelas suas propriedades anabolizantes, estrogênicas,

carcinogênicas, mutagênicas e teratogênicas (HAYES & CAMPBELL, 1986).

Porém, o maior problema das micotoxicoses é atribuído aos prejuízos

relacionados aos diversos órgãos e sistemas dos animais, implicando na

diminuição do desempenho produtivo dos mesmos. As manifestações

agudas ocorrem quando os indivíduos consomem doses moderadas a altas

de micotoxinas. Podem aparecer sinais clínicos, sintomas e um quadro

patológico específico, dependendo da micotoxina ingerida, da

susceptibilidade da espécie, das condições individuais do organismo e

interação ou não com outros fatores. As lesões são dependentes de cada

micotoxina, porém as mais encontradas dizem respeito a hepatites,

hemorragias, nefrites, necrose das mucosas digestivas e morte. A

micotoxicose crônica é a mais freqüente, e ocorre quando existe um

consumo de doses moderadas a baixas. Nestes casos, os animais

apresentam um quadro caracterizado pela redução da eficiência reprodutiva,

diminuição da conversão alimentar, taxa de crescimento e ganho de peso.

Este quadro somente é detectado com cuidados especiais ou através de um

programa de análise de micotoxinas presentes na alimentação. Os sinais

clínicos ainda podem ser confundidos com deficiências de manejo, com

outras doenças, inclusive as decorrentes desta micotoxicose ou com

deficiências nutricionais. Existem poucas estatísticas precisas com relação a

incidência de micotoxicoses, porém há uma consciência geral que o perigo

oculto (intoxicações crônicas) é responsável pela maior parcela de perdas

que se tem nos meios criatórios (OMS, 1983).

OCORRÊNCIA DE MICOTOXINAS NO BRASIL

A ocorrência das micotoxinas, baseado nos dados de análise obtidos

pelo Laboratório de Análises Micotoxicológicas (LAMIC) da Universidade

Federal de Santa Maria, nos últimos 8 anos e de outras instituições oficiais

demostraram ser a Aflatoxina (AF) a de maior incidência, com uma média

geral de 17,4 ppb (µg/kg). O produto com a maior contaminação é o - 3 -

amendoim. Este grão foi encontrado com uma positividade de 44,37% e uma

média de 125 ppb, observando-se amostras com níveis de até 16,7 ppm

(mg/kg) (Figura 2).

O milho, principal cereal na dieta animal, nestes últimos anos

apresentou positividade 52,67% para AF em 20048 amostras analisadas,

com um nível máximo

de 14,2 ppm e média

de 16 ppb. Em

conseqüência desta alta

contaminação, as

rações animais

produzidas no Brasil

apresentaram uma

positividade de 46,66%,

pouco inferior da

incidência encontrada

no milho. A

contaminação média dessas rações foi de 10,2 ppb com valore extremo de

6,7 ppm.

A contaminação por zearalenona (ZEA) é um pouco menos freqüente.

A média da concentração desta micotoxina para todos os produtos positivos

analisados no LAMIC é de 36,0 ppb, obtendo-se um percentual de

positividade de 8,1% das amostras com um nível acima de 10 ppb. O nível

máximo encontrado pelo LAMIC foi de 7,7 ppm.

A presença de ocratoxina A foi constatada com menor freqüência

sendo que a incidência atinge um índice de aproximadamente 0,5%.

A contaminação por fumonisinas (FB) vem sendo monitorada, apenas a

partir de 1996. Durante este período foram avaliadas 2591 amostras,

originárias principalmente da Região Sul do Brasil. Foram encontradas 1024

(39,5%) amostras contaminadas por FB1. A concentração média das

amostras positivas foi de 0,75 ppm com um máximo de 53,7 ppm em

amostras relacionadas a um surto de leucoencefalomalácea eqüina (LEME).

- 4 -

Figura 2 – Contaminação por aflatoxinas em matrizes alimentares.

DIAGNÓSTICO DE MICOTOXINAS

A metodologia mais específica, precisa e confiável é a obtida com o

emprego de processos químicos. Esses procedimentos poderão ser tanto os

dirigidos para a Cromatografia em Camada Delgada (TLC), quanto para a

Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC). Ambas apresentam

resultados semelhantes. Os testes de imunoensaio poderão ser empregados

para triagem e em casos excepcionais, para a semiquantificação. O uso dos

testes químicos ainda é a metodologia internacionalmente mais aceita e

recomendada para os laboratórios de diagnóstico de micotoxinas.

Atualmente, o emprego de extração em fase sólida vem trazendo avanços,

principalmente, na padronização e automação das análises

micotoxicológicas.

O sistema de análise empregado no monitoramento “on line” usa o

HPLC acoplado a metodologias automatizadas ou semi-automatizadas de

extração. O tempo necessário para a análise desde a entrada da amostra até

a expedição do laudo final de análise não deve ultrapassar 48 horas para

uma análise padrão, compreendendo aflatoxinas e zearalenona.

AMOSTRAGEM PARA PESQUISA DE MICOTOXINAS.

O procedimento amostral é, sem dúvida o ponto mais importante para

o monitoramento de micotoxinas. Uma amostragem incorreta leva a tomada

de decisão errada na avaliação de um silo, por exemplo. Isto implica em

custos, recusa do produto fora das especificações e micotoxinas nas dietas

que levam a perdas de produtividade e prejuízos econômicos, além dos

riscos à saúde pública. Contudo, a distribuição heterogênea das micotoxinas

nos grãos é outro fator, talvez o principal a interferir na amostragem. Os

estudos de Whitaker et al. (1972) sobre o assunto mostram, que a

variabilidade dos resultados poderá ser diminuída com:

Amostragem com maior tamanho da amostra e do número de pontos

amostrados;

Sub-amostragem com o aumento de tamanho (peso) da sub-amostragem

ou pela diminuição do tamanho das partículas pela moagem;

Analisando um maior número de amostras.

- 5 -

Por exemplo, se o peso da amostra é dobrado, a variância na

amostragem é reduzida pela metade. Esta relação também é verdadeira

para se obter a redução da variância no processo de sub-amostragem e de

análise.

PLANEJAMENTO DE UM PROGRAMA DE ANÁLISE DE MICOTOXINAS

Este planejamento requer o conhecimento das características da

distribuição das micotoxinas. Os trabalhos de Whitaker et al. (1972) sobre a

distribuição dos resultados das análises de micotoxinas em lotes são leitura

obrigatória. O conhecimento de curvas operacionais (OC) e da forma de

interferirmos na diminuição do risco de amostragem são pressupostos

fundamentais.

A forma mais prática encontrada em nossas condições, para

diminuição do risco de amostragem e com um compromisso entre

custo/benefício encontra-se definida na Figura 3. O programa amostral

empregado na maioria das indústrias assistidas pelo LAMIC é o

recomendado pela Comissão de normas da UE (Amtsblatt der Europäische

Gemeinschaften N L 102/1, TEIL II, 1976 e Futtermittelrecht mit Typenliste

fur Einzel - und Mischfuttermitteln, 1994). Adaptações foram realizadas para

amostrar sempre as matérias primas após serem moídas, possibilitando boa

exeqüibilidade e melhor representatividade. A colheita das amostras ocorre

sempre quando o material se encontra em movimento e moído sendo

realizada em intervalos de tempo pré-estabelecidos, dependendo da

quantidade de toneladas produzidas por turno de produção. Assim, uma

fábrica de rações que produz 100 T/dia, fará uma amostra coletiva mínima

de 45 kg de material moído. Deste material será retirada uma amostra de

no mínimo 1 kg que será enviada ao laboratório. Os responsáveis pela

colheita do material deverão estar constantemente envolvidos no processo

e evidentemente treinados para tal. A participação do amostrador é

fundamental impotância para a operacionalização e bom andamento de um

sistema de controle de micotoxinas.

- 6 -

A amostra deverá ser enviada imediatamente, ao laboratório, devendo

o material ser acondicionado em embalagem resistente. Para áreas mais

afastadas, recomenda-se o uso do serviço de transporte aéreo. É importante

que o tempo de transporte não ultrapasse 48 horas.

A analise, e principalmente quais as micotoxinas que devem entrar em

um programa de controle, somente poderão ser definidas pelo

conhecimento da incidência das mesmas na área de origem do material a

ser empregado na

indústria. Em função da

necessidade da tomada

de dicisões rápidas nas

agroindústrias,

recomenda-se que a

análise seja realizada o

mais rápido possível, em

um tempo não seja

superior a 48 horas.

Na avaliação dos

resultados é necessário, inicialmente, estabelecer os limites de confiança

para o sistema amostral. O procedimento usual inicia com a colheita de no

mínimo 3 e máximo 5 amostras por turno de produção. Os resultados são

avaliados em sua amplitude para com isto ajustar-se o número mínimo de

amostras. Após um período inicial, de aproximadamente 1 mês, é possível

reduzir o número de amostras até a uma só por dia, dependendo da

produção total e do cereal empregado.

CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES

Um programa de monitoramento de micotoxinas pode apresentar grande

variabilidade associada à análise de produtos como os cereais. A

concentração de micotoxinas não poderá ser determinada com 100% de

exatidão. Isto é o resultado da variância da amostragem (92,7%), sub-

amostragem (7,2%) e da análise (0,1%). Para diminuição desta variabilidade

- 7 -

de resultados, os seguintes aspectos deverão ser considerados em um

monitoramento:

Adoção de programa amostral compatível com a realidade, mas

executado integralmente, e em todas as amostras;

Aumentar o número das sub-amostragens tornando-as sistematizadas

mas com distribuição aleatória;

Aumentar o número de partículas por unidade de massa através da

moagem de grãos;

Efetuar o maior número de análises possível;

Colher as amostras quando o material a ser amostrado encontra-se em

movimento de preferência com amostradores automáticos;

Nas rações terminadas, nos casos de suspeita de micotoxicose, recolher

as amostras próximas ao ponto final de consumo;

Protocolar as amostras corretamente, permitindo a localização do sub-

lote contaminado ou sem a presença de micotoxinas.

Para o controle da produção de micotoxinas e micotoxicoses

recomendamos especial atenção aos seguintes fatores:

Evitar situações estressantes : Observa-se uma maior prevalência de

micotoxinas onde os tratos culturais dispensados a cultura são menores,

a concorrência de ervas daninhas, a restrição hídrica e outros fatores são

responsáveis por maiores contaminações;

Lesões à integridade do cereal : Os problemas de mau empalhamento e

infestação por insetos, determinam a contaminação ainda nos estágios

iniciais da cultura. A escolha de híbridos com características

morfológicas adequadas deve ser a preocupação inicial na escolha da

semente;

Colheita : A deficiente regulagem dos equipamentos de colheita,

transporte e manipulação do cereal representam a condenação do

material pela lesão no cereal exposição do nutriente ao fungo;

Umidade do cereal: Colheita no estado de maturação fisiológica e

secagem imediata em temperatura correta, reduzem o tempo para a

proliferação fúngica e conseqüente perda de nutrientes, bem como

formação de toxinas;- 8 -

Armazenagem : Umidade correta de estocagem e aeração, bem como o

emprego de inibidores fúngicos, pré/pós-produção da ração, devem ser

considerados no programa de prevenção de micotoxinas durante a

armazenagem. A limpeza prévia e criteriosa do silo dever ser rotineira.

Seleção de híbridos resistentes : Esta nova possibilidade de seleção de

materiais com características intrínsecas de proteção ao crescimento

fúngico e conseqüente possibilidade de produção de micotoxinas,

representa um avanço considerável;

Neutralização química : O uso de substâncias com capacidade

seqüestrante ou de inativação enzimática em um programa de

prevenção de micotoxinas é em muitas situações a única alternativa

tecnicamente viável para evitar prejuízos sanitários e econômicos.

PRINCIPAIS MICOTOXINAS NA AVICULTURA

AFLATOXINAS

Em surtos de aflatoxicose no campo, uma das características mais

marcantes é a má absorção que se manifesta como partículas de ração mal

digeridas nas excretas das aves. Está associada com esteatorréia ou

excreção aumentada de lipídeos. Esta má absorção prejudica a eficiência de

conversão alimentar e, conseqüentemente, aumenta o custo da produção. A

esteatorréia da aflatoxicose pode ser severa com o aumento de até dez

vezes no teor de gordura no material fecal. Em frangos de corte, a

esteatorréia é acompanhada por uma diminuição nas atividades específicas

e totais da lipase pancreática, principal enzima digestiva das gorduras, e

pela diminuição dos sais biliares, necessários tanto para a digestão como

para a absorção de gorduras, levando a esteatose hepática (fígado

gorduroso). Também se observa, em frangos e poedeiras que recebem

ração contaminada com AF, extrema palidez das mucosas e pernas. Esta

pigmentação deficiente parece ser resultado da menor absorção, diminuição

no transporte e deposição tecidual dos carotenóides da dieta sendo a

aflatoxicose identificada como “síndrome da ave pálida”.

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EFEITO DAS AFLATOXINAS SOBRE A POSTURA:

A percepção dos distúrbios causados pelas aflatoxinas sobre a

produção de ovos é possível somente após alguns dias ou semanas. A

diminuição da postura é precedida pela redução nos níveis sangüíneos de

proteínas e lipídeos. A presença de folículos antes do consumo da

micotoxina no trato reprodutivo das aves, justifica esta resposta tardia.

Poedeiras que consumiram dieta com 20 ppm de aflatoxinas durante 7 dias

apresentam redução na produção de ovos a partir do oitavo dia, baixando

35% na postura uma semana após a retirada da micotoxina da dieta. Além

de reduzir a produção de ovos, a aflatoxicose também é responsável pela

redução do tamanho dos ovos, bem como pela redução proporcional no

tamanho das gemas, devido aos prejuízos causados na síntese protéica e

lipídica. Mas a deposição de cálcio na casca dos ovos por si só não é

afetada. A resistência da casca aumenta quando aves consomem

aflatoxinas devido à redução na casca desses ovos não terem a mesma

proporção da redução ocorrida na clara e gema. Este aumento da espessura

da casca pode afetar a eclodibilidade pela reduções nas trocas gasosas

entre embrião e ambiente.

A melhor explicação para os prejuízos na eclodibilidade de ovos

férteis, produzidos por aves que consumiram aflatoxinas, está na

transmissão destas micotoxinas aos ovos. Aflatoxina B1 (AFB1) pode ser

transmitida tanto às gemas como para as claras. A Aflatoxina B1, AFM1 e o

aflatoxicol podem ser encontrados nos ovos, 24 horas após o início do

consumo de ração contaminada. Portanto, é necessário salientar que,

enquanto o índice postura é afetado somente 8 dias após o início da

intoxicação, a eclodibilidade começa a ser afetada imediatamente após o

início do consumo de ração contaminada.

TRICOTECENOS:

As principais micotoxinas deste grupo compreendem a: Toxina T-2,

Deoxynivalenol (DON), Diacetoxyscirpenol (DAS), todas produzidas por

diversos gêneros de fungos, principalmente por espécies de Fusarium.

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Estudos com intoxicações crônicas envolvendo toxina T-2 ou DAS

revelaram redução no consumo de ração e ganho de peso, lesões orais,

necrose dos tecidos linfóide, hematopoiético e mucosa oral, com eventuais

distúrbios nervosos (posição anormal das asas, falta de reflexos),

empenamento anormal e diminuição na espessura da casca dos ovos.

Particularmente em poedeiras, as lesões orais foram provocadas em 50%

dos lotes quando estas aves receberam 2 ppm da toxina T-2, decrescendo

paralelamente a produção de ovos. E mais, a toxina T-2 é, in vitro, tóxica

para macrófagos de frangos, inibindo a sua capacidade fagocitária. Esta

toxina também pode formar peróxidos a partir dos lipídeos, tendo como

conseqüência a diminuição da concentração de vitamina E nas aves. Outras

aves como perus e gansos são mais susceptíveis a toxina T-2 que frangos de

corte. Em gansos, a partir de 0,1 mg/kg de peso vivo ocorre a queda na

produção de ovos. Os níveis de postura e eclodibilidade diminuíram em

50%, quando foram administrados 300 mg de toxina T-2/kg de peso vivo. As

micotoxinas T-2 e DAS produzem lesões orais em frangos de corte em níveis

a partir de 1 ppm na ração. Ocorreram efeitos tóxicos mais significativos

com níveis de 4 ppm onde as aves apresentam baixo consumo, retardo no

crescimento, alterações no quadro sanguíneo e neurotoxidade. Também

foram observadas lesões orais em peruzinhos alimentados com ração

contendo concentrações de 5 ppm da toxina T-2 e redução de ganho de

peso com 10 ppm da mesma micotoxina. Numa comparação direta,

concluiu-se que peruzinhos são mais sensíveis que frangos de corte.

Contudo, gansos também são muito sensíveis à Toxina T-2 quando em

concentrações próximas de 3 ppm, que podendo ser letal par os animais

desta espécie.

Estudos similares realizados com DON, entretanto tem mostrado que,

com exceção a um decréscimo transitório nos níveis de hemoglobina, ou um

levíssimo efeito na qualidade do ovo, não há evidência significativa que esta

toxina afete o desempenho de aves.

As aves são capazes de tolerar concentrações relativamente altas de

DON na dieta e um pouco menos em relação à toxina T-2 e DAS. Nos níveis

de DON normalmente encontrados em rações contaminadas (0.35 a 8.0 - 11 -

ppm), não houve indicações de algum problema sanitário perceptível com

frangos. Concentrações de DON acima de 82,8 ppm foram administradas em

poedeiras Legorn por 27 dias sem nenhum efeito sobre o desempenho e

também sem apresentar lesões nas aves. Outros estudos descreveram

lesões muito leves e redução na qualidade de ovos em aves que receberam

18 ppm de DON na dieta.

Os tricotecenos geralmente não induzem aumento de mortalidade

para outras aves, requerendo níveis de várias centenas de partes por milhão

para resultar em mortes. De forma semelhante, em surtos de toxicose,

atribuídos a toxina T-2 que afetaram patos domésticos, gansos, eqüinos e

suínos, somente houve mortalidade em gansos, sugerindo uma grande

sensibilidade desta ave.

FUMONISINAS

Os efeitos tóxicos das fumonisinas em aves foram estudados

primeiramente, usando-se cultivos de Fusarium moniliforme como fonte

desta micotoxina. O cultivo foi administrado às aves junto com a ração.

Foram alimentados de frangos de corte de 1 dia durante 3 semanas com

rações que continham em torno de 525 ppm de fumonisina B1. As aves que

receberam 450 e 525 ppm tiveram uma diminuição significativa no ganho

de peso e conversão alimentar, aumento no peso dos rins, fígado e

concentração de hemoglobina. Comparado-se aos controles, todas as aves

que foram alimentadas com fumonisina B1 apresentaram níveis elevados de

esfinganina e esfingosina (precursores dos esfingosídeos celulares) no soro

sanguíneo. Devido a inibição da biosíntese de esfingolipídeos, por ação das

fumonisinas, os autores sugerem que as dietas contendo mais que 75 ppm

de fumonisina B1 pode ser tóxico para pintos. Mas estes autores também

não enfatizaram que Fusarium moniliforme produz, além de fumonisinas,

outras micotoxinas como moniliformina, fusarina, ácido fusárico e um

número ainda desconhecido de metabólitos citotóxicos. Como eles não

purificaram a fumonisina e sim utilizaram o cultivo “bruto” de Fusarium

moniliforme, deve-se aceitar com reservas estes resultados. Em um estudo

realizado com perus, foi demonstrado que somente houve efeito deletério - 12 -

de fumonisina B1 em níveis acima de 200 ppm na dieta. Entretanto, outro

trabalho, utilizando metodologia semelhante, mostrou que 75 ppm já

apresenta toxicidade para peruzinhos. O emprego de fumonisina B1

purificada, nas doses de 0, 20, 40 e 80 ppm em frangos de 1 até 21 dias de

idade, demonstrou que estes níveis de toxina não levaram a efeitos

adversos sobre ganho de peso, conversão alimentar ou consumo de água.

Quanto a interações entre fumonisina B1 e outras micotoxinas, não houve

ação sinérgica entre esta e aflatoxina em perus. No entanto este sinergismo

ocorreu com moniliformina em frangos e com toxina T-2 em perus quando

foi administrado 300 ppm fumonisina mais 5 ppm T-2.

Esta relativa inocuidade de fumonisinas foi contestada em estudos

experimentais, intoxicando pintos de 1 dia com 10 mg/kg (ppm) de ração

durante 6 dias. Observaram que fumonisina B1 pode contribuir para o

aparecimento de petéquias, aumentando o tempo de coagulação sanguínea

e diminuindo a concentração de albumina sérica.

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