Micro Apostila1

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    Curso de Microbiologia BsicaCurso :MB1504

    INDICE GERAL

    Captulo 1: Introduo Microbiologia

    a. Microbiologia como uma Cinciab. A clulac. Origem da Vidad. O microscpicoe. Caractersticas distintivas dos principais grupos de microrganismos

    Captulo 2: Caracterizao dos Microrganismos

    a. Isolamento e Cultivo de Culturas purasb. Conservao das culturas purasc. Preparo dos microrganismos para a Microscopia Luminosad. Informaes utilizadas para caracterizar os microrganismose. classificao dos organismos vivos

    Captulo 3: Estrutura das clulas Procariticas e Eucariticas

    a. Ultra-estrutura dos microrganismos procariotos

    b. Ultra-estrutura dos microrganismos eucariotos

    Captulo 4: Exigncias Nutricionais e o Meio Microbiolgico

    a. Elementos qumicos como nutrientesb. Classificao nutricional dos microrganismosc. Meios utilizados para o crescimento dos microrganismos

    Captulo 5: Cultivo e Crescimento dos Microrganismos

    a. Condies fsicas para o cultivo dos microrganismosb. Reproduo e cresimento dos microrganismos

    Captulo 6: Controle dos Microrganismos

    a. Antimicrobianosb. Agentes fsicosc. Agentes qumicos

    Captulo 7: Os Principais Grupos de Microrganismos

    a.

    Eubactrias e Arqueobactrias

    b. Eucaritos

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    Captulo 8: Metabolismo Microbiano

    a. Catabolismo e Anabolismob. Bioenergticac. Principais fontes de energia dos microrganismos

    d. Vias de degradao de nutrientese. Transporte de nutrientes para o interior da clulaf. Utilizao de energia para processos biosintticos

    Captulo 9: Gentica Microbiana

    a. Cromossomos de clulas procariticas e eucariticasb. Replicao do DNAc. O gened. Variabilidade dos microrganismos - Mutaoe. Regulao da expresso gnica

    Captulo 10: Vrus

    a. Principais caractersticasb. Replicao dos Vrusc. Isolamento e identificao dos vrusd. Patogenicidade

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    MICROBIOLOGIA BSICA

    CAPTULO 1: Introduo Microbiologia

    Microbiologia como uma Cincia

    Estuda a natureza fundamental e as propriedades dos microrganismos (Microbiologia Bsica).O controle e o uso dos microrganismos de maneira benfica (Microbiologia Aplicada)

    Principais temas de pesquisa usados na Microbiologia Bsica:

    1. Caractersticas Morfolgicas - forma e tamanho da clula; composio qumica efuno de suas estruturas internas.

    2. Caractersticas Fisiolgicas - p.ex; a necessidade nutricional especfica e as condiesfsicas necessrias ao crescimento e reproduo.

    3. Atividades Bioqumicas - como os microrganismos quebram os nutrientes para obterenergia e como eles usam esta energia para a sntese de compostos da clula.

    4. Caractersticas Genticas - a hereditariedade e variabilidade das caractersticas.5. Potencial de causar doena - presena ou ausncia para o homem, animais e plantas6. Caractersticas Ecolgicas - a ocorrncia natural dos microrganismos no ambiente e

    sua relao com outros m.o.7. Classificao - a relao taxonmica entre os grupos no mundo microbiano.

    Principais campos de aplicao da microbiologia Aplicada (medicina, alimentos e laticneos,agricultura, indstria e ambiente). Alguns exemplos:

    1.

    Produo de vacina com mtodo mais econmico

    2. Processos mais eficientes para o tratamento de esgoto3. Sntese de numerosas substncias, desde mais simples, como o cido ctrico, a

    antibiticos mais complexos, e enzimas4. Utilizado como suplemento alimentar (protena de clula nica - SCP)5. Produo de gs metano, utilizado como combustvel (pesquisa atual)6. Biometalurgia - explora a atividade qumica de bactrias para extrair minerais de

    minrios de baixa qualidade7. Usados como "inseticidas biolgicos", no lugar de produtos qumicos; microrganismos

    capazes de degradar poluentes8. Microrganismos capazes de melhorar a capacidade de detergentes caseiros, em

    remover manchas

    9. Isero de genes bacterianos em plantas para matar insetos10.Produo de enzimas bacterianas que dissolvem cogulos sanguneos; vacinashumanas utilizando vrus de insetos; e testes laboratorias rpidos para diagnstico deinfeco viral (novas pesquisas da Engenharia Gentica-Microbiologia Mdica)

    A clula

    As clulas microbianas podem ser divididas em duas categorias com base em como asubstncia nuclear se apresenta dentro da clula:Clulas Eucariticas, apresenta um ncleoseparado do citoplasma por uma membrana nuclear;Clulas Procariticas, que apresentammaterial nuclear sem membrana.

    Todos os organismos, unicelulares (constitudos de uma nica clula), ou multicelulares (quecontm muitas clulas), apresentam as seguintes caractersticas:

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    1. reproduo2. utilizao de alimentos como fonte de energia3. sntese de substncias e estrutura celular4. excreo de substncias5. resposta a alteraes ambientais

    6. mutaes (alteraes sbitas em suas caractersticas hereditrias), embora ocorramraramente

    Elementos diferenciais entre clulas procariticas e eucariticas:

    Elemento Clulas Procariticas Clulas Eucariticas

    Grupos pertencentesBactrias, algas verde-azuis

    Algas, fungos, protozorios,vegetais e animais

    Tamanho da clula tipicamente 0.2-2.0 m tipicamente 10-100 m

    Ncleomembrana nuclear enuclolo ausentes

    limitado por membrananuclear e presena denuclolo

    Organelas envolvidas pormembrana ausente

    presentes : lisossomos,complexo de Golgi, retculoendoplasmtico, mitocndriae cloroplastos

    Flageloconsiste de 2 protenasconstrudas em blocos

    complexo : consiste demltiplos microtbulos

    Glicoclicepresente como umacpsula ou camada limosa

    presente em algumasclulas que tem paredecelular

    Parede Celular

    usualmente presente;quimicamente complexa(parede celular bacterianatpica inclue peptidoglicano)

    quando presentequimicamente simples

    Membrana citoplasmticano contm carboidratos eesteris

    presena de esteris ecarboidratos que servemcomo receptores

    Ribossomos70S, distribuidos nocitoplasma

    80S (retculoendoplasmtico); 70S(mitocndria e cloroplasto)

    Cromossomos (DNA)cromossomo nico, circular,sem histona

    um ou mais cromossomos,linear, com histona

    Diviso Celular fisso binria mitose

    Reproduo sexualtransferncia de DNAapenas por fragmentos

    envolve meiose

    Relao G + C (%) 28 a 73 em torno de 40

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    Origem da Vida

    Concluses do estudo da origem da vida :

    1. origem nica das formas de vida2. existem 3 linhas primrias de descendncia evolucionria:Eubactrias,

    ArqueobactriaseEucaritos3. h duas linhas de procaritos: Eubcterias e Arqueobcterias4.

    tanto os cloroplastos como as mitocndrias - origem bacteriana

    5. o relgio evolucionrio no constante para todos os microrganismos6. as maiores divergncias entre as Arqueo e Eubactrias so das termoflicas7. a fotossntese surgiu depois8. os organismos mais primitivos so associados aos ambientes hidrotermais (gua + alta

    temperatura)9. os primeiros organismos deveriam ter duas propriedades: mecanismo de metabolismo

    (energia) e mecanismo de replicao (hereditariedade)

    Os primeiros organismos alm de anaerbios, deveriam ser organotrficos fermentativos

    No surgimento da vida em aerobiose, imagina-se ter comeado com as cianobactrias, as

    quais crescem produzindo molculas de oxignio (O2), as quais se decompem em tomos(O), que reagiria com as novas molculas de oxignio produzidas, formando o oznio (O3).Com a camada de oznio, surge proteo dos raios UV, e surgimento de microrganismosaerbios.

    Os organismos primitivos devem ter usados RNA como material gentico, tanto parareproduo como para produo de enzimas.

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    Diviso dos Reinos (Antiga):

    1. Monera (procaritos) - microrganismos primitivos2. Protista (algas, protozorios, fungos limosos)3. Plantae (plantas verdes, algas superiores)4.

    Fungi (fungos - bolores e leveduras)

    5. Animalia (animais que ingerem alimentos)

    Diviso dos Reinos (Atual):

    1. Eubactrias (clulas procariticas)2. Arqueobactrias (clulas procariticas) - microrganismos primitivos3. Eucaritos (clulas eucariticas)

    A teoria endosimbitica prope a maneira pela qual as clulas eucariticas tem evoluido:origem das organelas eucariticas (cloroplastos e mitocndrias) a partir dos procaritos.

    O Microscpico

    O olho humano incapaz de perceber um objeto com um dimetro menor que 0.1 mm, a umadistncia de 25 cm. Os microrganismos tem dimenses de m (1m = 10 -3mm)

    Os microscpicos so classificados dependendo do princpio no qual a ampliao baseada:pticos (empregam dois sistemas de lentes, ocular e objetiva, atravs das quais a imagemampliada obtida) e eletrnicos (empregam um feixe de eltrons para produzir a imagemampliada)

    A microscopia ptica a mais comumente utilizada no laboratorio de microbiologia. Em geral, omicroscpico ptico amplia o objeto at certo limite (1.000 a 2.000 vezes). Esta limitao devida ao poder de resoluo.

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    Poder de Resoluo (P.R) - medida do menor objeto que pode ser visto ao microscpico

    P.R = comprimento de onda ;

    A.N

    A.N. (Abertura Numrica) = n.sen

    n = ndice de refrao; (teta) = semi ngulo do cone de luz que entra na objetiva.

    Pode-se usar um meio (p.ex. leo de cedro) com o mesmo ndice de refrao do vidro dalmina, para que os raios de luz deixem a lmina sem refrao, seguindo uma direo retapara dentro da objetiva, aumentando assim o poder de resoluo (P.R.)

    Principais caractersticas das objetivas do microscpio ptico :

    Ampliaolinear da

    objetiva

    Distncia focal

    aproximada(mm)

    Dimetroaprox. do

    campo(mm)

    Abertura

    'Nmerica

    Dist. detrabalho

    aprox.(mm)

    Poder deresoluo

    (m)

    Mximaampliao

    aprox.(ocular 10x)10x

    (objetiva seco depequenoaumento)

    16 1.5 0.25 4.50 2.0 100 vezes

    40-45x(objetiva seco degrande

    aumento)

    4 0.34 0.65 0.65 0.7 450 vezes

    90-100x

    (objetivade

    imerso)

    1.8 0.15 1.25 0.13 0.4 1000 vezes

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    A objetiva produz uma imagem real ampliada do objeto, a qual ainda aumentada em escalamuito maior pela ocular, sendo a mesma captada pelo olho humano

    O Microscpico eletrnico possui grande vantagem diante do ptico, apresenta um poder deresoluo 100 vezes maior, em virtude do comprimento de onda muito curto dos raioseletrnicos utilizados. possvel resoluo de objetos to pequenos quanto 10 Ao (1Ao =10-4m). Produz aumentos teis de 200.000 a 400.000

    Tipos deMicroscopia

    Aumentomx. til

    Aspecto do Espcime Aplicaes

    Microscopia pticaCampo Luminoso 1000 - 2000

    coradas ou no, quando

    coradas geralmenteassumem a cor do corante

    determinao dos elementos grosseiros debactrias,leveduras,bolores,algas e protozorios

    Microscopia pticaCampo Escuro

    1000 - 2000geralmente no coradas,aparecem brilhante sobre

    um fundo escuro

    microrganismos que exibem algum dadomorfolgico caracterstico em estado vivo

    Microscopia pticaUltravioleta

    1000 - 2000no visualizado diretamente;

    fotografadodiferenciao de componentes celulares com base

    em > ou < absoro da luz UV.Microscopia ptica

    Fluorescente 1000 - 2000brilhante e corado, corante

    fluorescente tcnicas diagnsticas

    Microscopia pticaControle de Fase 1000 - 2000 vrios graus de brilho

    exames de estruturas celulares em clulas vivasde microrganismos maiores

    (leveduras,algas,protozorios, e algumasbactrias)

    Microsc. Eletrnica 200.000 -400.000visto em tela fluorescente exames de vrus e da ultra estrutura das clulasmicrobianas

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    Caractersticas distintivas dos principais grupos de microrganismos

    Microrganismos Caractersticas

    1.Protozorios

    eucariticos, unicelulares, ingerem partculas alimentares, noapresentam parede celular rgida, no contm clorofila, alguns

    movem-se por meio de flagelo ou cilios, e so amplamentedistribuidos na natureza (principalmente aquticos)

    2.Algas

    eucariticos, considerados semelhantes s plantas, contmclorofila, podem ser uni ou multicelulares, apresentam paredecelular rgida, crescem em muitos ambientes diferentes (a maioriaaquticos)

    3.Fungoseucariticos, com parede celular rgida, uni ou multicelulares,desprovidos de clorofila, absorvem nutrientes dissolvidos doambiente (no digerem alimentos) - so os bolores e leveduras

    Boloresfungos multicelulares, produzem estruturas filamentosas (hifas,miclios...)

    Leveduras fungos unicelulares, apresentam formas variadas (esfrica a ovide;elipside a filamentosos)

    4.Bactriasprocariticos, carecem de membrana nuclear e outras estruturasintracelulares organizadas observadas nos eucariticos, sodivididas em dois grupos: Eubactrias e Arqueobactrias

    Eubactriasapresentam vrias formas (esfrica, bastonete e espirilo) eaparecem em formas agrupadas, variam de 0.5 - 5.0 m, sounicelulares, algumas apresentam flagelos

    Arqueobactrias

    semelhantes s eubactrias pelo microscpio, porm apresentamdiferenas importantes quanto sua composio qumica, hbeisem viver em ambientes no usuais (lagos salinos, piscinas

    trmicas, fundo de pntanos)

    5.Vrus

    no so celulares como os citados acima, so muito menores (20 a300 nm; 1nm=1/1000m) e mais simples em estruturas que asbactrias, contm somente um tipo de cido ncleico circundantepor um envelope protico (DNA ou RNA), podem multiplicar-sesomente dentro das clulas vivas, apresentam-se sob vrias formas

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    CAPTULO 2 : Caracterizao dos Microrganismos

    Uma populao microbiana, sob condies naturais, contm muitas espcies diferentes. Os

    microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os microrganismos emuma amostra, para ento classific-los e caracteriz-los.

    Isolamento e Cultivo de Culturas Puras

    Os microrganismos na natureza normalmente existem em cultura mistas, com muitas espciesdiferentes ocupando o mesmo ambiente.

    Ao determinar as caractersticas de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura, ouseja, em que todas as clulas na populao so idnticas no sentido de que elas se originaramde uma mesma clula parental.

    Em laboratrio, os microrganismos so cultivados ou desenvolvidos em material nutrientedenominadomeio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vrios fatores :

    1. consideraes sobre a origem do material a ser analisado2. a espcie que se imagina estar presente nesta amostra3. as necessidades nutricionais dos organismos

    Tcnicas de isolamento de microrganismos:

    O material a ser analizado colocado no meio de cultura - inculo- O processo de inoculaopode ser feito mediante:

    1. tcnica de esgotamento por meio de estrias superficiais- a amostra semeada nasuperfcie do meio solidificado com uma ala de semeadura para esgotar a populao,assim em algumas regies do meio, clulas individuais estaro presentes.

    2. tcnica de semeadura em superfcie- uma gota da amostra diluida colocada nasuperfcie do gar e com o auxlio de uma ala de semeadura de vidro (ala deDrigalky) esta gota espalhada sobre o meio.

    3. mtodo de pour-plate- a amostra diluida em tubos contendo meios liquefeitos (45 oC). Aps homogeneizao so distribuidos em placas de Petri; e aps a solidificaodos meios as placas so incubadas. As colnias se desenvolvero tanto acima quantoabaixo da superfcie (colnias internas).

    Em cada uma dessas tcnicas o objetivo diminuir a populao microbiana, assim as clulas

    individuais estaro localizadas a uma certa distncia umas das outras. As clulas individuais,se estiverem distante o suficiente, produziro uma colnia que no entra em contato comoutras colnias. Todas as clulas em uma colnia tem o mesmo parentesco. Para isolar umacultura pura, uma colnia individual transferida do meio para um tubo de ensaio.

    Conservao das Culturas Puras

    Uma vez que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura, necessrio manter asculturas vivas por um perodo de tempo com o objetivo de estud-las.

    Para armazenar por um perodo curto, as culturas podem ser mantidas temperatura derefrigeradores (4 a 10 oC)

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    Para armazenar por um perodo longo, as culturas so mantidas em nitrognio lquido (-196 oC)ou em freezers (-70 a -120 oC), ou ainda congeladas, e ento desidratadas e fechadas vcuoem um processo denominado liofilizao

    Alguns dos mais usados mtodos de conservao:

    1. transferncia peridica para meios novos2. sob camada de leo mineral3. liofilizao4. congelamento

    As colees de culturas so bancos de microrganismos e outras clulas que esto disposiode pesquisadores, professores, investigadores de patentes, e todo aquele que necessiteestudar um tipo particular de microrganismos - um conjunto de clulas de referncia de umacoleo de cultura padro. As clulas so congeladas em cubas de nitrognio lquido ouliofilizadas para resistir a qualquer variao que possa destruir a identidade da clula original.

    Preparo dos Microrganismos para a Microscopia Luminosa

    Existem dois mtodos gerais utilizados para preparar espcimes microbiolgicas paraobservao por meio do microscpico luminoso.

    1. Tcnica entre lmina e lamnula e gota pendente - utiliza uma suspenso demicrorganismos vivos em uma gota ou uma camada lquida. Estas preparaes (afresco) so especialmente teis quando a estrutura de um microrganismo pode serdistorcida pelo calor ou agentes qumicos, ou quando o microrganismo no se corafacilmente.

    2. Tcnicas de Colorao - a camada fina do espcime seca e corada, assim osmicrorganismos ficam fixados superfcie e apresentam-se corados para facilitar avisualizao. Usadas para mostrar as vrias estruturas dos microrganismos, para

    identificar e separar suas estruturas internas e para ajudar a identificar e separarmicrorganismos similares.

    As principais etapas do preparo de um espcime microbiano corado para exame microscpicoso:

    1. Confeccionar um esfregao, ou uma camada fina do espcime sobre umalmina de vidro

    2. Fixar o esfregao seco lmina, usualmente com o calor, para fazer aderir omicrorganismo lmina

    3. Colorao com um ou mais corantes

    Colorao Simples- a colorao de microrganismo com uma nica soluo de corante; ex: azulde metileno para leveduras, ou bolores.

    Colorao diferencial- envolve mais de uma soluo de corante; ex: colorao de lcool-cidopara bactria causadora da tuberculose; distingue esta bactria patognicica, por meio da cor(vermelho, pelo corante principal), de outras bactrias (azul, pelo corante do fundo)encontradas em amostras como saliva e escarro.

    Colorao de Gram- neste processo, o esfregao bacteriano tratado com os reagentes naseguinte ordem: o corante prpura cristal violeta, a soluo de iodo (substncia que fixa ocorante no interior da clula), o lcool (remove o corante de certas bactrias) e o corantevermelho safranina.

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    Bactrias Gram-positivas, retm o corante cristal violeta e aparecem coradas em violeta-escuro

    Bactrias Gram-negativas, perdem o cristal violeta quando tratadas com lcool, so entocoradas com o corante safranina e aparecem coradas em vermelho

    Informaes utilizadas para Caracterizar os Microrganismos

    As tcnicas laboratoriais para caracterizar os microrganismos variam desde uma microscopiarelativamente simples anlise de material gentico encontrado na clula.

    As principais categorias de informaes usadas para caracterizar espcies diferentes so :

    1. Caractersticas Morfolgicas - tamanho, forma e arranjo das clulas2. Caractersticas Metablicas - maneira pela qual o microrganismo desenvolve os

    processos vitais3. Caractersticas Antignicas - os anticorpos produzidos em animais de laboratrios

    podem ser usados para detectar a presena de antgenos nicos em culturasbacterianas e so usados para caracterizar os microrganismos

    4. Caractersticas Patognicas - importante determinar se o microrganismo causa doena(patognico) ou no causa doena (no-patognico)

    5. Caractersticas Genticas - a maioria dos microbiologistas conta atualmente comtcnicas que permitem realizar anlises genticas para classificar ou identificar osmicrorganismos ou compreender a sua atividade. A sonda de DNA um exemplo deprocedimento gentico rpido e amplamente utilizado - uma fita de DNA de umaespcie conhecida misturada com uma fita de uma espcie desconhecida. Se osmicrorganismos so da mesma espcie, as duas fitas se combinaro, ou se ligaro.Esta combinao aparece como uma fita dupla de DNA com um marcador ligado.

    Classificao dos Organismos Vivos

    Como fazer para determinar os nomes dos microrganismos e como catalog-lo de formasistemtica?

    As denominaes especficas no mundo biolgico, surgem da sistemtica, que pode serdescrita como "a cincia do desenvolvimento de um arranjo ordenado das espcies, dentro decada uma das principais categorias de organismos". Sistemtica = Taxonomia

    A cincia da taxonomia inclui a classificao(arranjo), nomenclatura(nomes) e identificao(descrio e caracterizao) dos organismos vivos.

    Os organismos que compartilham certas caractersticas comuns, so agrupados em grupostaxonmicos denominados taxa(singular txon). O txonbsico a espcie, que uma

    coleo de cepas com caractersticas similares. Depois segue com :

    ESPCIE-GNERO-FAMLIA-ORDEM-CLASSE-DIVISO-REINO

    Regra dos nomes - SISTEMA BINOMIAL DE NOMENCLATURA

    1. Cada espcie recebe um nome constitudo de duas palavras (ex. Neurospora crassa)2. O primeiro termo o nome do gnero e sempre se inicia com letra maiscula3. A denominao do gnero uma palavra latina ou grega (um novo trmo composto de

    razes latina ou grega, ou o nome latinizado de uma pessoa - masculino, feminino, ouneutro)

    4. Os nomes prprios dos microrganismo so sempre escrito em itlico5. O segundo termo do nome de um microrganismo, especfico (espcie), escrito em

    letras minsculas e usualmente descritivo:

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    o adjetivo que modifica o nome (Bacillus albus- Bacillus branco)o adjetivo sob a forma de participio presente de um verbo (Clostridium dissolvens

    - que dissolve)o substantivo no caso, possesivo que modifica o nome genrico (Salmonella

    pullosum - Salmonella dos pintos)o nome de carter explicativo (Bacillus radicicola- Bacillus habitante da raz)

    Ocasionalmente, necessrio subdividir uma espcie em variedades. Tal atitude tomadaquando existem diferenas numa espcie, insuficientes para a criao de uma nova espcie,como por exemplo; a amostra de Streptococcus lactisque produz um aroma de malte e que designada de Streptococcus lactisvar. maltigenes

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    CAPTULO 3: Estruturas das Clulas Procariticas e Eucariticas

    Ultra-estrutura dos Microrganismos Procariticos

    A maioria das bactrias (organismos procariticos) so unicelulares e apresentam uma formasimples (esfrica, cilndricas ou espiraladas), apesar dos 3,5 a 4 bilhes de anos durante osquais elas tem evoludo

    Estrutura Geral de uma clula (bacteriana) procaritica tpica :

    Flagelos e pelos

    1. so estruturas externas parede celular. Filamentos finos e ocos, que seestendem a partir da membrana citoplasmtica atravessando a parede celular,e que nem todas as clulas possuem

    2. os flagelos so usados para locomoo da bactria, pulsionando-a atravs dolquido em aproximadamente 100m/seg (3000 vezes o seu comprimento). So

    mais longos que a clula (medindo de 15 a 20m). A energia para mover osflagelos vem dafora protomotiva

    3. os pelos ou fmbrias no so usados para locomoo, so mais finos,menores, mais retos e mais numerosos que os flagelos. So ocos e a maiorparte deste tipo de filamento est envolvido com a adeso superfcie

    Glicoclice

    1. um material viscoso (geralmente polissacardeos) que circunda algumasclulas bacterianas. Chamado de cpsula quando se encontra organizado eacoplado parede celular; e camada limosa se se encontra desorganizado eacoplado frouxamente parede celular - esta ltima tende a ser solvel em

    gua deixando assim o meio viscoso (como o caso da viscosidade do leite)2. apresentam vrias funes :

    aderncia (em pedras onde passa gua em grande movimento; emrazes de plantas; na superfcie lisa dos dentes humanos provocando acrie)

    proteo (contra dessecamento) evitar a adsoro e lise das clulas por bacterifagos

    Parede celular

    1. rgida, suportam altas presses, mantendo assim a forma caracterstica decada clula. Serve como uma barreira a algumas substncias prevenindo aevaso de certas enzimas que poderiam causar danos clula

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    2. podem reter corantes, alguns antibiticos, sais biliares, metais pesados eenzimas degradativas, em contra partida os nutrientes lquidos necessrios clula tem passagem permitida

    3. as paredes celulares so camadas de diferentes substncias que variam deacordo com o tipo de bactria envolvida, diferindo em espessura e composio

    Gram-Positivas :

    1. membrana citoplasmtica:o fosfolipdeoso protenas

    2. parede celular:o peptidoglicano - polmero poroso e insolvel, em grande

    quantidade nestas bactrias (50% ou mais do peso seco daclula), tornando a parede bem espessa

    o cido teicico - polmero de glicerol e ribitol fosfato; carregadosnegativamente pode ajudar no trasporte de ons + para dentroe fora da clula; e no armazenamento de fsforo. Se

    encontram ligados ao peptidoglicano ou membranacitoplasmticao polissacardeos - ligados ao peptidoglicano

    Gram-Negativas:

    1. membrana citoplasmtica:o fosfolipdeoso protenas

    2. parede celular - localizada no espao periplasmtico, ou seja, entre asmembranas citoplasmtica e externa.

    o peptidoglicano - representa 10% do peso seco da clula

    o lipoprotenas3. membrana externa - presente apenas nestas bactrias, serve paradistingui-las.

    o lipopolissacardeos - tpicos destas bactrias, ocorremsomente na membembrana externa; formados de lpideos,cerne de polissacardeo e antgenos O. Podem atuar como umveneno (LPS ou endotoxina)

    o trmeros de porina

    Comparao entre as paredes celulares de bactrias Gram-Positivas e Gram-Negativas :

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    as paredes celulares das Arqueobactrias diferem das Eubactrias tanto emcomposio qumica quanto na estrutura. Tais paredes contm protenas,glicoprotenas ou polissacardeos completos. No contm peptidoglicono.

    quando a parede de uma bactria Gram-positiva quase completamentedestruda, por enzimas, o resultado uma clula esfrica conhecida comoPROTOPLASTO, a qual permite a entrada de grande quantidade de gua,resultando em lise. As paredes das Gram-negativas so mais resistentes aestas enzimas

    Mecanismo de Colorao de Gram :

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    Membrana Citoplasmtica

    o stio de atividade enzimtica especfica, e do transporte de molculas paradentro e para fora da clula. uma barreira para a maior parte das molculassolveis em gua e muito mais seletiva que a parede celular

    composta primariamente de: 20 a 30% de fosfolipdeos e 50 a 70% deprotenas, estas podem fluir pelos fosfolipdeos

    contm enzimas envolvidas :

    no trasporte de molculas (permeases)

    na produo de energia

    sntese de parede celular

    a fotossntese ocorre em invaginaes da membrana citoplasmtica, as quaisfornecem uma extensa rea para acomodar uma alta concentrao depigmentos absorvidos da luz

    Difuso e Osmose atravs da Membrana Citoplasmtica

    1. Difuso Simples - passivo e a clula no gasta energia para realiz-lo. Osoluto se movimenta do lado menos diludo para o mais diludo at o equilbrio.Ex. entrada e sada de CO2 e O2

    2. Difuso por meio de Permeases - transporte da maior parte de nutrientes paradentro da clula. Requer gasto de energia pela clula

    3. Osmose - passagem do solvente de uma soluo de baixa concentrao de

    soluto (alta conc. de gua) para uma soluo com alta concentrao de soluto(ou baixa conc. de gua). A fora com que a gua se move atravs damembrana a presso osmtica. As clulas microbianas podem ser expostasa 3 tipos de condies osmticas :

    o Isotnica- a concentrao total dos solutos a mesma em qualquerlado da membrana

    o Hipotnica- a concentrao do soluto mais baixa no interior daclula. A gua entra na clula por presso osmtica. A maioria dasclulas crescem nesta condio

    o Hipertnica- a concentrao do soluto mais alta no interior da clula.A gua deixa a clula por presso osmtica

    Estruturas Celulares Internas da Membrana Citoplasmtica (Citoplasma)

    rea Citoplasmtica (poro fluida)

    o citoplasma tem em torno de 80% de gua, alm de cidos nclicos,protenas, carboidratos, lipdeos, ons inorgnicos, muitos compostos de baixopeso molecular, e partculas com vrias funes :

    1. Ribossomos - partculas densas, onde ocorre a sntese protica. Encontradasem todas as clulas procariticas e eucariticas. Consistem em 2 subunidadesde tamanhos diferentes (50S e 30S), que juntas formam o ribossomobacteriano 70S; S= unidade de quo rpido a partcula sedimenta quandocentrifugada em alta velocidade

    2. Poli--hidroxibutirato (PHB) - material lipdico solvel em clorofrmio. Atuacomo uma reserva de carbono e fonte de energia

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    3. Incluses - diferentes tipos de substncias qumicas que se acumulamformando depsitos insolveis. Os grnulos e incluses no so comuns atodas as clulas bacterianas

    rea Nuclear

    no apresenta ncleo delimitado por membrana, e ocupa uma poro prximado centro da clula - parece estar ligado ao sistema "membrana citoplasmtica-mesossomo"

    nucleide - consiste em um nico cromossomo (DNA) circular. O cromossomo a estrutura interna das clulas que fisicamente carrega a informaohereditria de uma gerao para outra

    Formas Latentes de Microrganismos Procariticos - Esporos e Cistos

    Esporos

    so formas inativas (no esto em crescimento), que podem viver em

    condies desfavorveis, como dessecamento e calor, mas seexpostas novamente em condies ambientais apropriadas comeama crescer e tornar-se clulas vegetativas metabolicamente ativas

    os esporos que se formam dentro da clula so chamadosENDSPOROS, e so exclusivos das bactrias

    possuem parede celular espessa, brilham muito com a luz domicroscpico, e so altamente resistente s mudanas ambientais - amaioria suportam ate 80 oC/10min

    o esporo contm o cido dipicolnico (DPA) no encontrados emclulas vegetativas, responsvel por 5 a 10% do peso seco doendosporo, ocorre em combinao com grande quantidade de clcio, eprovavelmente contribui na resistncia ao calor

    durante a esporulao ocorre um processo de desidratao,eliminando a maior parte de gua do esporo, o que possivelmentetambm vem contribuir para a resistncia ao calor

    as bactrias Actinomicetes produzem outro tipo de esporo, oCONDIO, muito resistente ao dessecamento mas no tanto ao calor.Este organismo pode produzir muitos destes condios na extremidadede um filamento, assim que tais condios so usados para areproduo e para proteo

    Endospros Condiosproduzidos no interior daclula

    na extremidade defilamentos

    1 por cada clula vegetalvrios so produzidos porclula

    resistentes ao calor edessecamento

    mais resistentes aodessecamento

    utilizados para proteoutilizado para reproduo eproteo

    Cistos

    apresenta estrutura e composio qumica diferente dos endsporos, eno apresentam alta resistncia ao calor. Ex. cistos presentes emAcetobacter

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    Ultra-estrutura dos Microrganismos Eucariticos - Fungos, Algas e Protozorios

    A caracterstica predominante das clulas eucariticas o ncleo com cromossomos lineares,envolvidos por uma membrana que no encontrada em procariotos

    Funo de cada estrutura :

    Flagelos e Clios

    estruturas delgadas, ocas, utilizadas para locomoo, diferem dos das clulasprocariticas, no que a energia necessria para movimentar estes apndicesprover da hidrlise do ATP

    Parede celular

    encontradas nas plantas, algas e fungos, apresenta a funo de manter aforma da clula e evitar que sofra lise pela presso osmtica

    Eucariotos Composio da Parede Celular

    plantaspolissacardeos - celulose epectina

    fungos filamentosos quitina e celulose

    leveduras unicelularesmananas - um polmero demanose

    algascelulose ou outro polissacardeo,e CaCO3

    Membrana Citoplasmtica

    possui morfologia e funes semelhantes as das clulas procariticas, pormapresentam caractersticas diferenciais destas clulas como :

    1. a presena de esteris - principalmente colesterol - os quaisentrelaam-se na bicamada lipdica e conferem resistncia membrana citoplasmtica dos eucariotos que no apresentam paredecelular

    2. a membrana citoplasmtica reforada por fibras de microtbulosformados pelas protenas actina e miosina.

    3. no possuem enzimas em sua membrana citoplasmtica envolvidas nometabolismo gerador de energia

    Organelas Celulares

    So estruturas envolvidas por uma membrana com funes especficas tais como, afotossntese, respirao, sntese protica, etc. O citoplasma a "residncia" das organelas"

    Ncleo

    a caracterstica marcante do ncleo dos eucariotos a membrananuclear, que contm muitos poros grandes, atravs dos quaisprotenas e RNA podem passar para o citoplasma

    a membrana nuclear geralmente d origem ou contnua ao retculoendoplasmtico, organela onde as protenas so sintetizadas

    esfrico ou oval, a maior organela na clula eucaritica. Nele estcontida as informaes hereditrias da clula na forma de DNA formado de 5 a 10% de RNA e o restante de protenas

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    Retculo Endoplasmtico

    conectados s membranas nuclear e citoplasmtica, podem terribossomos ligados (rugosos) ou sem ribossomos ligados (lisos)

    no retculo endoplasmtico rugoso as protenas produzidas pelosribossomos presentes nestas organelas, so liberadas no citoplasma

    o retculo endoplasmtico liso est envolvido na sntese de glicognio,lipdeos e esterides

    Complexo de Golgi

    o centro de empacotamento ou distribuio da clula. Responsvelpelo "transporte seguro" dos compostos sintetizados, para o exterior daclula, e tambm pela proteo da clula ao ataque de suas prpriasenzimas

    no complexo de Golgi enzimas que foram sintetizadas no retculoendoplasmtico rugoso (proteases, nucleases, glicosidases,sulfatases, lipases, e fosfatases) so empacotadas dentro de

    organelas chamadas lisossomos as protenas sintetizadas no R.E. rugoso, so levadas para o complexo

    de Golgi, onde os aucares so adicionados a estas para produzir asglicoprotenas

    Mitocndrias

    local onde o ATP gerado durante a respirao aerbia. A membranainterna altamente invaginada (cristas) - as quais aumentam a rea dasuperfcie disponvel para a atividade respiratria

    assemelham-se s clulas procariticas em vrios aspectos :o mede em torno de 0.5 a 1.0 m de dimetro;o contm seus prprios ribossomos, que tambm so 70S, em

    vez de 80S como os presentes no citoplasma eucaritico;o contm seu prprio DNA, o qual uma molcula nica, em fita

    dupla como nos procariotos - este DNA carrega informaesgenticas para a sntese de um nmero limitado de protenasque so produzidas nos ribossomos mitocondriais

    o dividem-se para formar uma nova mitocndria, praticamenteda mesma forma que as clulas procariticas se dividem - sedividem independentemente do ncleo celular, entretanto soincapazes de se dividirem se forem removidos do citoplasma

    Cloroplastos

    presentes nas plantas e nas algas, tambm so organelas geradorasde energia. o sitio das reaes fotossintticas apresenta um DNA circular (como nos procariotos) o qual codifica

    protenas no ribossomo destas organelas (70S) e enzimas necessriaspara a utilizao de CO2 no ar

    a membrana interna dobra-se no estroma (citoplasma dos cloroplastos)para formar pilhas de sacos em forma de disco ou fita chamadastilacides - contm pigmentos clorofila e carotenides

    so capazes de se dividir por fisso binria no citoplasma como asmitocndrias

    Formas Latentes dos Microrganismos Eucariotos - Esporos e Cistos

    Esporos

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    Os fungos produzem esporos sexuais e assexuais. Algumas caractersticas destas formaslatentes de vida so :

    os esporos sexuados so resultado de 2 clulas reprodutivas(gametas) em uma clula fertilizada. So produzidos menosfrequentemente e em menor nmero que os esporos assexuados

    os esporos assexuados so produzidos por hifas areas, e tem afuno de disseminar a espcie. So especialmente estruturados paraserem dispersos do talo-me. So normalmente brancos quandorcem produzidos, e depois adquirem cores caractersticas coma aidade

    os esporos dos fungos terrestres podem ser recobertos por camadasespessas para evitar ressecamento. Podem ser leves para seremcarregados em correntes de ar

    Cistos

    Produzidos por muitos protozorios, podem apresentar funo de

    proteo ou de reproduo para estes eucariotos

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    CAPTULO 4: Exigncias Nutricionais e o Meio Microbiolgico

    Elementos Qumicos como Nutrientes

    Os elementos qumicos principais para o crescimento da clula so : carbono, nitrognio,oxignio, enxofre e fsforo

    Carbono - C

    todos os organismos requerem carbono de alguma forma. Em geral oscompostos orgnicos so os que possuem carbono

    o carbono forma o esqueleto das 3 maiores classes de nutrientes orgnicos :carboidratos, lipdeos, e protenas - estes fornecem energia para o crescimentoda clula e serve como unidade bsica do material celular

    os heterotrficos utilizam compostos orgnicos como sua principal fonte decarbono, obtendo tais molculas a partir do meio, ou ingerindo organismosautotrficos ou mesmo heterotrficos

    os autotrficos utilizam o CO2 como sua principal ou nica fonte de carbono

    Nitrognio - N

    todos os organismos necessitam em alguma forma, a parte essencial dosaminocidos, que formam as protenas

    as bactrias so mais versteis para usar o N que os organismos eucariotos.Algumas bactrias podem utilizar o N2 (nitrognio atmosfrico) - fixao denitrognio - e outras podem utilizar compostos nitrogenados como : nitratos,nitritos e sais de amnia. E algumas utilizam ainda compostos de nitrognioorgnico tais como os aminocidos e peptdeos

    Hidrognio (H), Oxignio (O), Enxofre (S) e Fsforo (P)

    essenciais a todos os organismos. H e o O fazem parte de muitos compostos orgnicos e da gua S necessrio para a biossntese dos aminocidos cistena, cistina, e

    metionina P essencial para a sntese de cidos nuclicos e ATP alguns desses elementos so encontrados na gua ou na atmosfera gasosa do

    meio. Os os inorgnicos como sulfatos e fosfatos, podem tambm suprir osprincipais elementos necessrios ao microrganismo

    Outros Elementos

    muitos outros elementos essenciais so requeridos, porm em menorquantidade que os citados acima - sdio, ferro, molibdnio, cobalto, zinco,cobre mangans

    o sdio, Na+, requerido pelas permeases da membrana que transporta oacar melibiose em clulas de Escherichia coli

    o ferro, Fe+2, requerido pelas enzimas citocromo, catalases e succinildesidrogenases (como cofator)

    alguns minerais, em pequenas quantidades (mg/l) como o Zn+2, Cu+2, Mn+2,Mo+6, Co+2 so requeridos para ativar enzimas. O Mo+6 por exemplo requerido pela nitrogenase, a enzima que catalisa a converso do N2 para o

    NH3 (amnia) durante a fixao do N2

    Classificao Nutricional dos Microrganismos

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    Grupo Nutricional Fonte de Carbono Fonte de Energia Exemplos

    Quimioautotrficos CO2compostosinorgnicos

    bactrias nitrificantesdo Fe, H e S

    Quimioheterotrficoscompostos orgnicoscompostos orgnicosmuitas bactrias,

    fungos, protozoriose animais

    Fotoautotrficos CO2 luzbactrias sulfurosas

    verde e prpura,algas, plantas e

    cianofceas

    Fotoheterotrficos compostos orgnicos luzbactrias prpuras e

    verdes noenxofradas

    Meios Utilizados para o Cultivo de Microrganismos

    Os componentes comuns na estrutura do meio faro parte de uma destas categorias :

    1. nutrientes nitrognio-amnico - peptonas, infuses, extratos .....2. fonte de energia - glicose ....3. fatores de promoo de crescimento - sangue, soro, vitaminas, NADH ....4. tampo fosfato, para manuteno de pH em meios de fermentao - sais de

    fosfato acetatos e citratos solveis5. sais minerais e metais, para melhorar o crescimento - PO4-2, SO4-2, Ca+2, Mg+2,

    Fe+2, Mn+2 e metais6. agentes seletivos - reagentes qumicos, antibiticos, e tinturas inibidoras7. corantes indicadores, teis para indicar mudanas de pH no meio, durante e

    depois do crescimento de microrganismos - fenol vermelho, vermelho neutro,bromocresol prpura ....

    8.

    agentes gelificantes - gar, gelatina ....

    Caractersticas de alguns produtos complexos usados como ingredientes dos meios de cultura

    Ingredientes Caractersticas

    Agar

    uma mistura de 2 polissacardeos, obtido de algas marinhas, usadopara solidificar o meio; insolvel em gua fria, gelifica a

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    Infuses usa-se infuses de corao de boi ou de bezerro, e de crebro

    Neopeptonadigerido enzimtico de protinas, adequado p/ muliplicao deorganismos cuja cultura in vitrose considera difcil

    Ox-Gall constitudo por bilis fresca purificada; um agente inibidor

    Peptonaum produto da digesto enzimtica da carne, solvel em gua eformada por polipeptdeos, gua e oligossacardeos. Se trata de umapeptona para uso geral

    Fitonapeptona vegetal preparada por digerido de farinha de soja compapana, til para culturas de organismos de multiplicao difcil

    Polipeptonamistura de peptonas (tripticase + thiotone) para uso em meios querequerem ambas protenas

    ProteosePeptona

    uma peptona especializada, preparada por digestivos de carne frescaselecionada com papana, til para produo de toxinas microbianas

    Soytonahidrolizado anzimtico de farinha de sementes de soja, adequados

    para meios que no h hidratos de carbono

    Acarestodos devem ser quimicamente puros e adequados para finsbacteriolgico

    Tiotonapreparado por digestivo pptico de tecido animal; alto contedo deenxofre, til nas anlises de formao do H2S

    Tripticasepeptona derivada da casena por digesto pancretica, fonte rica emnitrognio de aminocidos

    Triptonahidrolisado pancretico, fonte rica de nitrognio-amnico; destinado aoisolamento de cultivo de organismos de difcil crescimento

    Extrato deLevedura

    extrato aquoso de clulas de leveduras lisadas, fonte excelente de

    substncias estimulantes do crescimento como vitamina B; contmcompostos orgnicos de N e C

    guadeve-se usar somente gua desmineralizada, que no txica aosmicrorganismos

    1. Meios para Cultivo de Bactrias

    Os meios escolhidos para o cultivo de bactrias especficas normalmente imitam o habitatnormal das mesmas, assim:

    para as bactrias que preferem os nutrientes encontrados no sangue -

    adiciona-se sangue ao meio se a glicose o constituinte comum de um nicho bacteriano - adiciona-se o

    acar ao meio

    Para aquelas bactrias que apresentam maiores exigncias nutricionais - fastidiosas- utiliza-se os meios complexos, citados acima na tabela, os quais contm uma grande variedade desubstncias orgnicas preparadas a partir de matrias naturais

    Alguns exemplos de meios quimicamente definidos utilizados no crescimento de bactrias :

    1. bactria quimioautotrfica :

    fonte de nitrognio - (NH4)2SO4

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    fonte de carbono (na forma de CO2) - NaHCO3

    tampo e ons essenciais - Na2HPO4 ; K2HPO4

    ons essenciais - MgSO4.7H2O ; FeCl3.6H2O ; CaCl2.2H2O

    solvente - H2O

    2. bactria heterotrfica no fastidiosa :

    fonte de energia e carbono - glicose (0.1%)

    fonte de nitrognio, tampo e ons essenciais - NH4H2PO4

    tampo e ons essenciais - KH2PO4

    ons essenciais - MgSO4.7H2O

    solvente - H2O

    3. bactria heterotrfica fastidiosa :

    fonte de carboidrato, nitrognio orgnico, vitaminas, sais - extrato de carne

    fonte de nitrognio orgnico e algumas vitaminas - peptona

    ons e requerimento osmtico - NaCl

    solvente - H2O

    2. Meios para o Cultivo de Fungos

    Assim como as bactrias os fungos absorvem nutrientes em vez de inger-los. A adsoro auxiliada por enzimas secretadas no meio, que quebram as molculas orgnicas em poresmenores que podem ser transportadas mais facilmente parta dentro da clula

    Todos os fungos so heterotrficos. E podem crescer no laboratrio;

    em uma mistura simples contendo acar, uma fonte de nitrognio inorgnicoou orgnico e alguns minerais;

    alguns necessitam de vitaminas; e outros podem crescer somente em meio complexo que contenha uma grande

    variedade de compostos orgnicos providos da peptona e extrato de carne.

    Em geral, o meio utilizado para culturas de fungo tem : (1) uma concentrao maior de acarque as bactrias - 4%; (2) e um pH menor - 3.8 a 5.6

    Composio de um meio utilizado para o isolamento e crescimento de fungos em geral : garSabourand

    fonte de carbono, nitrognio - peptona

    fonte de carbono e energia - glicose (em alta concentrao inibe o crescimento bacteriano)

    agente solidificante - gar

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    solvente - H2O

    3. Meios para o Cultivo de Algas

    As algas utilizam luz para produzir energia, e requerem somente CO2, H2O e vrios onsinorgnicos para crescer.

    Os meios complexos para algas normalmente contm extrato de soja. Mais existem poucosmeios "prontos" como os existentes para bactrias e fungos

    Meios com finalidades especiais - MEIOS ESPECIAIS

    So utilizados quando se quer isolar, identificar ou contar os microrganismos, eles forneceminformaes especficas sobre os microrganismos

    Meios para Anaerbios

    os primeiros cultivos de anaerbios foram em camadas profundas de meiossolidificado, assim podem crescer pois a camada de gar da superfcie exclui ooxignio atmosfrico

    a adio de um agente redutor ao meio remove o oxignio - MEIO REDUZIDO- ex. tioglicolato de sdio

    para anaerbios estritos, como as arqueobactrias produtoras de metano porexemplo, o cuidado deve ser maior. Deve-se :

    (1) ferver o meio para que a maior parte do oxignio dissolvido seja retirado

    (2) adicionar o gs N2, livre de oxignio, nos tubos contendo o meio

    (3) adicionar um agente redutor, p.ex. a cistena remove os ltimos traos de

    oxignio

    (4) esterilizao do meio (recomendvel a utilizao de vlvula de selagem notopo do frasco para prevenir a entrada de oxignio)

    Meios Seletivos

    serve para selecionar um microrganismo permitindo um tipo particular demicrorganismo ou suprimindo o crescimento de outros microrganismos.Exemplos : gar sabourand para fungos; gar verde brilhante para Salmonella;o corante verde brilhante adicionado ao meio inibe as bactrias Gram +comuns do trato intestinal; o gar feniletanol inibe o crescimento de Gram-

    negativas, mais no das Gram-positivas recentemente os antibiticos vem sendo adicionado aos meios, tornando-os

    seletivos para os microrganismos resistentes estes agentes antimicrobianos

    Meios Diferenciais

    servem para diferenciar os vrios tipos de microrganismos em uma placa comgar. P.ex. : se uma amostra de secreo da garganta semeada numa placade gar sangue, pode-se diferenciar as batrias hemolticas (produzemenzimas que lisam as clulas vermelhas formando uma zona clara ao redor dacolnia) das no hemolticas (que no dissolvem as clulas vermelhas, eportanto no formam este halo ao redor das colnias)

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    Meios Seletivos/Diferenciais

    agem tanto como seletivos como diferenciais, so particularmente teis emmicrobiologia de sade pblica, como na determinao da qualidade da guaou na identificao de causas de infeco alimentar

    gar MacConkey - contm sais biliares e corante cristal violeta, os quais inibemo crescimento de Gram+ e permitem o desenvolvimento de Gram-negativas, eainda a lactose, que distingue as Gram + (produtoras de cido a partir doacar tornando-as vermelhas) das Gram-negativas (no produtoras de cido)

    Meios de Enriquecimento

    utilizados para selecionar microrganismo que est presente em determinadolocal, em pequenas quantidades com relao populao. O meio favorece ocrescimento da espcie desejada, mas no o crescimento das outras espciespresentes em uma populao mista

    ao contrrio do meio seletivo, nenhum agente inibido utilizado para prevenir o

    crescimento de microrganismos indesejveis um exemplo so as bactrias que oxidam o fenol - que podem ser isoladas de

    amostras do solo, utilizando um meio de enriquecimento, constituido de sais deamnia, e fenol como nica fonte de carbono e energia - assim somente osmicrorganismos capazes de oxidar o fenol estaro presente em grande nmerodepois de vrios cultivos seletivos

    Meios de Estocagem

    utilizado para a manuteno da viabilidade e das caractersticas fisiolgicas deuma cultura, a qual pode exigir um meio diferente daquele timo para o seucrescimento - o desenvolvimento rpido e luxuriante pode estar associado coma rpida morte celular. Assim p.ex., a glicose, que favorece com frequncia ocrescimento, tambm desenvolve maior quantidade de cidos no meio, sendoprefervel omitir a glicose na preparao de um meio de estocagem

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    CAPTULO 5: Cultivo e Crescimento dos Microrganismos

    Crescimento - o aumento ordenado de todos os componentes de um organismo. Morte - a

    perda irreversvel da capacidade de reproduo, crescimento e diviso, por parte de umorganismo ou de uma clula

    Condies Fsicas para o cultivo dos Microrganismos

    A temperatura, os gases do meio, e o pH so os principais fatores fsicos, que juntos criamcondies timas para o crescimento celular

    1. Temperatura :

    De grande influncia no cresciemnto dos microrganismos - todos os processo de crescimentoso dependentes de reaes qumicas, as quais so afetadas pela temperatura

    A temperatura na qual uma espcie de microrganismo cresce mais rapidamente atemperatura tima de crescimento - em temperaturas mais favorveis para o crescimento, onmero de divises celulares por hora, chamada de taxa de crescimento, dobra para cadaaumento de temperatura de 10 oC

    Para qualquer microrganismo particular h 3 temperaturas importantes a conhecer : mnima,tima e mxima (nesta ltima as enzimas so danificadas pelo calor e a clula para de crescer)

    Os microrganismos podem ser divididos em 3 grupos de acordo com a variao de temperaturana qual crescem melhor :

    Psicrfilos- crescem em baixas temperaturas (15 - 20 oC)

    alguns morrem se expostos temperatura ambiente (25 oC). A temperaturasmuito alta certas enzimas e a membrana citoplasmtica podem ser danificadas

    existem bactrias, fungos, algas e protozorios que so psicrfilos.Emtemperaturas de 4-10 oC os microrganismos psicrfilos deterioram alimentosestocados por longo perodos

    so encontrados principalmente em guas frias e solos, tais como os oceanose regies polares. Alguns gneros so : Pseudomonas, Flavobacterium,Alcaligens.

    Mesfilos- crescem em temperaturas moderadas (25 - 40 oC)

    a maioria dos microrganismos pertencem a este grupo. As bactrias saprfitas,os fungos, as algas e os protozorios crescem no limite mnimo da variao detemperaturas mesfilas (25 oC), e os parasitrios de humanos e animais nolimite mximo dessa variao (40 oC)

    Termfilos- crescem a altas temperaturas (40 - 85 oC)

    podem ser encontrados em reas vulcnicas, em misturas de fertilizantes e emnascentes quentes

    a maioria so procaritos, nenhuma clula eucaritica cresce em umatemperatura superior a 60 oC - a perda de funo da membrana citoplasmticaa baixa temperatura pode ser o que determina a temperatura de crescimento

    mnima dos termfilos

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    2. Atmosfera Gasosa

    Os microrganismos no seu habitat natural necessitam de quantidades variadas de gases taiscomo : O2, CO2, N2, CH3 .

    Alguns gases so utlizados no metabolismo celular; outros podem ter sido excludos de uma

    cultura por serem txicos s clulas. O O2 e CO2, so os dois gases principais que afetam ocrescimento de clulas microbianas

    De acordo com a resposta ao O2 os microrganimismos so divididos em 4 grupos :

    Aerbios- requerem oxignio para o crescimento (padro: 21% de O2)

    alguns aerbios podem crescer mais lentamente quando o O2 limitado. Se osmicrorganismos crescem em meio lquido podem rapidamente utilizar o O2dissolvido na camada superficial do meio. Para evitar este problema, asculturas lquidas de microrganismos aerbios so algumas vezes agitadas(shaker) para aumentar o suprimento de O2 dissolvido e produzir um estoque

    celular maior num tempo de incubao menor existem alguns grupos de microrganismos que requerem nveis elevados de

    CO2 - Neisseria gonorrhoea- 5 a 10% de CO2. Neste caso pode-se colocar aplaca com meio semeado com o microrganismos dentro de uma jarrahermeticamente fechada, contendo uma vela acessa, a qual queimarenquanto tiver O2 suficiente para manter esta combusto (C + O2 --- CO2),assim a atmosfera dentro da jarra vai conter uma quantidade de O2 reduzida euma concentrao de CO2 aumentada.

    Facultativos- crescem na presena de O2 ou podem tambm crescer em anaerobiose

    quando em condies de anaerobiose, obtm energia pelo processometablico chamadofermentao. Ex. genros da famlia bacterianaEnterobacteriacea (Escherichia coli), leveduras (Saccharomyces cerevisae)

    Anaerbios- aqueles que podem ser mortos pelo oxignio

    no utilizam o O2 para reaes de produo de energia alguns at toleram baixas concentraes de oxignio :

    o Clostridium perfringens- altamente tolerantes ao O2o Clostridium tetani- moderadamente tolerantes ao O2o Methanobacterium- anaerbios estritos

    a toxicidade do oxignio para os anaerbios :o O2 + e

    - ---- O2- (radical superxido) : podem causar danos s clulas

    (1)o 2O2 - + 2H+ ---- O2 + H2O2 (perxido de hidrognio) : podem destruir os

    componentes vitais da clula (2)

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    o O2- + H2 O ---- O2 + OH

    -2 + OH (hidroxila) : pode danificar quase todotipo de molcula encontrada em uma clula viva, inclusive o DNA (3)

    Os microrganismos aerbios e facultativos, que crescem em aerobiose, e atalguns microrganismos anaerbios, desenvolveram vrios mecanismosprotetores contra estas formas txicas de O2 :

    (1) produo da enzima superxido dismutase - que elimina os radicaissuperxidos convertendo-os rapidamente em perxido de hidrognio

    (2) metabolizao do perxido de hidrognio por mais duas enzimas - catalase,que converte o H2O2 em O2 eH2O; e a peroxidase que converte o H2O2 emH2O. Assim a reao (3) no mais ocorre e os radicais OH no mais soformados

    Cultivo de bactrias anarobias :

    (1) uma incubadora - cmara de anaerobiose

    (2) jarra de anaerobiose - este sistema inadequado para o cultivo deanaerbios estritos

    Depois que a jarra fechada o O2 presente removido em horas pela reaocatalisada pelo pldio :

    O2 + 2H2 paldio 2H2O

    Microaerfilos- podem utilizar oxignio nas reaes qumicas para a produode energia (1 a 15% de O2)

    no suportam nveis de O2 de 21% presentes na atmosfera, como requerem osaerbios, mais podem utilizar o O2 em nveis mais baixos

    a tolerana moderada ao oxignio deve-se alta susceptibilade aos radicaisperxidos e o perxido de hidrognio que so formados nas culturas incubadassob condies de anaerobiose. Exemplo : Campylobacter jejuni(provocadiarria em humanos)

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    3. pH - Potencial Hidrogeninico

    pH = - log {H+}. Quanto > {H+}, < pH, e mais cido

    o pH timo normalmente bem definido para cada espcie. Encontra-se novalor mediano de variao de pH sobre o qual o crescimento acontece,

    diferentemente da tempertura tima para o melhor crescimento do microrganismo num meio cido ou bsico, ele

    deve ser capaz de manter o seu pH intracelular em torno de 7.5, noimportando qual o valor do pH externo. A maneira de obter o pH da clula vivanessa faixa, expulsando ou absorvendo ons hidrognio (at um certo limite)

    as variaes de pH podem ser mortal ao cultivo de microrganismo, isto podeser prevenido pela adio de um tampo ao meio

    pH de alguns ambientes :o guas de escoamento de solos vulcnicos e de minas : pH = 1 a 3o guas de nascentes : pH = 10o solos ricos em amnia : pH = 11o oceanos : pH = 8; guas polares : pH = 6

    Microrganismos pH timobactrias 4 a 9fungos 5 a 6protozorios 6.7 e 7.7algas 4 a 8.5

    4. Outras condies

    os microrganismos podem apresentar outras necessidades como : a luz, paraos organismos fotossintticos. Alm da funo ligada ao metabolismo celular eaos nutrientes, a gua influencia o crescimento por meio da presso osmtica

    e da presso hidrosttica

    Presso Osmtica- fora com a qual a gua se move atravs da membranacitoplasmtica de uma soluo contendo uma baixa concentrao de solutospara uma contendo alta concentrao de soluto. As clulas podem estar emum meio:

    (a) Isotnico - onde a concentrao de solutos em um meio igual quela no interior da clula.No h movimento de gua para dentro e para fora da clula

    (b) Hipertnico - onde a concentrao de solutos fora da clula maior que no interior. A guaflui para fora da clula resultando na desidratao e contrao do protoplasto

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    (c) Hipotnico - a concentrao de soluto no interior da clula maior que fora dela. A gua fluipara dentro da clula, o influxo da gua fora o protoplasto contra a parede celular. Se aparede for fraca, pode romper-se; o protoplasto pode inchar, e eventualmente rompe

    Presso Hidrosttica- a presso exercida pelo peso da gua que permanece na superfciedela. Os microrganismos dependente de presso so chamados barfilos, estesmicrorganismos morrem um meio com baixa presso hidrosttica pois contm vesculas de gsque se expandem com grande fora na descompresso e rompem as clulas

    Reproduo e Crescimento dos Microrganismos

    O crescimento em uma cultura microbiana normalmente significa um crescimento no nmerototal de clulas devido reproduo dos organismos individuais na cultura

    Dois fenmenos ocorrem : (1) o crescimento, ou reproduo das clulas individualmente; (2)crescimento ou aumento na populao de uma cultura microbiana

    Reproduo em Microrganismos Eucariticos

    Na natureza a reproduo ocorre de duas maneiras :

    (1) Reproduo Assexuada - basicamente resulta em novas clulas idnticas

    s originais

    (2) Reproduo Sexuada - permite a troca de material gentico e assim agerao de um novo ser

    1. Reproduo Assexuada

    apesar de no implicar em variao gentica mais eficiente que a reproduosexuada em propagar as espcies. Neste tipo de reproduo os novosindivduos so produzidos por: (1) um organismo parental ou; (2) uma clula(organismos unicelulares)

    a reproduo assexuada nos organismos eucaritos mais complexa que nos

    procaritos, onde uma nica clula parental simplesmente se divide em duasclulas-filhas idnticas. Nos eucaritos deve ser precedida de MITOSE - umaforma de diviso nuclear na qual todos os cromossomos da clula so

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    duplicados e os dois novos conjuntos se separam para formar os ncleos filhosidnticos. A clula ento se divide em 2 clulas-filhas, cada uma recebendo umncleo

    Etapas da Mitose em detalhe :

    (1) assim que as clulas entram em PRFASE os cromossomos condensa-se em estruturasem forma de fitas e tornam-se visveis ao microscpico

    (2) os cromossomos so duplicados, dispondo-se lado a lado, unidos no centro pelocentrmero (um anel de protenas), ao mesmo tempo, os centrolos (cilndricos de microtbulosprotecos) migram para lados opostos da clula

    (3) a medida que os centrolos se separam um fuso mittico comea a se formar entre eles. NoFINAL DA PRFASE os centrolos se movem para os plos opostos da clula com o fuso entreeles. Durante esta fase, a membrana nuclear comea a desintegrar-se

    (4) a membrana nuclear desaparece, e os cromossomos parecem estar acoplados pelos seuscentrmeros s fibras do fuso. O centrmero de cada cromossomo se divide e os doiscromossomos-filhos em cada conjunto se separam completamente

    (5) este o estgio mais curto da MITOSE, onde os cromossomos-filhos se move para um doslados da clula utilizando as fibras do fuso como guia

    (6) marcada pela chegada dos dois conjuntos de cromossomos em um dos plos do fuso.Uma membrana nuclear forma-se ao redor do agrupamento dos cromossomos em cada plo eo cromossomo se alonga em fitas de cromatina tpica da INTERFASE (fase em que as clulasse apresentam em estgio de repouso)

    (7) todas as clulas derivadas da MITOSE de um organismo eucarito tem ento o mesmonmero de cromossomos e o mesmo tipo de genes das clulas parentais

    2. Reproduo Sexuada

    fuso de duas clulas sexuais diferentes (gametas) que so procedentes dedois pais de sexos diferentes ou tipo de relao sexuada

    a fuso de gametas denominada fertilizao e a clula resultante, de zigoto na reproduo sexual tem-se :

    (1) fuso de dois ncleos haplides

    (2) formao de um zigoto (diplide)

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    (3) MEIOSE, resultando novamente em clulas haplides

    (4) a fuso das clulas haplides completando o ciclo

    O ciclo celular dos eucaritos

    o todas as clulas eucariticas perfazem um ciclo celular semelhante,com exceo dos gametas.

    o a duraco do ciclo celular varia de um tipo de clula para outra.o as fases do ciclo pode ser resumida :

    G1 - fase de crescimento - a clula cresce e sintetiza protenas

    S - fase de sntese de DNA - a clula continua a crescer e a sntese de DNAocorre no ncleo at que a quantidade de DNA seja duplicada

    G2 - fase de crescimento - o crescimento celular atinge o seu mximo

    M - mitose - a sntese de macromolculas quase cessa e o ncleo sofre mitose

    Reproduo em Microrganismos Procariticas

    A maioria das bactrias se multiplicam pelo processo de reproduo assexuada - FISSOBINRIA TRANSVERSA - onde as clulas dividem-se individualmente em 2 clulas-filhas detamanho aproximadamente igual

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    Alguns procariotos reproduzem-se assexuadamente por outros modelos de diviso celular :

    (1) Brotamento - ex. Rhodopseudomonas acidophila

    (2) Fragmentao - ex. Nocardia

    (3) Formao de Exospros - ex. Streptomyces

    Crescimento de uma cultura bacteriana

    durante o crescimento ativo de uma cultura microbiana as populaes declulas crescem exponencialmente, aumentando por meio de uma progressogeomtrica (2n)

    o intervalo de tempo requerido para que cada microrganismo se divida

    conhecido como TEMPO DE GERAO, os quais so fortementeinfluenciados no somente pela composio nutricional do meio mais tambmpelas condies fsicas de incubao

    tempo de gerao: g = t/n ; t = intervalo de tempo particular, n = nmero degeraes

    taxa de crescimento: R = n/t

    Exemplos :

    Escherichia coli: tg = 12.5 min; Mycobacterium tuberculosis: tg = 13 a 15 h

    Curva de crescimento bacteriana tpica

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    Fase decrescimento

    Taxa decrescimento

    Caractersticas

    (a) - Lag zero

    nenhum aumento no nmero de clulas,aumentam de tamanho, so sintetizadasnovas enzimas para as clulas seadaptarem ao novo meio

    (b) -Exponencialou Log

    mxima ouconstante

    condies de crescimento balanceado; asclulas so uniformes em termos decomposio qumica e atividademetablicas e fisiolgicas. Pico da atividadee eficincia fisiolgica

    (c) -Estacionria zero

    acmulo de produtos metablicos txicose/ou exausto de nutrientes. Algumasclulas morrem, outras crescem e sedividem. O nmero de clulas viveisdiminue

    (d) - Morte negativa

    acmulo adicional de produtos metablicosinibitrios. A taxa de morte acelerada; o

    nmero de clulas diminue de modoexponencial. Tipicamente todas as clulasmorre em dias ou meses

    Medida de crescimento da populao

    os microbiologistas utilizam uma variedade de tcnicas para quantificar ocrescimento microbiano. Os mais comuns so :

    (1) Contagem Microscpica - muito comum, aplicada para quantificar clulas em vacinas, leite eculturas, e expresso em nmero de clulas/ml

    (2) Contagem Celular Eletrnica - muito comum, aplicada para quantificar clulas em vacinas,leite e culturas, e expresso em nmero de clulas/ml

    (3) Contagem em Placa - muito comum, aplicada para quantificar clulas em vacinas, de leite,culturas, solos e alimentos, expresso em UFC/ml (unidade formadora de colnia)

    (4) Membrana Filtrante - aplicada para quantificar clulas em vacinas, de leite, culturas, solos ealimentos, expresso em UFC/ml (unidade formadora de colnia)

    (5) Turbidez - aplicado para ensaio microbiolgico, estimativa de unidades de absorbncia damassa de clulas em caldo ou outras suspenses

    (6) Contedo de Nitrognio - muito comum, aplicado para a medida indireta da massa celular,expresso em mg de N/ml

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    (7) Peso Seco - muito comum, aplicado para a medida indireta da massa celular, expresso emmg de N/ml

    (8) Produtos Metablicos - aplicados a ensaios microbiolgicos e medidas indiretas daatividade metablica (crescimento), expressa em quantidade do produto/ml

    Cultura Contnua

    usadas para simular o habitat natural de uma espcie microbiana para estudarsua estabilidade gentica em relao ao tempo

    nas indstrias, manter as clulas em fase de crescimento logartmico ativocessar o volume mximo de produtos desejados. Estes sistemas abertos ouCULTURAS CONTNUAS podem ser obtidos assim :

    o quimiostato um aparelho amplamente usado para o crescimento contnuodos microrganismos

    Culturas Sincrnicas

    as clulas se dividem todas ao mesmo tempo, mais pode se conseguir isto (porum determinado perodo), por exemplo semeando uma cultura em umatemperatura razovel para seu crescimento, mantendo-a nessa temperatura,onde elas metabolizaro lentamente, mas no se dividiro. Quando atemperatura rapidamente aumentada para a de crescimento timo da clula,estas sofrero divises sincronizadas (ao mesmo tempo)

    as culturas sincrnicas permitem aos pesquisadores estudar o cresciemntomicrobiano, a organizao e a morfognese durante estgios particulares dociclo de diviso celular

    na verdade no prtico analisar uma nica clula microbiana, por causa doseu tamanho diminuto. Entretanto, se todos as clulas em uma cultura estono mesmo estgio de cresciemtno a informao que se pode extrair de toda apopulao de clulas pode ser extrapolada para fornecer informaesaplicveis a uma nica clula

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    CAPTULO 6: Controle dos Microrganismos

    Controlar - destruir, inibir ou remover. Vrios sao os agentes fsicos e qumicos que podem ser

    utilizados para manter os microrganismos em nveis aceitveis

    processos usados : aquecimento, baixas temperaturas, radiao, filtrao edessecao. O mtodo de escolha depende do tipo de material que contm omicrorganismo : (1) meio de cultura; (2) produtos farmacuticos; (3) superfcie deinstrumentos cirrgicos; (4) sala de cirurgia de um hospital; (5) alimento de consumohumano

    substncias qumicas que matam os microrganismos, ou previnem o seu crescimentoso chamados de agentes ANTIMICROBIANOS (antibacterianos, antivrus,antifngicos, antiprotozorios)

    Antimicrobianos :

    que matam os microrganismos - MICROBICIDA (bactericida, fungicida,viricida)

    Esterilizao - destruio de todos os microrganismos presentes em um material, incluindoesporos

    que apenas inibem o crescimento dos microrganismos -MICROBIOSTTICOS (fungisttico ou bacteriosttico)

    aspectos fundamentais que se deve aplicar aos agentes fsicos e qumicos :

    1. Padro de morte em uma populao microbiana

    o critrio de morte de um microrganismo em Microbiologia baseado em umanica propriedade : a capacidade de se reproduzir. Assim a morte de ummicrorganismo definida como a perda da capacidade de reproduo

    a avaliao da eficincia de um agente microbicida pode ser testada cultivandouma amostra do material tratado para determinar o nmero de sobreviventes

    2. Condies que influenciam a atividade antimicrobiana

    tamanho da populao microbiana - quanto maior mais tempo para morrer concentrao do agente microbicida - quanto menor a concentrao mais

    tempo leva para destruir tempo de exposio ao agente microbicida - quanto maior o tempo de

    exposio maior ser o nmero de clulas mortas temperatura em que so expostos ao agente microbicida - quanto mais alta a

    temperatura mais rapidamente a populao morta natureza do material que contm os microrganismos - tempo de exposio

    menor - meio fluido e pH 5.0 caractersticas dos microrganismos que esto presentes

    3. Mecanismo de destruio das clulas microbianas

    conhecendo o mecanismo de aode um dado composto possvelpredeterminar as condies sob as quais atuar mais eficientemente, alm detambm revelar que espcies de microrganismos sero mais susceptveisquele agente

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    os possveis mecanismos esto associados com os principais aspectosestruturais : alterao do estado fsico do citoplasma, inativao de enzimas,ou rompimento da membrana ou parede celular - podem levar morte daclula

    Agentes Fsicos

    Altas Temperaturas : calor mido, calor seco, incinerao

    1. Calor mido

    mais eficiente que o calor seco para destruir os microrganismos - leva menostempo e a temperaturas menores

    causa desnaturao e coagulao das protenas vitais, as enzimas, enquanto ocalor seco causa oxidao dos constituintes orgnicos da clula (queimalentamente)

    os endosposporos bacterianos so as formas mais resistentes de vida

    clulas vegetativas de bactrias - mortas de 5-10 min a 60-70 oC

    clulas vegetativas de fungos - mortas de 5-10 min a 50-60 oC

    esporos de fungos - mortas de 5-10 min a 70-80 oC

    o calor mido utilizado para matar os microrganismos pode ser na forma de :vapor, gua fervente, gua aquecida a temperaturas abaixo do seu ponto deebulio (100 oC)

    (a) Vapor d'gua

    o vapor d'gua sob presso a mais prtica e segura aplicao do calormido. O aparelho destinado a este fim a AUTOCLAVE, desenvolvida nosculo XIX

    1 - vazo; 2 - cano de sada; 3 - sada; 4 - cmara de exausto; 5 - vapor para a cmara; 6 - vlvula de segurana; 7 -manmetro; 8 - vlvula operadora; 9 - porta; 10 - maaneta; 11 - fecho de segurana; 12 - tela removvel; 13 - termmetro; 14 -regulador de presso; 15 - injetor de ar de condensao automtica; 16 - revestimento de vapor; 17 - vapor; 18 - ar.

    Procedimento do funcionamento da autoclave :

    1. a cmara de parede dupla da autoclave primeiramente lavada com vapor

    fluente para remover todo o ar

    2. ento preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperaturae presso por um perodo especfico de tempo. essencial que todo o ar

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    residual inicialmente presente na cmara seja completamente substitudo porvapor d'gua - se o ar estiver presente reduzir a temperatura interna daautoclave , e a temperatura e no a presso no interior da cmara que mataos microrganismos

    3. uma autoclave usualmente operada uma presso de 15 lb/pol2, na qual atemperatura de vapor de 121 oC. Leva mais tempo para um calor penetrar em

    um material viscoso ou slido do que em um matterial fluido. Quanto maior ovolume mais tempo para o calor penetrar

    RecipienteTempo de exposio (min, a 121 -

    123 oC)Tubos de ensaios18 x 150 mm

    32 x 200 mm

    38 x 200 mm

    12 - 14

    13 - 17

    15 - 20Frascos Erlenmeyer50 ml

    500 ml

    1.000 ml

    2.000 ml

    12 - 14

    17 - 22

    20 - 25

    30 - 35Garrafas de diluio, 100 ml 13 - 17Frascos de soro, 9.000 ml 50 - 55

    (b) gua Ferve