Micro Arrays

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Medida de la Expresin de Genes mediante Microarreglos (Microarrays)Jos Luis Vicente Villardn Departamento de Estadstica

IntroduccinLos experimentos con microarreglos (microarrys) forman parte de lo que se ha dado en llamar Bioinformtica. En sta se integran mtodos matemticos, estadsticos y de ciencias de la computacin, para analizar datos que provienen de la biologa molecular. La tecnologa de los microarreglos tiene una importancia creciente, en especial debido al avance de los resultados de la genmica estructural (el mapa genmico humano fue completado en 2003 con el secuenciamiento de los pares de bases que constituyen el ADN cromosmico). Es parte de la genmica funcional en la que se desarrollan modelos para explicar el funcionamiento de las diferentes secuencias genmicas. El nmero de publicaciones cientficas relacionadas con el tema ha crecido exponencialmente en los ltimos aos.

El dogma central de la biologa molecularhttp://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/transcription/overview.html

El dogma central de la biologa molecular se describe mediante un proceso en dos pasos, transcripcin y translacin, por los que la informacin contenida en los genes se transforma en proteinas: DNA RNA proteina.

Transcripcin es la sntesis de una copia de RNA a partir de un segmento de DNA. El RNA se sintetiza mediante la enzima RNA polimerasa. Translacin es la sntesis de un polipptido especificado por un mRNA

Transcripcin y Traslacin en ClulasEn una clula procariota la transcripcin y la traslacin estn emparejadas; esto es, el proceso de traslacin comienza cuando el mRNA est siendo an sintetizado. En una clula eucariota, la transcripcin se realiza en el ncleo mientras que la traslacin se realiza en el citoplasma. Debido a que no hay ncleo para separar los procesos de transcripcin y traslacin, cuando se transcriben los genes de las bacterias, sus transcripciones pueden trasladarse inmediatamente.

En las clulas eucariotas ambos procesos estn espacial y temporalmente separados; la transcripcin se lleva acabo en el ncleo produciendo una molcula de pre-mRNA. La molcula de pre-mRNA se procesa para producir el mRNA maduro, que sale del ncleo y es trasladado en el citoplasma.

Diferentes genes para diferentes RNAsHay 4 tipos de RNA. El DNA genmico contiene toda la informacin de la estructura y funcionamiento de un organismo. En cada clula, solamente algunos de los genes se expresan, es decir se transcriben en RNA.

Hay 4 tipos de RNA, cada uno codificado por un tipo de gen: mRNA - RNA mensajero: Codifica la secuencia de aminocidos de un polipptido. tRNA - RNA transferente: Lleva los aminocidos a los ribosomas durante la traslacin. rRNA - RNA ribosmico: Con proteinas ribosmicas, constituye los ribosomas, encargados de la traslacin de mRNA. snRNA - RNA pequeo nuclear: Est implicado en el proceso de maduracin del RNA en las clulas eucariotas.

Estructura bsica de un gen codificador de protenasUn gen codificador de protenas consiste en un promotor, seguido de la secuencia de codificacin de la protena y de un terminador.

El promotor es una secuencia de pares de bases que especifica dnde debe comenzar la transcripcin. El terminador es una secuencia que especifica el final de la transcripcin en mRNA.

La Molcula de RNAEl RNA es estructuralmente similar al DNA.

Los nucletidos de DNA y RNA tienen estructuras similares

El proceso de TranscripcinLa sntesis de RNA implica la separacin de las cadenas de DNA y la sntesis de una molcula de RNA, mediante la enzima RNA polimerasa, utilizando las cadenas de DNA como patrn.

La RNA polimerasa cataliza una reaccin qumica que resulta en la sntesis de RNA a partir de la cadena patrn de DNA.

En los pares complementarios, A, T, G, y C en la cadena patrn de DNA se convierten en U, A, C, y G, respectivamente, en la cadena de RNA que est siendo sintetizada.

Transcripcin completa de una molcula de RNALa transcripcin comienza en el promotor, por toda la regin de codificacin, y se acaba en el terminador.

mRNA en Clulas ProcariotasLa secuencia de un gen codificador de protenas en una clula procariota es colinear con el mRNA trasladado; esto es, la transcripcin del gen es la molcula que se traslada en un polipptido.

mRNA en Clulas EucariotasLa secuencia de un gen codificador de protenas en una clula eucariota no es normalmente colineal con el mRNA trasladado; esto es, la transcripcin de un gen es una molcula que debe ser procesada para eliminar las secuencias extra (intrones) antes de trasladarlo en un polipptido.

Procesado del pre-mRNA (Splicing)

La mayor parte de los genes codificadores de protenas en las clulas eucariotas contienen segmentos denominados intrones, que dividen la secuencia codificadora de aminocidos en segmentos denominados exones. La transcripcin de estos genes es pre-mRNA (mRNA precursor). El pre-mRNA es procesado en el ncleo para eliminar los intrones y unir los exones en una cadena de mRNA trasladable. Este mRNA sale del ncleo y se traslada en el citoplasma.

Medida de la presencia y/o expresin de genes (Microarrays)Medida de la expresin de genes (mRNA microarrays)Plataformas de un color Plataforma de dos colores

Medida de la presencia de DNA (DNA microarrays) Medida de la expresin de protenas

Medida de la expresin de genes (mRNA microarrays)- IntroduccinEl proyecto Genoma Humano ha documentado nuestra secuencia gentica y ha descubierto que es idntica en un 99.9% en todos los seres humanos. Sin embargo, incluso pequeas diferencias en la secuencia de DNA pueden tener un efecto importante sobre la salud y la enfermedad. El mismo gen puede trabajar correctamente en una persona, pero una mutacin puede causar que no trabaje correctamente en otra. Aunque todas las clulas poseen el cdigo gentico completo, no todos los genes producen protenas (se expresan) en todas las clulas. Esto es lo que determina la diferencia en las funciones especficas de cada clula el los distintas partes del cuerpo.

Medida de la expresin de genes (mRNA microarrays) - IntroduccinCon respecto a la enfermedad, la diferencia del 0.1% ciertamente contribuye, pero las influencias ambientales juegan un papel igualmente importante en determinar cuales de nuestros genes se expresan de manera diferente. Por ejemplo, la exposicin al humo del tabaco o los rayos X puede cambiar la forma en que se expresan los genes, resultando en la aparicin de enfermedades como el cncer. Aunque todas las clulas del cuerpo tienen la misma secuencia, cada clula no est afectada de la misma manera. Esto puede producir enfermedades ms especficas como cnceres de pulmn, colon, piel, etc. Los investigadores estudian la expresin de genes midiendo la cantidad de copias de mRNA que produce un gen. El microarray de expresin de genes es una herramienta que nos dice la cantidad de RNA que cada gen est fabricando, si es que lo est fabricando. Comparando la expresin del gen con la de una persona sana, el microarray ayuda a los cientficos a encontrar que genes estn fabricando demasiado o demasiado poco RNA en la persona enferma, ayudndoles a asociar un gen o grupo de genes con una enfermedad as como a a desarrollar drogas para tratar la enfermedad y pruebas diagnsticas para detectar o clasificar la enfermedad.

Medida de la expresin de genes (mRNA microarrays) - IntroduccinLa expresin de genes ha sido utilizados para estudiar casi todos los tipos de enfermedad en la esperanza de encontrar una base molecular que permita el tratamiento. La revolucin proporcionada por los microarrys es que permiten al investigador comenzar sin ninguna hiptesis previa. Los microarrays permiten a los investigadores medir la expresin de cada gen del genoma humano, incluso aquellos con funciones desconocidas. Estudiando los patrones de expresin de genes de, por ejemplo, 100 personas sanas y 100 enfermas los cientficos pueden pueden investigar rpidamente las diferencias en los patrones. Si observan un patrn de genes expresado (o no expresado) en los pacientes con la enfermedad, ah es dnde deben comenzar su bsqueda. El proceso de expresin de genes en RNA es conocido desde 1963. Hasta 1977 no se desarroll un procedimiento prctico de medida, que slo permita un gen. En 1989 se desarrollan, basados en la tecnologa de construccin de microchips, que permiten fijar millones de cadenas de DNA sobre una placa (los microarrays).

Medida de la expresin de genes (mRNA microarrays) - HibridacinComo ya vimos, cuando una cadena de DNA (ATCATG) se corresponde con una cadena de RNA (UAGUAC), la dos cadenas son complementarias y pueden pegarse la una a la otra. Sin embargo, si las bases no son complementarias, no pueden unirse. Con una sola base que no sea complementaria, ambas cadenas no se unen

Los microarrays usa esta propiedad de atraccin de los pares de bases conocida como hibridacin- para ayudar a los investigadores a identificar que secuencias de RNA estn presentes en una muestra y cual es la medida de la expresin de los mismos.

mRNA microarrays - ProbesEl primer paso consiste en fijar una cadena corta de DNA en la superficie de cristal del microarray. Estas cadenas son denominadas sondas (o probes en ingls). La cadena est formada por slo 25 bases de las 100 que podra tener el gen. Las cadenas se comprueban para asegurarse de que no est presente en ningn otro gen, de esta manera, cuando una molcula de RNA se une al probe los cientficos saben que el gen se ha expresado. Es como identidicar una cancin con slo unos compases.

Para asegurarse de que se est midiendo el gen correcto, los chips de Affimetrix toman 11 cadenas cortas pertenecientes al mismo gen.

mRNA microarrays - Pareja de probesLos probes buscan un alineamiento perfecto con el RNA que se trata de detectar. Por cada uno de los probes para alineamiento perfecto, se coloca un probe modificado (mismatch) en el