Determinar habilidad de las bacterias para producir ácidos estables por fermentación de la glucosa.

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: primero la metabolizarán aeróbicamente (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia (fermentación).

La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originaran productos finales Ácidos (Ácido Láctico, Ácido Acético, Ácido Fórmico), o productos finales neutros (Acetil Metil Carbinol).

Esta diferencia en el metabolismo bacteriano podría ser reconocida por la adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición de Alfa-Naftol e Hidróxido de Potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros.

Se conocen 2 tipos generales de fermentaciones:

Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.

Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose Acetoína como intermediario que podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarán con este compuesto produciendo un color rojo característico.

El rojo de metilo es un indicador de pH. Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato.

El rojo de metilo se prepara con 0,1 g de este reactivo en 300 ml de alcohol etílico y se diluye en 500 ml de agua. Una reacción positiva indica que el microorganismo realiza una fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta.

Es uno de los test del IMVIC para bacterias entéricas. Algunas vías fermentativas originan ácidos orgánicos mientras otras originan productos que son neutros. Las bacterias se crecen en caldo de Glucosapeptona. Si se fermenta el azúcar el pH baja por debajo de 4.3. Se añade rojo de metilo como indicador que es rojo a pH <4.3 y amarillo a pH >4.3.

Ambas pruebas se realizan en un caldo llamado RMVP (Medio de Clark y Lubs) o Rojo de Metilo Voges-Proskauer; el cual se prepara con los siguientes Ingredientes:♫Polipeptona (Extracto de Carne y Levadura; esta es la Fuente de Carbono) 7gr.♫Glucosa 5gr.♫Fosfato Dipotásico 5gr.♫Agua Destilada 1000ml.

Diferentes tipos de bacterias reducen el Piruvato de maneras diversas dando lugar a distintos procesos de fermentación que se conocen por sus productos finales. Fermentación Ácido-Mixta Fermentación Butilén Glicólica

Fermentación Ácido-Mixta

Fermentación Homoláctica Es un proceso de fermentación presente en

muchas bacterias del grupo láctico: Streptococcus (grupo de enterococos), Pediococcus y varios grupos de Lactobacillus. El producto final de esta fermentación es el ácido láctico. Las bacterias producen el Piruvato por catabolismo de la glucosa siguiendo la ruta de Embden-Meyerhof (vía glucolítica clásica).

Fermentación del Ácido Propiónico Esta ruta fermentativa la presentan las bacterias

del tipo Propionibacterium y otras anaerobias estrictas presentes en el rumen de herbívoros donde llevan a cabo una fermentación secundaria de los productos de las fermentaciones lácticas primarias. Para este tipo de fermentación se puede utilizar tanto azúcares como lactato como puntos de partida para el proceso. La ruta es un proceso complejo en el que se genera acetato, CO2 y ácido Propiónico como productos finales.

Fermentación Butilén Glicólica

Fermentación Etanólica o Alcohólica Proceso de fermentación llevado a cabo

por Saccharomyces. El Piruvato se reduce para formar etanol y CO2. Esta fermentación es utilizada para producir el alcohol presente en las bebidas fermentadas, el CO2 que se libera en esta fermentación produce el esponjamiento de la masa de pan.

Fermentación Butanodiólica (Voges-Proskauer)

Esta es una variante de la anterior presente en algunas enterobacterias como Klebsiella, Serratia y Erwinia, especie en la que se da una fermentación ácida mixta butanodiólica. En esta ruta se desprende CO2 y se logra como producto final el 2.3-butanodiol.

Como paso intermedio de la ruta se produce Acetoína que puede servir para la identificación de las bacterias que presentan esta ruta mediante la reacción de Voges-Proskauer que permite distinguir bacterias muy semejantes como Escherichia y Enterobacter. Es un tipo de fermentación llevado a cabo por bacterias anaerobias estrictas del género Clostridium. En el curso de esta fermentación se producen compuestos orgánicos disolventes de gran importancia industrial.

Fermentación Heteroláctica Este proceso lo llevan a cabo bacterias del grupo

láctico pertenecientes a los géneros Leuconostoc y Lactobacillus. Otra bacteria productora de este tipo de fermentación es Lactobacillus acidophilus que facilita el metabolismo de la leche. Su producto final no es exclusivamente ácido láctico. El proceso tiene un rendimiento menor al de la fermentación Homoláctica. La obtención del Piruvato en estas bacterias se logra mediante el catabolismo de la glucosa por la ruta de las pentosas.

Este tipo de Fermentación forma parte de ambas:

El Medio es el Caldo RMVP o Caldo de Clark y Lubs.

Disuelva los ingredientes en agua destilada y esterilice en autoclave por 15 minutos a 121°C a 15 libras de presión.

Solución indicadora de Rojo de Metilo: Se prepara disolviendo 0.1 gr de este indicador en 300 ml de Etanol al 95% y diluyendo luego con agua hasta 500 ml.

Inocule con el asa de platino transfiriendo una porción de cultivo puro. Incube a 37°C por 24 a 48 hrs.

Incubar a 35°C durante 48 horas. Finalizado el tiempo de incubación transfiera 5ml

de cultivo a un tuboAgregar 5 gotas del reactivo de rojo de metilo a

uno de los tubos y al otro añadir los Reactivos A y B (0,6ml del KOH y 0,2ml del Alfa-Naftol).

La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta.

Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

MEDIO DE CULTIVO

PROPOSITO

INOCULACION

TratamientoPost incubacion

RESULTADOS

POSITIVO

NEGATIVO

Caldo MR-VPPrueba de Rojo de Metilo

Determinar habilidad de las bacterias para producir ácidos estables por fermentación de la glucosa

48h/ 37ºC

2 a 3 gotas de Rojo de Metilo (después de los siete días)

Rojo, presencia de ácidos, pH 4

Amarillo, no producción de ácidos estables.

(+) Escherichia coli ( - ) Enterobacter aerógenes