Microbiología Aplicada Manual de Laboratorio, Castañeda Briones, María Teresa

MICROBIOLOGAAPLICADA

MANUAL DE LABORATO RIO

Mara Teresa Castaeda Briones

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MICROBIOLOGAAPLICADA

MA NUAL DE LABOR ATORIO

Mara Teresa Castaeda Briones

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DIvIsin de CienCIllS Bsicas e IngenIeraOepartamenlo de Ciel"lCias Basteas

CONTENIDO

Prefacio v

Reglamento de laboratorio de microbiologa .Vll

Equipo indispensable en el laboratorio de microbiologa IX

Material indispensable en el laboratorio Xl

Prctica Nm. Titulo Pg.1. El microscopio 12. Distribucin de los microorganismos en la naturaleza 143. Preparaciones de extensiones o frotis y tincin simple 224. Tincin diferencial de Gram 275. Tincln de endosporas por la tcnica de Schaeffer y 31

Fulton6. Tincin de flagelos bacterianos por el mtodo de Leifson 357. Esterilizacin por calor seco y calor hmedo 428. Desinfeccin de agujas hipodrmicas por ebullicin 469.

~--

Medios de cultivo 49~ .. ~ ~ -

10. Antisepsia de la piel 5711. Resiembra de tubo a tubo 6012. Aislamiento de microorganismos a partir de un cultivo 64

mixto y obtencin de un cultivo axnico13. Metabolismo bacteriano 7314. Aislamiento de bacterias anaerobias formadoras de 84

esporas a partir de suelo de jardn15. Aislamiento e identificacin de mohos del aire 9016. Recuento de bacterias mesfilas aerobias en agua de 104

consumo humano

17. Coliformes totales y fecales en agua de consumo 110humano

18. Investigacin de coliformes totales y fecales en agua 127residual ..

19. Determinacin de estreptococos fecales en agua 13720. Determinacin de clostridios sulfito reductores en agua 14421. Recuento de indicadores de contaminacin fecal en 150

agua mediante filtracin por membrana22. Investigacin de coliformes totales y fecales en 163

desechos slidosYcomposta23. Determinacin de bacterias sulfatorreductoras en agua 17024. Investigacin de protozoos y helmintos patgenos en 173

agua

Pg.APENDICE A : Composicin y preparacin de medios de cultivoAPENDICE B : Preparacin de colorantes

.

APENDICE C: Preparacin de soluciones y reactivosBIBLlOGRAFIA

181205211219

MICROBIOLOGA APLICADAManual de Laboratorio

PREFACIO

La Microbiologa es una ciencia que se encarga del estudio de losmicroorganismos, y ha logrado grandes avances como resultado de aos deinvestigacin, la cual est basada fundamentalmente en la observacin y laexperimentacin.

Por lo anterior, considero que, para tener un mejor conocimiento y comprensin dela Microbiologa, es absolutamente necesario contar con el apoyo del Laboratorio.La Microbiologa tiene gran aplicacin en diversas reas tales como las siguientes:Mdica, Agrcola, Industrial, Biotecnolgica y Ambiental.

En esta ltima, cada vez est adquiriendo ms importancia debido a laparticipacin de los diferentes grupos de microorganismos en la problemticaambiental, no nicamente como contaminantes del ambiente e indicadores decontaminacin, sino tambin por su gran influencia en la solucin de diversosproblemas de contaminacin, ya que juegan un papel muy importante en procesosde Biorremediacin por ejemplo en la blorrecupsracln de suelos contaminadoscon hidrocarburos, metales, insecticidas o algn otro agente txico.

Para la elaboracin de este Manual se seleccionaron tcnicas de diferentes textosy Manuales de Microbiologa, las cuales se organizaron y adecuaron al programade la unidad de enseanza aprendizaje (uea ) de Microbiologa Aplicada queforma parte del Plan de Estudios de la Licenciatura de Ingeniera Ambiental de laUAM-A, por lo que este Manual est dirigido a los alumnos de la uea deLaboratorio de Microbiologa Aplicada de dicha licenciatura. En l se incluyenprcticas de Microbiologa Bsica y de Microbiologa Aplicada, haciendo nfasisen el anlisis microbiolgico del agua.

Con el desarrollo de las prcticas que integran este Manual el alumno sefamiliarizar con el uso del microscopio, preparacin de extensiones y su tincin,preparacin, esterilizacin y distribucin de medios de cultivo, algunos mtodos decontrol de los microorganismos, diferentes tcnicas de aislamiento demicroorganismos aerobios y anaerobios y su identificacin, as como tambin conla determinacin de diversos indicadores de contaminacin fecal del agua y otrastcnicas de laboratorio que permitirn conocer el grado de contaminacinmicrobiolgica en aire, agua y residuos slidos.

De manera general se puede trabajar simultneamente en 2 prcticas por sesinde laboratorio, por lo tanto, el tiempo dedicado al curso es el adecuado.

Para lograr lo anterior, tengo una recomendacin muy importante para losalumnos: "Leer las prcticas que se van a realizar en cada sesin, antes dellegar al Laboratorio", de tal forma que se pueda aprovechar ms eficientemente

. .

v

MICROBIOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio

el tiempo. Igualmente les recomiendo que revisen las figuras y tablas, as comotambin los apndices correspondientes lo cual les ser de gran utilidad en eldesarrollo de las prcticas.

Por otra parte quiero manifestar mi agradecimiento al \'0, Jorge Ruz Snchez,. quien me seal algunos errores, los cuales se pudieron corregir oportunamente.

Asimismo agradezco a mis hijos Ismael y Marisol y a la D.G. Blanca HortensiaRodrguez Rodrguez por su valioso apoyo en la preparacin del manuscritooriginal de este Manual. .

MARIA TERESA CASTAEDA BRIONES.

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VI


REGLAMENTO DEL LABORATORIO Y ALGUNAS MEDIDAS DE SEGURIDADDENTRO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

1. No se permitir la entrada al laboratorio a los alumnos que lleguen 15 minutosdespus de la hora sealada.

2. Queda prohibida la entrada a personas ajenas al laboratorio.

3. Ningn alumno debe salir del laboratorio durante el tiempo que dure la prctica,sin previa autorizacin del profesor.

4. Por ningn motivo se permitir a los alumnos trabajar en el laboratorio mientrasno tengan puesta su bata blanca y limpia, as como tambin sus lentes deseguridad, cubreboca, cofia y guantes de cirujano estriles.

5. Al alumno que no venga provisto del material necesario que le corresponde, deacuerdo con la prctica a realizar durante las sesiones de laboratorio, no se lepermitir permanecer en el laboratorio.

6. No colocar objetos personales que no vayan a ocupar durante la sesin delaboratorio sobre la mesa de trabajo. Usar los cajones de sus gavetas.

7. No tirar basura o material no contaminado como algodn, papeles, cerillos u otro alsuelo, ni guardarla en los cajones de las gavetas, ni en los vertederos; stosdebern ser depositados en los botes destinados para ello.

8. Es muy importante lavarse las manos con agua y jabn antes de empezar atrabajar y al abandonar el laboratorio.

9. Antes de empezar y al terminar de trabajar, deber limpiarse la mesa delaboratorio, primero con una franela hmeda para eliminar el polvo y enseguidacon algodn humedecido en solucin desinfectante.

10.Queda estrictamente prohibido comer, beber, fumar y en general llevarseobjetos a la boca tales como el lpiz, bolgrafo o algn otro, dentro dellaboratorio.

11.Queda estrictamente prohibido pipetear con la boca las muestras para anlisis,soluciones reactivos.

VII


12.Aun cuando en el laboratorio no se manejan microorganismos patgenos,pudiera en un momento dado estar presente alguno o algunos de ellos encualquiera de las muestras a analizar, por lo cual es recomendable que losalumnos cuenten con las vacunas necesarias para evitar algn tipo deinfeccin. De esto se har cargo el propio alumno.

13.No se permitir al alumno hablar dentro del laboratorio durante el desarrollo delas prcticas sin tener puesto el cubreboca, para evitar todo tipo decontaminacin cruzada sobre todo en los cultivos puros.

14.No colocar tubos acostados sobre la mesa de trabajo, utilizar siempre una gradillapara ello.

15.En caso de romper o derramar material contaminado, verter sobre ste, solucinde fenol al 5% y dejarla actuar por 15 minutos antes de limpiar. Notificar alprofesor o al ayudante cuando esto suceda.

16.Mantener siempre separado el material sucio para esterilizar, material sucio paralavar y el material limpio, con su respectivo rtulo.

17.No lavar el material contaminado sin antes haberlo esterilizado.

18.Antes de esterilizar, ya sea en autoclave o en horno de calor seco, se deber.quitar al material todo tipo de etiquetas.

19.Al esterilizar en autoclave tubos, matraces o frascos con tapn de rosca, aflojarstos ligeramente para lograr una mejor penetracin del calor.

20. No conservar en incubacin o en refrigeracin frascos, tubos, cajas de Petri oalgn otro material, sin rotularlos debidamente con el contenido, nombre delalumno o nmero de equipo y fecha, de lo contrario ser desechado

21. No almacenar material innecesario en el refrigerador.

22. Al finalizar la sesin, cada alumno es responsable de la limpieza adecuada de surea de trabajo, as como de la tarja que usa.

23. Si un alumno rompe o extrava material, est obligado a reponerlo nuevo,. debiendo mostrar la nota de compra correspondiente.

VIII


24. Los alumnos debern leer previamente la o las prcticas que se realizarndurante cada sesin, debiendo presentar un diagrama de flujo de las mismas alllegar al laboratorio.

25. Los reportes de las prcticas concluidas debern entregarse el da sealado paraello, dentro del horario de laboratorio, escritos a mquina o en computadora y enun flder limpio. No escribir nada con lpiz.

26. Cada da de retraso en la entrega de los reportes, implicar un punto menos en lacalificacin.

NOTA:

El incumplimiento de este Reglamento repercutir en la calificacin delaboratorio.

EQUIPO INDISPENSABLE EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

- Microscopios- Autoclaves- Horno esterilizador de calor seco- Estufa para secado de material- Horno de vaco- Incubadoras- Bao incubador a 44 "C ( OSC) para coliformes fecales- Bao de agua, con control de temperatura- Refrigeradores- Balanza granataria- Balanza analtica- Medidor de pH- Campana de extraccin de gases- Campana de flujo laminar- Incinerador para esterilizar asa bacteriolgica- Centrfuga de alta velocidad- Centrfuga de baja velocidad- Equipos de filtracin Millipore- Filtros Seitz- Espectrofotmetro- Bombas de vaco

MICROBIOLOGIA APLICADAManual de LaboratorIo

- Cuentacolonias Quebec- Jarras de anaerobiosis- Parrillas de calentamiento con agitacin magntica

Agitadores Vortex- Agitador orbital para matraces, botellas y tubos- Fermentadores (biorreactores)- Densmetro- Turbidmetro- Termmetros- Picnmetros- Lmpara de luz ultravioleta- Rotavapor- Licuadoras de 2 velocidades- Muestreadores para agua

Hidrmetro

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MATERIAL INDISPENSABLE EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGAAPLICADA

- Bata blanca y limpia- Asa bacteriolgica- Portaobjetos con y sin excavacin- Cubreobjetos- Pinzas de diseccin- Pinzas para crisol- Pinzas con punta plana, para membrana millipore- Pinzas de Mohr- Tijeras con punta roma- Mechero Bunsen- Mechero Fisher- Manguera de ltex- Lmparas de alcohol- Tripis- Telas de asbesto- Baos Mara- Gradillas para tubos de diferentes dimensiones- Canastillas de polipropileno y de aluminio- Cajas Petri de vidrio, de diferentes dimensiones- Cajas Petri estriles, desechables- Porta cajas Petri de acero inoxidable- Tubos de ensayo de diferentes dimensiones- Campanas Durham- Tubos para centrfuga- Matraces Erlenmeyer de diversos volmenes- Matraces Kitasato de 1 y 2 L- Matraces volumtricos de diferentes volmenes- Vasos de precipitado de diferentes volmenes- Vasos para licuadora resistentes al autoclave- Vidrios de reloj- Probetas de diferentes volmenes- Buretas de diferentes volmenes- Soportes para bureta- Pinzas para bureta- Pipetas graduadas de 10, 5, 2 Y 1 mL- Pipetas volumtricas de diferentes volmenes- Pipetas Pasteur

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MlCROBlOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio

- Micropipetas de diferentes volmenes- Pipeteros de aluminio o de acero inoxidable- Propipetas de tres vas- Soporte para realizar linciones- Embudos de separacin- Embudos de filtracin rpida- Papel filtro- Membranas de filtracin millipore (Tamao de poro = 0.45 urn)- Membranas de asbesto para filtro Seltz de diferente tamao de poro- Agitadores de vidrio- Esptulas de diferentes tamaos- Bistur- Tapones de hule- Pisetas- Botellas de Roux- Botellas Winkler- Frascos para reactivos de diferentes volmenes, con tapn esmerilado

Frascos gotero- Frascos de boca ancha resistentes al autoclave, para toma de muestras- Frascos de vidrio o de polipropileno resistentes al autoclave de 1 L Y 300 mL

Cpsulas de porcelana- Crisoles Gooch- Desecador- Morteros- Cerillos o encendedor- Algodn- Gasa (no estril) .- Rollo de Masking tape- Lpiz graso- Marcador indeleble- Caja de colores- Tapa de un frasco o un comps para dibujar crculos.- Detergente- Jabn y jabonera- Escobillones para lavar tubos de 30 x 200, 18 x 150 y 13 x 100 mm- Fibra Scotch Brite (verde) con esponja, para lavar cajas Petri- Caja de aplicadores- Franela de cualquier color (60 x 50 cm aprox.)- Rollo de papel sanitario- Papel aluminio

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- Papel parafilm- Papel de estraza para envolver material- Toallas de papel- jeringas- Cubre bocas- Guantes de cirujano estriles- Cofias- Lentes de seguridad- Libreta de pasta gruesa de 100 hojas forma francesa (Bitcora)

NOTA:Del listado anterior, los alumnos debern de proveerse de algn material en formaindividual, otro por equipo y el resto ser proporcionado en el laboratorio:

Individual:

- Bata blanca y limpia- Asa bacteriolgica- Cerillos o encendedor- Cubrebocas- Guantes de cirujano estriles- Cofias- Lentes de seguridad- 1 Caja de colores- 1 Tapa de un frasco o un comps para dibujar crculos- Libreta de pasta gruesa de 100 hojas forma francesa (Bitcora)

Por equipo:

- 1 Caja de cubreobjetos- 1 Pinzas de diseccin- 1 Pinzas con punta plana, para membrana millipore- 1 Tijeras con punta roma- 1 Propipeta de tres vas- 3 Frascos gotero de 60 mL- 3 Frascos de boca ancha resistentes al autoclave, para toma de muestras- 500 g de Algodn- 1 Paquete de Gasa (no estril)

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MICROBlOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio

- 2 Rollos de Masking tape- 1 Lpiz graso- 1 Marcador indeleble- 1 Kg de detergente- 1 Jabn y jabonera- Escobillones para lavar tubos de 30 x 200, 18 x 150 y 13 x 100 mm, 1 de cada

uno.- 1 Fibra Scotch Brite (verde) con esponja, para lavar cajas Petri- 1 Franela de cualquier color (60 x 50 cm aprox.)- 1 Rollo de papel sanitario- 1 Kg de papel de estraza para envolver material- 3 Paquetes o rollos de toallas de papel para secarse las manos.- 3 Jeringas desechables (de 10, 5 y3 mL)

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PRCTICA Nm. 1

EL MICROSCOPIO

l. OBJETIVO

Conocer sus partes y su funcin, as como el cuidado, manejo y utilidad en elLaboratorio de microbiologa.

11. INTRODUCCiN

El microscopio es indispensable en el Laboratorio de Microbiologfa para el estudiode la morfologfa y estructura de los microorganismos, asf como su reaccin adiferentes colorantes, lo cual junto con otros criterios, permitir su identificacin,por lo tanto, es importante conocer su adecuado manejo.

Anthony van Leeuwenhoek, en 1676, gran apasionado en pulir lentes que utilizabapara examinar gran variedad de materiales, fue el primero en observar bacterias yprotozoarios en agua de lluvia, en infusiones diversas y en su sarro dental.

La mxima amplificacin que logr Leeuwenhoek en los diversos microscopiosque construy fue de 300 dimetros.

La perfeccin del moderno microscopio compuesto facilita el estudio de lamorfologa de microorganismos y de algunas de las grandes estructuras de laclula bacteriana.

A finales del siglo XIX surgieron avances importantes en microscopa, perodo degran progreso en Microbiologfa.

TIPOS DE MICROSCOPIO

Simple

Los primeros microscopios, construidos por Leeuwenhoek alrededor de 1675, eransimples, es decir, contenan slo una lente o lupa.

Compuesto

Tiene varias lentes combinadas, capaces de producir gran aumento (Figura 1.1).


. MICROSCopA PTICA

Se usa para aumentar el tamao de la imagen aparente de los objetos, lo cualpermite observar los detalles estructurales de los microorganismos. Con lamicroscopa ptica se pueden lograr aumentos de 100 a 1,000 dimetros y, enalgunos casos, hasta 2,000, segn el tipo de luz que se utilice y la forma deiluminar el objeto en estudio o preparacin.

Los microscopios pticos pueden ser de varios tipos, siendo el microscopio pticode campo claro, el ms utilizado en microbiologa. En la microscopa de campoclaro, el campo microscpico est brillantemente iluminado y los objetos enestudio aparecen ms oscuros en el fondo.

El microscopio ptico normal que se usa para observar bacterias y otrosorganismos celulares es un microscopio compuesto, el cual est provisto de unafuente luminosa, una lente condensadora de luz que la dirige hacia el objeto aobservar y dos juegos de lentes que ayudan a la amplificacin de la imagen.

A travs de la refraccin o reflexin de los rayos luminosos mediante el sistema delentes del microscopio, se forma la imagen del objeto, que es ms grande que elobjeto mismo, permitiendo el examen de sus estructuras en detalle.

Existen varios aditamentos que utilizados en el microscopio ptico ordinario,aumentan mucho su rendimiento como instrumento de observacin, por ejemplomicroscopio en campo oscuro (ultramicroscopio), microscopio de contraste defases, microscopio de fluorescencia, microscopio de luz ultravioleta, microscopiode interferencia, microscopio de contraste de interferencia diferencial de nomarski.

AMPLIFICACiN

La capacidad amplificadora de un microscopio compuesto es el producto delaumento individual de los oculares y los lentes objetivos. Un microscopio tpicoque se usa en bacteriologa tiene objetivos con poder de resolucin de 10X, 40X Y100X y ocular de 10X, por lo cual es capaz de amplificar la imagen de la muestra100, 400 Y 1000 veces.

En un aumento de 1000X, las bacterias y microorganismos grandes se puedenvisualizar muy bien, pero los virus y muchos de los detalles finos de las estructurasbacterianas no se pueden ver.

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PODER DE RESOLUCiN

La resolucin se define como el espacio de mxima aproxirnacln entre dospuntos en el que an se pueden observar claramente como dos entidadesindependientes, es decir, es la distancia entre dos entidades estructurales de unobjeto en la cual todava se pueden observar como estructuras separadas en laimagen amplificada.

El poder de resolucin de un microscopio est sujeto a la longitud de onda de laluz y a la propiedad de las lentes conocidas como la apertura numrica (AN). Ellmite del poder de resolucin de un microscopio es aproximadamente igual a0.61/AN, que para un microscopio ptico es de alrededor de 200 nm (nanmetros).

A menor longitud de onda de la luz y AN de las lentes, ser mejor el poder deresolucin del microscopio. Por lo tanto, queda claro que el poder de resolucin delos microscopios pticos se encuentra restringido por AN que se obtenga de lossistemas de lentes y las longitudes de onda del espectro de luz visible.

APERTURA NUMRICA

Esta expresin, que suele abreviarse AN, indica la cantidad de luz que entra en unobjetivo desde un punto del campo del microscopio. Tal valor es de sumaimportancia, ya que, como se dijo anteriormente, de l depende el poder deresolucin, la propiedad ms importante de un objetivo.

La AN de una lente depende del ndice de refraccin (N) del medio que llena elespacio entre el objeto y la parte frontal del objetivo, ydel ngulo (.) de los rayosde luz ms oblicuos que puedan entrar al objetivo. La frmula para calcular la ANes:

AN =N x sen /1/2

El aire tiene un ndice de refraccin de 1.0, que limita la resolucin que se puedeobtener, pero se puede incrementar la AN poniendo aceite de inmersin entre elespcimen y el objetivo, aumentando as el poder de resolucin del microscopio.

El aceite de inmersin tiene un ndice de refracclon de 1.5, lo que aumentaconsiderablemente la AN y esto mejora el poder de resolucin del microscopio.

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MICROBIOLOGlA APLICADAManual de Laboratorio

MICROScopA ELECTRNICA

Con el uso del microscopio electrnico la amplificacin de la imagen se obtienemediante un haz de electrones el cual sustituye a la luz, y un campo magnticoque hace las veces de lentes, logrndose aumentos de 200,000 a 400,000dimetros.

Debido a sus posibilidades para obtener imgenes claras de los objetos msdiminutos, ha permitido contribuciones de la mayor importancia, sobre todo en elestudio de la constitucin y ciclos vitales de los virus filtrables.

El poder de resolucin del microscopio electrnico es mucho mayor que el delmicroscopio ptico, pudindose incluso observar estructuras moleculares comoprotenas y cidos nuclecos, pero debido a que los haces electrnicos poseenbajo poder de penetracin, es necesario emplear tcnicas especiales para laobtencn de cortes ultra finos que permitan la observacin de las muestras.

Hay dos tipos bsicos de microscopios electrnicos:

El microscopio electrnico de transmisin (MET) y el microscopio electrnico conbarrido (MES) (Figura 1.2).

Para el estudio de las estructuras internas de las clulas es esencial un MET.

En el MET se utilizan electrones en lugar de rayos de luz, y la funcin de las lentesla realizan electromagnetos, operndose en todo momento a alto vaco.

Cuando slo se pretende estudiarlas estructuras externas de una muestra, no sonnecesarios cortes ultranos, pudindose realizar la observacin directa en METdespus de aplicar una tincin negativa. Tambin se puede usar el MEB.

Todos los microscopios electrnicos tienen cmaras incorporadas que permitenfotografiar las muestras y obtener microfotografas electrnicas.

MTODOS DE MICROSCopA

Examen de organismos vivos

La forma ms simple de examinar las bacterias y otros microorganismos vivos essuspenderlos en agua u otro lquido, colocar una gota de esta suspensin en unportaobjetos ordinario y encima un cubreobjetos, utilizando para su observacin al

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microscopio los objetivos seco dbil y seco fuerte. Existen otros mtodos comoson el de gota pendiente y el microcultivo.

Examen de bacterias teidas

La forma y estructura de las bacterias se revelan con ms claridad cuando sondesecadas sobre un portaobjetos y posteriormente coloreadas o examinadascontra un fondo teido. Existen diversas tcnicas de tincin.

PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO DE CAMPO CLARO Y SUFUNCiN

SISTEMA MECNICO

Base, soporte, brazo y cuerpo del tubo.

Sirven para mantener en posicin las partes pticas esenciales. Estas partes songruesas y fuertes, para disminuir la vibracin.

Tubo intercambiable

Se encuentra insertado en la parte superior del cuerpo del tubo. Soporta el oculary su funcin es ajustar la longitud mecnica del tubo, es decir, la distancia entre lalente del ocular que est arriba y la unin del objetivo al revlver, que est abajo.

Platina.

Parte del microscopio donde se coloca la muestra que va a ser examinada.

Pinzas de la platina

Sirven para sujetar la muestra a examinar.

Tornillos para desplazar la platina

Sirven para mover la muestra que est sobre la platina, hacia arriba, abajo,derecha o izquierda, lo cual facilita la localizacin del objeto hasta enfocar elcampo adecuado, as como tambin permite la revisin de toda la preparacin.

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Revlver

Es el disco que soporta a los objetivos, ste se gira para colocar el objetivorequerido bajo el tubo.

Tornillos macromtrico y micromtrico.'

Sirven para enfocar, logrando que la muestra se vea ntida y clara, ya quepermiten subir y bajar todo el cuerpo del tubo junto con sus lentes y enmicroscopios modernos, junto con la platina.

El tornillo rnacromtrico permite un enfoque aproximado y el micromtrico' ElIenfoque exacto y preciso.

SISTEMA PTICO

Fuente de luz

Se encuentra colocada debajo del objeto; emite la luz que pasa por elcondensador, para despus iluminar la preparacin.

Algunos microscopios tienen integrado a la lmpara un diafragma, el cual se abreo cierra para regular la intensidad de la luz; en otros nicamente se regula elvoltaje.

Condensador

Antes de que la luz alcance la muestra en la platina, se condensa y enfoca atravs de una gran lente condensadora que se halla bajo la platina.

Diafragma iris

Sirve para controlar la luz a travs del condensador, regulando el paso de luz a lapreparacn para dar nitdez a la imagen.

Objetivos

Son las lentes que tiene como funcin delimitar el tamao de la imagen. Lamayora de los microscopios tienen tres objetivos que proporcionan diferentesaumentos:

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+Objetivo de pequeo aumento o "seco dbil"

til para observar microorganismos grandes, por ejemplo Protozoarios.Abarca un campo microscpico con una superficie mayor. Este objetivoest marcado con un "3" "2/3", que significa 2/3 de pulgada 16 mm.

Tambin est marcado como 10X. Tiene una lente en el extremo muchoms grande que cualquiera de los otros objetivos.

+Objetivo de gran aumento o "seco fuerte"

ste se usa para el examen de microorganismos vivos suspendidos engotas de agua u otros lquidos. Est marcado con "6" "1/6" que significa1/6 de pulgada 04 mm. Tambin est marcado como 45X 50X. La lentedel extremo es de menor tamao que la del seco dbil.

+Objetivo de inmersin en aceite

ste es indispensable para el examen de frotis de bacterias, teidos. Lalente visible del extremo es mucho ms corta que la de los objetivossecos.

Este objetivo est marcado "011 inmer" u "homog lnmer" que significainmersin homognea. Tambin est marcado "1/12" (1/12 de pulgada,1.9 mm, 1.8 mm) y con 97X 100X.

Las marcas 10X, 45X y 97X con que suelen estar marcados los objetivosdel microscopio corresponden a la potencia amplificadora, y las letras"NA" a la apertura numrica.

Mientras mayor sea la cifra "NA", mayor ser el detalle que revele elobjetivo.

Las cifras 16 mm, etc., en los objetivos, se refieren a lo que se llamadistancia focal equivalente, osea, nos da una idea de la distancia quedeber haber entre el extremo del objetivo y la muestra al enfocarse.

Cuando el microscopio es parafocal, las distintas lentes estn ajustadasde tal manera que al enfocar el objeto de estudio con una lente, aspermanece al cambiar a otros objetivos. De esta manera, se puedeenfocar con el objetivo de menor aumento y cambiar a los objetivos demayor aumento sin volver a enfocar.

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Oculares

Son tubos cortos, cada uno con dos lentes que se encuentran insertados en lostubos intercambiables. La funcin de stos es amplificar la imagen del objetoformado por el objetivo y permite que sta sea percibida por el ojo.

Los oculares estn marcados "5X", "10X", etc. indicando que amplan la imagendel objetivo 5 veces, 10 veces, etc.

Cuando se utiliza el ocular 10X con el objetivo de pequeo aumento (10X) da unaamplificacin final de 100 veces.. El de 50X dar una amplificacin final de 500veces y el de 100X una amplificacin final de 1000 veces.

CUIDADO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. Para transportar el microscopio a la mesa de trabajo deber tomarse del brazocon la mano derecha y de la base con la mano izquierda y en posicin vertical.

2. Antes y despus de usarlo, limpiar perfectamente la fuente de luz delmicroscopio, parte superior del condensador, oculares y objetivos con vaho yfrotando suavemente con papel seda o con un pincel suave libre de grasa. Sino basta el agua del vaho, puede usarse una pequesima cantidad de termuy puro, pero nunca alcohol ni otros disolventes, porque pueden disolver elpegamento de las lentes.

3. Limpiar el sistema mecnico conperfectamente limpio y humedecidocompletamente.

un pao que no suelte pelusa,con agua destilada y despus secar

4. Mantener el microscopio retirado de la orilla de la mesa.

5. No encender la fuente de luz, sino hasta que se vaya a usar.

6. Evitar girar el revlver de los objetivos sin antes bajar la platina. Recordar queel objetivo 45X es ms largo que el de 10X y ms todava que el de inmersin,por lo que deber tenerse cuidado, pues si llegan a rozar la platina, sta losinutilizar permanentemente.

7. Colocar la muestra sobre la platina y girar el revolver para colocar el objetivoque se va a usar hacindolo en la posicin correcta mientras que se observa elmaterial.

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8. Ver por el ocular y controlar la cantidad de luz adecuada, moviendo elcondensador y diafragma.

9. Para enfocar con el objetivo seco dbil (10X), subir al mximo la platina con eluso del tornillo rnacromtrico, sin forzarlo, luego enfocar primero con el tornillomacromtrico y una vez que se ha localizado el campo, usar el tornillomicromtrico para enfocar con mayor precisin, ajustando la distanciainterpupilar (distancia entre los ojos).

10.Cuando se vaya a utilizar el objetivo seco fuerte (45X), hacer primero elenfoque de la preparacin con el objetivo seco dbil, luego, girar el revlver detal manera que el siguiente objetivo sea el seco fuerte, observar lateralmente,cuidando que la lente no choque con la preparacin. Ajustar el enfoque usandoel tornillo micromtrico.

11.Con respecto al objetivo de inmersin, si se cambia de un objetivo seco a ste,hay que tener mucho cuidado, ya que la distancia focal es muy corta y habrque emplear nicamente el tornillo micromtrico y no el macromtrico debido aque se puede daar la preparacin y la lente del objetivo.

12. Para utilizar el objetivo de inmersin en aceite (100X), es recomendable:

a) Bajar la platina del microscopio antes de poner el objetivo en posicin.

b) Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. No usar aceiteen exceso, ya que daa el cemento de las lentes.

e) Viendo por fuera del microscopio, subir la platina con el tornillo macromtricohasta que toque la gota de aceite. A partir de ese momento el objetivo estarprcticamente dentro de su distancia focal. Enfocar la preparacin conmovimientos finos del tornillo micromtrico.

111. MATERIAL Y SUBSTANCIAS

- Microcultivo- Preparaciones teidas- Aceite de inmersin- Papel seda o pincel suave.- Papel absorbente (papel filtro o papel sanitario)- Pao de lino o de otro material que no suelte pelusa.- Microscopio

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IV. TCNICA

1. Siguiendo las indicaciones para el manejo del microscopio:

Observar una preparacin teida, con el objetivo de inmersin.

Observar un microcuitivo, primero con el objetivo seco dbil y despus con elseco fuerte.

2. Dibujar lo observado.

MICROCULTIVO:

Seco fuerte

PREPARACIN TEIDA:

Objetivo de inmersin10

Seco dbil


v. CUESTIONARIO

1. Hacer un esquema del recorrido de la luz a travs de un microscopio pticocompuesto de campo claro. .

2. Consultar el fundamento de: microscopa electrnica, microscopa en campooscuro, microscopa de luz ultravioleta, microscopa de contraste de fases ymicroscopa por fluorescencia.

3. Mencionar ejemplos de la utilidad de las anteriores microscopas.

4. Describir brevemente los tipos de microscopio electrnico.

5. Consultar dos tcnicas de preparacin de muestras biolgicas para serobservadas con microscopio eleCtrnico.

11

jMICROBIOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio

Oc ular ._"-_.~--- .. .r.:

L--~--=/ \Hila

MICRomOLooA APLICADAManual de Laboratorio

MOHOS

Mucor

Penicillium

Rhizopus

-~Aspergillus

LEVADURAS

Saccharomyces Biastomyces

~b.,.. ",. , ."... :Z

MICROBlOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio

Figura 2.3 Algas del plancton y otras algas de aguas superficiales

20


Trvpenosome sp.Euglena sp.

Giardia /amblia

Trichomonas sp.

cneoe carolinensis

Amoebasp.

Actinospaerium eichorni

Vorticella sp.

E/pidium crispa

Eug/ypha a/veoiata

Balantidiumcoli

Figura 2.4 Diversos gneros de protozoarios

21

1MICROBIOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio

PRCTICA Nm. 3PREPARACiN DE EXTENSIONES O FROTIS y TINCIN SIMPLE

l. OBJETIVO

Conocer el procedimiento para preparar extensiones frotis y los diferentesmtodos de tincin, as como su utilidad en el estudio microscpico de losmicroorganismos.

11. INTRODUCCiN

Un procedimiento til para el examen de muestras es el estudio microscpico depreparaciones fijas - extensiones o frotis - preparados a partir de ellas ycoloreadas por el mtodo adecuado. Esto permite eliminar el movimiento quepresentan los microorganismos en las preparaciones en fresco. La retencin decolorantes por las bacterias permite su fcil observacin bajo el microscopio.

La forma ms comn de preparar un frotis es extender con el asa bacteriolgicaun poco de muestra sobre un portaobjetos desengrasado pero tambin se puedehacer con un hisopo o presionando el portaobjetos sobre la muestra: "impronta".

Dependiendo del tipo de microorganismo o estructura del mismo que se deseeobservar es el tipo de tincin que se emplea. Por ejemplo: Uncin simple,diferencial de Gram, negativa, para cpsulas (Mtodo de Anthony), para flagelos,para endosporas, para ncleo, para bacterias cido alcohol resistentes (tincin deZiehl Neelsen), entre otras.

Tincin simple.

Se denomina as, porque slo se utiliza un colorante.

Con este tipo de coloracin solo se pretende observar la morfologa de losmicroorganismos.

Las tcnicas de coloracin simple pueden ser positivas cuando el colorante esfijado por las clulas apareciendo los microorganismos de color oscuro ocoloreado sobre un fondo luminoso o claro, y son negativas cuando losmicroorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tie y losmicroorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro.

22

MICROBIOLOGAAPLICADAManual de Laboratorio

Para hacer las tinciones positivas se utilizan colorantes, que son compuestoscoloridos que al combinarse con otras sustancias les imparten color; estnformados por un grupo cromforo que es la parte de la molcula responsable delcolor, y un grupo auxcromo tales como grupos amino e hidroxilo que ayudan afortalecer a los cromforos, ya que al formar sales le permite disociarse ycombinarse.

Las propiedades cidas o bsicas de los colorantes permiten su clasificacin en:

+cidos

Estos ionizan en soluciones acuosas para producir un ncleo colorante concarga (-), es decir el grupo inico que imparte el color (cromforo) tiene carganegativa, o sea, es un anin. Estos colorantes tien material citoplasmtico,no son muy usados en microbiologla. Por ejemplo: eosina, rojo congo,fucsina cida

+Bsicos

En los que el ion que lleva el color (cromforo) tiene carga (+). Estoscolorantes tienen afinidad por el material nuclear y otros componentes. Estosson los ms usados en microbiologla, ya que debido a la gran cantidad deribosomas que contienen cido ribonucleico en todo el protoplasma de laclula bacteriana, stas se tien fcilmente. Por ejemplo: azul de metileno,fucsina bsica, cristal violeta.

+Neutros

Se obtienen cuando se mezclan colorantes cidos y bsicos, donde la cargaelctrica de stos es cero. P. ej. Glernsa, derivado de sal de amonio yeosina.


- 4 portaobjetos- Gradilla- Asa bacteriolgica- Mechero Bunsen- Cerillos o encendedor- Lpiz graso- Papel absorbente (papel filtro o papel sanitario)- Papel seda o pincel suave

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- Aceite de inmersin- Cristal violeta-Azul de metileno

Verde de malaquita- Safranina- Cultivo en medio slido- Cultivo en medio lquido- Microscopio

IV. TCNICAA.Preparacin de extensiones o frotis

Se debern emplear portaobjetos perfectamente limpios y sin raspaduras paraevitar interferencias en la observacin.

Las extensiones debern ser finas y uniformes para permitir el paso de la luz atravs de ellas y facilitar su observacin (Figura 3.1).

Preparar 2 extensiones a partir de cada cultivo:

1. Flamear el portaobjetos para desengrasarlo.

2. Si el cultivo es slido, colocar una gota de agua en el centro del portaobjetos, ycon el asa bacteriolgica estril, tomar una pequea cantidad de material,emulsionar y extender uniformemente en una superficie aproximada de 1 cm2 .

3. Si la muestra es lquida, tomar directamente el material con el asa estril yextenderlo uniformemente sobre la superficie indicada anteriormente;

4. Dejar secar la extensin al aire.

5. Una vez seca la extensin, fijarla al calor suave, pasando rpidamente elportaobjetos sobre la flama del mechero, sin calentar demasiado, unas 10veces.

B. Tincin

1. Cubrir la extensin debidamente preparada con la solucin colorante..

2. Dejar actuar el colorante por 1 minuto.24


3. Lavar con agua corriente hasta eliminar el exceso de colorante.

4. Dejar secar al aire o presionando el portaobjetos entre 2 capas de papelabsorbente, como papel filtro o papel sanitario.

5. Una vez seca la extensin, colocar sobre ella una gota de aceite de inmersin yobservar al microscopio con el objetivo de inmersin.

6. Dibujar lo observado:

Cultivo en medio slido

v. CUESTIONARIO

Cultivo en medio lquido

1. Consultar las estructuras qulmlcas de 2 colorantes cidos y 2 bsicos.

2. Qu significa "fijar" la extensin y qu sucede durante este proceso?Mencionar otros 2 mtodos de fijacin.

3. Qu caracterstica presenta el aceite de inmersin?

4. Por qu es necesario teir las extensiones?

5. Consultar otras 2 tcnicas para la preparacin de extensiones.

25


Colocar muestra

Fijar al calor

Eliminar exceso de agua

Exlender en forma fina y uniforme

Adicin de colorante

~Secar ai aire

Lavar con agua

Agregar 1 gota deaceite de inmersin

y observar en elobjetivo 1QOx

Figura 3.1 Preparacin de una extensin ofrotis y tincin simple

26


PRCTICA Nm. 4TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM

1. OBJETIVO

Distinguir las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.

11. INTRODUCCiN

La tcnica de coloracin de Gram .es de gran utilidad en Bacteriologa, ya quepermite diferenciar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas. Casi lamitad de las bacterias, son Gram positivas y el resto Gram negativas.

El mtodo fue descubierto por Christian Gram (Dans), en 1884, quien observque en cortes histolgicos que contenan bacterias coloreadas con violeta degenciana y tratadas con solucin acuosa de yodo, con el empleo de alcohol estecolorante podra ser removido del corte histolgico, pero no de las bacterias.

Posteriormente descubri que no todas las bacterias retenan al violeta degenciana sino que algunas erandecoloradas por accin del alcohol. A las primeraslas llam Gram positivas y a las segundas Gram negativas. stas que quedanincoloras son teidas luego mediante el empleo de un colorante de contraste comola safranina, para hacer posible su observacin.

Hay bacterias cuya composicin las sita en el lmite entre Gram positivas y Gramnegativas y por lo tanto reaccionan de maneras diferentes, por lo cual sedenominan Gram variables, pero su verdadero carcter de Gram puedeestablecerse en cultivos muy jvenes obtenidos en medios especficos como agarsangre y controlando cuidadosamente todas las condiciones incluyendo, desdeluego, los detalles de la manipulacin. . .

Finalmente, los factores que afectan a la pared celular como el envejecimiento o eldao fsico, alteran el Gram de las bacterias positivas lo mismo que el mediocido.

Existen muchas modificaciones de esta coloracin, pero el fundamento es elmismo.

27



- Gradilla- Portaobjetos- Asa bacteriolgica- Mechero Bunsen- Cerillos o encendedor- Lpiz graso- Papel absorbente (papel filtro o papei sanitario)- Papel seda o pincel suave- Aceite de inmersin'- Cristal violeta- Luqol- Alcohol al 95%- Safranina- Cultivos bacterianos: A, B Y C- Microscopio

IV. TCNICA

1. Preparar 3 extensiones en la forma ya indicada.

2. Cubrir la extensin con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto.

3. Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la preparacin y sacudirpara eliminar el exceso de agua.

4. Cubrir la extensin con solucin de lugol y dejar actuar por un minuto.

5. Lavar con agua corriente.

6. Decolorar con alcohol al 95 96%, aproximadamente 10 segundos o hastaobservar el alcohol transparente.


8. Cubrir la extensin con satranlna y dejar actuar por 1 minuto.


10.Secar la preparacin al aire o colocndola entre 2 capas de papel absorbente.28


11.Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y observar almicroscopio con objetivo de inmersin.

INTERPRETACiN:

Las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta y se teirn en azulomorado.

Las Gram negativas se tien en rojo o rosa.


Cultivo A

Cultivo e

29

Cultivo B


V. CUESTIONARIO

1. Cul es el fundamento de la tincin diferencial de Gram?

2. Explicar la funcin que desempean ellugol y el alcohol en esta coloracin.

3. Escribir el nombre cientfico (gnero y especie), de 5 bacterias Gram positivas y5 Gram negativas.

4. Describir la tcnica de otra tincin diferencial.

5. Explicar: Por qu algunos microorganismos Gram positivos en un cultivo jovenpueden volverse Gram negativos cuando ste envejece?

30


PRCTICA Nm. 5TINCIN DE ENDOSPORAS POR LA TCNICA DE SCHAEFFER y FULTON

l. OBJETIVO

Demostrar mediante tincin y observacin microscpica la presencia de esporasen las bacterias.

11. INTRODUCCiN

Existen diversos tipos de esporas microbianas, pero la espora bacteriana tieneespecial importancia ya que son organelos de gran resistencia que se producen enel interior de la clula, por lo que reciben el nombre de endosporas.

La endospora es una estructura compuesta, de dipicolinato de calcio en el centro,dentro de su compleja cubierta que consta de siete capas que contienen murena.

Pocos gneros de bacterias son capaces de formar endosporas, siendo losprincipales: Bacillus y Clostridlum.

La esporulacin de una bacteria no es debida a condiciones desfavorables delmedio, sino que se forman en cierto perodo del desarrollo de la clula.

La funcin de las endosporas no es la reproduccin, ya que de un bacilo queforma una espora slo surge una bacteria por su germinacin.

Tanto el tamao, como la forma y posicin de la espora en la clula bacteriana soncaracteres relativamente constantes de cada especie, ya que poseen cierto valorpara distinguir entre s los diferentes tipos de bacterias esporuladas.

La posicin de la espora en la clula puede ser central,sub-terminal o terminal yde forma redonda u ovalada (Figura 5.1).

La espora puede tambin ser ms grande que el dimetro de la bacteria o menorque ste. .

Las endosporas bacterianas son muy resistentes y refractarias a la desecacin, alos agentes qumicos y sobre todo a temperaturas elevadas, ya que puedensobrevivir expuestas a altas temperaturas durante largos perodos, a diferencia delas bacterias vegetativas normales que mueren con breves exposiciones.

31


11I. MATERIAL Y SUBSTANCIAS

- Cultivo de Bacillus subtils- Portaobjetos- Asa bacteriolgica- Mechero Bunsen

. - Tripi- Soporte para efectuar tinciones- Cerillos o encendedor- Papel absorbente (papel filtro o papel sanitario)- Papel seda o pincel suave- Lpiz graso- Portaobjetos- Gradilla- Aceite de inmersin- Verde de malaquita al 5% en agua destilada- Safranina al 0.5% en agua destilada

Microscopio

IV. TCNICA

1. Preparar una extensin a partir del cultivo bacteriano.

2. Colocar la extensin sobre un soporte y agregar suficiente solucin de verde demalaquita al 5%.

3, Flamear la extensin pasando por debajo de sta el mechero Bunsen o lalmpara de alcohol hasta observar una ligera emisin de vapores, por espaciode minuto y medio, evitando que se evapore totalmente el colorante..

4. Lavar enrgicamente al chorro del agua, hasta eliminar el exceso de colorante.

5. Cubrir la preparacin con solucin de contraste, safranina al 5%, y dejar actuarel colorante durante un minuto y medio.

6. Lavar al chorro del agua hasta eliminar el exceso de colorante.

7. Secar al aire o utilizando papel absorbente.

8. Observar al microscopio con objetivo de inmersin en aceite.32


INTERPRETACiN:

Las esporas debern estar teidas de color verde y los cuerpos bacilares enrojo.


Objetivo de inmersin

V. CUESTIONARIO

1. Mencionar otros mtodos de coloracin de esporas.

2. A qu se debe la resistencia trmica de la endospora?

-3. Qu importancia tienen las endosporas?

4. Explicar cmo pueden ser destruidas las endosporas?

5. Mencionar las pnnclpales caractersticas de los gneros 8acillus y Clostridium.

33

MIC'OBIOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio

a)

elFigura 5.1 Posicin de endosporas en las bacterias:

a) terminal, b) subterminal c) central

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PRCTICA Nm. 6TINCIN DE FLAGELOS BACTERIANOS POR EL MTODO DE LEIFSON

l. OBJETIVO

Demostrar la presencia de flagelos mediante tincin y observar la movilidad quepresentan algunas bacterias, diferencindola del movimiento browniano.

11. INTRODUCCiN

Muchos microorganismos son mviles, desplazndose de un lugar a otro paraobtener nutrientes, crecer y reproducirse.

Muchas de las bactenas poseen esta capacidad, debido a la presencia de unosrganos de locomocin denominados flagelos.

Estos son filamentos simples qumicamente compuestos de protena conocidacomo flagelina. Tienen su origen en el protoplasma de la clula bacteriana y suespesor es alrededor de 0.01 micrones.

El nmero y disposicin de los flagelos es variable en las diferentes bacterias,pero generalmente es constante para cada especie.

Algunas tienen solamente un flagelo, otras dos o ms y pueden ser polares opertricos - alrededor del cuerpo de la clula - (Figura 6.1 j.

Las bacterias flageladas cuando estn suspendidas en una gota de lquido sonactivamente mviles. Sin. embargo, es muy importante distinguir entre elmovimiento real debido a los impulsos originados por los flagelos permitiendo eldesplazamiento de la bacteria dentro del campo microscpico y el llamadomovimiento browniano que se produce siempre que se suspenden en un lquido,partculas pequeas y que presentan las bacterias inmviles debido al bombardeomolecular sobre la superficie de la clula.

Los flagelos pueden ser teidos, pero debido a su dimetro tan pequeo, serequieren tcnicas especiales.

Los flagelos de organismos eucariticos, como algas y protozoarios, son muchoms gruesos y pueden observarse en preparaciones en fresco o con tincionessimples.

35



- Suspensin bacteriana- Solucin salina o agua destilada estril- 1 Portaobjetos excavado- 1 Portaobjetos normal perfectamente limpio y desengrasado con mezcla

crmica- 1 Cubreobjetos perfectamente limpio y desengrasado- Pipetas Pasteur estriles- Gradilla- Asa bacteriolgica- Lpiz graso- Mechero Bunsen- Cerillos o encendedor- Aplicadores- Vaselina- Papel absorbente (papel filtro o papel sanitario)- Papel seda o pincel suave- Colorante de Leifson- Mezcla crmloa

Aceite de inmersin- Microscopio

IV. TCNICA

A. OBSERVACiN AL FRESCO EN GOTA PENDIENTE

1. Depositar en condiciones aspticas tres o cuatro asadas de la suspensinbacteriana en el centro del cubreobjetos limpio y libre de grasa. Tambin sepuede usar una pipeta Pasteur estril para este fin, procurando que la gotaquede lo suficientemente grande para facilitar la observacin.

NOTA:

Los cubreobjetos se pueden limpiar frotndolos cuidadosamente entre losdedos con agua y jabn y enjuagndolos en agua caliente. Luego sumergirlosen alcohol y secarlos con un trapo limpio, sin pelusa. Finalmente, elcalentamiento suave a la flama quitar los ltimos restos de grasa.

36


2. Cuando se trata de un cultivo slido, colocar una gota de solucin salina o aguadestilada estril en el centro del cubreobjetos limpio y emulsionar una pequeacantidad del material. Se puede hacer una pequea marca cerca de la gota enel cubreobjetos para facilitar la observacin.

3. Poner un poco de vaselina alrededor de la concavidad del portaobjetosutilizando para ello un aplicador.

4. Invertir y colocar el portaobjetos sobre el cubreobjetos que contiene la gota dela suspensin bacteriana cuidando que quede bien centrado para que laexcavacin quede directamente encima de la gota. La gota no debe tocar elportaobjetos.

5. Presionar suavemente cubreobjetos y portaobjetos para que se adhieranperfectamente.

6. Invertir rpidamente. La gota que contiene el material a examinar pende delcubreobjetos sobre la excavacin del portaobjetos (Figura 6.2).

7. Observar al microscopio con ei objetivo seco dbil y enseguida con el secofuerte. Al localizar la marca hecha en el cubreobjetos, el borde de la gota seencontrar fcilmente.

8. Determinar si hay movilidad real - desplazamiento de las clulas de un lado aotro dentro del campo microscpico -, o movimiento browniano.

9. Si se desea observar clulas individuales, colocar una gota de aceite deinmersin sobre el cubreobjetos y observar con objetivo de inmersin .

.B. TINCIN DE FLAGELOS

1. Hacer un crculo en un portaobjetos pertectamentelimpio para lo cualpreviamente fue sumergido en mezcla crmica durante 24 horas, lavadoposteriormente con agua destilada, enjuagado con alcohol y secado con untrozo de tela limpio. Desengrasarlo pasando por una flama varias veces.

2. Colocar dentro del circulo, con pipeta Pasteur, una gotita de la suspensinbacteriana e inclinar el portaobjetos a uno y otro lado para extender la muestra.

3. Fijar la preparacin al aire ya que si esta operacin se hace usando la flama delmechero se pueden destruir los flagelos.

37


4. Humedecer la preparacin con el colorante de Leifson y dejarla en reposo atemperatura ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso, o en laincubadora en tiempo fro.


6. Secar y observar con objetivo de inmersin.

INTERPRETACiN:

Los flagelos se tien bien de color rojo en aquellas bacterias que no presentanflagelos extremadamente delicados.

7. Dibujar las observaciones hechas:

Observacin A

V. CUESTIONARIO

Observacin B

1. Dar la clasificacin de las bacterias de acuerdo al nmero y localizacin de susflagelos.

2. Dibujar la estructura de un flagelo bacteriano.

3. Consultar otro mtodo de tincin para flagelos.

4. Diferenciar los flagelos bacterianos de los de clulas eucariticas.38


5. De qu otra manera se puede demostrar la movilidad de una bacteria?

39


j

,1

Figura 6.1 Diferente nmero y disposicin de flagelos en bacterias

40


~/:sa. _._~~~/ bacteriolgica

Cultivo --."O'Ir'?f!-- ._ : _._-_ ......~._- Cubreobjetos

Invertir portaobjetosy presionar contrael cubreobjetos

_---Vista lateral de una~~~;~ gota pendiente

Figura 6.2 Preparacin de una muestra de gota pendiente

41


PRCTICA Nm. 7ESTERILIZACiN POR CALOR SECO Y CALOR HMEDO

1. OBJETIVO

Demostrar la diferencia del efecto del calor seco y hmedo, usando comoindicador la viabilidad de una bacteria.

11. INTRODUCCiN

Existen diversos mtodos fsicos de esterilizacin y de inhibicin del crecimientomicrobiano, como pueden ser el calor, la filtracin y la radiacin, pero el msampliamente usado es el calor, ya sea hmedo o seco, los cuales tienen diferentepenetrabilidad.

Conforme aumenta la temperatura por encima de la temperatura mxima decrecimiento, se producen efectos letales en los microorganismos.

La muerte de las bacterias por el calor hmedo es consecuencia de ladesnaturalizacin de sus protenas, en tanto que en una atmsfera seca se debe ala oxidacin de los constituyentes de la clula.

Los enlaces intracelulares e intermoleculares (puentes de hidrgeno), de lasprotenas de los cuales depende su funcionalidad, son ms lbiles cuando lasprotenas estn hidratadas que cuando no lo estn, de tal manera que el "calorhmedo" es ms efectivo en la desnaturalizacin de enzimas y otros componentesprotenicos importantes para la clula que el "calor seco".

Es por eso que se dice que el calor hmedo tiene mayor "penetrabilidad" que elcalor seco.

El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letalbacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales ysubstancias, con el propsito de matar a las bacterias que ellos contengan.

Este proceso se llama "esterilizacin" y al material, cultivo o medio de cultivosometido a ste, se le denomina entonces "estril", es decir, desprovisto de todaforma viviente.

El calor puede ser generado en diversos aparatos y por lo tanto se puedeesterilizar por calor hmedo y por calor seco.

42


En ambos casos hay numerosos factores que condicionan la efectividad delproceso: cantidad de agua, temperatura, presin, tiempo de contacto, superficie deesterilizacin, pH, "edad" de las bacterias, presencia o no de esporas, composicindel medio de suspensin, etc.

Las clulas vegetativas y las endosporas bacterianas de un mismo organismovaran considerablemente en cuanto a su resistencia al calor.

La muerte de los microorganismos es ms rpida a pH cido.

Las concentraciones elevadas de azcares, protenas o grasas disminuyen lapenetracin del calor y habitualmente aumentan la resistencia de los organismosal calor, mientras que las elevadas concentraciones de sal pueden incrementar obien reducir la resistencia al calor, dependiendo del organismo.


- 2 tubos de ensayo conteniendo cada uno un hisopo contaminado con cultivo deBacillus sbtllis, bacteria esporulada

- 2 tubos de ensayo conteniendo caldo nutritivo estril- Gradilla- Canastilla para colocar los tubos rotulados con "autoclave"- Vaso de precipitados para colocar los tubos rotulados con "horno"- Mechero Bunsen- Cerillos o encendedor- Masking tape- Asa bacteriolgica- Autoclave- Horno de calor seco

IV. TCNICA

1. Rotular los dos tubos conteniendo un hisopo previamente contaminado con uncultivo de Bacillus subtilis (bacteria esporulada), uno con la palabra horno y elotro con la palabra autoclave, anotando adems el nombre del alumno onmero de equipo, para su identificacin.

2. Colocar los tubos en el autoclave o en el horno de calor seco segn el rtulo,para su esterilizacin, utilizando en ambos casos una temperatura de 121C yun tiempo de 15 minutos.

43


3. Despus de este perodo, sacar los tubos y aadirles, en condiciones aspticas,caldo nutritivo estril.

4. Incubar a 37 oC, por 24-48 horas.

5. Despus de este perodo observar si hubo o no desarrollo en los tubos, el cualse manifiesta mediante turbidez del medio.

6. Anotar los resultados y sacar conclusiones en cuanto a la diferencia del efectodel calor seco y del calor hmedo.

MANEJO DEL AUTOCLAVE:

1. Asegurarse de que haya un buen nivel de agua en el autoclave. S no haysuficiente, agregarla hasta que casi llegue a la parrilla inferior.

2. Introducir el material que se va a esterilizar procurando que quede biencolocado para evitar algn problema y cerrar la puerta ajustndola bien. Debequedar hermticamente cerrado.

3. Abrir la vlvula de salida de vapor y encender la fuente de calor del autoclave.

4. A medida que suba la temperatura del agua (ver el termmetro), empezar a. salir una mezcla de vapor-aire por la vlvula de salida de vapor, dejar queescape esta mezcla hasta que slo salga un flujo continuo de vapor yel airehaya sido eliminado; a sto se le llama purgar el autoclave.

5. Una vez purgado el autoclave, cerrar la vlvula de salida de vapor y dejar quela presin suba hasta 15 libras por pulgada cuadrada (vigilar el manmetro), loque proporciona una temperatura de 121C. Recordar que no es la presin delautoclave lo que mata a los microorganismos sino la elevada temperatura quepuede alcanzarse cuando el vapor de agua se somete a presin.

6. En esemomento empezar a contar el tiempo.

7. Transcurridos 15 minutos a 15 libras de presin, apagar la fuente de calor ydejar que el autoclave se enfre slo (no abrir la vlvula de salida de vapor),hasta que la presin haya bajado a Olibras.

8. Abrir el autoclave y sacar el material.44

MICROBIOLOGA APLICADAMannal de Laboratorio

MANEJO DEL HORNO DE CALOR SECO:

1. Para efectos de esta prctica, - ya que para efectuar la esterilizacin con esteequipo las instrucciones verdaderas son otras -, encender el horno elctrico ycon el uso del termostato, elevar la temperatura hasta que llegue a 121C ymantener sta constante.

2. Introducir el material a esterilizar y cerrar la puerta.

3. Empezar a contar 15 minutos de exposicin a esa temperatura.

4. Despus de este perodo, apagar el horno, abrir la puerta y sacar el material. Sian est caliente, usar un guante de asbesto.

v. CUESTIONARIO

1. Describir un autoclave y un horno de calor seco.

2. Qu tipo de material se puede esterilizar en el horno de calor seco y en elautoclave? Dar ejemplos.

3. Cul es la temperatura y el tiempo que se requieren para lograr laesterilizacin en el horno de calor seco?

4. Por qu es necesario ajustar el tiempo y la temperatura para lograr laesterilizacin?

5. En qu consisten los mtodos de arnoldizacin y pasteurizacin?

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PRCTICA Nm. 8DESINFECCiN DE AGUJAS HIPODRMICAS POR EBULLICiN

l. OBJETIVO

Medir el tiempo letal trmico y conocer la importancia de la eliminacin demicroorganismos por ebullicin y su aplicacin.

11. INTRODUCCiN

Frecuentemente se usa en medicina el mtodo de desinfeccin de instrumentospor sumersin en agua u otros lquidos a altas temperaturas. Con el objeto deutilizar correctamente este mtodo, es conveniente comprender algo de sudinmica.

Se llama tiempo letal trmico al tiempo necesario para obtener la eliminacin demicroorganismos a una temperatura dada.

Se llama punto letal trmico a la temperatura necesaria para obtener eliminacinde microorganismos en un tiempo fijo.

En estaprctlca slo se realizar el primero, ya que es el ms til.


- 1 Caja de Petri conteniendo 5 agujas hipodrmicas contaminadas conEscherichia coti (una bacteria no esporulada) .

- 1 Caja de Pelri conteniendo 5 agujas hipodrmicas contaminadas conBacillus subtilis (una bacteria esporulada)

- 10 tubos de ensayo conteniendo caldo nutritivo estril- Pinzas de diseccin- Mechero Bunsen- Cerillos o encendedor- Masking tape- Tripi- Tela de asbesto- Vaso de precipitado de 500 mL- Gradilla- Termmetro- Reloj o cronmetro

46


IV. TCNICA

1. Marcar una serie de 5 tubos conteniendo caldo nutritivo, como E. coli: Testigo,5',10',15',20' Yotra como B. subtilis:Testigo, 5',10',15' Y20'.

2. Tomar con la pinza flameada, una aguja contaminada con E. coli y depositarlaen el tubo de ensayo marcado como testigo (ste ser el tubo testigo deviabilidad de las bacterias).

3. Poner en el vaso de precipitados agua destilada y calentarla hasta ebullicinsuave (> 90 C).

4. El resto de las agujas contaminadas con E. coli, verterlas en el lquido enebullicin, todas al mismo tiempo. En este instante empezar a contar el tiempo.

5. Sacar a los 5' la primera aguja y depositarla inmediatamente en el tubo concaldo estril marcado con 5.'.

6. Sacar a los 10 minutos la segunda aguja y depositarla inmediatamente en eltubo con caldo estril marcado con 10'. Efectuar la misma operacin a los 15' y20'.

7. Repetir el experimento con las agujas contaminadas con Bacillus subtlis.

8. Incubar 24 - 48 horas a 37 "C.

9. Observar despus de este perodo si la bacteria se desarroll o no.

10. Anotar resultados y generar conclusiones.

V. CUESTIONARIO

1. Qu tiempo fue requerido para inactivar a E. colt;

2. Qu tiempo fue requerido para inactivar a B. subtilis?

3. Con base a los resultados anteriores, generar conclusiones.

4. Explicar el fundamento de la esterilizacin con el uso de radiaciones ionizantesy no ionlzantes.

47


5. Describir dos equipos y tipos de membranas empleadas en el mtodo deesterilizacin por filtracin.

48


PRCTICA Nm. 9MEDIOS DE CULTIVO

l. OBJETIVO

Conocer la clasificacin, preparacin y esterilizacin de los medios de cultivo ascomo su distribucin en diferentes recipientes.

11. INTRODUCCiN

Un medio de cultivo es cualquier "material o sustrato" que proporcione substanciasnutritivas que permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos.

Estos pueden ser lquidos, slidos o semislidos (Apndice A).

CLASIFICACiN DE MEDIOS

Los medios de cultivo pueden clasificarse en:

Naturales,

Estn constituidos por substancias naturales, tales como papa, leche, huevos,sangre, etc.

Sintticos

Estn compuestos de substancias que son manipuladas por el hombre en ellaboratorio.

Estos a su vez se clasifican en:

Composicin qumica definida

Preparados exclusivamente con substancias de composicin qumicaconocida.

49


Composicin qumica indefinida,

Hecho con substancias qumicas cuyos componentes no puedenanalizarse o es difcil establecer su composicin.

Un medio ampliamente usado en bacteriologa es el caldo nutritivo, que no es msque una infusin de carne magra (sin grasa, tendones, aponeurosis, etc.). Lacarne puede ser de cualquier msculo incluyendo el corazn. En ocasiones y conel objeto de que tenga ms productos nutritivos, se le agregan infusiones decerebro, hgado, etc., que contienen ciertos factores nutritivos en mayor cantidad.

Tambin son muy usados los caldos peptonados, en los cuales la carne o leche essometida a hidrlisis cida o enzimtica, obtenindose entonces pptidos y anaminocidos en diversas proporciones incrementando de esta manera estoscomponentes que son ms fcilmente metabolizados.

Los caldos nutritivos pueden solidificarse con diversos agentes capaces de serconvertidos de "sol" a "gel" y viceversa. Uno de los ms usados es un polisacridocomplejo inatacable por las bacterias, muy higroscpico y que es extrado deciertas algas rojas que existen en el Ocano Pacfico, Este producto se llamaagar.Una cantidad de 1.5 g agregados a 100 mL de caldo es suficiente paraconvertirlo en una masa de consistencia gelatinosa, ms bien dura.

Para que el agar sea disuelto necesita temperaturas de casi 100C y al irseenfriando permanece en esta forma de "sol" hasta los 40C. Por debajo de estatemperatura se transforma en una masa slida ("gel") que es estable as portiempo indefinido.

Tambin se cuenta con medios de cultivo semislidos que son aquellos medioslquidos a los que se adiciona agar en bajas concentraciones: 0.4 a 0.8%. stosson tiles para determinar la movilidad de los microorganismos.

Medios selectivos

Estos han sido diseados de tal manera que inhiban el desarrollo de un grupo deorganismos, mientras que permiten el desarrollo de otro grupo proveniente de unaflora mixta.

La inhibicin puede deberse a la alteracin del pH de un medio slido, Tambin sepueden incluir en un medio slido substancias inhibidoras que dejen crecer ciertostipos de bacterias pero no otras, sensibles a tal agente, teniendo entonces unmedio que puede ser moderada o altamente selectivo, por ejemplo 8-110

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(Estafilococo 110), S.S. (Salmonella-Shigella) y S.D.A (agar de Sabourauddextrosa), los cuales a la vez son diferenciales y selectivos.

Medios enriquecidos

Son aquellos a los que se les pueden agregar substancias para enriquecerlo,como por ejemplo gelosa nutritiva a la que se le agrega sangre, se denomina agarsangre, el cual puede ser utilizado en el aislamiento de bacterias muy exigentes ensus requerimientos nutricionales.

Tambin se puede estudiar en este medio la accin de productos solublesbacterianos como las hemolisinas, en cuyo caso la colonia est rodeada de unaaureola clara, donde estas enzimas han destruido los glbulos rojos. Son ejemplosde medios enriquecidos: medio de suero de Loeffler para bacilos diftricos, mediode Lowenstein-Jensen, para bacilos tuberculosos, caldo selenita cistena y caldotetrationato.

Medio diferencial.

Es aquel en el que se ha aadido alguna clase de indicador, generalmente uncolorante, que permite diferenciar entre distintas reacciones qumicas que seproducen durante el crecimiento Ej. E.M.B. (eosina-azul de metileno), que seutiliza para el aislamiento de enterobacterias Gram negativas. La presencia delazul de metileno inhibe a las bacterias Gram positivas.

Medios de ensayo

Son aquellos tiles en la identificacin y clasificacin de los microorganismos deacuerdo a sus actividades metablicas particulares. Por ejemplo agar con harinade maz para ayudar a identificar a Candida albicans; leche con indicador paraobservar la actividad proteoltica y fermentativa, as como la reduccin delindicador.

Medios deshidratados

Son los que se encuentran en el comercio en forma de polvos secos.

La mayora de los medios comnmente utilizados en microbiologa son de estetipo. Estos productos deshidratados se transforman fcilmente en medios decultivo por adicin de agua y esterilizacin.

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- Agar nutritivo deshidratado (Apndice A)- Caldo nutritivo deshidratado (Apndice A)- 2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL- 6 Tubos de ensayo de 18 x 150 mm con tapn de rosca- 3 Cajas de Petri estriles- Algodn y gasa- Esptula- Vidrios de reloj- Mechero Bunsen- Cerillos o encendedor- Tripi y tela de asbesto- Bao Mara- Balanza

IV. TCNICA

1. Pesar las cantidades correspondientes para preparar 30 mL de caldo nutritivo y75 mL de agar nutritivo.

2. Disolver las cantidades pesadas en el volumen correspondiente de aguadestilada, utilizando los matraces Erlenmeyer.

El caldo nutritivo se disuelve fcilmente sin necesidad de calentar.

Para disolver el agar nutritivo ser necesario calentar a bao Mara por algntiempo. El matraz deber taparse con algodn y gasa para evitar evaporacin yagitarse de vez en cuando para que la disolucin sea uniforme.

El medio estar disuelto cuando ya no haya formacin de grumos y se observetransparente y no turbio.

3. Vaciar aproximadamente 10 mL de caldo nutritivo en cada uno de tres tubos deensayo y taparlos.

4. De los 75 mL de agar nutritivo preparados, vaciar aproximadamente cinco mLde agar nutritivo en cada uno de tres tubos de ensayo y taparlos. El resto delmedio dejarlo en el matraz.

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5. Esterilizar los medios de cultivo en autoclave a 15 libras de presin (121C) por15 minutos. Algunos medios requieren ser esterilizados mediante filtracin paraevitar su descomposicin prdida de su valor nutritivo (Figuras 9.1 y 9.2).

6. Una vez esterilizados los medios, dejar enfriar a temperatura ambiente los decaldo, inclinar los tubos que contienen agar nutritivo y dejarlos solidificar de talforma que se obtenga una superficie de agar inclinada.

7. Dejar enfriar el agar contenido en el matraz hasta unos 45C (hasta tolerar enla palma de la mano) y en condiciones aspticas distribuirlo en las tres cajas dePetri estriles (aproximadamente 20 mL en cada una).

NOTA:

Para hacer esta operacin se retira el tapn del matraz, sin dejarlo en la mesa,y se pasa por la flama del mechero la boca de ste, luego se levanta la tapade la caja de Petri estril, solamente lo necesario para permitir la entrada delcuello del matraz para vaciar el agar. Inmediatamente se vuelve a tapar la cajade Petri.

Volver a flamear la boca del matraz y taparlo nuevamente si es que ancontiene medio de cultivo.

Es necesario mover ligeramente la caja de Petri para que el medio sedistribuya uniformemente.

No se debe mover bruscamente ni destapar la caja hasta que el agar estcompletamente endurecido, para poder ser inoculado.

8. Por lo que respecta a los tubos que contienen agar nutritivo, una vez que hansolidificado, estarn listos para inocularse.

9. Guardar todos los tubos y cajas en el refrigerador rotulndolos adecuadamente,ya que se usarn posteriormente.

V. CUESTIONARIO

1. Por qu es necesario preparar los medios de cultivo con agua destilada odesmineralizada?

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2. Mencionar dos ejemplos de medios de cultivo que requieran su esterilizacinpor filtracin?

3. Por qu se recomienda enfriar a 45C e.1 agar antes de efectuar el vaciado enlas cajas Petri?

4. Qu caractersticas tiene el agar en cuanto a composicin qumica, valoralimenticio y propiedades fsicas?

5. Consultar la composicin de los siguientes medios: 8.8., 8-110, EMB, XLD,L1A, 8DA, MIO, caldo nutritivo y caldo Czapek-Dox.

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Se aade el medio no estril

Mdio estril

o

Pinza de sujecinI

-

Al vacoI

--- Embudo

c:::::>---- Membrana Millipore~.- Plataforma de vidrio

~~~=- BaseI --Goma

Figura 9.1 Esterilizacin de medios de cultivo mediante filtracin Millipore

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;;;,....::;':; --~ Tapn

Tuercas deajuste

Se aade el medio----no estril y se tapa

.~_..- Tapn/'---

___~ .,'. - Medio estril

Al vado

IGoma _

Matrazkitazato

Recipientede acero ----

Base con ma;::I~la,--__,de acero -".....~

Membrana de =:asbesto ~l~~

Tornillos guia --.

Figura 9.2 Filtro Seitz til en la esterilizacin de medios de cultivo

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PRCTICA Nm. 10ANTISEPSIA DE LA PIEL

1. OBJETIVO

Conocer la accin de diversos antispticos sobre la flora normal de la piel.

11. INTRODUCCiN

Para el control de microorganismos infecciosos o perjudiciales en algn otroaspecto como puede ser el deterioro de algunos materiales, se pueden usaragentes quimicos tales como: alcoholes, fenal y compuestos fenlicos, yodo, cloroy compuestos clorados, jabones y detergentes, colorantes, etc. o agentes fsicoscomo la temperatura - calor o fro -, radiaciones uitravioleta, mtodos de filtracin,etc., pero cuando deseamos eliminar microorganismos indeseables de lasuperlicie o el interior de los seres vivos estos ltimos no pueden ser usados, porlo que se tiene que recurrir a los agentes qumicos.

Existen muchas substancias qumicas tiles para este fin, cuya potenciaantimicrobiana es variable, ya que no existe ningn agente ideal para todos y cadauno de los casos, as, mientras algunos son muy eficaces para ciertos casos,tienen poco o ningn efecto en otros. Por ejemplo, un agente qumico adecuadopara desinfectar utensilios contaminados (desinfectante), puede ser totalmenteinadecuado para aplicarlo sobre la piel, ya que puede ocasionarle dao, en cuyocaso se recurre al uso de productos qumicos que previenen o detienen la accinde los microorganismos, ya sea destruyndolos o inhibiendo su crecimiento yactividad asegurndose de que no causen ningn dao al husped (antispticos).

Los desinfectantes son productos qumicos que matan a los microorganismos yse utilizan sobre objetos inanimados. Los antispticos, por otra parte, sonagentes qumicos que inhiben el crecimiento de los microorganismos y no sonsuficientemente txicos como para ser aplicados a los tejidos vivos.

Los agentes que matan a los microorganismos se denominan microbicidas, con unprefijo que indica el tipo de microorganismo que mata. As pues hay agentesbactericidas, fungicidas y viricidas.

Un agente bactericida mata a las bacterias, aunque puede matar o no a otrasclases de microorganismos.

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Los agentes que no matan y solamente inhiben el crecimiento se denominanagentes biostticos y se puede hablar de agentes, bacteriosttico, fungisttico yviristtico.


_. Agua oxigenada- Tintura de yodo al 1%_.. Tintura de merthiolato- Alcohol al 96%- Solucin salina isotnica estril (NaCI al 0.85%)- Agua y jabn-- 12 Hisopos estriles- 5 Cajas de Petri con agar nutritivo estril- Lpiz graso- Mechero Bunsen- Cerillos o encendedor- Cuenta colonias Quebec

IV. TCNICA

1. Dividir una caja de Petri en dos mitades, trazando por detrs una lnea con unlpiz graso. Marcar una de las mitades como control y la otra con el nombre delantisptico asignado, por ejemplo:

lodo Control

2. Humedecer en condiciones aspticas un hisopo en solucin salina isotnicaestril y frotarse con l la cara interna del antebrazo derecho e inocularmediante estras la mitad de la caja de Petri marcada como control.

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3. Humedecer otro aplicador con el agente antisptico asignado y frotarse slouna vez en el antebrazo izquierdo en un rea de 5 cm2

4. Esperar un minuto y humedecer otro hisopo en solucin salina y frotar el reatratada con el antisptico e inocular mediante estra, la otra mitad de la caja dePetri.

5. Los alumnos que usarn agua y jabn, seguir el paso 1, luego lavar con agua yjabn por un minuto un rea del antebrazo izquierdo, enjuagar con aguacorriente y enseguida frotar con un aplicador humedecido en solucin salinaestril e inocular mediante estra la otra mitad de la caja de Petri.

6. Incubar las cajas durante 24A8 horas a 37 "C.

7. Despus de este perodo observar si hubo crecimiento sobre las estras deinoculacin de cada una de las mitades de las cajas de Petri.

8. Contar las colonias usando el cuenta colonias tipo Quebec.

9. Interpretar resultados.

v. CUESTIONARIO

1. Comparar los resultados con los dems compaeros y hacer una Tablaindicando el antisptico empleado y el nmero de colonias en donde hubocrecimiento.

2. Mencionar ejemplos de desinfectantes y antispticos indicando un usoespecfico en cada caso.

3. Mencionar otros agentes qumicos que afectan la viabilidad de losmicroorganismos.

4. De los antispticos utilizados en la prctica culresult ser ms eficaz?

. 5. Indicar el. sitio y modo de accin de cada uno de los siguientes agentesantimicrobianos: fenal, sales de mercurio, sales de metales pesados, xido deetileno y alcoholes.

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PRCTICA Nm. 11RESIEMBRA DE TUBO A TUBO

1. OBJETIVO

Aprender a inocular o sembrar aspticamente de tubo a tubo.

11. INTRODUCCiN

Existen diversas tcnicas de inoculacin, ya sea en tubo ce ensayo, caja de Petri,matraz, etc., siendo necesario en cualquiera de ellas, hacerlo en condicionesaspticas, es decir, tomando todas las precauciones necesarias para evitar lacontaminacin tanto de los cultivos como de la persona que est realizando lasiembra, para lo cual se requiere realizar la siembra en el menor tiempo posible aefecto de minimizar el tiempo de exposicin en el que puede ocurrir lacontaminacin.


- Tubo de ensayo con suspensin bacteriana- Tubo de ensayo con agar nutritivo inclinado- Tubo de ensayo con caldo nutritivo- Gradilla- Mechero Bunsen- Cerillos o encendedor- Asa bacteriolgica- Masking tape

IV. TCNICA

1. Aflojar los tapones de los tubos. Si los tapones son de algodn que stos girenlibremente por las paredes del tubo,

2. Sostener el tubo con suspensin bacteriana entre los dedos ndice y medio dela mano izquierda.

3. Sostener el tubo que contiene medio de cultivo no inoculado entre los dedosmedio y anular de la misma mano izquierda.

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4. Sostener los tubos por el fondo con el dedo pulgar. Ambos tubos debernformar una ligera V quedando las bocas a la misma altura (Figura 11.1).

5. Esterilizar el asa bacteriolgica calentndola "al rojo" en la parte ms alta de laflama del mechero, antes y despus de la siembra.

6. Quitar el tapn del tubo que contiene la suspensin bacteriana usando losdedos ndice y medio de la mano derecha y con el espacio interdigital de losdedos medio y anular quitar el tapn del otro tubo.

7. Flamear las bocas de los tubos momentneamente.

8. Cerca de la flama del mechero, introducir el asa la cual ya se ha enfriado, en eltubo que contiene la suspensin bacteriana, tomar una asada y depositarla enel tubo que contiene medio sin inocular.

9. Si el medio es lquido, descargar el asa mediante agitacin.

10.Si el medio es slido inclinado, descargar el asa en el fondo del tubo y trazarzig-zag en toda la superficie, desde el fondo hasta arriba, procurando noromper el agar.

11.Flamear de nuevo momentneamente las bocas de los tubos y colocar lostapones en el mismo orden en que se quitaron.

12.Esterilizar nuevamente el asa bacteriolgica.

13. Incubar durante 2448 horas a 37 "C.

14.Despus de este perodo, observar el tipo de desarrollo.

15.Interpretar los resultados.

v. CUESTIONARIO

1. Definir el trmino "inoculacin"

2. Por qu es necesaria la incubacin de los microorganismos?

3. En microbloloqla, qu significa el trmino "crecimiento"?

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4. Describir la tcnica de inoculacin en tubo por "picadura"

5. Consultar las diferentes formas de desarrollo que se pueden observar en lasiembra en tubo con medio lquido, agar vertical inoculado por picadura y agarinclinado sembrado por estra.

62


.. ~~v~, /_.r

Figura 11.1 Resiembra de tubo a tubo

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PRCTICA Nm. 12AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO

y OBTENCiN DE UN CULTIVO AXNICO

1. OBJETIVO

Aislar dos microorganismos por la tcnica de siembra de dilucin por estra enplaca de agar y obtener un cultivo axnico o puro.

11. INTRODUCCiN

Si se toma un asa bacteriolgica cargada con una muestra que contenga bacteriasy se van haciendo estras de sta sobre una placa de agar nutritivo de tal maneraque el material se vaya "diluyendo" sobre la superficie (Figura 12.1), llegar unmomento en que las bacterias depositadas en la estra estn bien separadas unasde otras, reproducindose cada una en progresin geomtrica (1, 2, 4, 8, 16, 32,

64, etc.).

Dependiendo del tiempo de generacin, que vara segn la especie bacteriana,despus de cierto tiempo, cada una se habr multiplicado muchas veces,formando sobre la superficie del medio un pequeo promontorio constituido porclulas bacterianas llamado "colonia", que se obtiene generalmente en unas 24c48 horas.

Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamao, color,consistencia etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases.

Cada colonia aislada est constituida de un solo tipo de bacterias, ya que sesupone que es la descendencia de una sola clula y por tanto, un cultivo puro.

Para estudiar las caractersticas fsicas, qumicas, fisiolgicas, etc., de unabacteria, se necesita que sta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en cajade Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de unaporcin de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su purezadespus de la incubacin apropiada, mediante observacin al microscopio.

La morfologa de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debefamiliarizarse el alumno con ella (Figura 12.2). La terminologa mencionada acontinuacin sobre algunas de las caractersticas ms constantes de una coloniabacteriana es muy til:

64


FORMA:

Puntiforme, circular, irregular, alargada, filamentosa, rizoide, etc.

TAMAO:

Estimar el dimetro en mm.

SUPERFICIE:

Lisa, rugosa, cerebrifonne, en anillos concntricos, etc.

ELEVACiN:

Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, etc.

BORDE:

Entero o continuo, ondulado, lobulado, festoneado, filamentoso, etc.

ESTRUCTURA INTERNA:

Amorfa o granulosa.

COLOR:

Segn sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de .color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.

OPACIDAD:

Transparente, opaca, etc.

CONSISTENCIA:

Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el asa bacteriolgicapara determinar la consistencia.

111. MATERIAL Y SUBSTANCIAS.

- Caja de Petri conteniendoagar nutritivo estril- 2 Tubos de ensayo conteniendo agar inclinado

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- Tubos de ensayo conteniendo cultivo mixto- Lpiz graso- Asa bacteriolgica- Mechero Bunsen- Cerillos o encendedor- Gradilla

IV. TCNICA

1. Con el lpiz graso dividir la caja de Petri en 3 sectores, de tal manera que aldestaparla para proceder a la inoculacin, se tenga como se indica en la figura:

1

2

3

El sector No. 1 es ms pequeo y sirve para descargar el asa.

2. Usando la tcnica ya conocida, tomar el cultivo bacteriano y en condicionesaspticas obtener una asada del material.

3. Una vez cerrado el tubo, colocarlo en una gradilla.

4. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri ydescargar el material en el sector 1, trazando una serie de zi g-zags muycerrados a todo lo ancho del sector. Cerrar la caja.

5. Esterilizar el asa flamendola y mientras que se enfra, girar la caja 90 hastaque el sector 1 quede abajo y el 2 en el lado izquierdo.

6. Trazar unos 5 zig-zags menos cerrados en el sector 2 invadiendo el sector 1para llevar un poco de material al sector 2 y trazar los siguientes zig-zags sintocar el sector 1. En esta forma se diluye el material quedando unas bacteriasseparadas de las otras. Cerrar la caja.

66


7. Esterilizar de nuevo el asa, girar la caja 90 y ahora el sector 2 estar abajo y el3 a la izquierda.

8. Trazar unos 5 zig-zags cada vez mas abiertos en el sector 3 invadiendo elsector 2 y los siguientes zig-zags sin tocar el sector 2, como se muestra en eldibujo:

~~ __ ~O-c;__

-----::::..-::=-=-- =.=-/1-i~9'F ----

--------=:~=~-I :-- \\~lli!! ,111 :C> 1\ \~- ~-~ --jY

9. Incubar a 37 "C por 24-48 horas.

10. Observar si hubo o no, aislamiento de colonias.

NOTA:

En el sector 1 generalmente no se obtienen colonias aisladas, pero en 2 y 3 s.

11.Anotar las caractersticas de las colonias aisladas.

12.A partir de cada una de las diferentes colonias aisladas preparar frotis y teircon la tcnica de Gram.

13.Observar al microscopio con objetivo de inmersin para verificar la morfologa yreaccin al Gram y determinar la pureza de las colonias, considerando puras alas que muestren un solo tipo de bacteria.

14.A partir de las colonias puras efectuar una segunda resiembra en caja de Petrientres campos y una nueva verificacin de pureza por observacinmicroscpica en la forma indicada anteriormente.

15.Una vez determinada la pureza de las colonias, a partir de cada una de ellasinocular por estra en tubos de aqar inclinado, para obtener cultivos puros(Figura 12.3).

67


16. Incubar a 37 "C por 24-48 horas.

17. Despus de este perodo observar si eectlvamente hubo crecimiento de unsolo tipo de microorganismos.

18.Preparar un frotis, teir con la tcnica de Gram y observar al microscopio conobjetivo de inmersin para confirmar su pureza.

19.Dibujar las observaciones hechas al microscopio.

20. Guardar los cultivos puros en el refrigerador para su posterior identificacin.

Siguiendo la misma tcnica, la caja de agar se puede dividir en ms de 3sectores, obteniendo una dilucin mayor, como se muestra en el dibujo:

Existen otras tcnicas de aislamiento en placa, como pueden ser la siembraen superficie y la de placa vertida (Figura 12.4).

V. CUESTIONARIO

1. Describir una tcnica de aislamiento bacteriano a partir de una fuente natural.

2. Describir dos tcnicas de aislamiento en tubo.

3. Qu es un cultivo axnico o puro?

4. Qu importancia tiene la obtencin de un cultivo puro?68


5: Mencionar 5 colecciones de cultivos suministradoras de cultivos microbianospuros.

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(1)

Esterilizar elasay dejar

enfriar alaire

(3)Tomar inculo,volver a flameary tapar el tubo

(4)

Hacer estras formando ngulo entreun campo y otro, esterilizando

previamente elasaentre uno y otro

Campo4Dilucin porestra en4 campos

Coloniasaisladas

Figura 12.1 Siembra en placa para aislamientopor la tcnica de dilucin por estra

70

MlCROBIOLOGA APLICADAManual de Laboratorio

Forma ~1)'" Oo Puntiforme Rizoide

~~ ~Alargada Irregular

e -;:-. -.~Circular FilamentosaElevacin

Convexa

Pulvinada

Umbonada

.{ I

Elevada

Aplanada

Borde

~~ l____Entero Ondulada

~ ~\,


1. Examinar la caja yseleccionarla colonia

a transferir

2.- Esterilizarel asa y

dejar enfriar3.- Tocar suavementecon el asa la colonia

seleccionada

4.~ Inocular la superficie deagar inclinada hacia arriba

trazandoeetrlas.Flamear el asa-incubar

Figura 12.3 Obtencin de cultivo puro

La muestrase extiendesuavemente utilizandouna

asa de vidrio

SIEMBRADESUPERFICIEEN PLACA c=>

La muestra se pipetea sobre lasuperficiedel agar (O, 1 mt, o menos)

SIEMBRAPOR

VERTID.~. AY c=>ENPLAC~La muestrase pipeteaen una placa estril

Se aademedio estrily semezcla conel

lncula

Incubacinl{ )

Colonias de superficie

Resultado tlplco deesta siembra

Coloniasde Coloniassuperfici

Documents

Microbiología Aplicada Manual de Laboratorio, Castañeda Briones, María Teresa