UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSEDISCIPLINA MICROBIOLOGIA GERALROTEIRO DE AULAS PRATICAS2NORMAS PARA OS TRABALHOS NO LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA- O avental ( ou jaleco ) e de uso obrigatorio. Nao sera permitida a entrada do aluno no laboratorio emhorario de aula ou fora dela sem o mesmo.- O laboratorio deve ser um recinto calmo, os alunos devem evitar conversar e sair de seus lugaresdesnecessariamente.- Em caso de algum acidente, comunicar imediatamente ao professor. No caso de quebra, durante amanipulagao com tubos ou placas contendo meios contaminados, nao remover os fragmentos quebrados, deixando-os no local. Na ausencia do professor, verter sobre estes formol, avisando o professor ou monitor o horario do acontecido para apos transcorrido o tempo necessario para que o formol mate os microrganismos, o material seja removido e o local devidamente limpo.- Sempre lavar as maos com agua e sabao antes e apos terminar o trabalho pratico. - Nao fumar, nao comer e nem levar a boca qualquer objeto. No laboratorio de microbiologia trabalha-secom microrganismos potencialmente patogenicos, devendo-se ter sempre cuidado para evitar uma possivel contaminagao ( a boca e porta de entrada para muitas infecgoes ).- Na bancada de trabalho nao deve haver acumulo de objetos, nela permanecendo apenas osindispensaveis para o experimento em execugao, alem do roteiro e caneta ou lapis para as devidas anotagoes. Todo material do aluno devera ficar nas estantes que se encontram nos laboratorios.- Durante os trabalhos, manter o bico de gas aceso somente quando necessario. - As algas e agulhas de platina, pingas, estiletes, cotonetes, tubos contendo os meios de cultura, reagentese corantes, etc., devem ser colocados nos suportes apropriados e nao abandonados sobre a bancada de trabalho.- As pipetas usadas, laminas e laminulas (quando for o caso), etc., devem ser colocados em recipientesapropriados contendo solugao desinfetante ou detergente.- Todo o material utilizado nos experimentos, como por exemplo as placas de Petri e os tubos de ensaiocontendo meios de cultura ou solugoes, deverao ser devidamente identificados para observagoes posteriores. (Estes devem conter: disciplina, data, curso, equipe, microrganismo ou material utilizado)- Antes de qualquer observagao microscopica, devem ser verificadas as condigoes em que se encontra omicroscopio.- Apos o uso do microscopio, desligar a lampada, retirar a lamina usada e quando for o caso, dispensa-lana cuba apropriada. Limpar as objetivas com algodao embebido em xilol ou benzina e depois com um algodao seco ou flanela.- Terminado o trabalho pratico, deixar a bancada em ordem. - O material contaminado nunca deve ser colocado na bancada, pia ou lixo. Deve voltar ao recipiente deonde foi tirado para ser esterilizado. OBS: Cada aula pratica devera iniciar-se com uma explicagao e um periodo de demonstragao. O trabalho nao deve ser iniciado pelo aluno, ate que haja recebido todas as instrugoes necessarias. Os alunos deverao adquirir para seu uso individual o seguinte material, que devera acompanha-lo impreterivelmente em todas as aulas praticas: - Isqueiro ou caixa de fosforos. - Caneta para retroprojetor azul ou preta ( para identificagao do material ). - Pinga inoxidavel.3INTRODUCAO AO CURSO PRATICO DE MICROBIOLOGIANa natureza os microrganismos encontram-se formando populacoes mistas (varios tipos de microrganismos que pertencem a um mesmo habitat). Por outro lado, o desenvolvimento da microbiologia assim como todos os procedimentos laboratoriais para o diagnostico, dependem da obtencao do crescimento dos microrganismos na forma de populacoes puras , que quando crescidas em meios de cultura denominamse culturas puras ou axenicas ( populacoes homogeneas quanto ao tipo de microrganismo, cultivados em meios de cultura sem a presenca de outras formas de vida contaminantes ). A obtencao de uma cultura pura a partir de uma cultura mista denomina-se isolamento, conseguido atraves da semeadura dos microrganismos na superficie de meios de cultura solidos em placas de Petri, o que permitira a formacao de colonias ( que sao populacoes isoladas que crescem na superficie destes meios). Como todos os seres vivos, os microrganismos necessitam de nutrientes apropriados ao seu desenvolvimento, assim como condicoes fisicas ou ambientais favoraveis. Quando cultivados em laboratorio, estas necessidades devem ser respeitadas. O meio de cultura, portanto, deve conter: nutrientes em concentracoes adequados ao crescimento do microrganismo que desejamos cultivar, alem das condicoes ambientais requeridas como: pH ideal, adequado ao seu crescimento, aeracao, umidade, pressao osmotica, temperatura, etc. Os meios de cultura sao utilizados em tres diferentes tipos de consistencia: sob a forma liquida (denominados de meios liquidos ou caldos), solida (denominados de meios solidos ou solidificados, obtidos pela adicao de agar-agar ao meio) e eventualmente semi-solida (denominados de meios semi-solidos, obtidos pela adicao de pequena quantidade de agar-agar ao meio ). Conforme ja dito, o estudo dos microrganismos (fungos e bacterias) , depende da obtencao de uma grande quantidade de microrganismos identicos ( cultura pura ), que sao obtidos em laboratorio atraves do isolamento a partir de uma populacao mista. Para isto devemos preparar meios de cultura estereis e conserva-los em condicoes estereis (desprovidos de qualquer forma de vida). Ao introduzimos no meio esteril o inoculo (quando estaremos semeando, inoculando), teremos o cuidado tecnico necessario para que nao haja contaminacao externa (ambiental). Este procedimento denomina-se tecnica asseptica. Depois de inoculado, o meio de cultura contendo os microrganismos e incubado (colocado para crescer) em local apropriado e se for o caso, em local cuja temperatura seja controlada ( por exemplo : a estufa ). O crescimento significara o desenvolvimento de uma populacao a partir de uma ou algumas celulas. Este podera ser evidenciado a olho nu, sob a forma de turvacao (em meio liquido ) ou formacao de colonias quando em meio solido.4PRINCIPIOS BASICOS DE MICROSCOPIA OPTICAConstituigao Do M.O.C.Atualmente, o microscopio optico composto (M.O.C.) e constitufdo por duas partes - uma parte mecanica e uma parte optica. Cada parte engloba uma serie de componentes constituintes do microscopio (fig. 1). A parte mecanica serve para dar estabilidade e suportar a parte optica. Esta parte e constitufda por:Pe ou Base - suporta o microscopio, assegurando a sua estabilidade. Brago ou Coluna - pega fixa a base, na qual estao aplicadas todas as outras partesconstituintes do microscopio.Tubo ou Canhao-cilindroquesuportaossistemasdelentes,localizando-senaextremidade superior a ocular e na inferior o revolver com objectivas.Platina - pega circular, quadrada ou retangular, paralela a base, onde se coloca apreparagaoa observar,possuindonocentroumoriffciocircularou alongadoquepossibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador.5Parafuso Macrometrico - engrenagem que suporta o tubo e permite a sua deslocagao ada platina. E indispensavel para fazer a focagem.Parafuso Micrometrico - imprime ao tubo ou a platina movimentos de amplitude muitoreduzida,completandoafocagem.Permiteexploraraprofundidadedecampodomicroscopio.Revolver - disco adaptado a zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivasde diferentes ampliagoes: por rotagao e possfvel trocar rapida e comodamente de objectiva. A parte optica e constitufda por:Sistema de Oculares e Sistema de Objetivas - o conjunto de lentes que permitem aampliagao do objeto. A ampliagao dada ao microscopio e igual ao produto da ampliagao da objetiva pela ampliagao da ocular.Fonte Luminosa - existem varios tipos de fontes luminosas, podendo ser uma lampada(iluminagao artificial), ou um espelho que reflita a luz solar (iluminagao natural).Condensador - distribui regularmente, no campo visual do microscopio, a luz refletidapelo espelho.Diafragma - regula a intensidade luminosa no campo visual do microscopio.Devido a estes componentes serem de alta precisao e porque o microscopio e um instrumento caro, requer cuidados especiais de transporte, utilizagao e manutengao.Posigao do Observador- O observador deve estar sentado. - Se o M.O.C. possuir uma ocular, deve olhar por ela com o olho esquerdo, mantendo osdois olhos abertos. Se o M.O.C. tiver duas oculares, deve olhar por ambas.- Os parafusos de comando devem ser manuseados com a mao esquerda, deixando amao direita livre para desenhar as observagoes.Focalizagao- Colocar a ocular desejada; - Acender a fonte de luz acoplada;6- Posicionar o condensador o mais proximo possfvel da platina; - Verificar se o diafragma esta completamente aberto; - Colocar em foco a objetiva de menor aumento; - Fixar a lamina preparada para observagao na platina, atraves das presilhas; - Observar o campo microscopico; - Ajustar o foco utilizando o parafuso macrometrico. - Para maior aumento trocar as objetivas e ajustando o foco com o parafuso macrometricoe se necessario o micrometrico;- Para observar a lamina corada com a objetiva de imersao, colocar uma gota de oleo decedro sobre a area corada da lamina;- Girar o revolver colocando a objetiva de imersao (maior aumento) em foco; - Olhando pelo lado, descer o canhao (ou subir a mesa de platina) utilizando o parafusomacrometrico ate que a lente da objetiva de imersao encoste no oleo de cedro. NUNCA focalizar a imagem pela objetiva de imersao olhando pela ocular e sim sempre pelo lado;- Olhando pela ocular, girar o parafuso macrometrico LENTAMENTE, ate conseguirfocalizar de formar grosseira a preparagao;- Mover o parafuso micrometrico ate conseguir uma focalizagao ideal; - Para mudar o campo microscopico a ser observado, mover o charriot ;Cuidados a ter com o M.O.C.- Deve-se pegar no M.O.C. pelo brago, com a mao direita, enquanto se suporta a basecom a mao esquerda;- Nao se deve tocar no sistema optico com os dedos; - A lente das objetivas nao deve tocar na lamela; - O M.O.C. deve estar completamente pousado numa mesa desocupado, e afastado daborda da mesa.7Material NecessarioLaminas coradas pelo metodo de Gram com as seguintes bacterias:10-Staphylococcus sp 11-Streptococcus sp 12-Escherichia coli 13-Bacillus spMicroscopio optico Oleo de imersao (cedro) Papel absorvente, limpar lentes apos o usoObjetivos da aula14-Conhecer o microscopio optico e suas partes 15-Manusear o microscopio optico com os devidos cuidados 16-Observar morfologia bacteriana utilizando o microscopio optico8B) COLORACAO DE BACTERIASAs bacterias podem ser observadas de duas maneiras: com e sem coloragao.17-Sem coloragao: os microrganismos sao observados vivos, podendo ser evidenciada a motilidade. 18-Com coloragao: os microrganismos sao corados apos serem mortos.Apesar de quimicamente distintas do meio que as rodeiam, as bacterias sao quase incolores nao apresentando contraste suficiente com o meio em que se encontram, o que dificulta sua visualizagao. A diferenga quimica entre as bacterias e o meio e que nos permite distingui-las por meio de coloragao, pois o corante nao reage com o meio externo, tornando-as quando coradas, mais visiveis ao microscopio. Desta maneira poderemos observar suas formas fundamentais, dimensoes e arranjos. A coloragao apresenta ainda outras vantagens, pois com a utilizagao da objetiva de imersao teremos uma maior amplificagao da imagem, alem de nos permitir o estudo de estruturas da celula bacteriana como: parede celular, endosporos, flagelos e capsula. As bacterias coram-se com os derivados de anilina [azulde metileno, fucsina,cristal, violeta, etc..) que sao corantes basicos ( ion colorido = cation ) e que possuem afinidade pelo citoplasma destas celulas. Esta afinidade se deve ao fato do citoplasma bacteriano apresentar carga eletrica negativa, derivada, principalmente, dos radicais fosfatos dos acidos nucleicos que ai se encontram. Sao dois os processos que nos permitem corar as bacterias: COLORACAO SIMPLES: Nesta coloragao utilizamos apenas um corante e ela baseia-se na diferenga quimica existente entre as bacterias e o meio. Uma vez coradas, apresentam contraste, podendo ser melhor visualizadas. COLORACAO DIFERENCIAL: Nesta coloragao utilizamos geralmente 2 corantes, alem do mordente e do diferenciador. Baseia-se na diferenga quimica existente entre as bacterias e consequentemente na reagao diferente que as bacterias podem apresentar frente a um determinado corante. E utilizada para distinguir diferentes tipos de bacterias. Os metodos de Gram (1884) e de Ziehl-Neelsen (1882) sao exemplos de coloragao diferencial.PREPARACAO DO ESFREGACO E FIXACAO DA AMOSTRA PARA COLORACAO: Marcar com lapis dermografico o lado da lamina onde realizaremos o esfregago e colocar sobre ela o material contendo os microrganismos. Estes poderao ser provenientes de: agua, solo, alimentos, medicamentos, lesao, sangue, urina, liquor, fezes, escarro, secregao uretral, etc. No caso do material ser obtido a partir de meio de cultura solido ou de outro que contenha microrganismos em excesso, deve-se dilui-9lo com uma gota de agua destilada ou salina esteril (colocada anteriormente sobre a lamina com auxilio de uma alca de platina esteril) ate obter-se uma leve opalescencia. Espalhar com movimentos circulares ate formar uma fina camada sobre a lamina. Deixar a lamina secar ao ar, em repouso. A secagem ao ar evita a formacao de aerossois que acontecem quando fixamos a lamina antes que a mesma esteja seca. Os aerossois se constituem de fonte de contaminacao, pois nestes estao contidos os microrganismos presentes no material. Apos seca, a lamina devera ser fixada, antes de iniciarmos o processo de coloracao. A fixacao evita que as celulas dos microrganismos sejam lavadas e perdidas durante o processo de coloracao. Alem disto, a fixacao permite a aderencia das celulas a lamina, matando os microrganismos atraves da coagulacao seus protoplasmas, preservando suas estruturas na forma e posicao originais. O calor e o metodo de fixacao frequentemente utilizado. Para fixarmos, passamos a lamina com o esfregaco voltado para cima, por tres vezes atraves da chama. Evitar o super aquecimento testando a cada passada a temperatura da lamina no dorso da mao.COLORACAO PELO METODO DE GRAME o metodo de coloracao mais empregado em bacteriologia. Importancia do metodo: . separa as bacterias em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS (G+/GP) e GRAM NEGATIVAS (G- /GN); . taxonomia ( identificacao, classificacao e nomenclatura, sendo o primeiro passo no processo de identificacao); . possibilita o diagnostico presuntivo (preliminar), principalmente em casos de infeccoes graves e de evolucao fatal quando o medico necessita introduzir uma terapeutica, antes mesmo da identificacao do microrganismo causador da infeccao ; . permite evidenciarmos a contaminacao a partir de diferentes materiais. SOLUCOES EMPREGADAS:19-CRISTAL VIOLETA - funcao: corante principal ( cora igualmente todas as bacterias ) 20-LUGOL ( solucao de iodo-iodeto de potassio) - funcao: mordente. O mordente tem a finalidade deaumentar a afinidade do corante pela celula, permitindo que ela se core mais intensamente.21-ALCOOL ETILICO - funcao: agente descorante e diferenciador. Sua utilizacao permite que algumascelulas se descorem mais facilmente que outras. Este comportamento distinto de descoloracao e que diferencia as bacterias.22-- FUCSINA DILUIDA - funcao: corante de contraste, corante secundario ou contracorante. E o corante queda as celulas descoradas uma cor diferente daquelas que mantem a cor do corante principal.10Os microrganismos que nao se descoram facilmente retem a cor do corante principal ( cristal violeta ) enquanto que aqueles que se descoram facilmente poderao ser visualizados, pois corar-se-ao com o corante de contraste ( fucsina. ). TECNICA: 1- Cobrir o esfregago ja fixado com solugao de Cristal Violeta por um (1) minuto. 2-Escorrer o cristal violeta, lavar em fio d'agua e cobrir o esfregago com Lugol por um (1) minuto. 3-Escorrer o lugol, lavar em fio d'agua . 4- Descorar rapidamente com Alcool Etilico ( +/- 20 segundos) 5-Interromper o processo de descoramento lavando o esfregago com fio d' agua. 6-Cobrir o esfregago com Fucsina diluida por 30 segundos. 7-Lavar e secar com papel filtro, pressionando o esfregago cuidadosamente. 8-Colocar uma gota de oleo de imersao sobre o esfregago e observar ao microscopio, utilizando a objetiva de imersao. RESULTADO: Bacterias coradas em roxo ( cor do cristal violeta ) - GRAM POSITIVAS Bacterias coradas em vermelho ( cor da fucsina ) - GRAM NEGATIVASFUNDAMENTO DA TECNICA DE GRAM: Muitas explicagoes ja foram sugeridas na tentativa de elucidar o mecanismo da reagao de Gram. As mais plausiveis dizem respeito a diferenga na estrutura quimica da parede celular. Num primeiro momento, todas as bacterias ( G+ e G- ) absorvem igualmente o cristal violeta ( corante basico que possui afinidade pelos seus citoplasmas, devido a carga eletrica negativa oriunda principalmente dos radicais fosfatos dos acidos nucleicos ). A seguir, o lugol reage com o cristal violeta formando o complexo iodo-pararosanilina, que se fixa e cora a celula mais intensamente. Posteriormente, quando tratamos o esfregago com alcool, as bacterias se comportam de maneira diferente: -1) as Gram-positivas nao se descoram facilmente pelo tratamento com o alcool. Isto se explica pelo fato de comporem sua parede celular uma espessa camada de peptideoglicano, alem de outros possiveis componentes, como: ac. teicoicos, proteinas. polissacarides e etc., substantias estas, nao soluveis em alcool. O alcool atua desidratando as varias camadas desta parede, o que traz como consequencia uma diminuigao na sua porosidade e esta diminuigao reduziria a permeabilidade da parede, dificultando a extragao (saida) do complexo CV-I ( que se encontra no citoplasma ) de dentro da celula. Alem disto, parece haver uma retengao do CV-I na parede apos a agao do alcool, o que tambem contribuiria para a diminuigao de sua porosidade. A bacteria Gram-positiva permanece entao com a mesma coloragao ate o final. -2) as bacterias Gram-negativas sao descoradas pelo tratamento com o alcool. Tal fato se explica por comporem a parede destas bacterias: delgada camada de peptideoglicano (menor entrecruzamento, o que nao e suficiente para impedir a passagem do solvente ) alem de substancias ricas em lipides (lipoproteina de apoio, fosfolipides da membrana externa e lipidio "A" que participa do LPS). O alcool solubiliza (dissolve) estes lipideos (muitas vezes extraindo a camada da membrana externa), aumentando a porosidade da parede, o que contribuiria para um aumento da permeabilidade. Assim sendo, o alcool penetra dentro da celula (atravessando a membrana citoplasmatica), removendo o complexo CV-I, descorando a celula. Finalmente as bacterias descoradas pelo alcool, por nao apresentarem contraste que permita sua visualizagao, seriam coradas pelo corante secundario que e a fucsina. As celulas que nao foram descoradas pelo alcool (e tiveram sua permeabilidade diminuida) permaneceriam coradas com a cor do corante principal ate o final da coloragao, pois nao absorveriam a fucsina.11CONTROLE DAS POPULACOES MICROBIANASIMPORTANCIA :23-Prevenir transmissao de doencas. 24-Prevenir a contaminacao ou crescimento de microrganismos nocivos. 25-Prevenir a deterioracao e danos de materiais pelos microrganismos.OBJETIVOS: remocao, inibicao ou morte dos microrganismos atraves da acao de agentes fisicos e quimicos. OS AGENTES FISICOS E QUIMICOS PODEM PROMOVER:- Esterilizacao: destruicao de todas as formas de vida (celulas vegetativas e esporos ). - Desinfeccao: destruicao das formas vegetativas dos microrganismos (patogenicos e inocuos), mas naonecessariamente das formas esporuladas. Geralmente refere-se a substancias quimicas ( desinfetantes ) aplicadas sobre objetos inanimados.- Anti-sepsia: processo permite a remocao de parte dos microrganismos presentes em tecidos vivos.Associado a substancias quimicas ( anti-septicos ) aplicadas sobre estes tecidos.- Esporocida: agente fisico ou quimico que mata as formas esporuladas dos microrganismos. - Assepsia: conjunto de tecnicas utilizados para impedir a penetracao de germes em locais que nao oscontenha. CONDICOES QUE AFETAM A ACAO ANTIMICROBIANA DOS AGENTES FlSICOS E QUIMICOS 1. Relacionadas ao microrganismo:- tipo: forma vegetativa (mais susceptivel), forma esporulada (mais resistente). - estado fisiologico das celulas: celulas jovens (mais susceptiveis), celulas velhas ( mais resistentes, que porpoderem apresentar alteracoes fisiologicas e/ou estruturais, tornam-se mais resistentes ).- n de microrganismos: quanto maior o numero de microrganismos presentes num material, maior a chancede haver sobreviventes e formas resistentes.26-Relacionadas ao ambiente ou material onde se encontram os microrganismos: - pH: o calor e mais eficiente em pH acido. - temperatura: quanto maior, maior a probabilidade de eliminacao. - presenca de compostos organicos: protegem os microrganismos, diminuindo a acao de alguns agentesquimicos.- consistencia do material: aquoso (maior penetracao), viscoso, denso (menor penetracao) 27-Tempo: os processos nao sao instantaneos.12AGENTES FISICOS UTILIZADOS NO CONTROLE DOS MICRORGANISMOSCALOR:28-Calor Seco: 29-Forno de Pasteur (forno de ar quente): acao esterilizante (causa a morte por promover: a oxidacao dasproteinas que constituem o microrganismo).- Condicoes de esterilizacao: de 150 a 170 C, de 1 a 2 horas - Utilizacao: esterilizacao de substancias imisciveis em agua (como pos, oleos etc.), instrumentoscortantes (tesouras, bisturis, agulhas hipodermicas e etc.) e vidrarias limpas e secas (placas de Petri, seringas de vidro, pipetas, baloes, tubos de ensaio).30-Incineracao: acao esterilizante. Leva a carbonizacao do material e dos microrganismos. - Para descartaveis: animais usados em experimentos e produtos contaminados (cotonetes, curativose ataduras contaminados, seringas plasticas contaminadas e etc.).31-Flambagem: acao esterilizante: carbonizacao do microrganismo. - O material e submetido a acao direta da chama. - Condicoes de esterilizacao: 200 a 300C, por poucos segundos. - Uso: apenas na rotina microbiologica (alcas e agulhas de platina, estiletes, bocas dos tubos). 32-Calor Umido: 33-Autoclavacao: realizada em autoclaves (aparelhos que utilizam vapor saturado sob pressao). Acaoesterilizante. Causa a morte por promover a desnaturacao das proteinas que constituem os microrganismos.- Condicoes para esterilizacao: 121 C por 15 a 30 minutos a 1 atmosfera a mais de pressao. - Substancias misciveis com agua (meios de cultura, solucao salina, agua, etc.), cotonetes, luvas delatex (cirurgica), sondas, cateteres, gaze, rouparia, material contaminado, etc. OBS: utilizada apenas em materiais que nao se alteram com a temperatura.34-Ebulicao: agua a temperatura de 100C por um tempo de 30 minutos. Causa desnaturacao proteica,eliminando apenas formas vegetativas.35-Pasteurizacao: processo utilizado para alimentos. Elimina apenas microrganismos patogenicos:Salmonella typhi, Brucella abortus e etc.- Condicoes: 63C por 30 minutos ou 72C por 15 segundos, seguido de resfriamento rapido (leite evinho). UHT: leite aquecido a 74C, em seguida aquecido a 140C (5 segundos) e resfriamento imediato.134- Vapor Fluente Fracionado - Tyndalizagao : submeter ao vapor fluente continuo por 3 vezes, com intervalo de 12 a 18 horas apos cada execugao, tomando-se o cuidado de nao abrir o recipiente onde esta acondicionado o material. Elimina formas vegetativas e esporuladas. Causa a morte por promover a desnaturagao de proteinas dos microrganismos. - Uso: solugoes (vitaminas, carboidratos) e materiais que nao suportam temperaturas acima de 100C.36-Radiacoes: o tempo e a intensidade das radiagoes depende do material a ser esterilizado. 37-Radiacoes Nao lonizantes - raios Ultra-Violeta: baixo poder de penetragao: l longo (carreia menosenergia). Utilizado apenas em superficies. Causam danos ao DNA levando a formagao de dimeros de pirimidina (mutagao).- Utilizado: eliminagao de microrganismos em superficies. 38-Radiacoes lonizantes - raios X e raios Gama : alta penetrabilidade. l curto (muita energia). Promovema excitagao de eletrons, formando radicais altamente reativos (OH-, H+, H2O2 ).- Esterilizagao de fios de sutura, material biologico (soros, antibioticos e vacinas) que nao podem sersubmetidos a agao do calor.39-Microondas: muito empregado em laboratorios. As radiagoes emitidas nao afetam diretamente osmicrorganismos, mas geram calor, que e o responsavel pela morte dos microrganismos. Ainda nao existem trabalhos mostrando tempo e potencia.40-Filtracao: fazem desinfecgao e nao esterilizagao. Apresentam poros de diferentes diametros.Ex.: Membranas Filtrantes - Millipore: ester de celulose (remove bacterias e alguns virus)AGENTES QUlMICOS UTILIZADOS NO CONTROLE DOS MICRORGANISMOS.41-Alcoois: anti-septicos ou desinfetantes. Atua sobre formas vegetativas promovendo a desnaturagao deproteinas. E mais eficiente a 70%, pois as proteinas celulares sao mais facilmente desnaturadas na presenga da agua.42-Aldeidos e derivados: atua alquilando grupamentos funcionais das proteinas como aminas,carboxilas e hidroxilas, formando hidroximetilderivados inativos. Mais empregados: aldeido formico (concentragao: 3 - 8%) e aldeido glutarico a 2%.14c) Fenois e derivados: Atua sobre proteinas a uma concentracao de 0.2 a 1%. Bastante toxico.Mais empregados: cresois (metacresol e um dos isomeros mais ativos). A creolina (mistura de cresois) e utilizada na desinfeccao de pisos, vasos sanitarios, excrementos, etc.43-Halogenios e derivados: o iodo e o mais empregado. Atua como bactericiada, fungicida eesporocida, combinando-se irreversivelmente com proteinas, atraves de interacao com aminoacidos aromaticos (fenilalanina e tirosina). As solucoes alcoolicas contendo 2% de iodo exercem acao imediata. Cloro: ataca grupamentos aminados das proteinas, formando cloroaminoacidos inativos. Utilizado sob a forma: hipoclorito de sodio ou calcio, acido hipocloroso.44-Agentes de superficie: detergentes cationicos: utilizados em desinfeccao e anti-sepsias. Maisempregados sao: cloreto de benzalconio, cloreto benzetonio e cloreto de cetilpiridinico. Clorexidina: empregada na anti-sepsia da pele, em anti-septicos bucais, etc.45-Esterilizantes gasosos: oxido de etileno: utilizado na esterilizacao de instrumentos cirurgicos, fios desutura, etc. Atua promovendo a alquilacao direta dos grupamentos carboxila, hidroxilas e sulfidrilas, inativando certas enzimas.INDICADORES DE ESTERILIZACAO:- Substantias com ponto de fusao conhecidos :Acido Benzoico (121C) e Ureia (125C). - Cultura de microrganismos esporulado: Bacillus stearothermophilus - Fitas indicadoras de esterilizacao.15ANTISSEPSIA DA PELEVarias substancias quimicas sao utilizadas no processo de anti-sepsia da pele. Dentre estas, encontramos o iodo, alcool, triclosan e clorexidina como uma das mais utilizadas. O iodo e um halogenio que exibe sua agao sobre os microrganismos atraves de diferentes mecanismos de agao quais sejam: promovendo inativagao enzimatica ou como oxidante, causando assim sua morte, Atua como bactericiada, fungicida e esporocida, combinando-se irreversivelmente com proteinas, atraves de interagao com aminoacidos aromaticos (fenilalanina e tirosina). As solugoes alcoolicas contendo 2% de iodo exercem agao imediata. Os Alcoois: anti-septicos ou desinfetantes. Atua sobre formas vegetativas promovendo a precipitagao e desnaturagao de proteinas. E mais eficiente a 70%, pois as proteinas celulares sao mais facilmente desnaturadas na presenga da agua. O gluconato de clorexidina e um Anti-septico quimico, Antifungico e um bactericida capaz de eliminar tanto bacterias gram-positivas quanto as gram-negativas, no entanto mostra-se menos eficiente com os microrganismos gram-negativos. Tambem e um bacteriostatico, impedindo a proliferagao de bacterias. Acredita-se que o mecanismo de agao ocorra atraves da ruptura da membrana celular, e nao pela inativagao por ATPase como pensava-se anteriormente.Gluconato de clorexidina Triclosan ou triclosano e um agente anti-septico efetivo contra bacterias gram negativas, bem como gram positivas. E eficaz tambem contra fungos e bolores. E encontrado em medicamentos, sabonetes, logoes e cremes dentais. Apresenta boa tolerancia para uso na pele e cavidade bucal em baixas concentragoes.Triclosancr ^^ xiOBJETIVO: utilizar uma solugao de iodo, alcool, triclosan e clorexidina sobre uma porgao da pele com a finalidade de reduzir a microbiota , eliminando quase todos os microrganismos presentes.16TECNICA: Dividir o fundo da parte externa da placa como auxilio de uma caneta de retroprojetor, escrevendo de um lado " salina " e do outro " iodo, alcool, triclosan ou clorexidina ". Depois proceder como segue: 1: molhar o cotonete em solucao fisiologica ( salina ) e esfrega-lo no dorso de uma das maos, em uma area de + ou - 4 cm ( girando sempre o cotonete ). 2: Semear com este cotonete a metade da placa, no lado correspondente a "salina." 3: Com a outra extremidade da haste ( nao utilizada ) deste mesmo cotonete, embebe-la na solucao de iodo e esfrega-la sobre o dorso da outra mao em area de + ou _4 cm. AGUARDAR 5 ( CINCO ) MINUTOS PARA QUE O IODO POSSA ATUAR SOBRE OS MICRORGANISMOS DA PELE, ELIMINANDO-OS. 4: Pegar o outro cotonete e molha-lo em solucao fisiologica, esfregando-o sobre a area onde foi passada a solucao de iodo, alcool, triclosan ou clorexidina. 5: Semear com este cotonete a outra metade da placa, no lado correspondente ao "iodo, iodo alcool, triclosan ou clorexidina". 6: Levar a placa identificada para ser incubada na estufa a 37C por 24 horas. Apos esse prazo retornar ao laboratorio para complementar seu experimento, conforme instrucoes abaixo.Fazer leitura da placa apos 24 horas de incubacao, concluir o resultado e realizar um Gram das diferentes colonias crescidas dos dois lados da placa, descrevendo o observado.17MEIOS DE CULTURAOBJETIVO: Tecnica para a execucao dos meios de cultura; tipos de meios empregados para o isolamento e identificacao de microrganismos ( bacterias e fungos ). MEIO DE CULTURA: Os microrganismos possuem um ciclo natural na agua, solo, ar, na nossa superficie corporal e de outros animais etc. Estes microrganismos conseguem sobreviver a custa de materiais organicos e inorganicos existentes nestes ambientes. O ciclo artificial (meio de cultura) e o modo que empregamos em laboratorio para cultivarmos os microrganismos. Chamamos de meio de cultura ao conjunto de substantias necessarias ao crescimento e multiplicacao dos microrganismos No ciclo artificial tentamos reproduzir as condicoes naturais fornecendo: A - Substantias nutritivas em concentracoes adequadas, que devem servir como:- fonte de energia - fonte de carbono - fonte de enxofre e fosforo - doador de eletrons- fonte de nitrogenio - fonte de sais e ions - fatores de crescimento - receptor de eletronsB - Condicoes ambientais favoraveis:- temperatura (termofilos, mesofilos e psicrofilos)- umidade- pH ( de 2 a 9 )- atmosfera de incubacao (aerobiose, microaerofilia, anaerobiose)Tecnicas para a execucao dos meios de cultura:46-Usar somente substantias quimicas ou ingredientes de boa qualidade 47-Fazer a pesagem corretamente 48-Usar vidraria seca e limpa 49-Usar apenas os ingredientes da formula 50-Se necessario, filtrar 51-Ajustar o pH do meio apos a filtracao, antes de juntar o agar 52-Para manter a eficiencia dos meios depois de prontos, conserva-los em lugar frio, escuro e em recipienteshermeticamente fechados.Estado fisico (consistencia):Os meios podem ser classificados em:53-Liquidos: utilizados para crescimento em massa ( nao promovem a formacao de colonias, mas sim,crescimento por dispersao ).54-Semi-solidos: para verificacao de motilidade (0,5% de agar-agar) 55-Solidos: para fazer isolamento, devido a formacao de colonias (1,5 % a 2% de agar-agar)18Finalidade:- Meios de enriquecimento: aumentam a possibilidade de crescimento da especie desejada, quando a mesmase encontra em pequeno numero.- Meios indicadores (ou diferenciais): revelam uma propriedade bioquimica, permitindo uma identificagaopresuntiva.- Meios seletivos: impedem o crescimento de determinados grupos num inoculo misto, mas permite odesenvolvimento de outros. - Meios seletivos-indicadores: revelam uma propriedade bioquimica e selecionam grupos de bacterias.- Meios de triagem: empregados para separar bacterias da mesma familia. - Meios de transporte: garantem por mais tempo a viabilidade dos microrganismos que nao podem sersemeados logo apos a coleta e que poderiam morrer.Componentes basicos dos meios de cultura:- Extratos: de carne e de levedura. Concentrados aquosos desidratados que servem como fonte de:carboidratos, vitaminas, compostos organicos nitrogenados e sais. - Peptonas: derivados da hidrolise acida ou enzimatica de proteinas de origem animal ou vegetal (peptona de caseina, peptona de soja) que servem como fonte de N organico, vitaminas, carboidratos, enxofre, fosforo, calcio e magnesio. - Agar-agar: polissacarideo obtido a partir de algas rodoficeas. Fungao: agente solidificante, cujo P.F.= 95 C e o P.S.= 45 C. Nao tem fungao nutritiva. - NaCl: mantem o equilibrio osmotico do meio e serve como fonte dos ions Na e Cl. - Agua: umidade e fontes de ions. Formulas de alguns meios basicos, de uso rotineiro em bacteriologia: CALDO SIMPLES: AGAR SIMPLES: - Caldo simples ( com pH aferido ) - 1000 ml - Agar-agar - 20 g- Extrato de carne - 5 g - Peptona - 10 g - NaCl - 5 g- H2O - 1000 ml - pH: 7 4 +/- 0 2Modo de preparo: Fundir a mistura acima em banho-maria, ate a completa dissolugao do agar. -a- Meios em tubos: distribuir o meio ainda quente nos tubosobs.: Aferir o pH aps a dissolugao dos componentes, distribuir nos toto^ acondicionar e esterilizar.e depois autoclavar (no caso de necessitarmos utilizar agar inclinado, inclinar os tubos apos autoclavagao, com o meio ainda quente para solidificagao ). -b- Meios em placas: autoclavar o balao onde foi preparado o meio e a seguir distribui-lo ainda quente, em placas previamente esterilizadas em forno de ar quente.19TECNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOSIsolamento de um microrganismo:O isolamento consiste na obtencao de uma cultura pura (colonias isoladas de um unico microrganismo, separando-o de outros que se encontram no mesmo material ). Finalidades do isolamento: . Identificacao de um microrganismo. A simples observacao de caracteres morfologicos nao e suficiente para a identificacao e classificacao dos microrganismos. Para isto lancamos mao da analise de uma serie de caracteristicas destes como: caracteristicas bioquimicas, sorologicas, de patogenicidade, e etc. O estudo destas caracteristicas esta na dependencia do microrganismo que se pretende identificar.. Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um materialcontaminado qualquer.. Repique: Consiste na transferencia de um microrganismo de um meio de cultura para outro.. Tecnica de semeadura ou repique de bacterias em meio liquido:56-Segurar a alca com a mao direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (aalca e flambada na posicao vertical e devera ficar atras da chama para protecao do operador).57-Retirar a rolha de algodao do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado ( que deveraestar na mao esquerda ) utilizando-se o dedo minimo da mao direita. A ROLHA DEVERA PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MlNIMO, ATE O FINAL DA OPERACAO.58-Flambar a boca do tubo, e retirar o inoculo com a alca fria. 59-Flambar novamente a boca do tubo e fechar. 60-Pegar o tubo onde se ira realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar. 61-Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar. 62-Esterilizar a alca, identificar o tubo semeado e levar para incubacao em estufa.Semeadura ou repique de bacterias em meio solido inclinado: Os cuidados sao os mesmos que para o meio liquido. Empregamos geralmente a alca. Quando necessitamos realizar semeadura de profundidade, utilizamos a agulha. O plantio e feito em zig-zag, iniciando-se pelo fundo do tubo.20Semeadura ou repique de bacterias em placas de Petri: O material a ser semeado devera conter poucos microrganismos porque o inoculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colonia formada na superficie de um meio solido e originada de um ou alguns microrganismos. Quando maior o numero, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inoculo for obtido a partir de meio solido ( inoculo pesado ), este podera ser diluido em salina esteril ou ser utilizada a tecnica de esgotamento adequada. O inoculo obtido a partir de uma cultura em caldo ou de uma diluigao da cultura em meio solido e feito da seguinte maneira: 1. Retiramos o inoculo do tubo com a alga ja flambada e fria.63-Abrimos a placa, de modo que a tampa forme um chapeu com a placa . 64-Colocamos o inoculo junto a parte superior da placa, espalhando-o a seguir atraves de estriamento ( quepodera ser continuo ou descontinuo ). O estriamento podera se feito de maneiras variadas, tomando-se sempre o cuidado de nunca passar a alga duas vezes no mesmo local. O estriamento permite o esgotamento dos microrganismos que se encontram na alga. Quando passamos a mesma 2 vezes no mesmo local, promovemos o recarregamento do local, deixando ali mais bacterias, o que dificultara o seu perfeito isolamento. Durante o estriamento, apos termos semeado metade da placa, deveremos cessar o mesmo. A seguir flambamos a alga, esperamos esfriar e continuamos o estriamento novamente, carregando a alga na ultima estria que realizamos. Apos terminado o estriamento, fechar a placa e identificar, levando-a a seguir para incubagao na estufa, com a tampa voltada para baixo.65-Flambar a alga utilizada, esperar esfriar e guardar no suporte apropriado.OBS: Para a realizagao da semeadura utilizando-se inoculos pesados nao diluidos, a tecnica e a mesma que a descrita anteriormente, so que ao inves de interrompermos o processo uma vez para flambarmos a alga, o faremos duas vezes.Tecnica de repique em meio semi-solido:66-Retirar o microrganismo do meio solido ou liquido com o auxilio de uma agulha ja flambada e fria. 67-Abrir o tubo que contem o meio semi-solido e semear o microrganismo atraves de picada ate mais oumenos 1/3 ou / do tubo.68-Fechar o tubo, identificar e levar para incubagao. 69-Flambar a agulha, deixar esfriar e colocar no suporte adequado.21EMPREGO DE MEIOS DE CULTURA SELETIVO-INDICADORESOs meios seletivo-indicadores sao utilizados para selecionar grupos bacterianos ( atraves da utilizacao de substancias inibidoras que impecam o crescimento de bacterias indesejaveis ) e indicar uma propriedade bioquimica destas bacterias, que contribuam para o processo de identificacao.AGAR MAC-CONKEY: Finalidade: meio de cultura seletivo-indicador, utilizado para isolamento de enterobacterias ( bacilos Gram negativos ) a partir de fezes, urina, liquor, alimentos, agua residual, etc. FORMULA: Peptona de caseina Peptona de carne agar-agar Lactose Mistura de sais biliares Cloreto de sodio Vermelho neutro pH: + ou - 7.1 agua destilada cristal violetaFUNDAMENTOS:70-Os sais biliares e o cristal violeta inibem o crescimento da microbiota Gram-positiva por ventura existenteno material (seletividade para Gram-negativo).71-A lactose junto com o indicador de pH (vermelho neutro) serve para comprovar a degradacao (fermentacao ) deste carboidrato ( o que e feito por apenas parte dos membros desta familia). Quando ocorre a fermentacao, a bacteria e classificada como Lac +.LEITURA:- Colonias lactose-positiva (Lac. +) : degradacao ( fermentacao ) da lactose com acidificacao do meio queproduzira colonias de cor rosa com halo central mais claro. Ex.: E. coli, Klebsiella, Enterobacter.- Colonias lactose-negativa (Lac. -): nao utilizacao da lactose, formacao de colonias incolores etransparentes. As colonias assumem a coloracao do meio, que se apresentara um pouco alterado, devido a utilizacao dos outros componentes ( so nao utilizara a lactose) . Ex.: Proteus, Salmonella, Shigella.22PROVAS BIOQUlMICAS UTILIZADAS NA IDENTIFICACAO DE BACTERIASMETABOLISMO DE CARBOIDRATOS72-Fermentacao de carboidratos:Algumas bacterias sao capazes de hidrolizar os carboidratos (dissacarideos ate glicose), e metabolizar a glicose ate acidos (com ou sem liberagao de gas) e/ou alcoois. Carboidrato ( manitol, sacarose, lactose, etc. ) glicose ac. piruvico acidos, alcoois e gases.Meio utilizado: meio de cultura indicador que contem: caldo simples + carboidrato + indicador de pH (indicador de Andrade ) + tubo de Durhan. TECNICA:73-repicar o microrganismo ja isolado para o meio contendo o carboidrato e incubar em estufa a 37 C por24 horas.74-Leitura: observar se houve produgao de acidos (viragem da cor do meio) com ou sem produgao de gas(formagao de bolha no interior do tubo de Durhan).75-Prova do citrato:Muitas bacterias sao capazes de utilizar o citrato (ac. organico do ciclo de Krebs) como fonte de carbono .A enzima que cataliza a clivagem do citrato recebe varias denominagoes, dentre elas, citratoliase e citrilase. Os produtos de clivagem sao acetato e oxaloacetato, este ultimo sendo subsequentemente convertido em Piruvato e CO2 , por uma oxalacetato descarboxilase. citrato citrilase ^ oxalacetato ____________________oxalacetato________^ Ac. Piruvico + CO2 + descarboxilase acetatoO piruvato e utilizado pela celula ( para seu metabolismo ) e o CO2 e liberado no meio de cultura. O CO2 liberado reage entao com o sodio ( proveniente do sal citrato de sodio incorporado na composigao do meio de cultura ), formando carbonato de sodio ( composto alcalino ), que promove a viragem da cor do meio, devido a alcalinizagao. Meio utilizado: Citrato de Sodio + H2O + Indicador de pH ( azul de bromotimol ). O pH final do meio apos preparo: 6.8 . Indicador de pH: azul de bromotimol: verde em meio ligeiramente acido ( 6.8 ) e azul em pH acima de 7,6.Tecnica: repicar o microrganismo ja isolado no meio do citrato e incubar na estufa a 37 C por 24 horas. Leitura: - teste positivo: meio de cultura azul (a bacteria utilizou o citrato, liberando CO2,) - teste negativo: meio inalterado ( verde ): bacteria nao utilizou o citrato.23METABOLISMO DE PROTEINAS A decomposicao de proteinas ( liberacao de aminoacidos ) conduz a producao de substantias putridas (de mal cheiro) como: H2S, Indol e escatol e etc. Neste experimento, observaremos a utilizacao ou nao de certos aminoacidos pelas bacterias ( necessarios ao seu metabolismo ), atraves da deteccao da presenca de substancias putridas. Meio de cultura utilizado: Meio SIM. ( S=sulfeto; I=indol; M=motilidade ) Composicao: peptona (proteina que serve como fonte de tryptofano e cistina), sal de metal pesado (sal de ferro ou chumbo), agua e agar. TECNICA: Semear com agulha ( picada ate + ou - 1/3 do tubo ) a bacteria ja isolada para o meio SIM. Incubar em estufa a 37C por 24 horas. Apos incubacao, adicionar de 3 a 5 gotas do reativo de Kovacs e proceder a leitura. FUNDAMENTO:1 - Producao de Indol: degradacao do tryptofanoTryptofano triptofanase ^ Ac. piruvico e indol produzida pela bacteriaAc. piruvico: utilizado pelo metabolismo da bacteria. Indol: liberado no meio de cultura. Adicionar apos incubacao, de 3 a 5 gotas do reativo de Kovacs ( solucao de paradimetilaminobenzaldeido ). Se houver liberacao de indol, formar-se-a um anel vermelho ( composto denominado rosindol) Resultado: - Indol positivo: anel vermelho - Indol negativo: nao utilizacao do tryptofano. Presenca de anel amarelo (cor do reativo de Kovacs)2- Producao de H2S:Cistina: aminoacido que contem enxofre (S). Degradacao da cistina com liberacao de H2S. Cistina __________^ 2 cisteina cisteina dessulfidrilase ^ H2S + ac. piruvicoproduzida pela bacteria Ac. piruvico; utilizado no metabolismo da bacteria. H2S: liberado no meio de cultura. O H2S liberado combina-se com o sal de ferro ou chumbo, dando como resultado um precipitado de cor negra. Resultado: - H2S positivo: precipitado preto - H2S negativo: sem precipitado24TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ( TSA ) / ( ANTIBIOGRAMA )1. CONCEITO e INTRODUCAO: Teste para verificar o comportamento dos microrganismos (sensibilidade ou resistencia) "in vitro", frente a diversos antibioticos e quimioterapicos, para a escolha do antimicrobiano ideal. A orientacao fornecida pelo TSA sobre a eficacia de determinada droga contra um agente infeccioso pode vir a ser de grande importancia, visto que diferentes especies bacterianas, ou diferentes cepas de uma mesma especie, podem demonstrar diferentes niveis de sensibilidade a uma droga. Neste particular, destaca-se a resistencia infecciosa protagonizada por diversos generos bacterianos. Multiresistencia de origem plasmidial talvez seja a principal causa do surgimento de cepas resistentes, aliada a selecao natural que ocorre entre populacoes bacterianas. Suassuna: "Para o sucesso da antibioticoterapia, a partir do conhecimento de um agente etiologico cuja sensibilidade foi indicada pelo laboratorio, ha de se considerar, entre tantos condicionantes para o exito do tratamento, se as lesoes sao abertas ou fechadas; contaminadas ou nao; purulentas ou granulomatosas; superficiais, justamucosas, profundas ou sob barreiras anatomicas". Criterio absoluto da eficacia de um antibiotico -> Resposta clinica do paciente quando a ele se administra a dose adequada da droga correta.76-INDICACOES:Para microrganimos isolados e identificados como os agentes causadores da infeccao; quando o microrganismo causador da infeccao apresenta, estatisticamente, grande variabilidade no espectro de resistencia ou tendencia a mesma. Ex.: Enterobacterias, Staphylococcus aureus, Pseudomonas.77-DISPENSADO:Para microrganismos, cuja sensibilidade nao apresenta variacao ao longo do tempo. Ex.: Neisseria meningitidis e Streptococcus do grupo A (sensiveis a penicilina G), Salmonella typhi (sensivel ao cloranfenicol)78-TIPOS DE TESTE:4.1. QUANTITATIVO: determinacao da Concentracao inibitoria minima (CIM).- Diluicao : em tubo e em placa - Teste E (Teste epsilometrico): consiste em uma fita plastica, impregnada com um gradiente deconcentracao do antimicrobiano.254.2. QUALITATIVO: Metodo de difusao de discos em agar. PRINClPIO DO METODO QUALITATIVO: medida do halo de inibigao em mm. LEITURA: - ausencia de halo: resistencia - presenga de halo: sensibilidade ou resistencia5. FATORES QUE INFLUENCIAM O RESULTADO DO TSA:79-COMPOSICAO QUIMICA DO MEIO DE CULTURA:Meio de cultura padrao para a realizagao do TSA: Agar Mueller-Hinton (pH: 7.2 a 7.4), em placas com 4 a 6 mm de espessura. Permite bom crescimento do microrganismo e boa difusibilidade do antibiotico, podendo ainda se necessario, ser acrescido de sangue.80-DENSIDADE DO INOCULO: concentragao do inoculo: 108 celulas/mL. 81-TEMPERATURA:A temperatura de incubagao ideal se situa entre: 35 a 37C. Temperaturas alteradas podem conduzir a uma deterioragao do farmaco ou no caso dos microrganismos produtores de enzimas, a produgao de enzimas podera ser baixa e quantidade tao pequena que havera a formagao de halo maior ( falso-positivo ).2682-CONCENTRACAO DOS ANTIMICROBIANOS NOS DISCOS: padronizada pelo fabricante.83-VALIDADE E CONSERVACAO DOS DISCOS: observar sempre: a data de validade, a umidade e atemperatura ideal de armazenamento84-ACAO E ESTABILIDADE DA DROGA:. algumas drogas podem sofrer hidrolise nas primeiras horas de incubacao (o que possibilita o desenvolvimento dos microrganismos, mesmo que sensiveis a elas ) . alguns microrganismos se reproduzem antes de serem inibidos pela droga (velocidade de crescimento maior que a velocidade de difusao da droga. Tais fatos permitem o surgimento de "colonias satelite" (colonias que podem surgir dentro do halo de inibicao). Alem destas, outras explicacoes sao atribuidas ao surgimento de colonias satelite: inoculo misto e mutantes resistentes ao antimicrobiano dentro da populacao.85-TEMPO DE INCUBACAO: de 12 a 18 horas 86-INTERPRETACAO: medida do diametro do halo de inibicao (mm).6. RESULTADO:- Sensivel (S),- Moderadamente resistente ou intermediario (I), - Resistente (R).TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS ( TSA ) / (ANTIBIOGRAMA)METODO DE KIRBY-BAUERMetodo de difusao em meio de cultura solido pelo sistema de discos unicos. Padronizado pela OMS em 1977. Caracteristicas necessarias ao meio de cultivo para TSA:- O meio de cultivo, sem enriquecimento, deve sustentar o bom crescimento dos organismos emteste.- Nao deve possuir substancias que antagonizem os antibioticos testados. - Deve ser resistente a mudancas de pH durante o periodo de incubacao. - Deve permitir o acrescimo de sangue quando o organismo em teste exigir.12336495678927- Meio nao deve conter carboidratos fermentaveis porque o pH acido estimula as ciclinas (enquantoque o pH alcalino estimula aminoglicosideos e macrolideos).- O pH do meio deve manter-se entre 7,2 e 7,4.O meio Miller - Hinton satisfaz parcialmente estas exigencias, sendo recomendado por diversos autores. Quando usado para o teste de difusao, deve ser adicionado as placas em quantidade suficiente para que solidifique com uma espessura de 4 mm.MATERIAL: . suspensao bacteriana em caldo ( concentragao: 108 celulas/mL). - E recomendado um inoculo correspondente ao padrao 0,5 da escala de MacFarland. . placa contendo meio de cultura padrao: Agar Mueller-Hinton . cotonete esteril ( para a semeadura) . discos de papel contendo os antimicrobianos ( em concentragoes padronizadas )Escala de MacFarland: Preparar solugao de acido sulfurico a 1%. Preparar solugao aquosa de cloreto de bario a 1,175%. Lentamente, e sob constante agitagao, adicionar as quantidades indicadas a 10 tubos previamente preparados. Fechar os tubos hermeticamente, conservando-os a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. O precipitado de sulfato de bario, quando ressuspendido, corresponde a densidade conferida por cultivo de E. coli em meio liquido, nas concentragoes relacionadas na tabela:0,5 BaCl2(ml ) H2SO4(ml ) Concentraga o (x108/ml) O inoculo pode ser obtido de formas variadas: 1,5 12 15 18 21 24 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,810 0,9 1,09,19,0273028 Selecionar 4 - 5 colonias desenvolvidos em meio solido e que apresentem o mesmo tipo morfologico. Transferir estas colonias para o meio liquido.29Incubar a 35 - 370C ate turvacao visivel (normalmente entre 2 a 8 horas). Ajustar a turvacao com salina esteril ou meio liquido ate a concentracao desejada. Obter suspensao bacteriana em salina esteril ou em meio liquido a partir de colonias que se tenham desenvolvido em meio solido. Utilizar tantas colonias quantas forem necessarias para a obtencao da turvacao visivel. Ajustar a turvacao com salina esteril ou meio liquido ate obter a concentracao desejada. Obs: Esse metodo e recomendado especialmente para bacterias que se desenvolvem com dificuldade em meio liquido.TECNICA: . retirar a suspensao bacteriana contida no tubo com o cotonete , tomando o cuidado de retirar o excesso de caldo , comprimindo a haste contra a parede do tubo; . semear a suspensao na placa contendo o Agar Mueller-Hinton, em tres planos, para que haja crescimento confluente; . deixar a placa secar entreaberta durante no maximo, por 15 minutos, em frente a chama; . colocar os discos de papel com o auxilio de uma pinca flambada, resguardando um espaco de 2 cm do disco para a borda da placa e de 3 cm entre um disco e outro; . esperar de 20 a 30 minutos para que ocorra a difusao do antimicrobiano, antes que o microrganismo comece a se desenvolver; . levar a estufa a 35 ou 37 durante 12 a 18 horas; . apos a incubacao, promover a leitura e interpretacao.OBSERVACOES: OBS: Staphylococcus sp., o periodo de incubacao deve ser prolongado ate 24 horas, visando deteccao de cepas meticilina resistentes (O.R.S.A.). Incubacao em atmosfera de microaerofilia nao e recomendada, uma vez que o CO2 proporciona acidificacao da superficie do meio de cultivo. Organismos que requerem CO2 para seu desenvolvimento devem ser testados (N. gonorrhoeae, N. meningitidis, H. influenzae) no ambiente solicitado, ainda que, idealmente, o procedimento deva ser acompanhado por teste paralelo com cepa padrao.30Leituras: Resultados quantitativos - expressos em concentracao inibitoria minima. Resultados qualitativos - como sensivel, intermediario, resistente. Interpretacao de antibiogramas recomendada pelo NCCLS:Sensivel (S): Uma infeccao por determinada cepa pode ser tratada apropriadamente com dosagem de agente antimicrobiano recomendada para aquela infeccao, salvo qualquer outra contra - indicacao. Intermedial (I): A CIM dos agentes antimicrobianos aproximam-se dos niveis plasmaticos e tissulares habituais. Pode apresentar uma resposta menor que a das cepas sensiveis. Resistentes (R): Cepas nao sao usualmente inibidas por concentracoes sistemicas avaliadas do agente.Staphylococcus sp meticilina - resistente (heterorresistente) O mecanismo de resistencia esta relacionado a alteracao de PBP codificada pelo gene mec A. Cepas com o gene mec A habitualmente sao multirresistentes, e o resultado da resistencia a oxacilina deve ser confirmado. Pesquisa tradicional discos de oxacilina 1 mg. Disco de cefoxitina 30 mg detecta de forma segura todas as classes de MRSA, mesmo cepas que apresentam resistencia a oxacilina em baixos niveis. Reportar como resistente a oxacilina, penicilina, Beta - lactamicos, Beta - lactamicos mais inibidores, cefens, monabactans, carbapenens.Selecao de antimicrobianos:- Antimicrobianos devem ser os mais adequados para o microrganismo isolado e o sitio da infeccao. - Devem ser adequados ao hospital ou a instituicao. - Orientacoes publicadas anualmente pelo NCCLS (National Committee for Clinical LaboratoryStandards).Controle de qualidade:- Utilizacao de cepas padrao para verificacao dos testes. Cepas padrao ATCC (American Type Culture Collection).Exemplos: E. coli ATCC 25922 b - Lactamase negativa para controle de discos para enterobacterias.31Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 -> Controle de discos para detecgao de cepas K. pneumoniae, E. coli, K. oxytoca ESBL (extended spectrum beta lactamase). S. aureus ATCC 25923 Cepa b - Lactamase negativa para controle de discos de Gram positivos.Frequencia do teste de controle de qualidade: Cada novo lote do meio preparado, cada novo lote de antibiotico recebido no laboratorio. Atentar para microrganismos com resistencia intrinseca (microrganismos que, se reportados como resistentes, a identificagao deve ser revista).Guia para realizacao do teste de avaliacao da resistencia pelo metodo de difusao em disco:Microrganismos -nferobacreriasMHMeioInoculo Metodo de crescimento ou inoculo direto Metodo de crescimento ou inoculo direto de meio nao-seletivo 33 a 35C em esrufa aerobia 16 a ISh e 20 ; 24h para S. maltophftitIncubacao de meio nao-seletivo 33 a 35C em esrufa aerobia 16 a 18h e B. cepaciaBacilos gram-negativos r.ao-enterobacterias Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltopbilia e Burkolderia sepacia)Kjphylococcus spp.MHMHInoculo direto de meio nao-seletivo 33 a 35C em esrufa Metodo de crescimento ou inoculo direto de meio nao-seletivo Inoculo direto do meio Inoculo direto do meioaerobia 16 a 18h; 24h para oxacilina e vancomicina 33 a 35C em estufa aerobia 16 a ISh; 24h para vancomicina 33 a 35C em 5% de CO, 16 a 18h 33 a 35C em 5% de CO, 20 a 24h-nterococcus spp.MHaemophilus spp. Neisseria gonorrhoeaeHTGC suplementado com 1% Isovitalex MH + sanguc de carneiro a 5%Streptococcus -neumoniae e outros tsrreptococosInoculo direto do meio33 a 35C em 5% de CO, 20 a 24b32 Cefalosporinas de Cefalosporinas de I1 geracao 31 geracaoPRINCIPAIS CLASSES DE ANTIBIOTICOS SubclassesAminopenicilinas Carboxipcnicilinas Pcnicilina G Oxacilina, meticilina e cloxacina Ampicilina, amoxicilina Carbenicilina, ticarcilina (betalactamicos) Ureidopenicilinas Piperacilina, mezlocilina, azlocilina Amoxicilina/acido clavulanico Ampicilina/sulbactam Ticarcilina/acido clavulanico Piperacilina/tazobactam Cefalotina, cefazolina, cefadroxil"', cefradina!% cefapirina Cefoxitina, cefotetan, cefmetazol de cefalexina*,ClassesPenicilinas (betalactamicos) Penicilinas naturais Penicilinas resistentes a betalactamasesExemplosBetalactamicos + inibidores de betalactamases Cefens Cefamicinas (cefalosporinas de 2- geracao) Cefalosporinas 21 geracaoCefuroxima sodica, cefamandol, cefaclor5", cefetamer', cefproziP", cefuroxima Cefoperazona, cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, ceftizoxima, cefdinir1", cefixima*, cefpodoxima*, ceftibutem*cefonicidi.Cefalosporinas 4 a geracao Monobactam (bctalactamieo) Carbapenens (betalactamico) Aminoglicosfdeos Quinolonas FluoroquinoionasdeCefepima AztreonamImipenem, meropenem, ertapenem Amicacina, gentamicina, netilmicina, estreptomicina, neomicina, canamicina Acido nalidixico, acido piperm'dico Ciprofloxacina, ofloxacina, norfloxacin, levofloxacina, gatifloxacina, sparfloxacir.: lomefloxacina, grepafloxacina, moxifloxacina, gemifloxacina Clindamicina, lincomicina Fosfomicina Rifampicina Eritromicina, azitromicina, roxitromicina, dirrtromicina cIaritromicdr.=. tor:Lincosamidas Fosfomicinas Ansamicinas Macrolideos Glicopeptideos Tetraciclma Fenico! Nitrofurantoina Nitromidazol Estreptogramina Oxazolidinona Inibidores do acido folico CetolideoGlicopeptideo L ip oglicop eptideoTetraciclina, CloranfenicolVancomicina Teicoplanina doxiciclina, Nitrofurantoina Metronidazol Qumupristina/dalfopristma mmociclinaLinezolida Sulfamctoxazol/trimetoprima, trimetoprima Telitromicinasulfonamide33ISOLAMENTO E IDENTIFICACAO DE FUNGOS1 - INTRODUCAO:87-- IMPORTANCIA DO ESTUDO DOS FUNGOSOs fungos sao seres vivos e apresentam uma caracteristica marcante que e a ubiquidade, ou seja, se encontram amplamente disseminados na natureza, onde desempenham efeitos beneficos (manutencao do equilibrio dos diversos ecossistemas, participacao no ciclo de vida na terra, fertilizacao do solo, etc.) e maleficos (causando doencas e deteriorando alimentos e materiais) para a humanidade. Ressalta-se tambem a utilizacao desses microrganismos em industrias de alimento e bebidas (queijo, pao, vinho, cerveja, etc.), farmaceutica (antibioticos, hormonios, alucinogenos) e quimica (enzimas, acidos organicos, vitaminas, pigmentos, etc.). Os fungos sao tambem largamente usados como ferramentas em pesquisa basica de genetica, fisiologia, bioquimica, entre outras. O habitat natural desses microrganismos e bastante variado, permitindo classifica-los como anemofilos (fungos do ar), geofilicos ou teluricos (do solo), aquaticos (da agua), zoofilicos (de animais), antropofilicos (do homem) e fitofilicos (de vegetais). Portanto, e possivel promover o isolamento desses microrganismos de qualquer um destes locais, ou de materiais como madeira, couro, alimentos e detritos de um modo geral. Para isto, e necessario que sejam fornecidas condicoes ambientais e nutrientes adequados para promover o desenvolvimento destes microrganismos nos meios de cultura.88-- FINALIDADES DO ISOLAMENTOSao varias as situacoes onde se faz necessario o isolamento dos fungos:- Estudo da microbiota fungica de determinada regiao. - Avaliacao de poluicao ambiental. - Determinacao do grau de contaminacao de determinados ambientes. - Verificacao de contaminacao de alimentos e medicamentos. - Obtencao de amostras de interesse industrial. - Diagnostico etiologico de micoses. - Obtencao de amostras para o preparo de antigenos. - Estudo da correlacao de alergia com a presenca de fungo no ambiente. 89-- OBJETIVO DAS AULASApresentar as tecnicas mais utilizadas em micologia, discutindo a metodologia de isolamento e identificacao de fungos. Para tal, usaremos um modelo de estudo dos fungos anemofilos, que pode ser adaptado para outras investigacoes.342 - ISOLAMENTO DOS FUNGOS90-- SEMEADURA EM MEIOS DE CULTURA 91-Meio de cultura mais utilizado: Agar SabouraudComposigao quimica: agua, agar-agar, peptona, dextrose ou maltose, pH: acido (em torno de 5.6)92-Outros meios de cultura utilizados em micologia: - Agar Mycosel - este meio apresenta composigao quimica semelhante ao Agar Sabouraud,porem acrescido de antimicrobianos (Cloranfenicol - antibacteriano e Cicloheximida ou Actidione inibidor docrescimento de fungos saprofitas), sendo muito utilizado no isolamento de fungos patogenicos. O AgarMycosel e um meio seletivo para isolamento de fungos patogenicos.- DTM - meio seletivo e indicador utilizado no isolamento de dermatofitos.- Czapeck-Dox - utilizado no isolamento de fungos presentes em escarro e outras secregoes ( tem substantias que fluidificam o muco).- Chlamydospore agar - utilizado para induzir a formagao de clamidosporos. - Agar fuba, agar arroz, agar batata - meios pobres, mas ricos emcarboidratos que estimulam a esporulagao, sendo usados no microcultivo93-- CONDICOES DE INCUBACAO: - Temperatura: - ambiente- para os fungos dimorficos: 1 tubo a 37C e outro a temperatura ambiente.- Atmosfera: aerobiose - Tempo: fungos saprofitas - em torno de 3 dias ( 3 a 7 dias)fungos patogenicos - de 5 a 30 dias94-- ACOMPANHAMENTO DO DESENVOLVIMENTO E ANALISE DA COLONIA3 - IDENTIFICACAO DE FUNGOS A identificagao dos fungos se baseia principalmente em caracteristicas morfologicas (macro e microscopicas), reprodutivas e metabolicas.3.1 - CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS Na analise da morfologia colonial varias caracteristicas devem ser observadas como: aspecto da colonia, cor, bordos, superficie, consistencia, presenga de protuberancia e sulcos.3595-- CARACTERISTICAS MICROSCOPICASNesta observacao devemos analisar nao apenas a micromorfologia como tambem aspectos relacionados a reproducao dos fungos. Verifica-se, portanto, se o microrganismo e uni ou multicelular, a forma e tamanho das celulas, a presenca de hifas, de celulas leveduriformes e de pseudo-hifa, se a hifa e septada ou cenocitica, a presenca de estruturas facultativas (capsula, rizoides e haustorios), o tipo de reproducao e o aspecto dos esporos e do corpo de frutificacao.96-- CARACTERISTICAS METABOLICAS (OU BIOQUlMICAS)Sao varias as provas de identificacao de fungos que se baseiam em aspectos metabolicos. Dentre elas podemos citar o zimograma (prova de fermentacao de carboidratos), o auxanograma (prova de assimilacao de carboidratos e de compostos nitrogenados) e pesquisa de enzimas (urease, por exemplo). Estas provas bioquimicas (principalmente zimograma e auxanograma) sao indispensaveis na identificacao de leveduras.97-- OUTRAS PROVAS DE IDENTIFICACAO. Tubo germinativo . Termotolerancia . Dimorfismo . Perfuracao do pelo . Sensibilidade a cicloheximida4 - TIPOS DE EXAMES MICROSCOPICOS:98-- COLORACAO DE GRAMEsta coloracao, muito utilizada na bacteriologia, permite tambem a observacao microscopica dos fungos, desde que a colonia ou o material a ser analisado permita a confeccao e fixacao de esfregaco, conforme recomendado para tal metodo. Os fungos sao Gram positivos, ou seja, se coram de roxo.99-- TRATAMENTO PELA POTASSA ( KOH )Este e o procedimento mais utilizado para exame direto de especimes clinicos (escamas de pele, pelos, fragmentos de unha, escarro, secrecoes, etc.). O hidroxido de potassio (usado em concentracoes de 20 a 40%) e uma substantia clareadora que digere os elementos tissulares, permitindo uma melhor visualizacao das estruturas fungicas (hifas, celulas leveduriformes, esporos).36100-- COLORACAO COM TINTA NANQUIMA tinta nanquim ou tinta da China e um corante utilizado para verificagao da presenga de capsula (que nao se cora). Ex: Cryptococcus neoformans, Rhodotorula.101-- COLORACAO COM LACTOFENOL DE AMANN OU AZUL DE ALGODAOO lactofenol e o corante mais utilizado para observagao microscopica de fungos, apos o seu desenvolvimento em meios de cultura. Na sua composigao quimica encontramos: agua, fenol, acido latico, glicerina e azul de algodao (ou de metila). O estudo da micromorfologia dos fungos, corado pelo lactofenol, pode ser realizado basicamente atraves de 2 tecnicas: retirada de fragmentos de colonia e o microcultivo. A tecnica do microcultivo (ou cultura em lamina) pode ser realizada em uma placa de Petri contendo uma lamina sobre um suporte de vidro. Esta vidraria e previamente esterilizada e sobre a lamina coloca-se um bloco (um cubo) do meio de cultura. Geralmente se usa o agar batata para o estudo dos bolores e agar fuba para leveduras. O fungo a ser analisado e entao repicado para o pedago de meio de cultura e coberto com laminula. Para se criar um ambiente umido, coloca-se um pouco de agua destilada esteril dentro da placa, que e incubada a temperatura ambiente. Apos 15 dias, ou quando houver um bom desenvolvimento do fungo no meio de cultura (inclusive na laminula), retira-se a laminula que devera ser colocada sobre uma outra lamina com 1 gota de lactofenol e observada ao microscopio, no menor, medio e maior aumento.102-- EXAME COM FITA DUREXEsta tecnica permite a colheita de material e observagao microscopica de casos de pitiriase versicolor (micose de pele causada pela levedura Malassezia furfur).103-- EXAME HISTOPATOLOGICOOs exames histopatologicos sao de grande relevancia no diagnostico de doengas infecciosas e permitem a detecgao de fungos nos tecidos. 5- ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NAS AULAS PRATICAS SOBRE ISOLAMENTO E IDENTIFICACAO DE FUNGOS ANEMOFILOS. Observagao de exposigao sobre fungos . Descrigao da morfologia colonial: Os alunos deverao observar todas as colonias expostas, procurando analisar as semelhangas e diferengas entre os mesmos tipos morfologicos. A seguir, escolher uma colonia de bolor e uma de levedura (da nossa micoteca) e anotar as principais caracteristicas de cada uma, fazendo a diferenciagao entre elas.37A tabela de identificacao macromorfologica dos fungos (em anexo) podera servir de base para tal descricao.. Observacao da micromorfologia Os alunos deverao fazer observacao microscopica dos fungos focalizados, analisando as caracteristicas e diferencas de micelio, orgaos de reproducao (corpo de frutificacao) e esporos. Anotar (ou desenhar) as caracteristicas observadas. Correlacionar os dados da micromorfologia dos fungos focalizados com os tipos expostos em culturas. Muitos fungos expostos nas culturas estao igualmente focalizados nos microscopios.Coleta de material Os alunos deverao escolher um ambiente para investigar a presenca de fungos anemofilos. Neste local, as placas de Petri contendo agar Sabouraud deverao ser abertas e expostas ao ar, por aproximadamente 15 minutos. Em seguida, as placas serao fechadas, identificadas e incubadas a temperatura ambiente.. Acompanhamento do desenvolvimento de colonias Os alunos deverao retornar ao laboratorio todos os dias para acompanhar o experimento e verificar se esta havendo crescimento de colonias de fungos na superficie dos meios de cultura. Anotar o tempo de crescimento, o numero e variedade de colonias. Comparar com a de outros colegas e tentar determinar possiveis diferencas ou semelhancas. . Descricao da morfologia colonial: ( dos isolados em sua placa): Apos o desenvolvimento dos fungos no meio de cultura, escolher uma colonia e descrever a sua macromorfologia.. Descricao da micromorfologia: A colonia de fungo anemofilo escolhida sera agora analisada sob o aspecto microscopico, utilizando a tecnica de fragmento de colonia. Com a agulha de platina flambada e fria, raspar a superficie da colonia escolhida para obter pequenos fragmentos. Estes serao colocados sobre uma lamina, juntamente com 1 gota de lactofenol e cobertos por laminula. Em seguida, observar ao microscopio no menor, medio e maior aumento. Anotar (ou desenhar) as caracteristicas observadas. Estes dados poderao permitir a identificacao do fungo escolhido.. DESCRICAO FINAL DO FUNGO ESCOLHIDO: Baseando-se na analise da macro e micromorfologia do fungo por sua equipe escolhido, de sua descricao final, e se possivel, o genero a que este fungo pertence.38TABELA DE IDENTIFICACAO MACROMORFOLOGICA DOS FUNGOS104-Micelio ( aspecto macroscopico ):( ) leveduriforme (levedura) ( ) aereo ( o que se projeta acima do meio de cultura) meio de cultura) ( ) filamentoso (bolor) ( ) rasteiro (o que cresce sobre ou abaixo do105-Cor da colonia:.......................................................................... 106-Presenca de pigmento: ( reverso da colonia - verso da placa).............................................................. 107-Bordos: ( ) inteiro( ) ondulado ( ) franjado ( ) encrespado ( ) liso ( ) arredondado5- Superficie: ( ) lisa( ) rugosa( ) cerebriforme ( ) coriacea ( ) algodonosa ( ) concentrica ( ) opaca ( ) aveludada( ) mucoide ( ) cremosa( ) brilhante ( ) pulverulenta ( ) pastosa108-Sulcos: ( ) presentes 109-Tipo: ( ) seca( ) umida( ) ausentes110-Protuberancia central: ( ) presente 111-Elevacao: ( ) achatada( ) ausente ( ) amontoada( ) levantada112-Reverso da colonia:............................................................................. 113-Morfologia colonial final apos a identificacao:......................................OBS: Esta tabela tem por finalidade orienta-lo na verificacao das principais caracteristicas macromorfologicas que deverao ser observadas. Entretanto, nao significa que a colonia que voce deseja identificar tenha todos os itens descritos acima, e alem disto, para cada item podera ser observada mais de uma caracteristica. (por exemplo: a superficie de uma colonia podera ser ao mesmo tempo: lisa, pastosa e brilhante).