MICROBIOLOGIA GENERAL
MICROBIOLOGIA GENERALUNP
COLORACIONES
I. INTRODUCCION El tamao de la mayora de las clulas bacterianas
es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La
principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el
medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste
es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para
distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como
flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad
respiratoria, etc.Las clulas generalmente son tratadas para
coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin.
Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque
tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido,
cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante,
no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma.
La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas
sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y
siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce
habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el
contrario, hace que las clulas aparezcan mayores de lo que son
realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido
fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora
de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna
afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes
utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente
(cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y
los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el
azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros
colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se
combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente,
tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la
fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son
sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan
con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para
revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un
ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos
colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada
con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta
sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido
tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo
altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se
desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la
microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin.
El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre
todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color
tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente
til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales,
puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. La
tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual:
las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio
que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas.
La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco
que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una
suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un
colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo
satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la
microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la
presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianasLos mtodos
de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de
colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen
estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones
completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales
estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas
precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos
equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente
existente.
Marco tericoLosmordientes, aunque no son colorantes, tienen gran
importancia en algunas tcnicas de tincin. Los mordientes
intensifican la tincin porque aumentan la afinidad de la clula por
el colorante. Tambin se pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los
flagelos, que debido a su delgadez no podran ser visualizados de
otra forma,Existen tres tipos de tcnicas de tincin: simples,
diferenciales y especficas:Tinciones simples:En lastinciones
simplesse usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico. Se
utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas
absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Por tanto,
la tincin simple mejora la observacin de la clula completa. Se fija
el espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para
que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparacin ya
est lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente, hay que
aadirlo justo antes del colorante.Tinciones
diferenciales:Lastinciones diferencialesse utilizan para distinguir
entre tipos de microorganismos. La tcnica de tincin diferencial
consta de dos etapas: unatincin primaria(siguiendo el mismo mtodo
que en una tincin simple) seguida de una tincin de contraste. En la
tincin de contraste se utiliza otro colorante que tie (y por tanto,
revela) las clulas no teidas por el primer colorante. Estas
tinciones son muy utilizadas en microbiologa. Por ejemplo, la
tincin de Gram y la tincin de cido-alcohol resistencia, ambas
aplicadas a bacterias.La tincin de GramLa tcnica de la tincin
deGramfue desarrollada por el bacterilogo dans Christian Gram en
1884. Esta tincin clasifica las bacterias en dos grupos:Gram
positivas y Gram negativasLa tcnica incluye tincin primaria,
decoloracin y tincin de contraste:
1. Se tie el espcimen con el primer colorante, cristal violeta,
que tie de violeta.2. Se aade el mordiente, yodo.
3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solucin de
acetona o etanol. En este momento, las bacterias Gram negativas
pierden su tincin violeta, pero las Gram positivas retienen el
colorante.
4. Como colorante de contraste se aade safranina, que tie de
rosa las bacterias Gram negativas, previamente decoloradas;
mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un
color violeta ms intenso.Una tincin acido-alcohol se realiza segn
los siguientes pasos
1. Tincin primaria con fucsina bsica, que tie todas las clulas
de rojo.2. Calentamiento suave de la preparacin para facilitar la
penetracin del colorante en el interior de la clula.3. Decoloracin
con una solucin de cido clorhdrico en etanol. Este decolorante
elimina la fucsina de todas las clulas excepto de las micro
bacterias, que la retienen debido a su superficie crea.
4. Coloracin de contraste con azul de metileno. Se tien de azul
todas las clulas previamente decoloradas, lo que facilita la
diferenciacin entre las clulas deMycobacterum,an teidas de rojo, v
las clulas restantes del espcimen.
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap305.htm
Objetivos Reconocer los dos grandes grupos de bacterias
existentes por el mtodo de coloracin diferencial. Demostrar la
tincin de las esporas en contraste en una clula vegetativa.
II. MATERIALES Y METODOS Materiales Coloracin de Gram Cultivo
Escherichia Coli y Streptococcus. Porta objetos. Cristal violeta.
Lugol. Alcohol-cetona. Safranina. Microscopio.Coloracin de esporas
Verde de malaquita. Safranina. Pinzas de madera Mechero de alcohol
Microscopio. Asa de kelle
Mtodos Coloracin de Gram Colocar un medio liquido con bacterias
sobre un porta objetos limpio, en caso de que tratarse de una
muestra solida colocar previamente una gota de agua destilada
estril sobre el portaobjetos y extender la muestra. Fijar la
muestra al aire o pasndola por encima de la llama de un mechero.
Despus de la fijacin de la muestra cubrirla con la solucin de
cristal de violeta. Lavar con agua a chorro Cubrir con lugol i
dejar actuar de 2 a 3 minutos. Lavar. Decolorar con el
alcohol-cetona hasta que se desprenda el colorante de la lmina.
Lavar. Contrastar con safranina d30 segundos. Lavar, secar y
observar.
Coloracin diferencial de esporas. Hacer la extensin bacteriana y
fijar al color. Aadir verde de malaquita. Calentar sin hervir hasta
el desprendimiento de vapor por 3 veces. Lavar. Agregar safranina.
Lavar secar y observar.
III. RESULTADOSColoracin de Gram ESCHERICHIA COLI Despus de la
coloracin se observ al microscopio y se vio que los grmenes han
cedido al color rojo por accin del alcohol-cetona y por haber
quedado sin coloracin han estado aptos para tomar el segundo color
que es el rojo por lo tanto son GRAM NEGATIVO.
STREPTOCOCCUSDespus de la coloracin se observ al microscopio y
se vio que los grmenes han quedado teidos de color azul por los que
son GRAM POSITIVOS
Coloracin diferencial de esporas BACILLUS SUBTILLUS.Despus de la
coloracin se observ al microscopio y se vio la formacin de esporas
que eran de color verde y la presencia de clulas vegetativas que
eran de color rojo.
IV. DISCUSIONES La tincin de Gram es la tincin diferencial ms
utilizada de forma rutinaria y prcticamente la primera prueba a la
que se someten las muestras de cualquier origen antes de su
estudio. Proporciona una informacin esencial, adems de sobre la
forma, tamao y agrupacin celular, como es el tipo y composicin de
la pared que presentan las bacterias. La tincin de Gram divide a
las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos:
bacterias con pared de tipo gram positiva y bacterias con pared de
tipo gram negativa. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas
tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la
estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula
bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como
para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular
bacteriana que confiere rigidez es el pptidoglicano. La pared de la
clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de pptidoglicano as como algo de cido teicoico.
TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L. 2007. Introduccin a la
Microbiologa, 9 Ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires.
Argentina.La tincin de Gram como qued demostrado en el laboratorio
y como se confirma en el anterior prrafo, sirve para diferenciar si
las bacterias son gram + o gram -, por lo cual se debe realizar los
pasos bsicos a aplicar sobre la muestra para determinar en qu
categora se encuentra y estos pasos fueron explicados en clase, con
lo cual se puede afirmar que su uso es universal y que ninguno
varia, ya que se sigue el mismo orden especfico. Se puede concluir,
que gracias a esta tincin se pueden dividir las bacterias en dos
grandes categoras ya antes mencionadas, y por ende se puede saber
las caractersticas que posee cada grupo, y gracias a estas se puede
reconocer al momento de la realizacin del experimento, con qu tipo
de bacteria se est trabajando.Algunos gneros bacterianos, entre los
que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas
de resistencia denominadas esporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los
nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos,
etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar
el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la
espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora
germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de
germinar perdura durante aos. La tincin especfica de esporas
requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2.-
Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en
el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn
teidas con el segundo colorante. GAMAZO, C.; LPEZ-GOI, I., R. DAZ.
2005. Manual prctico de microbiologa. Masson. BarcelonaComo se
entiende del anterior prrafo existe un mtodo para poder observar
las esporas, el cual fue explicado en el laboratorio, con lo que se
puede concluir que este mtodo se aplica de forma universal, y que
sus componentes o sus pasos a seguir y los materiales a utilizar,
son los mismos que se expusieron y se realizaron en clase.
V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS
TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L. 2007. Introduccin a la
Microbiologa, 9 Ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires.
Argentina. GAMAZO, C.; LPEZ-GOI, I., R. DAZ. 2005. Manual prctico
de microbiologa. Masson. Barcelona
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap305.htm
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