Microbiología Prescott Capítulo 6

CAPITULO 6 Crecimiento microbiano

Los filtros de membrana se utilizan en el recuento de microorganismos. Este filtro ha sido utilizado para determinar el nmero de unidades formadoras de colonias; aparecen coloreadas gracias al indicador de pH empleado, facilitndose su recuento.

ndice 6.1 Curva de crecimiento 119

Fase de latericia (Lag) 119 Fase exponencial 120 Fase estacionaria 121 Fase de muerte 121 Expresin matemtica del crecimiento 121

6.2 Determinacin del crecimiento microbiano 124

Determinacin del nmero de clulas 124

Determinacin de la masa celular 125

6.3 Cultivo continuo de microorganismos 127

Quimiostato 127 Turbidostato 128

6.4 Influencia de los factores ambientales en el crecimiento 128

Solutos y actividad del agua 128

pH 131 Temperatura 132 Concentracin de oxgeno 135 Presin 137 Radiacin 137

6.5 Crecimiento microbiano en ambientes naturales 139 Limitacin del crecimiento por

factores ambientales 139 Recuento de formas vegetativas viables pero no cultivables de procariotas 140 Quorum sensing y poblaciones microbianas 141

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6.1 Curva de crecimiento 119

Conceptos 1. El crecimiento de un microorganismo se define como el aumento de sus

componentes celulares, que puede tener como resultado un incremento de su (amao o del nmero de su poblacin, o de ambos.

2. Cuando los microorganismos crecen en un sistema cerrado, el crecimiento de la poblacin permanece en fase exponencial durante tan slo unas pocas generaciones, pasando a una fase estacionaria debido a factores como la limitacin de nutrientes y la acumulacin de residuos. En un sistema abierto, donde se renuevan continuamente los nutrientes y se eliminan los residuos, la fase exponencial puede mantenerse durante perodos largos.

3. Se pueden emplear diversas tcnicas para estudiar el crecimiento microbiano, midiendo los cambios observados en el nmero total de clulas, la poblacin de microorganismos viables o la masa celular.

4. La disponibilidad de agua, el pH, la temperatura, la concentracin de oxgeno, la presin atmosfrica, la radiacin y muchos otros factores ambientales influyen sobre el crecimiento microbiano. Sin embargo, muchos microorganismos y, en particular, las bacterias, han conseguido adaptarse y desarrollarse en condiciones ambientales extremas que destruiran a la mayora de los organismos superiores.

5. En el entorno natural, a menudo el crecimiento se ve severamente limitado por los nutrientes disponibles y otros muchos factores ambientales.

6. Las bacterias se pueden comunicar entre s y conducirse de una forma cooperativa mediado por seales dependientes de la densidad de poblacin.

n el Captulo 5 se ha hecho hincapi en la necesidad que tienen los microorganismos de disponer de una fuente de energa y de materias primas esenciales

para elaborar los componentes celulares. Todos los microor-ganismos necesitan carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno, azufre, fsforo y diversos minerales; muchos precisan tam-bin uno o ms factores de crecimiento especiales. La clula capta estas sustancias mediante procesos de transporte a tra-vs de membrana, siendo los ms importantes: la difusin facilitada, el transporte activo y la translocacin de grupo. Las clulas eucariotas utilizan tambin la endocitosis.

Este captulo tratar ms directamente sobre el creci-miento que tiene lugar en presencia de un aporte adecuado de nutrientes. En primer lugar, se describe la naturaleza del crecimiento y las formas de medirlo, para, posteriormente, tratar las tcnicas del cultivo continuo. Finalmente, se dis-cutir la influencia de los factores ambientales sobre el cre-cimiento microbiano.

El crecimiento puede definirse como un incremento en los constituyentes celulares; este crecimiento ocasiona un aumento del nmero de clulas en el caso de los microorga-nismos que se multiplican por procesos como gemacin y fisin binaria. En el ltimo caso, clulas individuales se agrandan y dividen para originar dos clulas hijas de un tamao aproximadamente igual. Si el microorganismo es

cenoctico esto es, multinucleado, en el que las divisiones nucleares no se acompaan de divisiones celulares el cre-cimiento produce un incremento de tamao, pero no del nmero de clulas. No suele ser conveniente investigar el crecimiento y la multiplicacin de microorganismos indivi-duales debido a su pequeo tamao. En consecuencia, los microbilogos, cuando estudian el crecimiento, sealan nor-malmente los cambios observados en el nmero total de la poblacin. Ciclo celular (pp. 91; 307-308).

6.1 Curva de crecimiento

El crecimiento de una poblacin microbiana se estudia ana-lizando la curva de crecimiento de un cultivo microbiano. Cuando los microorganismos se cultivan en un medio lqui-do, normalmente se trata de un cultivo discontinuo o en sis-tema cerrado esto es, se incuban en un tubo de ensayo cerrado al que no se aade ms cantidad de medio que la ini-cial; en consecuencia, las concentraciones de nutrientes disminuyen y las de residuos aumentan. Se puede represen-tar el crecimiento de los microorganismos que se multipli-can por fisin binaria como el logaritmo del nmero de clu-las frente al tiempo de incubacin. La curva resultante tiene cuatro fases diferentes (Figura 6.1).

Fase de latencia (lag)

Cuando se introducen microorganismos en un medio de cul-tivo fresco, normalmente no se produce un aumento inme-diato del nmero de clulas o de masa y, por ello, este pero-do se denomina fase de latencia (lag). Aunque la divisin celular no se produce inmediatamente y no hay un incre-mento neto de masa, es un proceso activo, la clula est sin-tetizando nuevos componentes. Una fase de latencia previa

Tiempo *-

Figura 6.1 Curva de crecimiento microbiano en un sistema

cerrado. Las cuatro fases estn identificadas en esta curva y descritas en el texto.

E

120 Captulo 6 Crecimiento microbiano

al comienzo de la divisin celular puede ser necesaria por diversas razones. Las clulas pueden ser viejas y poseer can-tidades reducidas de ATP, cofactores esenciales o de riboso-mas; estas sustancias deben sintetizarse antes de que se ini-cie el crecimiento. El medio puede ser diferente al anterior donde crecan los microorganismos; en este caso, necesitar nuevas enzimas para usar esos otros nuevos nutrientes. Por ltimo, tambin es posible que los microorganismos se hayan alterado y necesiten un tiempo de recuperacin. Cual-quiera que sea el motivo, durante la fase de latencia las clu-las se equipan de nuevo, replican su DNA, comienzan a incrementar su masa y por ltimo, se dividen.

La duracin de la fase de latencia vara considerable-mente segn el estado de los microorganismos y la naturale-za del medio. Esta fase puede ser bastante larga si el inoculo procede de un cultivo viejo o de uno que haya sido refrigera-do. La inoculacin de un cultivo en otro qumicamente dife-rente resulta tambin en una fase de latencia mayor. En este mismo sentido, cuando se transfiere un cultivo en fase de crecimiento exponencial a un medio nuevo de la misma composicin, la fase de latencia se acorta o no se produce.

Fase exponencial

Durante la fase exponencial o logartmica (log), los micro-organismos crecen y se dividen hasta el nivel mximo posi-ble, en funcin de su potencial gentico, el tipo de medio y las condiciones en que crecen. La velocidad de crecimiento es constante durante la fase exponencial; esto es, los micro-organismos se duplican en nmero a intervalos regulares. No existe sincronizacin, cada clula se divide en un momento ligeramente diferente del resto, por ello, la curva de crecimiento aumenta suavemente, en lugar de realizar saltos discretos (Figura 6.1). Durante esta fase, la poblacin es ms uniforme, qumica y fisiolgicamente; por ello, los cultivos en fase exponencial se utilizan normalmente en estudios bioqumicos y fisiolgicos.

El crecimiento exponencial es un crecimiento equili-brado. Es decir, todos los constituyentes celulares se produ-

cen a una velocidad constante, unos respecto de otros. Si se modifican las concentraciones de nutrientes o las condicio-nes ambientales, se origina un crecimiento desequilibrado. Se denomina as porque las velocidades de sntesis de los componentes celulares varan entre s, hasta que se alcanza un nuevo estado de equilibrio. Esta respuesta se observa fcilmente en un experimento en el que se inoculan bacte-rias desde un medio pobre en nutrientes a otro ms rico (shift-up). Las clulas, en primer lugar, producen nuevos ribosomas para aumentar su capacidad de sntesis de prote-nas. Esta fase se contina con un obvio incremento en la concentracin de protenas y sntesis de DNA. Finalmente, tiene lugar el aumento esperado de la velocidad de multipli-cacin. Sntesis de protenas y DNA (secciones 11.3 y 12.2).

Tambin se produce un crecimiento desequilibrado cuando se pasa una poblacin bacteriana de un medio rico en nutrientes a otro ms pobre (shift-dowr). En el medio rico de origen, los microorganismos probablemente habrn obtenido directamente del medio muchos de los componen-tes celulares esenciales. Cuando se cambian a un medio ina-propiado nutricionalmente, necesitan tiempo para elaborar las enzimas que se precisan para realizar la biosntesis de los nutrientes no disponibles. En consecuencia, la divisin celu-lar y la replicacin del DNA continan despus de la trans-ferencia entre medios, pero la sntesis neta de protenas y RNA es ms lenta. Las clulas disminuyen de tamao y modifican su metabolismo hasta que sean capaces de crecer de nuevo; se reanuda el crecimiento equilibrado y el cultivo entra en la fase logartmica. Regulacin de la sntesis de los cidos nucleicos (pp. 296-305).

Estos dos tipos de experimentos {shift-up y shift-dowr) demuestran que el crecimiento microbiano se encuentra bajo un control preciso y coordinado, respondiendo rpidamente a cambios nutricionales y en las condiciones ambientales.

Cuando el crecimiento microbiano est limitado por la baja concentracin de un nutriente esencial, el crecimiento neto final o rendimiento celular aumenta con la cantidad ini-cial de dicho nutriente limitante (Figura 6.2a). ste es el fun-damento de los ensayos microbiolgicos para cuantificar vitaminas y otros factores de crecimiento. La velocidad de

Figura 6.2 Concentracin de nutriente y crecimiento, (a) Efecto de los cambios en la concentracin de un nutriente limitante sobre el rendimiento celular. A una concentracin suficientemente alta, el rendimiento se estaciona, (b) Efecto sobre la tasa de crecimiento.


crecimiento tambin aumenta con la concentracin de nutrientes (Figura 6.2b), aunque de forma hiperblica, muy semejante a la observada con muchas enzimas {vase la Figu-ra 8.17). La forma de la curva parece reflejar la tasa de inte-raccin de los nutrientes con las protenas transportadoras microbianas. Con niveles suficientemente altos de nutrientes, los sistemas transportadores estarn saturados, por lo que la tasa de crecimiento no aumentar a pesar de incrementarse la concentracin de nutrientes. Ensayos microbiolgicos (p. 103); Sistemas de transporte de nutrientes (pp. 104-109).

Fase estacionaria

Finalmente, el crecimiento de la poblacin cesa y la curva de crecimiento se hace horizontal (Figura 6.1). Las bacterias llegan normalmente a la fase estacionaria cuando la con-centracin es de, aproximadamente, 109 clulas por mL. Otros microorganismos no alcanzan normalmente esta den-sidad de poblacin; los cultivos de protozoos y algas no sue-len sobrepasar concentraciones de 106 clulas por mL. El tamao final de la poblacin depende, por supuesto, de la disponibilidad de nutrientes y otros factores, as como del tipo de microorganismo que se cultive. En la fase estaciona-ria, el nmero total de microorganismos viables permanece constante. Este hecho puede ser el resultado del equilibrio entre la divisin y la muerte de las clulas o, simplemente, que la poblacin deje de dividirse, aunque siga metablica-mente activa.

Las poblaciones microbianas entran en fase estacionaria por varias razones. Un factor obvio es la limitacin de nutrientes; si se reduce drsticamente la concentracin de un nutriente esencial, la poblacin crecer muy lentamente. Los organismos aerobios estn limitados a menudo por la dispo-nibilidad de O2. El oxgeno no es muy soluble y puede redu-cirse tan rpidamente que slo la superficie del cultivo tenga una concentracin de O2 adecuada para el crecimiento. En este caso, las clulas situadas por debajo de la superficie no podrn crecer, salvo que el cultivo se agite o airee de otra forma. El crecimiento de una poblacin puede tambin cesar debido a la acumulacin de productos residuales txicos. Parece que este factor limita el crecimiento de muchos culti-vos anaerobios (cultivos que crecen en ausencia de O2). Por ejemplo, los estreptococos pueden producir a partir de la fermentacin de azcares altas concentraciones de cido lctico y otros cidos orgnicos, que acidificarn su medio, inhibiendo el crecimiento. Finalmente, hay evidencias que indican que el crecimiento puede cesar cuando se alcanza un cierto nivel crtico poblacional. En definitiva, un cultivo est en fase estacionaria como consecuencia de varios factores que actan conjuntamente.

Como acabamos de ver, las bacterias en un cultivo dis-continuo pueden entrar en fase estacionaria en respuesta al estrs nutricional, hambre. Probablemente, esto ocurre en la naturaleza ya que numerosos ambientes tienen muy bajos niveles de nutrientes. Sin embargo, el hambre puede ser una

experiencia positiva para la bacteria. Algunas responden con cambios morfolgicos muy significativos, como la forma-cin de endosporas. La mayora, simplemente disminuyen su tamao, normalmente acompaado de una reduccin del protoplasto y condensacin del nucleoide, y se producen cambios significativos a nivel de la expresin gnica y fisio-lgicos. Las bacterias en condiciones de estrs nutricional producen frecuentemente una serie de protenas del ham-bre, que las hacen mucho ms resistentes al dao por dife-rentes mecanismos. Incrementan los puentes cruzados del peptidoglicano y, por consiguiente, la fuerza intrnseca de la pared celular. Se producen protenas que se unen y protegen al DNA (Dps, DNA-binding proteins from tarved cells). Chaperonas protegen a las protenas de su desnaturalizacin, adems de recuperar el estado nativo de protenas daadas. Como consecuencia de estos y muchos otros mecanismos, las clulas en condiciones de hambre se vuelven ms resis-tentes a la destruccin por el hambre en s mismo y a otros factores, como compuestos qumicos txicos, como el cloro. Estos cambios son tan efectivos que algunas bacterias pue-den sobrevivir en estas condiciones de estrs nutricional durante aos. Obviamente, estas consideraciones tienen una enorme implicacin prctica en medicina y en la industria. Hay evidencias de que Salmonella typhimurium y algunos otros patgenos se vuelven ms virulentos cuando pasan hambre.

Fase de muerte

Cambios ambientales perjudiciales, como privacin de nu-trientes y acumulacin de residuos txicos, originan la dismi-nucin del nmero de clulas viables, hecho que caracteriza la fase de muerte. La muerte de una poblacin microbiana, al igual que su crecimiento durante la fase exponencial, es normalmente logartmica (esto es, una cantidad constante de clulas muere cada hora). Este modelo se mantiene incluso aunque se observe que el nmero total de clulas permanece constante, ya que las clulas no se Usan inmediatamente des-pus de morir. A menudo, la nica forma de decidir si una bacteria es viable consiste en incubarla en un medio fresco; si no crece ni se multiplica, se considera que est muerta. Es decir, la muerte microbiana se define como la prdida irre-versible de la capacidad de multiplicarse.

Aunque la mayor parte de una poblacin microbiana normalmente muere de forma logartmica, la velocidad de mortalidad puede disminuir despus de reducirse drstica-mente la poblacin. Esto se debe a la supervivencia prolon-gada de clulas particularmente resistentes. Por stas y otras razones, la curva de la fase de muerte puede ser compleja.

Expresin matemtica del crecimiento

El conocimiento de la velocidad de crecimiento microbiano durante la fase exponencial es indispensable para los micro-


bilogos. Los estudios sobre la velocidad de crecimiento contribuyen a la investigacin bsica en fisiologa y ecolo-ga, y a la solucin de problemas aplicados industriales. En consecuencia, se van a analizar los aspectos cuantitativos del crecimiento de fase exponencial.

Durante la fase exponencial, cada microorganismo se divide a intervalos constantes. Por ello, la poblacin dupli-car su nmero durante un perodo determinado de tiempo, denominado tiempo de generacin o de duplicacin. Esta situacin puede ilustrarse con un ejemplo sencillo. Suponga-mos que se inocula un tubo de ensayo con una clula que se divide cada 20 minutos (Tabla 6.1). La poblacin ser de 2 clulas despus de 20 minutos, de 4 clulas a los 40 minu-tos, y as sucesivamente. Como la poblacin se duplica en cada generacin, el incremento de la poblacin ser expo-nencial o logartmico, igual a 2n, donde n es el nmero de generaciones (Figura 6.3).

Estas observaciones pueden expresarse en ecuaciones para determinar el tiempo de generacin.

La velocidad de crecimiento durante la fase exponencial en un cultivo discontinuo puede expresarse por la constante de

Figura 6.3 Crecimiento microbiano exponencial. En esta figura se han representado grficamente los datos de la Tabla 6.1 para seis generaciones, en forma lineal () y logartmica (=). La curva de crecimiento es exponencial, como muestra la linealidad de la grfica logartmica.

velocidad de crecimiento (k). Equivale al nmero de gene-raciones por unidad de tiempo, expresado a menudo como generaciones por hora.

Tabla 6.1 Ejemplo de crecimiento exponencial Nmero Poblacin Tiempo" de divisiones 2* (No* 2") logio N,

0 0 2" = 1 1 0.000 20 1 2' = 2 2 0.301 40 2 22 = 4 4 0.602 60 3 23 = 8 8 0.903 80 4 2" = 16 16 1.204

100 5 25 = 32 32 1.505 120 6 26 = 64 64 1.806

a El cultivo hipottico comienza con una clula con un tiempo de generacin de 20 minutos.

A partir de las frmulas anteriores se puede calcular el tiem-po que tarda una poblacin en duplicar su nmero esto es, el tiempo medio de generacin o tiempo medio de duplica-cin (g). Si la poblacin se duplica en un tiempo t (t = g), entonces, tras una generacin,


El tiempo medio de generacin es la inversa de la constante de la velocidad media de crecimiento.

El tiempo medio de generacin (g) puede determinarse directamente a partir de una grfica semilogartmica con los datos de la multiplicacin (Figura 6.4), y la constante de velocidad de crecimiento se calcular a partir del valor g. El tiempo de generacin puede tambin calcularse directamen-te a partir de las ecuaciones anteriores. Por ejemplo, supon-gamos que una poblacin bacteriana aumenta de 103 a 109 clulas en 10 horas.

Figura 6.4 Determinacin del tiempo de generacin. El tiempo de generacin puede determinarse a partir de la curva de crecimiento microbiano. Se representan los datos de la poblacin en un papel cuadriculado semilogartmico, indicando el nmero de clulas en el eje logartmico. Luego, se lee directamente el tiempo de duplicacin de la poblacin a partir de la grfica. Tambin puede representarse en ejes regulares utilizando el logaritmo del nmero de clulas frente al tiempo.

Tabla 6.2 Tiempos de generacin de algunos microorganismos seleccionados

Temperatura Tiempo de Microorganismo (C) generacin (horas) Bacterias

Beneckea natriegens 37 0.16 Escherichia coli 40 0.35 Bacillus subtilis 40 0.43 Staphylococcus aureus 37 0.47 Pseudomonas aeruginosa 37 0.58 Clostridium botulimim 37 0.58Rhodospirillum rubrum 25 4.6-5.3 Anabaena cyUndrica 25 10.6

Mycobacterium tuberculosis 37 12 Treponema pallidum 37 33

Algas Scenedeswus auadricauda 25 5.9 Chlorella pyrenoidosa 25 7.75 ster ion ella formosa 20 9.6 Euglena gracilis 25 10.9 Ceratium tripas 20 82.8

Protozoos Tetrahymena geleii 24 2.2-4.2 Leishmania donovani 26 10-12Paramecium caudatum 26 10.4 Acanthamoeba castellana 30 11-12 Giardia lamblia 37 18

Hongos Saccharomyces cerevisiae 30 2 Monilinia fructicola 25 30

Los tiempos de generacin cambian notablemente segn

la especie de microorganismo y las condiciones ambientales. Los valores varan desde menos de 10 minutos (0.17 horas) en algunas bacterias, hasta varios das, en algunos microor-ganismos eucariotas (Tabla 6.2). Los tiempos de generacin en la naturaleza suelen ser ms largos que en cultivo in vitro.

1. Defina crecimiento. Describa las cuatro fases de la curva de crecimiento en un sistema cerrado y razone las causas y caractersticas de cada una de ellas.

2. Defina crecimiento equilibrado, crecimiento desequilibrado, experimento shift-up y experimento shift-down.

3. Cmo afecta el incremento en un nutriente limitante sobre el rendimiento celular y la tasa de crecimiento?

4. Qu son tiempo de generacin o duplicacin, y constante de velocidad media de crecimiento? Cmo pueden deducirse a partir de datos de crecimiento?


6.2 Determinacin del crecimiento microbiano

Existen muchas formas de cuantificar el crecimiento micro-biano para determinar la velocidad de crecimiento y el tiempo de generacin. Se pueden medir tanto la masa como el nmero de clulas de la poblacin, ya que el crecimiento implica un incremento de ambos. A continuacin, se anali-zan brevemente las tcnicas ms comnmente empleadas para medir el crecimiento, y se exponen las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas. No siempre una deter-minada tcnica es la mejor, depender de cada situacin experimental.

Determinacin del nmero de clulas

La forma ms obvia de determinar el nmero de clulas microbianas es por recuento directo. La utilizacin de una cmara de recuento es fcil, econmica y relativamente rpi-da; ofrece tambin informacin acerca del tamao y la mor-fologa de los microorganismos. Las cmaras de Petroff-Hausser se pueden emplear para contar procariotas; los hemocitmetros pueden utilizarse para ambos, procariotas y eucariotas. Para facilitar el recuento de microorganismos procariotas en estas cmaras, stos deben teirse, o bien, emplear un microscopio de contraste de fases o de fluores-cencia. Estos portaobjetos especialmente diseados tienen cmaras tipo rejilla, excavadas en el fondo de la cmara, con una profundidad conocida (Figura 6.5). Se puede calcular el nmero de microorganismos en una muestra, a partir del volumen de la cmara y la dilucin que se efectu a la mues-tra. Esta tcnica presenta algunos inconvenientes. Debido al pequeo volumen de las microcmaras excavadas, normal-mente 0.001 mL, la concentracin de la poblacin microbia-na tiene que ser bastante alta para que el resultado sea repre-sentativo. Es tambin difcil distinguir entre clulas vivas y muertas sin el empleo de tcnicas especiales.

Los microorganismos de mayor tamao, como protozoos, algas y levaduras no filamentosas, pueden contarse directa-mente con contadores electrnicos, como el Contador Coul-ter. Este mtodo consiste en hacer pasar una suspensin microbiana a travs de un pequeo orifico. Una corriente elctrica fluye a travs del mismo, y los electrodos situados a ambos lados miden su resistencia elctrica. Cada vez que una clula microbiana atraviesa el orificio, aumenta la resis-tencia elctrica (o disminuye la conductividad) y se cuenta la clula. El Contador Coulter ofrece resultados precisos con clulas grandes y se utiliza ampliamente en los laboratorios de los hospitales para el recuento de eritrocitos y leucocitos. No es tan eficaz para contar bacterias debido, entre otros problemas, a la interferencia con partculas pequeas de residuos y con la formacin de filamentos.

Las cmaras de recuento y los contadores electrnicos permiten contar todas las clulas, vivas o muertas. Existen tambin otras tcnicas, que son procedimientos especficos

Figura 6.5 Cmara de recuento de Petroff-Hausser. (a) Vista lateral de la cmara, mostrando el cubreobjetos y el espacio entre ambos, ocupado por la suspensin bacteriana en estudio, (b) Vista superior de la cmara. La rejilla se encuentra en el centro del portaobjetos, (c) Vista aumentada de la rejilla. Se cuentan bacterias en varios cuadrados centrales, normalmente a un aumento de x400 a x500. El nmero medio de bacterias en estos cuadrados sirve para calcular la concentracin de clulas en la muestra original. Como hay 25 cuadrados en un rea de 1 mm2, el nmero total de bacterias en 1 mm de la cmara es (n. de bacterias/cuadrado) x (25 cuadrados). La cmara tiene una profundidad de 0.02 mm y por ello, N. de bacterias/mm3 = (n. de bacterias/cuadrado)(25 cuadrados)(50) El nmero de bacterias por cnr (mL) es 10 veces este valor. Por ejemplo, supongamos que el recuento medio por cuadrado es de 28 bacterias: N. de bacterias/cm3 = (28 bacterias)(25 cuadrados)(50)(103) = 3.5xlO7

para contar clulas capaces de crecer y multiplicarse. En la mayora de estos mtodos de recuento, se dispersa una muestra diluida de bacterias u otros microorganismos sobre una superficie de agar slido. Cada microorganismo o agre-gado de microorganismos desarrolla una colonia individual. El nmero original de microorganismos viables en la mus-

6.2 Determinacin del crecimiento microbiano 125

tra puede calcularse a partir del nmero de colonias forma-das y la dilucin de la muestra. Por ejemplo, si 1.0 mL de una dilucin de 1 x 10~6 produce 150 colonias, la muestra original contendra alrededor de 1.5 x 10* clulas por mL. Normalmente, el recuento es ms exacto si se utiliza un con-tador especial de colonias. De esta forma, se pueden emple-ar las tcnicas de siembra por extensin y en profundidad para determinar el nmero de microorganismos viables en una muestra.

Las tcnicas de siembra en placa son sencillas, sensibles y se utilizan ampliamente para el recuento de bacterias y otros microorganismos en muestras como alimentos, agua y suelo. Sin embargo, existen varios problemas que pueden producir imprecisiones. Es necesario desagregar previamente las agrupaciones de clulas ya que, de lo contrario, el nmero de colonias ser inferior al esperado. En cualquier caso, como no es posible estar totalmente seguro de que cada colonia proceda de una clula individual, los resultados suelen expresarse en unidades formadoras de colonias (UFC, colony forming unii), en lugar de expresarlo como nmero de microorganismos. El nmero de colonias por placa debe ser entre 30 y 300 para que sea un valor estadsti-camente fiable. Igualmente, el recuento no ser fiable si el medio con agar empleado no puede mantener el crecimiento de todos los microorganismos viables presentes. El agar caliente que se utiliza en la siembra en profundidad puede daar o matar clulas sensibles; por ello, la siembra en placa por extensin ofrece a veces recuentos superiores que con la tcnica de siembra en profundidad. Tcnicas de siembra en placa por extensin y en profundidad (pp. 112-114).

El nmero de microorganismos se determina tambin con frecuencia a partir de colonias que crecen sobre filtros especiales de membrana, que tienen poros de un tamao lo suficientemente pequeo para retener bacterias. En esta tc-nica, se pasa una muestra a travs de un filtro de membra-na (Figura 6.6), luego, el filtro se coloca sobre un medio

con agar y se incuba hasta que cada clula forme una colo-nia individual. Un recuento de colonias permite obtener el nmero de microorganismos presentes en la muestra filtra-da, y pueden emplearse medios especiales para seleccionar microorganismos especficos (Figura 6.7). Esta tcnica es especialmente til en el anlisis de muestras de agua. An-lisis de la pureza del agua (pp. 704-707).

Los filtros de membrana se utilizan tambin para contar bacterias directamente. Primero se filtra la muestra a travs de un filtro negro de membrana de policarbonato para crear un fondo oscuro que permita observar objetos fluorescentes. Luego, se tifien las bacterias con un colorante fluorescente, como naranja de acridina o DAPI, y se observan al micros-copio. Los microorganismos teidos con naranja de acridina brillan con un color naranja o verde y pueden contarse fcil-mente con un microscopio de epifluorescencia {vase la sec-cin 2.2). Normalmente, los recuentos obtenidos por este mtodo son mucho ms elevados que con las tcnicas de cultivo ya que algunas de las bacterias estn muertas. Actualmente se dispone de pruebas comerciales que permi-ten contar directamente el nmero de microorganismos vivos y muertos en una muestra, empleando reactivos fluo-rescentes que marcan diferencialmente las clulas vivas y las muertas (vase la Figura 2.13d).

Determinacin de la masa celular

El crecimiento de una poblacin tambin supone el aumento de la masa total celular, por ello, las tcnicas empleadas para medir los cambios de masa pueden utilizarse para medir el crecimiento. El mtodo ms directo consiste en determinar el peso seco microbiano. Se recogen las clulas que crecen en un medio lquido por centrifugacin, se lavan, se secan en estufa y se pesan. Esta tcnica es espe-cialmente til para medir el crecimiento de hongos. Sin

Figura 6.6 Sistema de filtracin con membrana. Para retener diferentes tipos de microorganismos se utilizan membranas con diferente tamao de poro. Posteriormente, los tiempos de incubacin variarn dependiendo del medio y del tipo de microorganismo.


Figura 6.7 Colonias sobre filtros de membrana. Muestras filtradas con membrana y cultivadas en diversos medios, (a) Medio estndar de nutrientes para un recuento bacteriano total. Un indicador colorea las colonias de rojo para facilitar el recuento, (b) Medio para coliformes fecales para detectar estos microorganismos que forman colonias azules, (c) Agar m-Endo para detectar E. coli y otros coliformes que producen colonias con un brillo verde, (d) Agar mosto para cultivar levaduras y mohos.

embargo, lleva mucho tiempo y no es muy sensible. Como las bacterias pesan tan poco puede ser necesario centrifu-gar varios cientos de mililitros de cultivo para recoger una cantidad suficiente.

Existen tcnicas ms sensibles y rpidas que se basan en la capacidad de las clulas de dispersar la luz que incide sobre ellas. Como el tamao de las clulas microbianas en un cultivo puro es casi constante, el grado de dispersin es directamente proporcional a la biomasa celular presente, e indirectamente relacionado con el nmero de clulas. Cuan-do la concentracin de las bacterias alcanza aproximada-mente 107 clulas por mL, el medio aparece ligeramente tur-bio. Incrementos posteriores en la concentracin producen nuevos incrementos de la turbidez disminucin de la luz transmitida a travs del medio. Se puede medir el grado

de dispersin de la luz con un espectrofotmetro, y, en nive-les de absorbancia pequeos, est casi linealmente relacio-nada con la concentracin bacteriana (Figura 6.8). Por tanto, el crecimiento de una poblacin puede medirse fcil-mente espectrofotomtricamente, siempre que la poblacin sea lo suficientemente grande para que pueda medirse la tur-bidez.

Si la cantidad de una sustancia determinada es constante en cada clula, la cantidad total de dicho constituyente celu-lar estar directamente relacionada con la masa celular total microbiana. As, por ejemplo, se puede analizar la cantidad total de protenas o nitrgeno de una muestra de clulas lavadas recogidas a partir de un volumen conocido de medio. Un aumento en la poblacin microbiana se reflejar en un incremento en el nivel total de protenas. De forma

Figura 6.8 Determinacin de la turbidez y masa microbiana. Determinacin de la masa microbiana por la medida de la absorcin de luz. Al aumentar la poblacin y la turbidez, se dispersa ms cantidad de luz y aumenta la absorbancia leda en el espectrofotmetro. El contador de este aparato tiene dos escalas. La escala inferior muestra la absorbancia, y la superior indica la transmitancia en porcentaje. La absorbancia aumenta al disminuir la transmitancia.

6.3 Cultivo continuo de microorganismos 127

similar, se puede utilizar el anlisis de clorofila para medir poblaciones de algas, y la cantidad de ATP, para estimar la cantidad de masa microbiana viva.

1. Describa brevemente cada tcnica de determinacin del nmero de clulas en una poblacin microbiana, exponien do sus ventajas e inconvenientes.

2. Por qu los resultados de recuento en placa se deben expresar como unidades formadoras de colonias?

6.3 Cultivo continuo de microorganismos

Hasta ahora se han tratado los sistemas cerrados, denomina-dos cultivos discontinuos, en los que no se renuevan los aportes de nutrientes ni se eliminan los residuos. El creci-miento exponencial dura solamente unas pocas generacio-nes y el cultivo alcanza pronto la fase estacionaria. Sin embargo, es posible cultivar microorganismos en un sistema abierto, en el que se mantengan constantes las condiciones ambientales gracias a un suministro continuo de nutrientes y la retirada de los residuos. Estas condiciones se cumplen en un laboratorio mediante los sistemas de cultivo continuo. En este tipo de cultivo, se puede mantener una poblacin microbiana en fase de crecimiento exponencial y a una con-centracin constante de biomasa durante un perodo largo de tiempo.

Colector

Figura 6.9 Sistema de cultivo continuo: el quimiostato. Diagrama esquemtico del sistema. El medio fresco contiene una cantidad limitante de un nutriente esencial. La tasa de crecimiento est determinada por la velocidad de flujo del medio ai frasco de cultivo.

Quimiostato

Se utilizan dos clases principales de sistemas de cultivo con-tinuo: 1) quimiostatos, y 2) turbidostatos. Un quimiostato se construye de forma que se alimenta un recipiente de culti-vo con un medio estril a la misma velocidad con que los microorganismos consumen los nutrientes que contiene (Figura 6.9). El medio de cultivo de un quimiostato contie-ne un nutriente esencial (p. ej., un aminocido) en cantida-des limitantes. Debido a la presencia de este nutriente limi-tante, tanto el crecimiento como la densidad final celular dependen de las concentraciones del mismo; es decir, la velocidad de crecimiento podr variarse dependiendo de la velocidad con la que se incorpore nuevo medio en el reci-piente. La velocidad de recambio del nutriente se expresa como velocidad de dilucin (D), que equivale a la tasa con la que el medio fluye al recipiente de cultivo en relacin al volumen de este recipiente, en donde / es la tasa de flujo (mL/h), y V es el volumen del recipiente (mL).

D=flV

Por ejemplo, si /es 30 mL/h y V, 100 mL, la velocidad de dilucin ser de 0.30 h"1.

La concentracin celular microbiana y el tiempo de generacin estn relacionados con la velocidad de dilucin (Figura 6.10). La densidad de la poblacin microbiana per-manece inalterada a lo largo de un amplio rango de veloci-dades de dilucin. El tiempo de generacin disminuye (esto es, la velocidad de crecimiento aumenta), al aumentar la velocidad de dilucin. El nutriente limitante quedar casi completamente agotado en estas condiciones de equilibrio. Si la velocidad de dilucin aumenta con demasiada rapidez, los microorganismos pueden realmente desaparecer del reci-piente de cultivo antes de que se multipliquen, porque la velocidad de dilucin es superior a la velocidad mxima de crecimiento. La concentracin de nutriente limitante aumenta a velocidades de dilucin elevadas porque hay pocos microorganismos presentes para utilizarlo.

A velocidad de dilucin muy baja, un aumento de D causa un incremento tanto de la densidad celular como de la velocidad de crecimiento. Esto se debe al efecto de la con-centracin del nutriente sobre la velocidad de crecimiento, a veces denominada relacin de Monod (Figura 6.2b). A velocidades de dilucin bajas, slo hay disponible una can-tidad limitada de nutriente. La velocidad de crecimiento aumenta cuando la energa total disponible supera la ener-ga de mantenimiento. Gran parte de la energa disponible debe utilizarse para el mantenimiento celular, no para el


Figura 6.10 Velocidad de dilucin y crecimiento microbiano en un quimiostato. Efectos del cambio en la velocidad de dilucin en un quimiostato.

crecimiento ni la multiplicacin. A medida que aumenta la velocidad de dilucin, aumentan la cantidad de nutrientes y la densidad celular resultante, porque la energa est dis-ponible, tanto para el mantenimiento como para el creci-miento.

Turbidostato

El segundo procedimiento para conseguir cultivos continuos se basa en el empleo de un turbidostato, que tiene una foto-clula para medir la absorbancia o turbidez de un cultivo en el recipiente de cultivo. La velocidad de flujo del medio al recipiente se regula automticamente para mantener una tur-bidez o densidad celular predeterminada. El turbidostato se diferencia del quimiostato por varias caractersticas. La velocidad de dilucin en un turbidostato es variable, en lugar de permanecer constante, y el medio de cultivo carece de un factor limitante. Un turbidostato funciona mejor a velocidades de dilucin altas; un quimiostato es ms estable y eficaz a velocidades de dilucin bajas.

Los sistemas de cultivo continuo son muy tiles porque ofrecen un aporte constante de clulas en fase exponencial, que crecen a una velocidad conocida. Estos sistemas permi-ten el estudio del crecimiento microbiano en niveles muy bajos de nutrientes, concentraciones prximas a las existen-tes en los medios naturales. Estos sistemas son esenciales para la investigacin en muchas reas p. ej., en estudios sobre reacciones entre especies microbianas en condiciones ambientales similares a las de un lago o charca de agua dulce. Los sistemas continuos tambin se utilizan en microbiologa de los alimentos e industrial.

1. En qu se diferencia un sistema abierto de uno cerrado o discontinuo?

2. Describa el funcionamiento de los dos sistemas de cultivo continuo, el quimiostato y el turbidostato.

3. Qu es la velocidad de dilucin? Qu es la energa de mantenimiento?

6.4 Influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento

Como se ha visto anteriormente (pp. 120-121), los microor-ganismos deben ser capaces de responder a variaciones en los niveles de nutrientes y, particularmente, a la limitacin en nutrientes. El crecimiento de los microorganismos est influido notablemente por la naturaleza qumica y fsica de su ambiente. El conocimiento de estas influencias ambienta-les permitir controlar el crecimiento microbiano y estudiar la distribucin ecolgica de los microorganismos.

La habilidad de algunos microorganismos para adaptar-se a ambientes extremos e inhspitos es realmente extraordi-naria. Los procariotas son virtualmente ubcuotas, se encuentran en cualquier lugar. Muchos habitat donde las bacterias pueden prosperar destruiran a la mayora del resto de microorganismos. Bacterias como Bacillus infernus pue-den incluso multiplicarse a ms de 2.5 km bajo la superficie terrestre, sin oxgeno y a temperaturas prximas a los 60 C. Los microorganismos que crecen en condiciones tan extre-mas se suelen denominar extremfilos.

En esta seccin revisaremos brevemente cmo afectan al crecimiento microbiano algunos de los ms importantes factores ambientales. Un mayor nfasis se pondr en el efec-to de los solutos y la actividad del agua, pH, temperatura, nivel de oxgeno, presin y radiacin. La Tabla 6.3 resume cmo pueden catalogarse los microorganismos segn su res-puesta a estos factores.

Solutos y actividad del agua

Una membrana plasmtica selectivamente permeable separa el contenido citoplasmtico del microorganismo de su ambiente, por ello, alteraciones en la concentracin osmti-ca del medio extracelular podrn afectar incluso a la viabili-dad de los mismos. Si se coloca un microorganismo en una solucin hipotnica (con una concentracin osmtica infe-rior), entrar agua en la clula causando su estallido, salvo que la propia clula desarrolle alguna estrategia para evitar su entrada. Por ejemplo, la concentracin osmtica del cito-plasma puede reducirse gracias a los cuerpos de inclusin (vanse las pp. 52-55). Los procariotas tambin pueden con-tener canales sensibles a la presin osmtica, que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno se vuelve ms baja que la del citoplasma.

6.4 Influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento 129

Factor y trmino descriptor Definicin Microorganismos representativos

Solutos y actividad del agua Osmotolerunte

Halfilo

Capaz de crecer en un amplkio rango de actividad del agua o presin osmtica Requiere altas

concentraciones de cloruro sdico para crecer, normalmente por encima de 0.2 M

Staphylococcus aureus, Saccharomyces rouxii

Halobacterhtm, Dunaliella, Ectothiorhodospira

pH Acidfilo

Neutrfilo Alcalfilo

Temperatura Psicrfilo

Psicrotrofo

Mesfilo Termfilo

Hipertermfilo

Concentracin de oxgeno

Aerobio obligado

Anaerobio facultativo

Anaerobio aerotolerante

Anaerobio obligado Microaerfilo

Presin Barfilo

ptimo de crecimiento entre pH 0 y 5.5

ptimo de crecimiento entre pH 5.5 y 8.0 ptimo de crecimiento entre pH 8.5 y 1 1.5

Crece bien a 0 C y tiene una temperatura ptima de 15 C o inferior Puede crecer a 0-7

C; ptima entre 20 y 30 C; mxima alrededor de 35 C

Temperartura ptima alrededor de 20-45 C Puede crecer a 55 C o superior; la ptima a

menudo entre 55 y 65 C Temperatura ptima entre 80 y 113 C

Completamente dependiente del O2 atmosfrico para crecer No requiere O2 para crecer, pero

crece mejor en su presencia Crece igualmente bien en

presencia como en ausencia de O2

No tolera el O2 y muere en su presencia Requiere niveles de O2 por debajo de 2-10 % para

crecer, y es daado por el O2 atmosfrico (20 %)

Crece ms rpido a altas presiones hidrostticas

Sulfolobus, Picrophilus, Ferroplasma, Acontium, Cyanidium caldarium

Escherichia, Euglena, Paramecium Badilas alcalophilus. N a I ronobaceri um

Badilas psychrophilus, Chlamydomonas nivalis

Listeria monocytogenes, P seudomonas fluorescens

Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis Badilas stearothethermophilus, Thermus aquaticus, Cyanidium

caldarium, Chaetomium thermophile Sulfoliibiis, Pyrococcus, Pyrodictium

Micrococcus luteus, Pseudomonas, Mycobacterium; la mayora de las algas, hongos y protozoos Escherichia,

Enlerococcus, Saccharomyces cerevisiae

Strcptococcus pyogenes

Clostridium, Bacteroides, Methanobacterium, Trepomonas agilis Campylobacler, Spirillum volutans, Treponema pallidum

Photobacterium pmfundum, Shewanella benlhica, Methanococais jannasch

La mayora de las bacterias, algas y hongos poseen una pared celular rgida que mantiene la forma e integridad celu-lar, pero cuando se colocan microorganismos con pared celular rgida en ambientes hipertnicos, disminuye el nivel de agua celular, la clula se contrae, y la membrana plasm-tica se separa de la pared celular. Este proceso se denomina plasmolisis. Esta situacin deshidrata la clula y puede daar la membrana plasmtica; normalmente, la clula no muere, aunque es inactiva metablicamente y deja de crecer.

Muchos microorganismos conservan la concentracin osmtica de su protoplasma por encima del correspondiente a su habitat utilizando solutos compatibles, de manera que aunque estn en medios tericamente hipotnicos, no entra agua a la clula. Estos solutos son compatibles con el metabolismo y el crecimiento aun cuando se encuentren en concentraciones intracelulares elevadas. As, por ejemplo, la mayora de las bacterias eleva su concentracin osmti-ca interna mediante la sntesis o captacin de colina, beta-na, prolina, cido glutmico y otros aminocidos; tambin participan, en cierto grado, cantidades elevadas de ion

potasio. Con el mismo objetivo, algas y hongos utilizan sacarosa y polioles p. ej., arabitol, glicerol y manitol. Los polioles y aminocidos son solutos ideales para esta funcin porque normalmente no alteran la estructura y fun-cin de las enzimas. Algunas bacterias como Halobacte-rium salinarium elevan su concentracin osmtica con iones potasio (tambin aumentan los iones sodio, pero no tanto). De hecho, las enzimas de Halobacterium son tan peculiares que requieren concentraciones de sal elevadas para poder desarrollar una actividad normal {vase la sec-cin 20.3). Como los protozoos no tienen pared celular, deben utilizar vacuolas contrctiles (vase la Figura 27.3) para eliminar el exceso de agua cuando habitan en entornos hipotnicos. Osmosis y funcin protectora de la pared celular (p. 64).

La cantidad de agua disponible para el microorganismo se puede reducir debido a las interacciones de la misma con molculas de soluto (efecto osmtico) o por adsorcin a las superficies de slidos (efecto matricial). Como la concentra-cin osmtica de un habitat tiene efectos tan marcados sobre

Respuestas microbianas a factores ambientales


los microorganismos, es de gran utilidad poder expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Para ello, los microbilogos emplean la actividad del agua (aw). La actividad del agua de una solucin es 1/100 de su hume-dad relativa (cuando se expresa en porcentaje). Equivale tambin a la relacin entre la presin de vapor de la solucin (Pso,) y la del agua pura (Pagua).

La actividad del agua de una solucin o un slido

puede establecerse aislndolos en una cmara y midiendo la humedad relativa despus de que el sistema haya alcanzado el equilibrio. Supongamos que, despus de tratar la muestra de este modo, el aire est saturado al 95 % es decir, con-tiene el 95 % de la humedad que tendra cuando se equili-brase a la misma temperatura con una muestra de agua pura. La humedad relativa sera del 95 %, por tanto, la actividad del agua de la muestra es 0.95. La actividad del agua est inversamente relacionada con la presin osmti-ca; si una solucin tiene una presin osmtica elevada, su aw es baja.

Los microorganismos difieren enormemente en cuanto a su capacidad para adaptarse a habitat con una actividad de agua baja (Tabla 6.4). Microorganismos osmotolerantes son aquellos que pueden crecer en un rango amplio de acti-vidad del agua o concentracin osmtica. Estos microorga-nismos tienen que realizar un esfuerzo adicional para crecer en habitat con un valor bajo de aw, porque deben mantener

una concentracin interna de solutos elevada para poder retener agua. Por ejemplo, Staphylococcus aureus, muy bien adapatada para multiplicarse sobre la piel, puede culti-varse en medios conteniendo concentraciones de cloruro sdico de hasta casi 3 M. La levadura Saccharomyces rouxii crece en soluciones de azcares con valores de aw tan bajos como 0.6. El alga Dunaliella viridis tolera incluso hasta concentraciones saturadas de cloruro sdico de 1.7 M.

Sin embargo, muy pocos microorganismos son verda-deramente osmotolerantes, la mayora crece solamente en medios con una actividad de agua de aproximadamente 0.98 (valor aproximado de aw para el agua de mar), o supe-rior. sta es la razn por la que la deshidratacin de los ali-mentos o la incorporacin a los mismos de una gran canti-dad de sal y/o azcar son mtodos muy eficaces para evitar su putrefaccin. Como muestra la Tabla 6.4, muchos hon-gos son osmotolerantes y, por ello, especialmente importan-tes en el deterioro de alimentos salados o deshidratados. Deterioro de los alimentos (pp. 1047-1050).

Los halfilos se han adaptado tan bien a condiciones hipertnicas que necesitan niveles elevados de cloruro sdico para crecer. Las bacterias halfilas extremas requieren concentraciones de entre 2.8 y 6.2 M (saturacin). La archa-eon Halobacterium puede aislarse en el Mar Muerto (lago salado situado entre Israel y Jordania, el ms bajo del mundo), el Gran Lago salado de Utah (EE.UU.) y en otros habitat acuticos con concentraciones de sal prximas a la saturacin. Los miembros de Halobacterium y otras bac-terias halfilas extremas han modificado sustancialmente la estructura de sus protenas y membranas, en lugar de

Tabla 6.4 Lmites inferiores aproximados de aw para el crecimiento microbiano

Actividad del agua Ambiente Bacterias Hongos Algas

1.00-agua pura Sangre 1 Verduras, La mayora de las Gram negativas no halfilas Plantas marchitas [carne, fruta

Agua de mar 0.95 Pan La mayora de los bacilos Gram positivos Basidiomycetes La mayora

de las algas0.90 Jamn La mayora de los cocos, Bacillus Fusarium, Mucor Rhizopus

Levaduras de ascomicetos 0.85 Salami Staphylococcus Saccharomyces rouxii (en sal) 0.80 Conservas Penicillium 0.75 Lagos salados Halobacterium Asperglus Dunaliella

Pescado salado Actinospora0.70 Aspergillus

Cereales, dulces, frutos secos 0.60 Saccharomyces rouxii

Chocolate (en azcares) Miel Xeromyces bisporus

Leche deshidratada 0.55-alteracin del DNA

Adaptado a partir de A. D. Brown, Microbial Water Stress en Bacteriological Reviews, 40(4):803-846, 1976. Derechos reservados por la Sociedad Americana de Microbiologa. Reimpreso con autorizacin.


aumentar simplemente las concentraciones intracelulares de solutos, sistema utilizado por la mayora de los microorga-nismos osmotolerantes. Estos halfilos extremos acumulan grandes cantidades de potasio para mantener hipertnico el ambiente intracelular; la concentracin interna de potasio puede llegar a un valor de 4 a 7 M. Las enzimas, los riboso-mas y las protenas transportadoras precisan niveles eleva-dos de potasio para ser estables y activas. Adems, la mem-brana plasmtica y la pared celular de Halobacterium se estabilizan por concentraciones elevadas de ion sodio. Si la concentracin de sodio disminuye demasiado, la pared y la membrana plasmtica se desintegran. Las bacterias halfilas extremas se han adaptado con xito a condiciones ambien-tales que destruiran a la mayora de los organismos. Duran-te el proceso, se han especializado tanto que han perdido la flexibilidad ecolgica y pueden desarrollarse solamente en unos muy restringidos habitat extremos. Halobacterias (sec-cin 20.3).

1. Cmo se adaptan los microorganismos a ambientes hipotnicos e hipertnicos? Qu es la plasmlisis?

2. Defina actividad del agua y describa brevemente cmo puede determinarse.

3. Por qu es difcil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw?

4. Qu son microorganismos halfilos, y por qu los miembros de Halobacterium precisan iones de sodio y potasio.

PH

El pH es una medida de la actividad de los iones de hidrge-no de una solucin, que se define como el valor negativo del logaritmo de la concentracin de iones de hidrgeno (expre-sada en moles).

La escala de pH se extiende de 0.0 (1.0 M H+) a 14.0 (1.0 x 10~14 M H+), representando cada unidad de pH un cambio de 10 veces en la concentracin de iones de hidrgeno. La Figura 6.11 muestra cmo los habitat en que crecen los microorganismos varan ampliamente desde valores de pH entre 1 y 2, en el extremo cido, hasta pH entre 9 y 10, en algunos lagos y suelos alcalinos.

No resulta sorprendente que el pH afecte intensamente al crecimiento microbiano. Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH ptimo. Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5; los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0; y los alcalfi-los prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5. Los alcalfilos extremos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento de 10 o ms. En general, cada grupo microbiano posee preferen-

cias de pH caractersticas. La mayora de las bacterias y pro-tozoos son neutrfilos. La mayor parte de los hongos prefie-ren medios ligeramente cidos, con valores de pH de 4 a 6; las algas prefieren tambin una ligera acidez. Existen nume-rosas excepciones a esta norma. Por ejemplo, el alga Cyani-dium caldarium y el archaeon Sulfolobus acidocaldarius habitan comnmente aguas termales acidas; ambos crecen bien a pH de 1 a 3 y a temperaturas elevadas. Las archaea Ferroplasma acidavmanus y Picrophilus oshimae pueden multiplicarse a pH 0, o muy prximos a este nivel.

Aunque los microorganismos crecen a menudo en medios con un amplio rango de pH, su tolerancia tiene un lmite. Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismos alterando la membrana plasmtica o inhi-biendo la actividad de las enzimas y las protenas transporta-doras. En general, los procariotas mueren si el pH interno desciende por debajo de 5.0 a 5.5. Los cambios en el pH externo pueden modificar tambin la ionizacin de las mol-culas de nutrientes, disminuyendo, por ello, su disponibili-dad para el organismo.

Se han propuesto diversos mecanismos para el manteni-miento del pH neutro en el citoplasma. La membrana plas-mtica puede ser relativamente permeable a los protones. Parece ser que los neutrfilos intercambian protones por potasio mediante un sistema de transporte antiporte (p. 107). Acidfilos extremos mantienen su pH interno prximo a la neutralidad, intercambiando protones externos por iones de sodio internos. Tambin los bferes internos pueden contri-buir a la homeostasis del pH.

Los microorganismos tienen que adaptase a menudo a cambios ambientales de pH para sobrevivir. En las bacterias, los sistemas antiporte potasio/protn y sodio/protn corri-gen probablemente pequeas variaciones de pH. Si el pH se vuelve demasiado cido, se ponen en marcha otros mecanis-mos. Cuando el pH baja hasta valores de 5.5 a 6.0, Salmone-lla typhimurium y E. coli sintetizan un grupo de nuevas pro-tenas, como parte de la denominada respuesta de tolerancia a un medio cido. La ATPasa translocadora de protones con-tribuye a esta respuesta protectora, produciendo ms ATP o bombeando protones fuera de la clula. Si el pH externo dis-minuye a valores de 4.5 o inferiores, se sintetizan chapero-nas como las protenas de choque cido o de choque trmico {vanse las pp. 293-294). Probablemente, estas sustancias eviten la desnaturalizacin de las protenas y faciliten de nuevo el plegamiento de las desnaturalizadas.

Los microorganismos cambian con frecuencia el pH de su propio habitat, al producir productos residuales metabli-cos cidos o bsicos. Los microorganismos fermentadores producen cidos orgnicos a partir de hidratos de carbono, mientras que los quimiolitotrofos como Thiobacillus oxidan compuestos reducidos de azufre a cido sulfrico. Otros alcalinizan su ambiente produciendo amonio mediante la degradacin de los aminocidos. Fermentaciones microbia-nas (pp. 192-194); Bacterias oxidantes del azufre (pp. 537-539).

En los medios de cultivo suelen aadirse bferes para evitar la inhibicin del crecimiento por cambios grandes de


Ejemplos de ambientes

cido ntrico concentrado

Contenido gstrico, aguas termales acidas

Zumo de limn Drenaje cido de minas

Vinagre, gingerale Pina

Tomate, zumo de naranja Suelo muy cido

Queso, repollo Pan

Carne de vacuno, pollo Agua de lluvia Leche Saliva Agua pura Sangre

Agua de mar

Suelo muy alcalino Lagos alcalinos

Jabn

Amonaco de uso domstico

Solucin saturada de hldrxido calcico

Leja Desatascador Mayor alcalinidad

Figura 6.11 Escala de pH. Escala de pH y algunos ejemplos de sustancias con diferentes valores de pH. Se muestran ejemplos de microorganismos a los pH ptimos indicados.

pH. El fosfato es el bfer ms comn y un

buen ejemplo de amortiguacin mediante un cido dbil (H2PO4~) y su base conjugada (HPO42~).

H+ + HPO42 OH-

+H2PO4"

Si se aaden protones a la mezcla, se combinan con la sal formada para producir un cido dbil. Se previene un aumento de alcalinidad porque el cido dbil neutraliza los iones hidroxilos, al donar protones para formar agua. Los pptidos y los aminocidos en medios complejos producen tambin un fuerte efecto de amortiguacin.

Temperatura

La temperatura ambiental afecta intensamente a los micro-organismos, as como al resto de organismos. De hecho, los

microorganismos son especialmente susceptibles porque son generalmente unicelulares y su temperatura vara con la ambiental. Por estas razones, la temperatura de la clula microbiana refleja directamente la de su ambiente. Las reac-ciones catalticas son las ms vulnerables, ya que, el factor que ms influye sobre el efecto de la temperatura en el creci-miento es la termosensibilidad de las enzimas. En condicio-nes por debajo de la temperatura ptima, un aumento en la temperatura eleva la velocidad de crecimiento, porque la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas, como la de cualquier reaccin qumica, casi se duplica por cada aumento de temperatura de 10C. Como la velocidad de cada reaccin aumenta, el metabolismo en general es ms activo a temperaturas altas y el microorganismo crece ms rpidamente. A partir de cierto punto (temperatura ptima), un mayor aumento disminuye la velocidad de crecimiento, y temperaturas ms altas llegarn a ser letales. Las altas tem-peraturas ocasionan daos a los microorganismos al desna-turalizar las enzimas, las protenas transportadoras, y otras

Ejemplos microbianos

Ferroplasma Picrophilus oshimae Dunaliella acidophila

Cyanidium caldarium Thiobacillus thiooxidans Sulfolobus acidocaldarius

Physarum polycephalum Acanthamoeba castellana

Lactobacillus acidophilus E. cot, Pseudomonas aeruginosa Euglena gracilis, Paramecium bursaria

Staphylococcus aureus

Nltrosomonas spp.

Mycrocystis aeruginosa Bacillus alcalophilus

> H2PO4"

HPO42 + HOH


Temperatura

Figura 6.12 Temperatura y crecimiento. Efecto de la temperatura en la velocidad de crecimiento.

protenas. El calor tambin deteriora las membranas micro-bianas; la doble capa lipdica puede fundirse y desintegrarse. Por ello, a pesar de que las enzimas funcionales actan ms rpidamente a temperaturas elevadas, el microorganismo puede alterarse hasta el punto de inhibirse su crecimiento, porque el dao no puede repararse. A muy bajas temperatu-ras, las membranas gelifican y las enzimas no operan a gran velocidad. En definitiva, cuando los organismos estn por encima de la temperatura ptima, tanto la estructura como la funcin celular estn afectadas. Si las temperaturas son muy bajas, la funcin se ve afectada pero no necesariamente su

estructura ni la composicin qumica. Dependencia de la actividad enzimtica respecto de la temperatura (pp. 174-175).

Debido a estos efectos opuestos de la temperatura, el crecimiento microbiano tiene una dependencia bastante caracterstica de la temperatura, existiendo temperaturas cardinales distintivas temperaturas mnima, ptima y mxima de crecimiento (Figura 6.12). Aunque la forma de la curva de dependencia de la temperatura puede variar, la ptima est siempre ms prxima a la mxima que a la mnima. Las temperaturas cardinales de una especie en par-ticular no son invariables, sino que dependen de otros facto-res ambientales, como el pH y los nutrientes disponibles. Por ejemplo, Crithidia fasciculata, protozoo flagelado que habita en el intestino de los mosquitos, crecer en un medio simple entre 22 y 27 C. Sin embargo, no puede cultivarse a temperaturas de entre 33 y 34 C, sin aadir metales, amino-cidos, vitaminas y lpidos.

Las temperaturas cardinales varan ampliamente entre microorganismos (Tabla 6.5). Las ptimas se encuentran normalmente en un rango de 0 C hasta un valor tan alto como 75 C, mientras que el crecimiento microbiano se pro-duce en un rango de -20 C hasta ms de 100 C. El princi-pal factor que determina este rango de crecimiento parece ser el agua, ya que, incluso a las temperaturas ms extremas, los microorganismos necesitan agua lquida para crecer. La temperatura de crecimiento de un microorganismo determi-nado abarca normalmente un margen de 30. Algunas espe-cies (p. ej., Neisseria gonorrhoeae) tienen un rango peque-o; otras, como Enterococcus faecalis, crecen en un amplio

Vida por encima de 100 C

asta hace poco, la temperatura ms alta publicada de cre-cimiento bacteriano era de 105 C. De hecho, se crea que el lmite superior de temperatura para la vida se

encontraba en aproximadamente 100 C, punto de ebullicin del agua. En la actualidad, se han descrito bacterias que crecen en chimeneas sulfurosas o black smokers, situadas a lo largo de grietas y estras del suelo ocenico, que expulsan agua bentnica rica en sulfuro, con. temperaturas muy altas, por encima de 350 C (vase la figura del recuadro). Se ha demostrado que estas bacterias pueden crecer y multiplicarse a 113 C. Es posi-ble que las bacterias puedan crecer a temperaturas superiores. La presin existente en este habitat es suficiente para mantener al agua en estado lquido (a 265 atm, el agua de mar no hierve hasta los 460 C).

Las consecuencias de este descubrimiento son numerosas. Las protenas, las membranas y los cidos nucleicos de estas bacterias son extremadamente termoestables y constituyen un tema idneo para estudiar los mecanismos de estabilizacin de las macromolculas y membranas. En el futuro, puede ser posi-ble disear enzimas que puedan actuar a temperaturas muy altas. Algunas enzimas termoestables de estas bacterias pueden tener

usos industriales y cientficos importantes. Por ejemplo, la Taq polimerasa del termfilo Thermus aquaticus se utiliza con mucha frecuencia en la PCR {vanse las pp. 349-352).

H


rango de temperaturas. Los principales grupos microbianos se diferencian entre s por la temperatura mxima de creci-miento. El lmite superior de los protozoos es de aproxima-damente 50 C. Algunas algas y hongos pueden crecer a temperaturas tan elevadas como 55 a 60 C. Se han aislado procariotas a temperaturas de o prximas a 100 C, punto de ebullicin del agua (vase la Figura 20.8). Recientemente, se han descubierto cepas que crecen a temperaturas incluso superiores (Recuadro 6.1). Sin duda alguna, los organismos procariotas pueden crecer a temperaturas mucho ms altas que los eucariotas. Se ha propuesto que los eucariotas no son capaces de sintetizar membranas para los orgnulos que sean estables y funcionales a temperaturas superiores a 60 C. El aparato fotosinttico tambin parece ser relativamente inestable, ya que los organismos fotosintticos no se en-cuentran en ambientes a muy altas temperaturas.

Los microorganismos, como los expuestos en la Tabla 6.5, pueden clasificarse en una de las cinco categoras siguientes, en funcin de los rangos de temperatura de crecimiento (Figura 6.13).

1. Los psicrfilos crecen bien a 0 C y tienen una temperatura ptima de 15 C, o inferior; la mxima es de aproximadamente 20 C. Se aislan fcilmente en habitat del rtico y Antartico; como el 90 % del ocano tiene una temperatura de 5 C, o inferior (vase el Captulo 29), ste constituye un inmenso habitat para los psicrfilos. El alga psicrfila Chlamydomonas nivalis puede realmente colorear en rosa un campo de nieve o un glaciar debido a sus esporas de color rojo brillante. Los psicrfilos estn muy distribuidos entre los taxa bacterianos y se encuentran en gneros como Pseudomonas, Vibrio, Alcaligenes, Bacillus, Arthrobactei; Moritella, Photobacterium y Shewanella. El archaeon Methanogenium ha sido recientemente aislado del Lago Ace en la Antrtida. Los microorganismos psicrfilos se han adaptado a su ambiente mediante varios mecanismos. Las enzimas, sistemas de transporte y ssntesis de protenas actan bien a bajas temperaturas. Las membranas celulares de estos microorganismos tienen niveles elevados de cidos grasos insaturados que permanecen en estado semifluido a temperaturas fras. De hecho, muchos psicrfilos comienzan a perder componentes celulares a temperaturas ms altas de 20 C porque se altera la membrana celular.

2. Muchas especies pueden crecer a 0 C, aunque su temperatura ptima sea de 20 a 30 C, y la mxima de casi 35 C. Estos microorganismos se denominan

_ psicrotrofos o psicrfilos facultativos. Las bacterias y los hongos psicrotrofos son los agentes principales del deterioro de alimentos refrigerados (vase el Captulo 41).

3. Los microorganismos mesfilos crecen a una temperatura ptima de 20 a 45 C, siendo la mnima de 15 a 20 C, y la mxima de casi 45 C. La mayora de

Tabla 6.5 Rangos de temperatura

para el crecimiento microbiano Temperaturas cardinales (C)

Microorganismo Mnima ptima Mxima

Bacterias no fotosintticas Bacillus psychrophilus -10 23-24 28-30 Micrococcus cryophilus -4 10 24Pseudomonas fluorescens 4 25-30 40 Staphylococcus aureus 6.5 30-37 46 Enterococcus faecalis 0 37 44 Escherichia coli 10 37 45Neisseria gonorrhoeae 30 35-36 38 Thermoplasma acidophilum 45 59 62Bacillus stearothermophilus 30 60-65 75 Thermus aquaticus 40 70-72 79 Sulfolobus acidocaldarius 60 80 85 Pyrococcus abyssi 67 96 102Pyrodictium occultum 82 105 110 Pyrolobus fumarii 90 106 113

Bacterias fotosintticas Rhodospirillum rubrum SD' 30-35 SD Anabaena variabilis SD 35 SDOscillatoria tennis SD SD 45-47 Synechococcus eximius 70 79 84

Algas eucariotas Chlamydomonas nivalis -36 0 4Fraguara sublinearis -2 5-6 8-9 Chlorella pyrenoidosa SD 25-26 29 Euglena gracilis SD 23 SD Skeletonema costatum 6 16-26 >28Cyanidium caldarium 30-34 45-50 56

Hongos Candida scottii 0 4-15 15Saccharomyces cerevisiae 1-3 28 40 Mucor pusillus 21-23 45-50 50-58

Protozoos Amoeba proteus 4-6 22 35 Naegleria fowleri 20-25 35 40 Trichomonas vaginalis 25 32-39 42Paramecium caudatum 25 28-30Tetrahymena pyriformis 6-7 20-25 33 Cyclidium citrullus 18 43 47

* SD, sin datos.

los microorganismos pertenecen a esta categora. Casi todos los agentes patgenos humanos son mesfilos, como es de esperar, pues la temperatura corporal humana es, casi de forma constante, de 37 C. 4. Algunos microorganismos son termfilos; pueden crecer a temperaturas de 55 C, o superiores. La temperatura mnima es normalmente de 45 C, y la ptima es de 55 a 65 C. La inmensa mayora son bacterias, aunque algunos hongos y algas son termfilos (Tabla 6.5). Estos organismos crecen rpidamente en muchos habitat, incluyendo compost, pacas de heno, tuberas de agua caliente y aguas termales. Los termfilos se diferencian de


Figura 6.13 Rangos de temperatura para el crecimiento microbiano. Los microorganismos se pueden clasificar en categoras diferentes segn los rangos de temperatura de su crecimiento. En orden de menor a mayor temperatura de crecimiento, se clasifican en: psicrfilos, psicrotrofos, mesfilos, termfilos e hipertennfilos. En esta figura se representan los rangos y las temperaturas ptimas de estos cinco tipos.

los mesfilos por poseer muchas enzimas termoestables y sistemas de protenas capaces de actuar a temperaturas altas. Los lpidos de su membrana son tambin ms saturados que los de los mesfilos, con un punto de fusin ms alto; por ello, las membranas de termfilos permanecen intactas a temperaturas altas. 5. Como se ha mencionado anteriormente, unos pocos termfilos pueden crecer a 90 C, o ms, y algunos tienen una temperatura mxima de 100 C. Los procariotas con una temperatura ptima de entre 80 C y casi 113 C se denominan hipertermfilos. No suelen crecer bien por debajo de 55 C. Pyrococcus abyssi y Pyrodictium occultum son ejemplos de hipertermfilos marinos aislados en zonas calientes del suelo marino.

1. Defina pH, acidftlo, neutrfilo y acalfilo. Cmo pueden modificar los microorganismos el pH de su ambiente, y cmo puede minimizar el microbilogo este efecto?

2. Qu son las temperaturas cardinales? 3. Por qu aumenta la velocidad de crecimiento con la

temperatura, para disminuir de nuevo a temperaturas ms elevadas?

4. Defina psicrfilo, psicrotrofo, mesfilo, termfilo e hipertermfilo.

Concentracin de oxgeno

Un organismo que puede crecer en presencia de O2 atmos-frico es aerobio, mientras que otro que puede crecer en su

ausencia, es anaerobio. La mayora de los organismos su-periores dependen totalmente del O2 atmosfrico para su crecimiento es decir, son aerobios obligados. El oxge-no acta como aceptor final de electrones en la cadena trans-portadora de electrones durante la respiracin aerobia. Ade-ms, los eucariotas aerobios utilizan O2 para sintetizar esterles y cidos grasos insaturados. Los anaerobios facul-tativos no requieren O2 para crecer, pero lo hacen mejor en su presencia, en cuyo caso emplearn la respiracin aerobia. Los anaerobios aerotolerantes, como Enterococcus faeca-lis, pueden crecen bien tanto en su presencia como en su ausencia. Por el contrario, los anaerobios estrictos u obli-gados (p. ej., Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium pas-teurianum, Methanococcus) no toleran en absoluto el O2 y mueren en su presencia. Los anaerobios aerotolerantes y los estrictos no pueden producir energa mediante respiracin y deben utilizar vas de fermentacin o respiracin anaerobia para este objetivo. Finalmente, existen aerobios, como Campylobacter, denominados microaerfilos, que se alte-ran con niveles atmosfricos normales de O2 (20 %), preci-sando concentraciones inferiores para crecer (2-10 %). La naturaleza de las respuestas bacterianas al O2 puede estu-diarse fcilmente cultivando las bacterias en medios slidos, o en medios lquidos que contengan agentes reductores para disminuir los niveles de O2, como en el caldo tioglicolato (Figura 6.14). Transporte de electrones y respiracin aerobia (pp. 196-199); Fermentacin (pp. 192-194); Respiracin anaerobia (pp. 203-204).

Un grupo microbiano puede mostrar ms de un tipo de relacin con el O2. Entre las bacterias y los protozoos po-demos encontrar representantes de los cinco tipos. Los hon-gos son normalmente aerobios, pero un nmero de especies especialmente entre las levaduras son anaerobias facul-tativas. Las algas son casi siempre aerobias obligadas. Debe remarcarse que la habilidad para crecer en ambientes tanto aerbicos como anaerbicos proporciona una enorme flexi-bilidad desde el punto de vista de la adaptacin ecolgica.

Aunque los anaerobios estrictos mueren en presencia de oxgeno, se pueden aislar de habitat aerobios. En realidad, aunque el ambiente sea anaerobio, se encuentran en micro-ambientes anaerobios, gracias a la accin de anaerobios facultativos que utilizan el O2 disponible. Por ejemplo, el anaerobio estricto Bacteroides gingivalis vive en la boca, creciendo en las grietas de alrededor de los dientes.

Estas diferentes relaciones con el O2 parece que se deben a varios factores, incluyendo la inactivacin de las protenas y el efecto de los productos txicos del O2. As, algunas enzimas pueden inactivarse cuando se oxidan gru-pos sensibles como los sulfhidrilos. Un ejemplo destacado es la enzima nitrogenasa fijadora de nitrgeno (vase la sec-cin 10.4), que es muy sensible al oxgeno.

El oxgeno acepta electrones y se reduce fcilmente porque los electrones de sus orbitales externos no estn apa-reados. Las flavoprotenas (vase la seccin 8.5), otros constituyentes celulares y la radiacin (pp. 138-139) pro-mueven la reduccin de oxgeno. El resultado suele ser una


Figura 6.14 Oxgeno y crecimiento bacteriano. Ilustracin del crecimiento de bacterias con diferentes respuestas frente al oxgeno. Cada punto representa una colonia bacteriana individual en el agar o sobre su superficie. La superficie, que est expuesta al oxgeno atmosfrico, ser aerobia. El contenido en oxgeno del medio disminuye con la profundidad hasta que el medio se hace anaerobio hacia el fondo del tubo. La presencia y ausencia de las enzimas superxido dismutasa (SOD) y catalasa se indican en cada tipo celular.

combinacin de varios productos de reduccin: radical superxido, perxido de hidrgeno y radical hidroxilo.

O2 + e~ > Or (radical superxido) O27 + e" + 2H+ ---------- > H2O2 (perxido de hidrgeno) H2O2 + e~ + H+ ----- > H2O + OH- (radical hidroxilo)

Estos productos de reduccin del oxgeno son extre-madamente txicos y tienen un gran poder de oxidacin, destruyendo rpidamente los constituyentes celulares. Un mi-croorganismo debe ser capaz de autoprotegerse contra estos productos del oxgeno, de lo contrario lo destruiran. Son tan eficaces que los neutrfilos y macrfagos utilizan estos pro-ductos txicos del oxgeno para destruir agentes patgenos invasores. Destruccin dependiente de oxgeno de agentes pat-genos (pp. 774-777).

Muchos microorganismos poseen enzimas que ofrecen proteccin frente a productos txicos del O2. Los aerobios obligados y anaerobios facultativos contienen normalmente las enzimas superxido dismutasa (SOD) y catalasa, que catalizan la destruccin de los radicales superxido y per-xido de hidrgeno, respectivamente. La peroxidasa tambin puede ser utilizada para eliminar el perxido de hidrgeno.

Los microorganismos aerotolerantes pueden carecer de cata-lasa, pero casi siempre tienen superxido dismutasa. Lacto-bacillus plantarum, aerotolerante, utiliza iones mnganosos, en lugar de superxido dismutasa, para destruir el radical superxido. Todos los anaerobios estrictos carecen de ambas enzimas o las poseen en concentraciones muy bajas y, por ello, no pueden tolerar el O2.

Como los aerobios necesitan O2 y los anaerobios son destruidos por ste, hay que aplicar mtodos radicalmente

diferentes para cultivar estos dos tipos de microorganismos. Cuando se cultivan volmenes grandes de microorganismos aerobios, se agita el tubo de cultivo para airear el medio o se bombea aire estril en el tubo. En caso de microorganismos anaerobios, el problema es el inverso, hay que eliminar todo el O2. Esto se puede realizar de varias maneras. 1) Se pueden emplear medios especiales anaerobios, conteniendo agentes reductores como tioglicolato o cistena. Los agentes reduc-tores eliminarn el O2 disuelto presente en el medio, de manera que los anaerobios puedan crecer. 2) Se puede tam-bin eliminar el oxgeno retirando el aire con una bomba de vaco y, posteriormente, el O2 residual con nitrgeno gas (Figura 6.15). A menudo, se aaden CO2 y nitrgeno a la cmara de incubacin, pues muchos anaerobios necesitan cantidades pequeas de CO2 para crecer mejor. 3) Uno de los sistemas ms empleados para cultivar un nmero reduci-do de anaerobios es el recipiente de GasPak (Figura 6.16). Con este sistema, el ambiente se hace anaerobio utilizando hidrgeno y un catalizador de paladio, se elimina el O2 ya que se forma agua. Los agentes reductores eliminan tambin el oxgeno, como se ha descrito anteriormente. 4) Las bolsas de plstico pueden servir de contenedores idneos cuando se quieren incubar unas pocas muestras en condiciones anaero-bias. Estas bolsas contienen un catalizador y carbonato calcico para producir una atmsfera anaerobia, rica en dixido de carbono. Se aade una solucin especial al compartimiento del reactivo; se colocan placas de Petri en la bolsa, se cierra con una pinza y se introduce en una estufa de incubacin. Un laboratorio puede utilizar todas estas tcnicas pues cada una de ellas es adecuada para diferentes objetivos.

1. Describa los cinco tipos de relaciones con el O2 que se observan en los microorganismos.

2. Para qu emplean los aerobios el O2? Por qu es txico el O2 para muchos microorganismos; cmo se protegen de ste?

3. Describa cuatro maneras de cultivar microorganismos anaerobios.


Figura 6.15 Una cmara de trabajo e incubador para anaerobios. Este sistema anaerobio contiene un rea de trabajo libre de oxgeno y una estufa de incubacin. El compartimiento de intercambio, situado a la derecha del rea de trabajo, permite transferir materiales en el interior sin exponerlo al oxgeno exterior. La atmsfera anaerobia se mantiene en gran parte con una bomba de vaco y purgas de nitrgeno. El oxgeno restante se extrae con un catalizador de paladio e hidrgeno. El oxgeno reacciona con hidrgeno para formar agua, que se absorbe con un desecante.

Presin

La mayora de los organismos pasan la mayor parte de su ciclo vital en la tierra o sobre la superficie del agua, siempre sometidos a la presin de 1 atmsfera (atm), sin que sta los afecte de forma significativa. Sin embargo, el ocano pro-fundo (a 1000 o ms metros de profundidad) ocupa el 75 % del volumen total del ocano. Aqu, la presin hidrosttica puede alcanzar de 600 a 1100 atm, mientras que la tempe-

ratura es de 2 a 3 C. A pesar de estos extremos, las bacte-rias pueden sobrevivir y adaptarse. Muchas son barotole-rantes: un aumento de la presin las afecta negativamente, pero no tanto como lo hara a las bacterias no tolerantes. Algunas bacterias presentes en el intestino de invertebrados del ocano profundo, como anfpodos y holoturias son autnticos barfilos crecen ms rpidamente a presiones elevadas. Estas bacterias intestinales pueden desempear un papel importante en el reciclaje de los nutrientes en dicho habitat. Se ha aislado un organismo barfilo en la zanja Mariana cerca de las Islas Filipinas (a una profundidad de casi 10 500 m), que realmente es incapaz de crecer a presio-nes por debajo de 400 a 500 atm cuando se incuba a 2 C. Hasta ahora, hay representantes barfilos en diferentes g-neros bacterinos (p. ej., Photobacterium, Shewanella, Col-wellia). Algunas Archaea son termobarfilos (p. ej., Pyro-coccus spp., Methanococcus jannaschi). El medio marino (pp. 694-697).

Radiacin

Nuestro mundo es bombardeado por diversos tipos de radiacin electromagntica (Figura 6.17). Esta radiacin a menudo se comporta como si estuviese compuesta de ondas que se desplazan en el espacio como las ondas sobre la superficie del agua. La distancia entre dos picos o valles de una onda se denomina longitud de onda. A medida que dis-minuye la longitud de onda de la radiacin electromagn-tica, aumenta la energa de la radiacin los rayos gamma y X son mucho ms energticos que la luz visible o las ondas infrarrojas. La radiacin electromagntica acta tambin como un flujo de paquetes de energa, denomina-dos fotones, cada uno de los cuales posee un cuanto de energa, cuyo valor depender de la longitud de onda de la radiacin.

Figura 6.16 Sistema para anaerobios GasPak. Un sobre de GasPak produce hidrgeno y dixido de carbono. El catalizador de paladio en la tapa de la cmara cataliza la formacin de agua a partir de hidrgeno y oxgeno, eliminando por consiguiente el oxgeno de la jarra sellada.


Figura 6.17 Espectro electromagntico. La parte visible del espectro se ha ampliado en la parte inferior de la figura.

La luz solar es la principal fuente de radiacin de la Tie-rra. Comprende luz visible, radiacin ultravioleta (UV), rayos infrarrojos y ondas de radio. La luz visible es el aspec-to ms importante y destacado de nuestro ambiente: salvo excepciones, la vida depende de la capacidad de los organis-mos fotosintticos para captar la energa solar. Los rayos infrarrojos son la fuente principal de calor de la Tierra. Casi el 60 % de la radiacin solar se encuentra en la regin infra-rroja, el resto se corresponde con la parte visible del espec-tro. A nivel del mar, hay muy poca radiacin ultravioleta inferior a 290 a 300 nm. La radiacin UV de longitud de onda ms corta que 287 nm es absorbida por el O2 de la atmsfera terrestre; este proceso forma una capa de ozono entre 40 y 48 km por encima de la superficie terrestre. La capa de ozono absorbe rayos V de longitud de onda algo mayor y vuelve a formar O2. Esta eliminacin de la radia-cin UV es crucial porque es muy perjudicial para los siste-mas vivos (vase el Captulo 11). La distribucin bastante uniforme de la luz solar a lo largo del espectro visible es la razn por la que esta luz sea generalmente blanca. Foto-sntesis microbiana (pp. 209-215).

Muchas formas de radiacin electromagntica son muy perjudiciales para los microorganismos. Esto es especial-mente cierto en el caso de la radiacin ionizante, de longi-tud de onda muy corta (alta energa), que puede provocar que los tomos pierdan electrones, es decir, que se ionicen. Dos formas principales de radiacin ionizante son 1) los rayos X, que se producen artificialmente, y 2) los rayos gamma que se emiten durante la desintegracin de radioistopos. Nive-les bajos de radiacin ionizante producirn mutaciones y

pueden causar indirectamente la muerte, mientras que nive-les superiores son directamente letales. Aunque los microor-ganismos son ms resistentes a la radiacin ionizante que los organismos superiores, pueden ser destruidos con una dosis suficientemente grande. La radiacin ionizante puede utilizarse para esterilizar objetos, aunque algunas bacterias (p. ej., Deinococcus radiodurans) y las endosporas bacte-rianas pueden sobrevivir a dosis elevadas de radiacin ioni-zante. Uso de radiacin para destruir microorganismos (p. 154); Deinococcus (p. 505).

La radiacin ionizante puede producir cambios impor-tantes en las clulas: rompe los enlaces de hidrgeno, oxida los dobles enlaces, destruye las estructuras en anillo y poli-meriza algunas molculas. El oxgeno aumenta estos efectos destructivos probablemente por la generacin de radicales hidroxilo (OH-). Aunque pueden afectarse muchos tipos de constituyentes celulares, obviamente la destruccin del DNA es la causa ms importante de muerte celular.

La radiacin ultravioleta (UV), mencionada anterior-mente, puede destruir la mayor parte de los microorganis-mos debido a su longitud de onda corta (aproximadamente, de 10.a 400 nm) y alta energa. La radiacin UV ms letal tiene una longitud de onda de 260 nm, ya que es la longitud de onda que es ms absorbida por el DNA. El principal mecanismo de destruccin por radiacin UV es por la for-macin de dmeros de timina en el DNA (vanse las pp. 266-267). Dos molculas de timina contiguas en una cadena de DNA se unen covalentemente, inhibindose la replicacin y funcin del DNA. Este dao puede repararse de diferentes formas. Mediante la fotorreactivacin, la enzima fotorre-activadora emplea la luz azul para separar los dmeros de timina. Tambin se puede cortar la secuencia que contenga el dmero de timina y ser sustituida por otra; este proceso se produce en ausencia de luz y se denomina reactivacin oscura. Los daos tambin pueden ser reparados por la protena recA mediante recombinacin y reparacin va el SOS. Cuando la exposicin a UV es demasiado fuerte, el dao es tan extenso que no es posible repararlo. Mecanis-mos de reparacin del DNA (pp. 273-275).

Aunque llega muy poca radiacin UV por debajo de 290 a 300 nm a la superficie terrestre, la radiacin cercana al UV, entre 325 y 400 nm, tambin puede daar a los microorga-nismos. Este tipo de radiacin menos energtica induce la degradacin del triptfano para producir fotoproductos txi-cos. Parece ser que estos fotoproductos conjuntamente con la citada radiacin cercana al UV causan la rotura de las hebras de DNA. Se desconoce el mecanismo preciso, aun-que es diferente al observado con radiacin UV de 260 nm.

Aunque la luz visible es enormemente beneficiosa, ya que es la fuente de energa de la fotosntesis, a una inten-sidad suficiente puede daar o destruir clulas microbianas. Para ello, normalmente se precisan O2y pigmentos denomi-nados fotosensibilizadores. Todos los microorganismos ce-lulares poseen pigmentos como clorofila, bacterioclorofila, citocromos y flavinas, que pueden absorber energa lumni-ca, excitarse o activarse, y actuar como fotosensibilizadores.

6.5 Crecimiento microbiano en ambientes naturales 139

El oxgeno en estado de singlete es muy reactivo y un agente con gran poder oxidante, que destruye rpidamente una clula. De hecho, es unos de los agentes, quizs el prin-cipal, empleado por las clulas fagocticas para destruir las bacterias fagocitadas (vase la seccin 31.8).

En contraste con los pigmentos fotosensibilizadores, estn los pigmentos fotoprotectores. Muchos microorganis-mos que se transmiten por el aire o viven sobre superficies expuestas usan pigmentos fotoprotectores tipo carotenoide para protegerse frente a la fotooxidacin. Los carotenoides inactivan eficazmente el oxgeno en estado de singlete es decir, absorben energa de ste y lo convierten de nuevo al estado elemental no excitado. Tanto los microorganismos fotosintticos como los no fotosintticos utilizan este tipo de pigmentos.

1. Qu son bacterias barotolerantes y barflas? Dnde cree que podra encontrarlas?

2. Enumere los tipos de radicacin electromagntica en orden decreciente de energa o de aumento de longitud de onda.

3. Por qu es tan importante que la Tierra reciba un adecuado suministro de luz solar? Por qu es tan necesaria la capa de ozono?

4. De qu manera daan las radiaciones ionizante y ultravioleta y la luz visible a los microorganismos? Cmo se protegen los microorganismos frente al dao ocasionado por la luz UV y visible?

6.5 Crecimiento microbiano en ambientes naturales

En la seccin precedente se estudiaron los efectos sobre el crecimiento microbiano de determinados factores ambienta-les tales como la disponibilidad de agua, pH y temperatura. Aunque la ecologa microbiana ser estudiada en otros cap-tulos, ahora vamos a considerar brevemente el efecto del entorno ambiental como un todo sobre el crecimiento micro-biano. Ecologa microbiana (Captulos 28-30).

Limitacin del crecimiento por factores ambientales

El medio microbiano es complejo y en continuo cambio. En la naturaleza, los microorganismos normalmente estn expuestos a diferentes gradientes solapados de nutrientes, y a

otros factores ambientales. Esto es particularmente cierto para los microorganismos que forman parte de biofilms. Los microorganismos se multiplicarn en este tipo de microam-bientes hasta que un factor nutricional o ambiental limite este proceso. La Ley de Liebig del mnimo seala que la biomasa total de un organismo estar determinada por el nutriente que se encuentre en menor concentracin en re-lacin con los requerimientos de dicho organismo. Esta ley es aplicable tanto en laboratorios (Figura 6.2) como en ambientes acuticos o terrestres. Un incremento en un nutriente limitante esencial (p. ej, el fosfato) implicar un incremento en la poblacin microbiana hasta que algn otro nutriente se haga limitante. Si un nutriente especfico es limitante, los cambios en otros nutrientes no tendrn efecto. La situacin puede llegar a ser incluso ms compleja, ya que mltiples factores pueden ser limitantes, influyendo sobre una poblacin en el tiempo. Adems, como se indic anteriormente, factores como la temperatura, pH, luz y sali-nidad, influyen sobre las poblaciones microbianas y limitan su crecimiento. La Ley de Shelford de la tolerancia seala que hay lmites en los factores ambientales por encima y por debajo de los cuales un microorganismo no puede sobrevivir ni crecer, a pesar del suministro disponible de nutrientes. Este es el caso de la temperatura (Figura 6.13). Cada microorganismo tiene una rango especfico de tempe-raturas dentro del cual puede crecer. La misma regla se aplica a otros factores como el pH, nivel de oxgeno, y la presin hidrosttica en el medio marino. Es decir, el creci-miento de un microorganismo depende tanto del suministro de nutrientes como de su tolerancia a las condiciones ambientales. Biofilms (pp. 668-670).

La mayora de los microorganismos tienen que afrontar deficiencias que limitan sus actividades, excepto cuando nutrientes en exceso permitan un crecimiento ilimitado. Sin embrago, un crecimiento tan rpido agotar enseguida los nutrientes y posiblemente provocar la emisin de productos residuales txicos, que limitarn el crecimiento.

Como respuesta a un nivel bajo de nutrientes (medios oli-gotrficos), muchos microorganismos se vuelven ms com-petitivos en la captacin de nutrientes y en la explotacin de los recursos disponibles. A menudo, la morfologa del orga-nismo variar para aumentar su rea de superficie y la capaci-dad para absorber nutrientes. Esto puede explicar la transfor-macin

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Microbiología Prescott Capítulo 6