Microbiologie - Geni Haemophilus.bordetella.legionella.corynebacterium

• Familie PasteurellaceaeO Gen HaemophilusO Gen Actinobacillus

Curs XXII. Haemophilus, Bordetella, Legionella, Corynebacterium

Genul Haemophilus

1. MinidefinitieII. Incadrare taxonomicaIII. HabitatIV. Implicare in patologia umanaV. Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si

diagnosticul microbiologieVI. Factori de patogenitateVII. PatogenieVIII. Raspunsul imun. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilorIX. Diagnosticul de laborator

Cuvinte cheie:cocobacili gram negativi, pretentiosi, capsulă; factori X si V;afecteaza gazde cu imunitate compromisa; localizari diverse: tract respirator,sistem nervos central, genito-urinar, septicemii, localizari secundare articulare,cardiace, digestive etc.

Infecţii nosocomiale, rezistenţa antibiotice

1. Minidefinitie

Din Genul Haemophilus fac parte cocobacili si/sau bacili Gram negatrvi,facultativ anaerobi, imobili, nesporulati (tulpinile virulente sunt capsulate), pretenţioşinutritiv, care au nevoie de factori din sange pentru a putea sa se dezvolte:

O Factor X = hematinaO Factor V = NAD

Unele specii pot fi condiţionat patogene, provocând la gazde cu imunodeficienţeinfecţii cu cele mai diverse localizări.

Denumirea speciei tip, atribuită de Pfeiffer, provine dintr-o confuzie iniţială cuagentul cauzal al gripei (Haemophilus = iubitor de sange; injluenzae = al gripei),deoarece era frecvent izolat în timpul marii pandemii de gripa din 1889 - 1892.

Ulterior, Smith, Andrews si Laidlaw au demonstrat rolul secundar al Hirfluenzae. Cu toate acestea, alături de Streptococcus pneumoniae, Staphzlococcus aureusşi mai rar alte bacterii condiţionat patogene este implicat în complicatia bacteriană acazurilor de gripă, care poate îmbrăca adesea aspecte severe, mai ales la vârste extreme şila pacienţi care prezintă alţi factori de risc.

II. Incadrare taxonomica

1

2

o Gen Pasteurella• Inrudiri:

O EnterobacteriaceaeO VibrionaceaeO Aeromonaceae

III. Habitat

H influenzae colonizează mucoasele omului, altor mamifere, păsărilor, peştilor,reptilelor. Sunt comensali ai tractului respirator, căilor genitale, intestinului. Se pot întâlni lanivelul plăcii dentare.

Spre deosebire de H. inf1uenzae, H aegyptius si H ducreyi sunt totdeauna patogeni.

IV. Implicare in patologia umana:

Speciile care sunt totdeauna patogene sunt:• H ducreyi - agentul cauzal al şancrului moale;• H aegyptius - agentul cauzal al conjunctivitei purulente şi febrei braziliene

Speciile care pot provoca infecţii la gazda imunocompromisă sunt:• H influenzae in special serovar b• H parainjluenzae• H aphrophilus

Speciile dependente numai de Factor V sunt denumite prin adăugarea prefixului"para".

Principalele forme de infecţii cauzate de haemofili sunt:• Tract respirator - pneumonii, meningite, epiglotita acută, otita medie: în special

tulpinile capsulate• Celulite• Bacteriemii, septicemii• Artrite, pericardite, endocardite, osteomielite• Infectii genitale si materno-fetale• Infectii ale plăgii• Infectii digestive, biliare

V. Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza sidiagnosticul microbiologie

În cazul heamophililor se descrie polimorfismul morfologic legat de condiţiile decreştere şi vechimea culturii (Fig. 1)

Există, de asemenea, diferente în relaţie cu specia.Haemophilii sunt "Gram la limita":. Se decoloreaza mai greu, prind mai greu

coloraţia secundara: se utilizeaza totdeauna fucsina, NU SAFRANINA.

Fig. 1. Frotiu cu Haemophilus injluenzae - polimorfism

Se dezvoltă numai pe medii bogate, suplimentate cu peptone, glucoza etc.Necesita Factor X si V; uneori numai V sau X.

• Factorul X, termostabil ( 45 min la 120 o C), este un precursor al hemului,protoporfirina IX

• Factorul V, termolabil (15 min la 90 o C), este NAD sau NADP - inactivati depirofosfataza si nicotinamindezoxiribonucleazaAceşti factori pot fi obţinuţi prin diferite metode:- şocolatizarea mediului cu adaos de sânge, adică Încălzirea treptată la 80 o e, şi

menţinerea acestei temperaturi timp de 10 minute. Factorii X şi V sunt eliberaţi prindistrugerea hematiilor.

- adăugarea de suplimente cum sunt: factor X şi V, supliment Fildes, Levinthal et.- hemoliza cu eliberarea conţinutului hematiilor prin cultivarea pe mediul de

izolare a unui striu de stafilococ hemolitic. În acest caz se observă fenomenul desatelitism, adică creşterea hemofilului doar lângă striul de stafilococ (Fig. 2).

Fig. 2. Satelitism la Haemophilus

Unele specii sunt capnofile: H. ducreyi, aphrophylus, unii H. parainjluenzae

3

IX. Diagnosticul de laborator

Pentru creştere, haemofilii au nevoie de umiditate şi uneon de incubareprelungită, mai ales după tratamente cu antibiotice.

Pentru H ducreyi, incubarea trebuie prelungită la 5 zile.În cazul prelevatelor înalt contaminate se folosesc medii selective.

VI. Factori de patogenitate

Principalii factori de patogenitate sunt: capsula, lipooligozaharidul, cu rol îninflamaţie, proteinele membranei externe Pl şi P2.

Toate tulpinile virulente produc neuraminidaza si o protează IgA, dar rolul lor nueste dovedit.

Fimbriile cresc aderenţa bacteriei la mucoase. De asemena, pe hematii există unantigen la care hamofilii se pot ataşa cu ajutorul fimbriilor (antigenul Anton).

VII. PatogeniePrincipalele faze ale instalării infecţiei sunt:

aderenţapătrunderea în submucoasăpătrunderea în circulaţie prin limfatice, vase de sânge, unde rezistă datorităcapsuleipoate pătrunde la nivelul LCR, prin depăşirea barierei hematoencefalicefenomene generale provocate de endotoxemie, cu sindrom febril, mergând încazurile grave până la sindrom de coagulare intravasculară diseminată (CIVD)

VIII. Raspunsul imun. Noţiuni de epidemiologie si profilaxie a infecţiilor

Anticorpii protectori pot fi sintetizaţi activ sau transmişi de la mamă la făt sau lasugar. In absenta imunizării, titrul Ac la copii de 2 luni - 3/4 ani este minim. De aceea, seimpune vaccinarea de la 2 luni.

Incidenţa bolii este invers proportională cu titrul anticorpi lor bactericizi în sânge,achiziţionaţi pasiv de la mamă sau sintetizaţi activ.

Există vaccinuri conjugate, care se pot administra la copii, cum sunt cele careasociază polizaharidul capsular cu anatoxina difterică, sau cu proteine din membranaexternă a N. meningitidis.

Diagnosticul de infecţie cu haemophili trebuie făcut prin corelarea atentă a datelorclinice cu cele de laborator, având în vedere faptul că haemophilii fac parte din floranormală a căilor respiratorii. Prezenţa factorilor de risc şi a semnelor de infecţiebacteriană în absenţa altor microorganisme cu patogenitate recunoscută poate conduce ladiagnosticul unei infecţii cu haemophili.

Hemoculturile sunt pozitive in peste 50% din cazurile simptomatice, cu exceptiacelor cu conjunctivită.

Prezenţa Poliribitolfosfatului în ser şi LCR şi concentrarea lui în urină apare înmai mult de 95% din cazurile de meningită cu H injluenzae.

4

Identificarea preliminară şi definitivă se face astfel:Identificare preliminara: Crestere comparativă pe medii cu factori V, X si VX,la aer şi în atmosferă cu C02Identificare definitivă etapizată, prin stabilirea spectrului metabolic faţă deaminoacizi, zaharuri etc.; sunt 8 biotipuri de H injluenzae, dupăcomportamentul biochimie faţă de indol, urează, omitină.

Pentru cultivare se utilizează Medii speciale pentru haemophili:O Geloza sange de cal sau iepureO Geloza soco latO Geloza cu factori X şi VO Geloza XV diferenţialăO Geloza LevinthalO Geloza FildesO Medii selective

Pentru scopuri epidemiologice se utilizează tipizarea prin metode imunologice,pentru incadrare în tipuri in funcţie de particularităţile unor antigene structurale (capsula,proteine ale membranei exteme, lipooligozaharid, proteine fimbriale etc.) sau prinmetode moleculare bazate pe analiza ADN.

Genul Bordetella

1. MinidefiniţieII. Incadrare taxonomicăIII. HabitatIV. Implicare în patologia umanăV. Microbiologie - principalele caractere şi implicaţii în patogeneză şi

diagnosticul microbiologieVI. Factori de patogenitateVII. PatogenieVIII. Răspunsul imunIX. Noţiuni de epidemiologie şi profilaxie a infecţii lor nosocomialeX. Diagnosticul de laborator

5

1. Minidefiniţie

II. Incadrare taxonomică

Domeniu: BacteriaPhylum: ProteobacteriaClasa: BetaproteobacteriumOrdin: BurkholderialesFamilia AlcaligenaceaeGenul Bordetella

Speciile genului cu importanţă medicală: B.pertussi, B.parapertussis,B..bronchiseptica, B.holmesii

III. Habitat

Genul Bordetella cuprinde specii obligatoriu parazite pentru om sau animale, cutropism pentru mucoasa respiratorie, supravietuire f. scurta in mediul exterior (2 ore)

Sunt distruse de antiseptice si dezinfectante uzuale, UV, temperatura de 55 o Ctimp de 30 minute.

IV. Implicare in patologia umana

• B.pertussis, B.parapertussis: izolate numai la om, sunt agenti etiologici ai tuseiconvulsive

• B.bronchiseptica: izolata de la animale (infectii respiratorii), rar intalnita la om(imunodeprimati)

• B.holmesii: izolata din hemoculturi la om (tineri cu afectiuni subiacente)

Tusea convulsiva

Poate surveni la toate varstele, mai frecvent la nou- nascuti si copii cu vârste sub5 ani (nevaccinati)

La nou-nascuti, chintele clasice de tuse pot fi inlocuite de crize de apnee, alterareimportanta a starii generale, varsaturi, accese de cianoza, tuse paroxistica

La adulti: semnele clinice clasice sunt f.rare, diagnosticul dificil sau absent

Boala evolueaza in 3 faze:

Incubatie : silentioasa de 8 zile (maxim. 14 zile)Faza catarala (10 - 15 zile): rinoree, febra moderata (38oC), tuse discretanespecifica, neproductiva, tenace, noctumaFaza paroxistica (stadiul convulsiv, perioada de stare, 15-20 zile): chinterepetate de tuse spasmodica, emetizante (10-30 pana la 40 in 24 ore),expectoratie vascoasa, dificila, urmata de varsaturi, insotite de inspiratie

6

Tratata cu formaldehida, toxina pierde activitatileantigenicitatii.

biologice cu pastrarea

profunda, sonora, prelungita (latrat de caine sau zbierat de magar),limfocitoza ( pana la 40 000/mm3 )Faza de convalescenta (3-4 saptamani)


Bacteriile din Genul Bordetella sunt cocobacili mici (0,2-0,3Jlm pana la 0,5-1um), gram negative, dispusi izolati, perechi, rareori lanturi scurte. Bordetella pertussis,parapertussis şi holmesii sunt specii mobile, strict aerobe, cu metabolism respirator,exigente nutritive mari: cultiva numai pe medii cu aminoacizi, vitamine, saruri minerale,substante neutralizante (amidon, carbune). Nu necesita factori X si V. Temperaturaoptima de cultivare este de 350-370 C.

Speciile genului Bordetella sunt in general inactive metabolic. Nu fermenteazahidratii de carbon, nu produc gaz, nu produc indol si hidrogen sulfurat, nu lichefiazagelatina, dar alcalinizeaza laptele turnesolat


Adezine• Hemaglutinina filamentoasa (FHA) - in fimbrii, se fixează pe celulele ciliate,

limfocite si macrofage, are rol in imunogenitate• Aglutinogenele - in fimbrii, se fixează pe celulele ciliate, determina serotipulla

B.pertussis (serotipuri majore 1, 2, 3 )• Pertactina - proteina de suprafata ce intervine in procesul de adeziune

Toxine1.Toxina pertussis(PT)-proteina hexamerica tip A-B (comuna la germenii gram

negativi). Este raspunzatoare de:- limfocitoza (semn important in tusea convulsive)- cresterea sensibilitatii la histamina- cresterea secretiei de insulina (factor hipogliceminat)- efect adjuvant manifestat prin cresterea raspunsului in anticorpi IgM, IgG si IgE

B.parapertussis si B.bronchiseptica poseda copii inactive ale genei responsabilede sinteza PT

2.Adenilat ciclaza (AC) - proteina complexa bifunctionala, cu activitateenzimatica si hemolitica

- forma intracelulara (endotoxina), termostabila;apare numai la B.pertussis- forma extracitoplasmatica (exotoxina), solubila, termolabila la 560C; comuna de

specie si responsabila de:

7

4. Citotoxina traheala (TCT) - produce ciliostaza cu distrugere celulara

a) cresterea secretiei seromucoase a cailor respiratorii;b) permeabilizarea mucoasei respiratorii pentru PT;c) inhibare a functiei polimorfonuclearelor si macrofagelor alveolare.

3. Toxina dermonecrotica (HLT) - termolabila, se inactiveaza in 15 min. la 56oC,se elibereaza prin liza germenilor

5. Lipopolizaharidul (LPS) - endotoxina, termostabila, cu structura asemanatoarecu cea de la Enterobacterii, dar cu actiune pirogenica mai scazuta

VII. Patogenie

Bipertussis are tropism pentru celulele ciliate ale epiteliului respirator, adera pecilii vibratili celulari si se multiplica rapid, produce paralizia cililor, activarea secretiilormucoase. Nu produce bacteriemie

VIII. Raspunsul imun

Răspunsul imun este de tip umora!.

IX. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomiale

B.pertussis şi parapertussis, speciile importante in patologia umana, suntraspunzatoare de tusea convulsiva, boala infectocontagioasa cu declarare obligatorie.

Habitatul natural este mucoasa respiratorie. Transmiterea se face direct pe caleaeriana de la om la om. Contagiozitatea este prezentă in faza catarala.

Receptivitatea este generala. Boala evolueaza endemo-epidemic cu "peak"-uri lainterval de3-4 ani.

În tarile cu protectie vaccinala buna, epidemiile sunt rare, spre deosebire de tarilecu acoperire vaccinala slaba, în care incidenta este crescuta.

Alte microorganisme care pot provoca sindrom de tuse convulsivă"nonbordetella" sunt: adenovirusuri, VRS, Mycoplasma pneumoniae

X. Diagnosticul de laborator

Se prelevă secreţii faringiene, cu ajutorul unor tampoane speciale, din dacron saualginat de calciu (bumbacul este inhibitor), cu formă curbată, pentru a atinge faringeleinferior.

O variantă mai puţin eficientă este metoda "plăcii tuşite", constând în pregătireaunei plăci cu mediu Bordet-Gengou, care se pune În faţa cavităţii bucale a pacientului, întimpul accesului de tuse.

• Diagnostic direct: punerea in evidenta a agentului etiologie- imunofluorescenta directa (IFD)- cultura- cercetarea producerii de adenilat ciclaza

8

Tratament

-PCR• Diagnostic indirect urmăreşte evidenţierea răspunsului imun in anticorpi, a

modificărilor în formula (hiperlimfocitoza), evidenţţierea hipoglicemiei

Diagnosticul direct

Prelevarea probelor se face precoce, la debutul bolii, inaintea administrarii deantibiotice.

Tip de prelevat: aspirat nazo-faringian sau bronsic (in mediu spitalicesc), tamponnazo-faringian (Dacron sau calcium alginate), "placa tusita"

Conditii de transport: insamantare la patul bolnavului sau mediu de transportRegan-Lowe semisolid selectiv, mediude transport universal ( Amies, Stuart)

Cultivarea se face pe mediu Bordet-Gengou selectiv si neselectiv (infuzie decartofi, glicerina, sange defibrinat de oaie, cefalexina sau meticilina) sau mediu Regan-Lowe (carbune activat, amidon, sange de cal)

lncubarea se face la 350 - 370 C, aerobioza, atmosfera umeda 3-4 zile pana la 7zile.

Identificarea se face pe baza caracterelor morfotinctoriale, caracterelor de cultura,caracterelor biochimice, antigenice (aglutinare pe lama)

Diagnosticul indirect:

Diagnosticul serologie este util pentru diagnosticul cazurilor cultura negativesau PCR nerealizabil.

Supravegherea epidemiologica se realizează prin diagnosticul cazurilor de boalăşi diagnosticul retrospectiv (in faza de convalescenta), Acesta din urmă se efectueaza pedoua probe de seruri recoltate la debut si la 3-4 saptamani de boala.

Metode de diagnostic serologie:a) reactia de aglutinare in tuburi (tip Flosdorf) - punerea in evidenta a Ac

aglutinanti antipertussis si antiparapertussisb) ELISA - determinare IgA (boala) si IgG (boala si vaccinare)

- determinare Ac anti-PT, anti-FHA

• Tratament simptomatic si preventiv:- izolare la domiciliu sau spitalizare- fluidifiante bronsice si mucolitice- sedative ale tusei

• Antibioterapia: eritromicina - antibiotic de electie; alternativa: cotrimoxazol,fluorochinolone; tratament cu eritromicina la contacti

Imunoprofilaxie

Vaccinare: Vaccinul DTP (diftero-tetano-pertussis) - 3 inoculari incepand dela 2 luni, la 2 luni interval si rapeluri in caz de contact cu un caz confirmat: - anatoxina

9

III. Habitat

difterica, anatoxina tetanica, Vaccin Pertussis corpuscular; Varianta - vaccin pertussisacelular

Legionella


diagnosticul microbiologieVI. Factori de patogenitateVII. PatogenieVIII. Raspunsul imunIX. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomialeX. Diagnosticul de laborator

Cuvinte cheie: bacil Gram negativ, biofilm sisteme alimentare cu apa, pneumonie

1. Minidefinitie

Legionella pneumophila este un bacil gram negativ, necapsulat, nesporulat, carese dezvoltă în mediu cu umiditate crescută, ca de exemplu sistemele de alimentare cu apăsau de umidificare a aerului, de unde pot ajunge în căile respiratorii ale omului şi potprovoca îmbolnăviri, în special la gazde cu imunitate scăzută.


Familie de 46 specii si 64 serogrupuri : L. pneumophila - specia cea maiimportanta in patologia umana - responsabila de peste 95 % din imbolnaviri - L.pneumophila serogrup 1 asociata la peste 80 % din cazuri

• Temperatura inferioara la 50De,• Zone "moarte", prezenta de biofilm, de alte micro organisme din mediul acvatic,

cum sunt cianobacteriile sau amoebele libere (Fig. 1=sau prezenta unor materiale,cum sunt: fier, zinc, PVC).

10

Fig. 1. Legionella şi amoeba în structura biofilmului


Legioneloza = pneumonie cu debut la nivelul comunitatii sau nosocomiala,provocata de bacterii din genul Legionella, facultativ intracelulare, Gram negative, cutropism hidric, larg raspandite in natura - ecosisteme naturale (ape dulci, zone umede) siretele de distributie a apei

Forme clinice• legioneloza sau maladia legionarilor - incubare 2-10 zile, sindrom pseudogripal,

febra, tuse seaca, cefalee, mialgie, anorexiefebra de Pontiac

• forme extra-pulmonare


Bacili Gram negativi (slab colorati), nesporulati, necapsulati, 0,3 - 0,9 Jlml2 - 20um, cu tropism hidric


Prtincipalul factor de patogenitate este capacitatea de supravieţuire intracelulară

VII. Patogenie

Pătrunsă la nivelul celulelor fagocitare, Legionella supravieţuieşte Ia nivelulfagozomului, unde se multiplică. La suprafaţa celulei sunt exprimate antigene proprii

11

Fig. 2. Legionella şi relaţia sa cu fagocitul

bacteriei, pentru ca în final fagocitul să fie distrus, iar bacteriile să treacă la altecelule.(Fig. 2)

VIII. Raspunsul imun

Răspunsul imun este de natură umorală.IX. Notiuni de epidemiologie si profilaxie

Legioneloza se manifesta in tot timpul anului, cu varfuri vara si toamnaFactori de risc:

a. Varsta (> SO ani)b. Sex (masculin)c. Tabagismd. Etilisme. Tratamente imunosupresoare cu boli asociatef. Expunere prelungita si repetata la surse de contaminare (calatorii, hoteluri,

centre de ingrijire sau de odihna etc.)Contaminare prin inhalare de apa contaminate, prin aerosoli contaminati

• Declararea cazului obligatorie pentru a permite detectarea precoce a cazurilorgrupate.

Prevenţie

• Preventie: supraveghere a mediului si clinica - program de intretinere constantaa retelelor (curatire pt. eliminare tartru, circulare permanenta a apei cu eliminareazonelor moarte, o temperatura suficienta a apei (60°C la locul de producere siSO°C la punctele de utilizare).

12

• Franta: obiectiv tinta in institutiile de sanatate - mentinerea concentratieilegionelelor < 103 UFC / litru apa.

X. Diagnosticul de laborator

• Dg. de certitudine: pneumonie asociata cu criterii biologice clare (Ag urinar sicultivare)

• Imunofluorescenta directa• Cultivare• Antigene urinare• Serologie• PCR

Cultivare

• Creste lent, in 3-10 zile, pe medii speciale: BCYE ("Buffered Charcoal YeastExtract") continand cisteina, fier si carbune

• Bacterii aerobe strict, capnofile (2,5%)• Colonii cu aspect caracteristic (en "verre fritte" = sticla pisata) (lupa binoculara

marire x 30) (Fig. 3).• Identificare prin imunofluorescenta directa sau latex-aglutinare cu Ac specifici

Fig. 3. Aspect de sticlă pisată al colonii lor pe medii de cultură

Depistarea antigenelor urinare

Depistare simpla, rapida si precoce a Legionella pneumophila serogrup 1.antigenele apar precoce: la 2 - 3 zile dupa semnele clinice (88 % din cazuri).Excretie lunga si variabila: de la cateva zile la 2 luni, p. la 1 anPrezenta Ag nu e influentata de antibioterapie

13

Ordin :Actinomycetales;

Tratament

• Antibiotice eficace: macrolide, fluoroquinolone, tetracicline si rifampicinanu se recomanda antibiograma in vitro (este intracelulara)

Genul Corynebacterium


diagnosticul microbiologieVI. Factori de patogenitateVII. PatogenieVIII. Raspunsul imun. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilorIX. Diagnosticul de laborator

cuvinte cheie:

1. Minidefinitie

Corznebacteriile constrtuie un grup heterogen de bacterii coryneforme cucaractere morfologice, metabolice si structurale commune, Gram pozitivi (exceptie C.diphtheriae - Gram pozitivi la limita in culturi vechi; granulatii intens G+)

Sunt bacili drepti sau usor curbati, cu capete frecvent maciucate, segmentecolorate neregulat, aspect barat sau segmentat prin prezenţa granulaţiilor metacromatice(se coloreaza in rosu cu coloranti albastri) de polimetafosfat.

Uneori apar ca bacili subtiri, usor ascutiti, alteori ovoidali sau cocali.Asezarea este caracteristică in litere ascutite: V, Y, L, litere chinezesti sau

palisade, rar celule paralele


Domeniu: Bacteria;

Phylum: Actinobacteria;

Familie: Corynebacteriaceae;

14

Difteria este o boala infectioasa acuta cu evolutie endemo-epidemica manifestată

Gen: Corynebacterium

III. Habitat

Corynebacteriile colonizează mucoase si tegumente la om si unele animale (cai,caini, maimute); la om, rezervorul este constituit din bolnavi şi purtătoribolnavi, purtatori


Clasic:, numai C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis (fost ovis) erauimplicate în patologia umană.

• Forme: de boală erau:difterie;

- septicemii, endocardite, infectii osteoarticulare - posibil C. diphtheriaetoxigen sau netoxigen, la pacienţi imunosupresaţi, uneori chiar la vaccinati

• In prezent si alte specii sunt implicate, la persoane cu deficit imunitar.• Aspecte clinice la alte specii: C. ulcerans- difterie, diphtheria-like, faringite acute,

infectii cutanate, abcese

pnn;• Fenomene inf1amatorii locale• Pseudomembrane la nivelul faringelui (diphtheria = membrana)• Tulburari toxice generale datorate exotoxinei• Mortalitate crescuta: aritmie cardiaca datorata miocarditei difterice• Asfixie acuta datorita extinderii membranelor in laringe• Romania 0%000; ultimul caz difterie 1989; ultima tulpina toxigena la CNR-

1998• reemergenta in 14 din 15 foste state URSS: datorită ratei redusa de vaccinare la

copii, cresterii susceptibilitatii populatiei adulte, insuficientei supravegheri a boliisi circulatiei agentului patogen

Fenomene locale la nivelul amigdalelor• falsa membrana (Fig. 1) care acopera amigdalele cu un depozit cenusiu, aderent,

care se detaseaza greu, lasand tesuturile sangerande; are tendinta de extindere inrino-faringe; apare ca raspuns inf1amator la necroza celulara determinata de toxinadifterica eliberata de localizarea bacilului difteric in straturile superficiale alemucoasei

• adenopatia ganglionilor regionali• edem al tesuturilor locale (gat proconsular) - Fig. 2• fenomene generale (febra 38-39°, tahicardie, paloare, dispnee, varsaturi,

hipotensiune)• examenele de laborator indica: leucocitoza, albuminurie• in exudatul recoltat din falsa membrana se identifica prezenta bacilului difteric;• titrul anticorpilor antidifterici la bolnav este :S0,01UI/ml

15

Formele clinice:- clasic, difteria faringo-amigdaliana care poate evolua cu extinderea membranei sprelaringe, unde poate determina fenomene locale de tip mecanic (crup difteric)- rinita difterica- difteria oculara, pe conjunctiva- difteria vulvara- difteria cutanata- forme atipice la persoane tratate anterior cu antibiotice,sau la persoane care prezintaun nivel de protectie =O,OlUI/mlForme: usoare, medii, grave; uneori forme hipertoxice, cu simptomatologieexacerbata si evolutie fulminanta.Agenti cauzali: C. diphtheriae, C. ulcerans (produce o toxina identica imunologie sica activitate cu toxina difterica). Producerea de toxina este efectullizogenizariitulpini lor C.ulcerans cu fag difteric; este neutralizata de serul antidifteric.Fenomenele toxice se datoreaza leziunilor produse prin fixarea ireversibila a toxineila nivelul tesuturilor specializate (miocard, glande suprarenale, rinichi, muschi netezi,sistem nervos):• miocardita acuta• tardiv, paralizii post difterice cu localizare pe nervii cranieni (oculomotor, gloso-

faringian)• polinevrite tardive

paralizii de diafragmDecesul se produce prin fenomene de miocardita

Fig. 1. Falsa membrana

16

Fig. 2. Gat proconsular în difterie

Fig. 3. Difterie cutanată

v. Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza sidiagnosticul microbiologie

• 1896 - Bacillus diphtheriae redenumit C. diphtheriae - Lehman Neuman

C. diphtheriae are rezistenta redusa la temperatura umeda; este omorat in 10' latemperatura de 60oC. Este, usor distrus de alcool si antiseptice uzuale, rezistent lauscaciune, poate persista in praf timp indelungat.În cultura pe mediu Loeffler ferit de lumina si in mediu uscat, bacilul difteric poate fimentinut viabil 2-3 luni la temperatura camerei; la temperatura de +4oC viabilitateaculturii de bacil difteric este foarte redusa; pentru acest motiv, culturile stoc vor fimentinute la temperatura camerei in tuburi sigilate.

17

Este sensibil la antibioticele uzuale in special la eritromicina, penicilina,cloramfenicol, tetraciclina, gentamicina; prezinta insa sensibilitate redusa laoxacilina; sunt citate cazuri de rezistenta la penicilina (in special C.d. gravis),tetraciclina, lincomicina, neomicina, trimethoprim, rifampicinaEste sensibil la actiunea bacteriofagilor difterici

Fig. 5. Corynebacterium diphtheriae - morfologie microscopică

• Peretele celularmuropeptida care contine meso c.s-acid diaminopimelic;peptidoglican, arabinogalactano componenta avand la baza un glicolipid, un diester al trehalozei carecontine acidul corynemicolic si corynemicolenic - cord factor cu efectde virulenta si invazivitate, determinata de actiunea locala a germenuluifata de tesuturi.proteine situate la suprafata considerate antigene termolabile specificede tip; antigene K Lantrop; fixarea acestora de peretele celular si rolullor in infectie si imunitate nu au fost pana in prezent clarificatereceptori pentru bacteriofagii specifici la exterior

• Stratul cel mai intern, reprezentat de membrana plasmatica careia i serecunoaste o participare activa in producerea de toxina difterica.

• Granulele de polifosfat (corpusculii metacromatici Babes-Ernst) - ininteriorul celulei; asezate polar sau subpolar; apar in special in conditii deanaerobioza si constituie elemente de diagnostic diferential fata de speciile cuhabitat comun.

• Material genetic - uneori in genomul bacterian material genetic apartinandunui fag temperat care determina starea de lizogenie si toxinogeneza.

• Pe mediu Loeffler (electiv):- Bacili Gram pozitivi la limita, 1-8 ~ lungime; 0,3-0,5 ~ grosime

18

Polimorfism accentuat: sinteza neechilibrata mureina in medii cu proteineserice, în prezenta Fe si fosfati in mediul de cultura, în culturi vechiDispozitie: X, Y, V, LInegalitate tinctoriala - corpusculi Babes-Emst 1888 - granule polifosfat(Gram violeti pe fond rosu, AM rosu pe fond albastru); mitis: bacili lungi,moniliformi; intermedius: bacili lungi, burati; gravis: bacili scurti, maiuniformi (putine granule)

• Aspect cocoidal, ovoidal pe alte medii: Gundel- Tietz, Tinsdale• I.Pe medii solide:

Loeffler:• C.diphtheriae: cultura semicremoasa,granulara; alte specii din genul

Corynebacterium: cultura lucioasa, cremoasaGundel- Tietz (geloza-sange-cistina-telurit)

C.diphtheriae varianta gravis (Fig. 6): colonii de 1-2 mm, plate, cu marginilecrenelate, cu striatii radiale, suprafata granulara, consistenta friabila; se emulsioneazagreu; coloniile sunt negre, cenusii, sau negre cu marginea transparenta; cand coloniaeste bine izolata si dezvoltata aspectul ei este de margareta;

Fig. 6. Corynebacterium diphtheriae varianta ravis

C.diphtheriae varianta intermedius (Fig. 7) : colonii de marime variabila mijlociisau mici, cu diametrul de 0.5-0.75 mm, cu aspect plat si centrul usor mamelonat, cumargini circulare, cu suprafata granulara sau lucioasa; coloniile sunt negre, iarmarginea lor este mai transparenta.

Fig. 7. Corynebacterium varianta intermedius

19

C.diphtheriae varianta mitis (Fig. 8) : colonii de marime variabila cu diametrul de1-2 mm, convexe, cu suprafata lucioasa si consistenta cremoasa; prin invechirecoloniile devin mai plate si suprafata mai granulara.

Aspecte asemanatoare apar si pe alte medii care contin telurit: mediu Hoyle-telurit, sauMcLeod (geloza-sange-telurit).

Fig. 8. Corynebacterium varianta mitis

Pe mediu cu agar sânge (Fig. 9):

• Aspecte similare cu cele de pe Gundel- Tietz; caracteristic, coloniile auculoarea alb-gri perle:- gravis, colonii margareta, suprafata granulara, friabile- intermedius, plate,uneori acuminate,margini circulare, suprafata

granulara, consistenta sem icre moasa- mitis,colonii circulare, convexe, lucioase, consistenta cremoasa

Fig. 9. Corynebacterium diphtheriae pe mediu cu agar-sânge

20

Pe mediu Tinsdale modificat (geloza-ser-cistina-telurit-tiosulfat) - Fig. 10

• Cidiphtheriae indiferent de biotip se dezvolta sub forma de colonii mici,negru-cenusiu, cu halou cafeniu net bine delimitat; haloul isi intensificaculoarea dupa 48 ore. Mediul permite diferentierea Cidiphtheriae, Culceranssi Cpseudotuberculosis de alte specii din cadrul genului Corynebacteriumcare sunt inhibate cantitativ pe acest mediu, sau daca apar sunt lipsite dehalou

Fig. 10. Corynebacterium diphtheriae pe mediu Tinsdale

Pe medii lichide

Pe medii lichide• Cdiphtheriae gravis creste cu pelicula, depozit, bulionul ramane limpede• Cidiphtheriae intermedius formeaza inel la suprafata, tulbura usor

mediul,formeaza depozit

21

• Toxina difterică este o exotoxina produsa de Cdiphtheriae toxigen, secretata inmediu; nu este eliberata prin liza celulara

• Tulpinile de Cdiphtheriae apartinand tuturor tipurilor biochimice si culturale,produc o toxina unica, universal neutralizata de serul antitoxic antidiftericpreparat cu un antigen unic, anatoxina difterica (obtinuta prin detoxifirea toxineidifterice in urma actiunii combinate a formolului si caldurii).

• Este o toxina puternica dotata cu proprietati toxice specializate:- dermonecrotica- produce leziuni degenerative la nivelul miocardului (alterarea mitocondriilor),- tulburari ale activitatii contractile, tulburari de vascularizatie subendocardica,

acumulare de produse toxice- produce leziuni degenerative cu staza capilara si hemoragii la nivelul

suprarenalei- leziuni degenerative ale sistemului nervos

• C.diphtheriae mitis tulbura uniform, produce depozit

• C.diphtheriae se dezvolta pe medii simple de cultura; cresterea este favorizata pemedii imbogatite cu proteine animale: ser de bou, ou

• Temperatura de crestere variaza intre 15 -40°C cu optimum 37°C.• Se dezvolta in conditii aerobe, dar este si facultativ anaerob• Pattern caracteristic de fermentare zaharuri• Reduce sarurile de telur; telurul metalic incorporat sub forma de cristale in celule

- aspect negru al coloniilor pe medii cu telurit• Cistinaza - eliberare H2S (caracter diferential valoros pe mediu Tinsdale cu ser-

cistina-telurit-tiosulfat: sulfura de telur, halou cafeniu;Ureaza si fosfataza negative la C diphtheriae si pozitive la C ulcerans si Cpseudotuberculosis

• Hemolizina activa pe hematii de cobai, iepure, oaie pt. tipurile gravis si mitis; nupentru intermedius

• Nitrat reductaza; negativ la biotipul belfanti; pozitiv la restul biotipurilor C.diphtheriae, C. ulcerans si C. pseudotuberculosis

• Neudaminidaza, catalaza• Culturi vechi: coproporfirina


Aspecte genetice

Daca o tulpina Cdiphtheriae netoxigena se infecteaza cu un bacteriofag temperatacesta se poate integra in cromozomul bacterian iar celula devine lizogena; prinlizogenizare celula devine rezistenta la actiunea fagului pe care il poarta, saufata de oricare fag inrudit antigenic cu acesta.

22

• Daca bacteriofagul poarta gena tox+, fenomenul de replicare al ADN-ului viral inbacterie este insotit de producerea unei proteine eliberata extracelular, toxinadifterica (conversie lizogena reversibila). Producerea toxinei este initiata la 3minute post infectie fagica si eliberarea extracelulara a toxinei se produce inainteca primele particule fagice sa fie eliberate de celula devenita lizogenaLa o concentratie redusa de Fe, ciclul de multiplicare al virusului se prelungeste,

fapt care mareste productia de toxina difterica• 2.Factori de invazivitate• adezine• cord factor (straturile superficiale care contin acizii corynemicolic si

corynemicolenic) actioneaza la nivelul mitocondrii lor care sunt distruse;fragmentele ramase nu mai pot asigura evolutia normala a proceselor respiratoriisi fosforilarea

• neuraminidaza si hialuronidaza factori necrozanti si de difuziune;neuraminidaza este prezenta la tulpini Cdiphtheriae toxigene si netoxigene

VII. Patogenie

AderentaMultiplicare Ia poarta de intrareToxemie - Desi sunt citate cazuri de difterie produse de Cdiphtheriae netoxigen,difteria tipica este o toxemie, agentul patogen fiind Cdiphtheriae toxigen.Evolutia bolii este dependenta de cantitatea si de rapiditatea cu care toxina

difterica difuzeaza in organism;Numai antitoxina difterica administrata rapid dupa internare, poate influenta

favorabil evolutia bolii.

VIII. Raspunsul imun. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectii lor

• Difteria - boala infectioasa, acuta, transmisibila, cu declarare obligatorie;• Boala obisnuita in zonele temperate si calde, fiind rara in zonele reci;

In zonele temperate difteria are sezonalitate, cu incidenta redusa primavara - varasi cu incidenta mai mare toamna si iarna

• Forma de raspandire a bolii este faringiana; in tarile calde predomina difteriacutanata

• Pana in 1970 a fost mai frecventa la copii de 5-9 ani; rareori a aparut la copii inprimele luni de la nastere datorita anticorpilor transmisi transplacentar. Poate saapara insa la toate varstele, incidenta bolii in ultimii ani deplasandu-se catrevarstele mai mari (adolescenti si adulti) datorita reducerii nivelului de. imunitateantidifterica la aceste grupe de varsta considerate de risc

• Este o boala tipica a colectivitatilor; focarele de difterie apar in special in conditiide contact strans (familie, internate, case de copii)

23

24

• evolutia este determinata de factori socio-economici si de structura imunologicaa populatiei

• sursa de infectie:- omul bolnav,cu rol epidemiologic limitat pentru ca este depistat si tratat in

primele zile de la internare- purtatorul sanatos de tulpini C.diphtheriae toxigene, in general asimptomatic

(simptomatic in 20% din cazuri)- purtatorul convalescent

• cazul se anunta telefonic• izolarea obligatorie cu masurile care se impun atat in perioada transportului

cat si in spital- decontaminare terminala la domiciliu- prelevarea probelor pentru confirmare bacteriologica si serologica

anterior administrarii tratamentului cu antibiotice si seroterapiei• supravegherea contactilor (de familie, de colectivitate) clinic 7 zile; sunt supusi

examenului bacteriologie si se vaccineaza indiferent de antecedentele vaccinale;chiar cei cu imunizarea completa vor fi revaccinati, daca intervalul de la ultimarevaccinare depaseste 5 ani

• desi nu exista dovezi certe referitoare la eficienta, majoritatea specialistilorrecomanda contactilor apropiati tratament preventiv cu antibiotice, preferandu-seadministrarea penicilinei retard, desi eritromicina este mai eficienta

• suspectul de difterie este internat si tratat ca bolnav pana la infirmareadiagnosticului

IX. Diagnosticul de laborator

• prelevarea probe clinice• . izolarea agentului cauzal si obtinerea acestuia in cultura pura• identificarea tulpinilor izolate care permite

stabilirea diagnosticului de specie- recunoasterea tipului biochimie,- capacitatea de a produce toxina difterica

La bolnav /suspect:- in difteria amigdaliana se recolteaza 3 tampoane din falsa membrana (prin detasareaunei portiuni din falsa membrana sau din depozitele aderente de pe amigdale) si 1 tamponcu exudat nazal- in celelalte forme clinice, se recolteaza trei tampoane din leziunile primare: exsudat dinrinita difterica sau secretie purulenta oculara, vulvara, otica. Intrucat leziunea din difteriacutanata nu se deosebeste uneori de piodermite, tampoanele vor fi recoltate din fiecareplaga sau leziune cutanata de la suspectul de difterie sau de infectie difterica. In cazuloricarei localizari, este insa obligatorie si investigarea cavitatii nazale si faringieneLa purtator: se recolteaza exudat faringian si nazal

• Prelevarea produsului patologic se efectueaza simultan la toti contactii dincolectivitate; nu necesita alte recomandari fata de metoda de recoltare clasica.

Este necesara insamantarea rapida pe mediile specifice. In absenta materialelor necesare,se recomanda transportul probelor la un laborator de bacteriologie in maximum 2 ore dela prelevareMedii de imbogatire: OST (Ou, Ser, Telurit), pentru mentinerea viabilitatii germeni lor 4-5 ore, sau alte medii de transport (Amiens, mediul Stuart)La bolnav:

• tampoanele prelevate din falsa membrana:descarcare pe mediul Tinsdale si pe geloza sange

- imbogatire prin introducere in mediu OST- frotiu colorat Gram

• tamponul cu exudatul nazal se introduce in mediul OST

Examen microscopic direct din produs:Frotiul: permite evidentierea bacililor suspecti Gram pozitiv la limita, florapolimorfa sau prezenta fuzospirililor (angina Plaut Vincent); procura date pentruun diagnostic prezumptiv de suspiciune de C.diphtheriae

Mediile insamantate sunt incubate 24-48 ore la temperatura de 370 C

a. Geloza- sange - valoare:caracterele morfologice colonialediagnostic diferential cu faringo-amigdalitele streptococice sau infectiile mixte.unele tulpini de C.diphtheriae sunt sensibile la tel urit de potasiu, putand fiinhibate de medii care contin acest ingredient

b. Mediu Tinsdale: colonii negre cu halou cafeniu net, bine delimitat- frotiul efectuat din colonii este obligator pentru a elimina confuzia cu unele specii destafilococc. Insamantarea tamponului faringian si nazal imbogatit in OST pe mediul TinsdaleLa purtator:

• Tampoanele prelevate din nas si gat - mediul de imbogatire O.S.T.• Incubare 24 ore la 37°C,• Descarcare pe mediul Tinsdale - aparitia coloniilor negre cu halou cafeniu net,

bine delimitat dupa incubare 24-48 ore la 37°C, indica suspiciunea deC.diphtheriae.

Identificare• Caractere morfotinctoriale• Caractere de cultura• Teste biochimice:

• testul cistinazei,testul ureazei,

• toxinogeneza• Lizotipie

Toxigeneza

25

• Testarea curenta "in vitro" prin testul Elek, test de imunodifuzie rapid, simplu,precis.

Rezultatele la 24-48 ore de incubare la 37°C.Test pozitiv: Aparitia unor linii de precipitare in unghiul format de cultura insamantata side antitoxina (sant care contine ser antidifteric) Cdiphtheriae/Culcerans toxigen.Tulpini de referinta: Cdiphtheriae toxigen, slab toxigen, netoxigen

• Alte teste pentru determinarea toxinogenezei:- testul" in vivo pe cobai, metoda recomandata numai pentru diagnosticul unor

tulpini Cdiphtheriae incerte si numai la nivelullaboratorului National de Referinta- metode moleculare pentru depistarea genei tox+(PCR), metoda utilizata in

situatia unor tulpini Cdiphtheriae incerte sau netoxigene

Fig. 11. Testul Elek

Lizotipia• Metoda conventionala pentru determinarea tipurilor fagice la Cdiphtheriae• Realizata in cadrullaboratorului National de Referinta si numai in scop

epidemiologic.• Are la baza fenomenele de lizogenie si de specificitate a receptori lor fata de

anumiti bacteriofagi.• Folosind schemele de tipizare (originala si aditionala), lizotipia stabileste sursa de

infectie, delimiteaza focarul si relatiile dintre focare, indica tipul epidemiogen.• In perioadele interepidemice, metoda este utila pentru stabilirea unor tipuri fagice

in cadrul unui biotip de Cdiphtheriae predominant in teritoriu

Metode moleculare• Permit studiul genomului bacterian pt. tipizare si detectie gena tox:

- PCRdigestie prin enzime de restrictiemigrare electroforetica in gel;

• Ribotipia (ARN ribozomal 16 si 23S) poate discrimina tulpinile de Cdiphtheriaein cadrul aceluiasi lizotip

• Profilul de macrorestrictie in camp pulsator diferentiaza tulpinile in cadrulaceluiasi ribotip

26

• Distanta genetica dintre tulpinile presupuse cu relatie epidemiologica (calculatape baza acestor doua metode) da informatii privind clonalitatea tulpini lorcirculante dintr-un areal

• Studiul molecular (RFLP) al unei regiuni de interes epidemiologic, detecteazadiferente de un nucleotid in secventa genomului a doua tulpini apartinandaceluiasi taxon

27

Documents

Microbiologie - Geni Haemophilus.bordetella.legionella.corynebacterium