Micropropagacin 2009

Micropropagacin de plantas

Micropropagacin

Micropropagacin vs. propagacin vegetativa convencional

Tipos de tcnicas de micropropagacin

Etapas de la micropropagacin y principales problemticas

Costos


MICROPROPAGACINTcnica de propagacin vegetativa de plantas en

condiciones in vitro.Produccin masiva a precios competitivos.

Cultivo asptico de un explanto en un medio de cultivo artificial y en condiciones ambientales controladas.


Es posible propagar algunas especies que no se propagan in vivo.

Se necesita muy poco material de partida.

El crecimiento es mayor por rejuvenecimiento y sanidad.Se requiere poca rea.

Se elimina el efecto estacional.

Simultneamente se limpia el material.


Tipos de tcnicas de micropropagacin

Por brotacin de yemas axilares.

Por brotacin de yemas adventicias:directa

indirecta


Eleccin y preparacin de la planta madre (etapa 0).

Establecimiento del cultivo y eleccin del medio de cultivo (etapa 1).

Multiplicacin (etapa 2).

Elongacin y enraizamiento (etapa 3).

Aclimatacin (etapa 4).

Etapas de la micropropagacinPor brotacin de yemas axilares.


Crecimiento en condiciones de sanidad controlada.

Tratamientos de rejuvenecimiento.

Pretratamientos con reguladores de crecimiento.

Etapa 0: Eleccin y preparacin de la planta madre.



Podas severas

Rebrotes de tocn

Yemas epicrmicas

Rebrotes de raz


Brotaciones epicrmicas,Eucalyptus grandis.


Brotaciones epicrmicas,Pinus canariensis.



Pretratamientos con reguladores de crecimiento.

Pulverizaciones con citoquininas Reversin a estado semi-juvenil Incremento en el nmero de brotes

Combinacin con tratamientos anteriores

Giberelinas en algunas especies Rebrotes juveniles, Acca sellowiana

(BAP)


Etapa 1: Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia.

Objetivo:Iniciar el cultivoMtodo reproducible% de xitoCompromiso esterilizacin/tasa de

sobrevivencia



Procedimiento:

Cortar brotes con caractersticas juveniles.Lavar con agua y jabn.

Se descartan las hojas, se dejan los pecolos.


Procedimiento:


Realizar la desinfeccin: etanol, hipoclorito de sodio,etc.tiempos

Realizar tres enjuagues con agua destilada estril.


Procedimiento:


Cortar segementos nodales, descartando los extremos basal y apical.

Cada nudo contiene un meristemo axilar.


Procedimiento:


Introducir un segmento nodal por tubo de ensayo conteniendo el medio de cultivo.

Tapar y colocar en cmara de crecimiento.


Acca sellowiana Actinidia deliciosaEucalyptus grandis


Allium cepa


Cules son las principales limitantes en esta etapa?

Contaminacin Oxidacin

HongosBacterias

Virus

MycoplasmasMicroartrpodos y Trips


Principales causas de contaminacin fngica:Esterilizacin superficial inadecuadaManipulacinIntroduccin de esporas por Trips

Se detecta fcilmente a simple vista.

Gneros de hongos ms frecuentes:AspergillusCandidaCladosporiumMicrosporiumPhialophora


3 %13 % 12 %19 %11 %26 %

AgrobacteriumBacillus

EnterobacterPseudomonasLactobacillus

Staphylococcus

Gneros de bacteria ms frecuentemente observados en cultivos de tejidos in vitro. (Leifert & Waites, 1990)

Bacterias: Principal agente contaminante.Sntomas sobre el explanto o en el medio de cultivo.Pueden aparecer luego de varios subcultivos.Sntomas no visibles, plantas que no sobreviven la aclimatacin.(Bacterias no patognicas, benficas)


Cmo puede solucionarse?

Hongos: Adecuada desinfeccin

Bacterias: Antibiticos

Uso humano y animal

Efecto bacteriosttico/bactericida

Virus: Cultivo de meristemas y termoterapia


Oxidacin:

Amarronamiento del explanto y/o el medio.Inhibicin del crecimiento y muerte del explanto.Ms marcado en especies que naturalmente tengan altos niveles de taninos u otros compuestos fenlicos.

Causas:

Accin de enzimas oxidasas que son liberadas o sintetizadas en respuesta a heridas.Sustratos distintos segn el tejido.Fenoles se oxidan a quinonas que a su vez tienen alto poder oxidante sobre protenas.



Agua estril 2-3 hs previo a la introduccin.Empleo de antioxidantes en el ltimo enjuague o en el medio de cultivo (cido ctrico, ascrbico).Transferencias frecuentes (cada dos o tres das) a medio fresco.Carbono activado.PVP


Etapa 2: Multiplicacin.


Nmero terico de plantas que pueden producirse en un ao.

Objetivo:Mximo coeficiente de multiplicacinCalidad de plantas



Procedimiento:

Extraer los explantos que brotaron en la etapa previa.

Cortar separando brotes individuales o segmentos nodales (segn el hbito de crecimiento de la especie).



Procedimiento:


Separar los brotes por tamao.

Colocar en medio de multiplicacin.



Medio de cultivo:Hormonas

Efecto de los reguladores de crecimiento en la sobrevivencia y multiplicacin de Salix sp.


Todos los medios contienen ANA (0,3 M).Grigoriadou, 2002.



Efecto de los reguladores de crecimiento en la multiplicacin de Malus sp. (4 semanas en cultivo).

Xu, 2007.




Hbito de crecimiento:



Variacin somaclonal

Variacin gentica heredable, que surge en plantas producidas por cultivo de tejidos.Desventaja importante cuando el objetivo es la fidelidad clonal.

Reducir el nmero de repiques.Uso racional de reguladores de crecimiento.Evitar el 2,4 D.




Hiperhidricidad (Vitrificacin)

Desorden fisiolgico, metablico y morfolgico

inducido por las condiciones de estrs durante el cultivo in vitro.


Etapa 3: Elongacin y enraizamiento.

Elongacin: es necesaria en especies con hbito de multiplicacin en roseta.

Tratamientos:

Medio sin citoquinina.Uso de carbn activado.Uso de giberelinas.Crecimiento en oscuridad.


Etapa 3: Elongacin y enraizamiento.

Enraizamiento:

In vitro o ex vitro

Auxinas: AIB, ANA

Sustratos

Enraizamiento ex vitro de A. flaccida. Enraizamiento in vitro de A. sellowiana.


Principal problemtica en esta etapa.

Capacidad de enraizamiento dependiente del genotipo.

Conexin raz parte area


Etapa 4: AclimatacinObjetivo:Optimizar la transferencia del ambiente in vitro a condiciones de invernculo o campo.Minimizar prdidas y acelerar el proceso.

PLANTAS OBTENIDAS IN VITRO:Hojas delgadasTallos dbilesRaces dbiles y poco funcionalesConexin tallo-raz incompletaBaja tasa fotosinttica

PROCESO GRADUAL:

Disminucin de la HR

Crecimiento autotrfico

Condiciones spticas.


Etapa 4: AclimatacinProcedimiento:


Etapa 4: Aclimatacin



Plantas in vitro presentan poca capacidad de retencin de agua.



Dark respiration and net photosynthesis measured at 80 mol m-2 s-1 (PPFD)during acclimatization of micropropagated (A) Spathiphyllum and (B) Calathea,

for in vitro (open symbols) and ex vitro (closed symbols) formed leaves.

Acca sellowiana, Guayabo del pas


Etapa 0 Etapa 1 Etapa 2

Etapa 3Etapa 4


Micropropagacin por brotacin de yemas adventicias.

Mtodo directo: Saintpaulia ionantha. Violeta africana



Mtodo indirecto: Prunus sp.

Feeney, 2007.


Formacin de callo/brotes a partir de explantos foliares en Arndano, en respuesta al agregado de citoquinina.



Dificultades que presentan las especies leosas in vitro.

Menor capacidad regenerativa

Efecto de dormancia en yemas

Induccin de rejuvenecimientoMenor tasa de multiplicacin

Mayor oxidacin inicial del explante

Desinfeccin ms dificultosa

Enraizamiento y aclimatacin limitantes


Costos de la micropropagacinCapital para la instalacin del laboratorioCosto de la mano de obraCosto de los materialesCaractersticas del comportamieno in vitro del material a propagar

Facilidad de establecimiento, rejuvenecimiento, etc. Tasa de multiplicacin Enraizamiento in vitro/ex vitro

Prdidas que ocurren en cada etapa del proceso contaminacin hiperhidricidad % plantas que no enraizan % plantas que no sobreviven la aclimatacin


8.9Funcionamiento

(Prod. Qumicos, energa, agua, mantenimiento, imprevistos)

63.8Salarios(Laboratorio, invernculo, oficina)

27.3Costo capital(Edificaciones y equipamiento)

%Componente del costo

En base a un laboratorio que produce 3 millones de plantas al ao (800 a 1400 m2).

Costos de la micropropagacin

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