MICROSCOPIA ELECTRONICĂ Microscopia electronică utilizează instrumente de examinare (microscoape electronice) care funcționează pe baza unui fascicul de electroni de înaltă energie (accelerați) în scopul examinării unor detalii de dimensiuni reduse ale obiectelor observate. Dimensiunile relative ale structurilor biologice și sistemele de vizualizare specifice sunt prezentate în figura de mai jos:

Tipuri de microscoape electronice Se descriu, la ora actuală, câteva tipuri de microscoape electronice, utile în cercetarea biomedicală sau în completarea diagnosticului de laborator:

- Microscopul electronic de transmisie (TEM) - Microscopul electronic de baleiaj (SEM) - Microscopul electronic de reflexie (REM) - Microscopul electronic de baleiaj și transmisie (STEM) - Microscopul electronic cu voltaj redus (LVEM)

Microscopul electronic se deosebește de cel fotonic prin faptul că utilizează ca sistem de examinare un fascicul de electroni emis într-un sistem vidat, în locul unui fascicul de fotoni. Scopul acestui tip de microscop este de a produce, asemenea celui fotonic, o imagine mărită a preparatului. Cu toate acestea, microscopul electronic are o putere de rezoluție mai mare decât un microscop fotonic, datorită dependenței acestei puteri de lungimea de undă a radiației electromagnetice folosite. Electronii au o lungime de undă de 100.000 de ori mai mică decât cea a luminii vizibile (fotoni) iar lungimea de undă este invers proporțională cu puterea de mărire. În plus, cu cât electronii au o viteză mai mare (implicit, cu cât tensiunea de accelerare este mai mare), cu atât lungimea de undă este mai redusă și rezoluția microscopului electronic crescută. Rezoluția microscopului electronic ajunge la circa 0,2 nm și la măriri de circa 2 milioane de ori, în timp ce microscoapele optice obișnuite (non-confocale) sunt limitate de fenomenul de difracție la o rezoluție de 200 nm și măriri sub 2000 de ori. Rezoluția TEM este limitată adesea de aberațiile de sfericitate dar noile sisteme

corectoare și tensiunile de alimentare mari au dus la apariția HRTEM (high resolution TEM) care are o rezoluție sub 50 pm și o putere de mărire de circa 50 de milioane de ori. Lentilele utilizate în microscopia electronică sunt electrostatice sau electromagnetice, spre deosebire de microscopia optică, unde lentilele sunt din sticlă sau compozite transparente. Lentilele de sticlă nu pot influenţa traiectoria fasciculului de electroni. Formarea imaginii depinde de electronii transmiși prin preparat (TEM) sau emiși secundar de către acesta (SEM). Informații obținute cu ajutorul microscopiei electronice Informațiile care se pot obține cu ajutorul microscoapelor electronice se referă la ultrastructura unor probe biologice sau anorganice, care pot cuprinde: microorganisme, celule, molecule mari, fragmente tisulare, metale sau cristale. Aceste informații pot sublinia:

- Topografia - caracteristicile de suprafață ale unui obiect, textura, raportul direct dintre aceste caracteristici și proprietățile materialului din care este compus obiectul (duritate, reflectivitate);

- Morfologia - forma şi/sau dimensiunile componentelor unui obiect, relația dintre aceste structuri și proprietățile materialului din care este compus obiectul (ductilitate, rezistență, reactivitate);

- Compoziție - cantitatea și calitățile elementelor dintr-un obiect analizat; relația directă dintre compoziție și proprietățile obiectului studiat;

- Noțiuni cristalografice - modul de distribuție a atomilor și relația cu proprietățile obiectului de studiat.

În biologie, scopul declarat al dezvoltării microscoapelor electronice este de a investiga aspecte ale universului celular, inaccesibile prin examinarea cu ajutorul microscoapelor optice. Astăzi, pornind de la principiul dezvoltat de Ernst Rushka și Max Knoll în 1931, putem examina ultrastructura celulelor și chiar a organitelor celulare. În aprilie 2010, la centrul de microscopie de la Universitatea California, LA, SUA a fost publicată prima imagine a unui atom, obținută prin crio-electronomicroscopie, iar posibilitățile de explorare ale universului submolecular și chiar subatomic par inepuizabile.

Microscopia electronică de transmisie Este o metodă de investigație microscopică în care un fascicul de electroni

este transmis printr-un preparat ultrafin, interacționând cu elementele componente ale preparatului și fiind refocalizat de o serie de lentile, pentru a genera imaginea finală, mult mărită, a obiectului de examinat.

Microscopul electronic de transmisie (TEM) utilizează un fascicul de electroni de înaltă energie, emiși de un tun electronic care conține un filament de tungsten sau un cristal de hexaborură de lantan (LaB6); filamentul sau cristalul menționate formează catodul. Electronii sunt accelerați de un anod, la o diferență de potențial de 100 keV. Traiectoria electronilor este controlată cu ajutorul unor lentile electromagnetice. Electronii sunt direcționați în formă de fascicul de către lentilele condensor și sunt orientați către preparat de către lentilele obiectiv. Lentilele de proiecție direcționează fasciculul de electroni spre sistemul de formare a imaginii. Acest sistem poate fi reprezentat de o placă fluorescentă, o placă fotografică acoperită de emulsie sau un senzor CCD care poate transmite imaginea spre un ecran.

Rezoluția microscopului electronic Rezoluția maximă (rezmax) pe care o poate atinge un microscop fotonic este

limitată de lungimea de undă a fotonilor (λ) și de apertura numerică a sistemului optic (NA).

NAnrez

2sin2max

Apertura numerică (NA) a unui sistem optic reprezintă o mărime

adimensională care caracterizează limita unghiului sub care acel sistem optic poate accepta sau emite lumină. NA = n*sin, unde este semi-unghiul conului maxim de lumină emisă sau acceptată de o lentilă (sistem optic).

Lungimea de undă a fotonilor este mult mai mare decât a electronilor și astfel, invers proporțional, rezoluția maximă a unui microscop electronic este mult mai mare decât a unuia fotonic. Lungimea de undă a fasciculului de electroni nu reprezintă un factor limitant al rezoluției TEM, deoarece această lungime de undă este funcție de energia electronilor și implicit de tensiunea de accelerare (ex. o rezoluție de 2 pm se obține la o tensiune de 300 kV). Cu toate acestea, aberațiile de sfericitate (care produc curbarea mai puternică a frontului de undă la marginea lentilelor față de axul optic), cromatice sau de astigmatism ale lentilelor electromagnetice și instabilitatea curenților care le străbat limitează rezoluția la 50 pm chiar și pentru cele mai scumpe TEM.

Părțile componente ale unui microscop electronic Un TEM include - o sursă de emisie pentru electroni (tun electronic plus sursă

de alimentare), o coloană care include lentile electromagnetice și plăci electrostatice, o cameră a preparatului și o cameră de examinare. Toate aceste sisteme sunt situate într-un vid înalt, generat de un sistem special de vidare. Lentilele și plăcile sunt necesare manipulării și ghidării fasciculului de electroni. În plus, un sistem ecluză și un dispozitiv special permite inserția, amplasarea sau îndepărtarea preparatului în axul optic al microscopului. Atașate microscopului se regăsesc sistemele electronice de formare sau amplificare a calității imaginii (cameră video laterală sau de fund, sistem de augmentare a contrastului, sisteme de imprimare a imaginii).

Schemă de funcționare a microscopului electronic de transmisie

Părțile componente ale microscopului electronic de transmisie Philips CM100 din dotarea disciplinei

de Biologie Celulară și foarte Moleculară Iași ①-tun de electroni; ②-Sistem de vidare (pompe); ③-lentile electromagnetice și aperturi; ④-camera probei, cu sistem de ecluză pentru vidare; ⑤,⑥- panouri de control (5 - pentru aliniere, 6 - pentru

mărire și focalizare); ⑦-ecran pentru afișarea imaginii captate de camera CCD; ⑧-camera de observație cu ecran fluorescent

Toate părțile componente ale TEM în care circulă electronii (de la filament la sistemul de observație din camera de formare a imaginii) sunt dispuse în interiorul sistemului care generează un vid înalt.

Tunul electronic (sursa de electroni) este format din: - filament (catod) - circuit de polarizare - cilindru Wenhelt (se citește "venelt") - anod de extracție

Sursa de electroni, reprezentată de filamentul de tungsten sau de cristalul de hexaborură de lantan (sau de ceriu) (catodul), încălzite de un circuit special.

Sursa de tensiune, de voltaj înalt, de obicei de 100-300 kV, alimentează anodul și catodul. În plus, există un circuit electric suplimentar pentru încălzirea filamentului. Creșterea curentului care trece prin filament duce la o saturație a curbei de emisie a electronilor. Pentru prelungirea duratei de exploatare a filamentului, trebuie să existe un echilibru între încălzirea filamentului și tensiunea de accelerare.

Sistemul de extracție/filtrare a electronilor - cilindrul Wenhelt. Acesta este format dintr-un circuit de polarizare cuplat la o diferență de potențial de numai câteva sute de volți față de filament (catod). Este util pentru focalizarea și controlul fasciculului de electroni. A fost inventat în 1902, de către fizicianul german Arthur Rudolph Berthold Wenhelt. Are rolul de a nu permite dispersia electronilor emiși de filament.

Sistemul de accelerare a electronilor - anodul. Este format dintr-o placă de metal, perforată, încărcată pozitiv.

Funcționarea sursei de electroni. Filamentul (sau cristalul) generează

electroni prin fenomenul de emisie termoionică (efect Edison) sau prin emisie electronică asistată de câmp, în mediu vidat. Prin emisie termoionică, electronii sunt emiși de filamentul încălzit printr-un circuit electric separat. Curentul care traversează filamentul controlează temperatura acestuia (optim 2500K) și implicit numărul de electroni emiși. În general, avem nevoie de un număr mare de electroni emiși de o regiune îngustă a filamentului; putem obține acest efect prin "saturarea" filamentului, implicit creșterea curentului în filament până la un prag limită (unde numărul de electroni emiși rămâne constant) Electronii sunt emiși cu o anumita viteză, câștigată prin ciocniri cu atomii care au o agitaţie violentă datorată temperaturii generate de alimentarea filamentului (catod). O parte mică din acești electroni ating anodul chiar in lipsa unui câmp electric aplicat. Electronii sunt apoi extrași și selectați cu ajutorul cilindrului Wenhelt, accelerați și focalizați cu ajutorul anodului. Circuitul de polarizare

controlează dimensiunea regiunii de filament care emite electroni. Dacă polarizarea este prea mare, nu există emisie de electroni. Variația curentului de polarizare influențează iluminarea probei. Orificiul specific al anodului emite un fascicul divergent de electroni. Electronii de energie înaltă permit examinarea unor probe cu grosimi mai mari, dar determină și afectarea probei.

Lentilele electromagnetice au rolul de a focaliza razele paralele la o anumită distanță focală. TEM utilizează lentile electromagnetice pe bază de solenoizi (bobine) care formează lentile convexe. Câmpul electromagnetic generat de aceste lentile trebuie să fie simetric radial, în caz contrar apărând aberații de sfericitate, cromatice sau astigmatism. Lentilele sunt alcătuite din fier, fier-cobalt și aliaje nichel-cobalt cum ar fi permalloy-ul.

Lentilele TEM sunt dispuse pe 3 nivele - condensor, obiectiv, proiector: - lentilele condensor au rolul de a forma fasciculul primar de electroni; - lentilele obiectiv au rolul de a focaliza fasciculul de electroni după trecerea prin

preparat; - lentilele proiector au rolul de a proiecta fasciculul care provine de la lentilele

obiectiv pe ecranul fluorescent sau pe senzorul CCD. Lentilele posedă și un sistem de răcire bine calibrat care disipă căldura

formată în timpul utilizării. În plus față de lentile, coloana TEM mai include plăci metalice inelare

(aperturi) care au rolul de a exclude electronii care sunt mai îndepărtați de o anumită distanță față de axul optic. Aceste plăci sunt practic formate din discuri mici, metalice, cu orificiu central, care sunt suficient de groase pentru a împiedica trecerea electronilor prin disc în timp ce trecerea electronilor axiali este permisă. Aperturile au rolul de a reduce intensitatea fasciculului de electroni precum și filtrarea electronilor împrăștiați sub unghiuri mari prin procese determinate de aberații cromatice sau de sfericitate.

Ajustarea lentilelor electromagnetice astfel încât planul imaginii este înlocuit cu planul focal posterior determină obținerea unui spectru de difracție pe sistemul de formare a imaginii. Probele cristaline formează o imagine cu un spectru multipunct în timp ce probele policristaline sau amorfe generează un spectru de difracție inelar.

Spectru de difracție cristalină pentru o granulă de oțel austenitic

Formarea imaginii pentru TEM depinde de modul de operare. În modul de operare obișnuit (câmp luminos), formarea contrastului este clasică, prin obstruarea sau

absorbția electronilor în probă. Zonele mai groase ale preparatului sau zonele cu atomi mai grei vor apărea întunecate, în timp ce zonele fără preparat apar luminoase, de unde și denumirea de "câmp luminos". Imaginea finală reprezintă o proiecție bidimensională a probei de-a lungul axului optic.

Microscopia electronică de baleiaj Microscopia electronică de baleiaj se distinge de TEM prin faptul că

analizează fasciculul de electroni emiși de preparat, în urma impactului cu electronii primari emiși de sursă.

Electronii de înaltă energie emiși de sursă baleiază suprafața probei după un model prestabilit (de la stânga la dreapta și de sus în jos).

Electronii primari interacționează cu nucleii și electronii atomilor din probă. Aceste interacțiuni generează mai multe tipuri de semnale: electroni secundari (cei care sunt analizați și care formează imaginea, electroni de retrodifuzie, electroni Auger, radiații X, luminiscență de catod.

Structura SEM: 1. Sursa de electroni (tunul electronic) care accelerează electronii în coloana

microscopului. 2. Lentile electromagnetice (condensor și obiectiv) care pot controla diametrul

fasciculului de electroni și îl pot focaliza pe preparat. 3. Aperturi (filme metalice cu orificii punctiforme) care filtrează electronii

deflectați sau cu un unghi incident prea mare. 4. Sistem de control al poziției probei (deplasări în plan orizontal, balans,

rotație) 5. O suprafață de interacțiune între fascicul și probă care generează

semnalele menționate mai sus. Aceste semnale produc imagini sau spectre.

6. Toate elementele menționate sunt menținute în vid de diferite niveluri (vidul din coloana superioară este mai înalt decât în camera probei).

Rezoluția SEM la ora actuală este de 0,4 nm pentru microscoapele industriale (voltaj înalt - 30kV) și de 0,9 nm pentru microscoapele biologice (Magellan de la FEI) (voltaj redus - 1 kV) Modul de funcționare al SEM

- tunul electronic generează un flux monocromatic de electroni - fluxul de electroni este condensat de către prima lentilă condensor; lentila este

utilă pentru formarea fasciculului de electroni cât și pentru limitarea curentului din fascicul

- fasciculul de electroni este condiționat de apertura condensorului, eliminându-se astfel electronii care au un unghi incident prea mare

- a doua lentilă condensor formează un fascicul de electroni subțire, coerent și controlabil

- o a doua apertură condensor filtrează electronii cu unghi de incidență crescut un set de bobine produc baleierea fasciculului de electroni după un model prestabilit (de la stânga la dreapta și de sus în jos); viteza de baleiere este reglabilă, fasciculul insistând câteva microsecunde asupra fiecărui punct al probei

- lentilele finale - obiectiv - focalizează fasciculul de electroni în zona dorită de la suprafața probei

- când fasciculul de electroni atinge proba, sunt produse semnalele menționate mai sus (electroni secundari, de retrodifuzie, radiații X etc)

- sistemele de detecție interpretează semnalele emergente și formează imaginea sau dau alte date analitice

- procesul de formare a imaginii durează 30-60 sec.

Schemă de funcționare a SEM

Granule de polen, imagine SEM