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VII Simposio Internacional sobre la Flora Silvestre en Zonas Áridas
Biotecnología Vegetal
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REGENERACIÓN IN VITRO DE CARNEGIEA GIGANTEA (ENGELM.) BRITT. & ROSE (CACTACEAE).
Mier Romero Germán1, González-Caballero Octavio1, Estrada Galván Bárbara1, Chávez-Ávila Víctor M1. y Mata-Rosas Martín2
.
1Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales, Jardín Botánico, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México.
2
[email protected]; [email protected] Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero, Instituto de Ecología A.C. Jalapa, Veracruz.
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RESUMEN
Carnegiea gigantea (Engelm.) Britt. & Rose (Cactaceae), “sahuaro”, especie columnar nativa de Sonora (México) y Arizona (Estados Unidos). A pesar de la destrucción de su hábitat y del saqueo con fines comerciales, no está catalogada en la NOM-059-ECOL-2001 y sólo se encuentra en el Apéndice II de CITES como toda la Familia Cactaceae. No se cultiva y debido a su lento y largo ciclo de vida su conservación requiere un procedimiento efectivo como la propagación por Cultivo de Tejidos, por lo que este estudio explora la regeneración de plantas in vitro. 50 semillas fueron sembradas en una mezcla de tepojal y tierra negra (1:1), fotop. 12h luz, 32ºC; asimismo, 50 semillas más, fueron sembradas asépticamente en medio MS 50%; fotop. 16h luz, 25±2°C. Algunas semillas germinaron dentro de la primera semana de cultivo. Al término de 90 días se evaluó la germinación: ex vitro fue del 48%; en tanto in vitro fue de 44%. Un segundo lote de 100 semillas escarificadas con H2SO4
Plántulas de 9 meses, germinadas in vitro fueron seccionadas en ápices, bases de tallos, cotiledones y raíces que fueron sembrados en medio MS 50% con ANA y BA en diferentes concentraciones. Después de 3 meses de inducción ápices y bases de tallos regeneraron brotes adventicios de las areolas.
fue sembrado in vitro. La germinación fue más acelerada, a los 15 días habían germinado 30%, a los 60 días 56%.
Palabras clave: Cultivo de Tejidos Vegetales, Carnegiea gigantea, Cactaceae, germinación in vitro
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INTRODUCCIÓN
La gran diversidad de nuestro país es el resultado de la combinación de variaciones
topográficas y climáticas, que al mezclarse, crean un mosaico de condiciones ambientales y
microambientes. Asimismo, México, es una “zona de transición” o convergencia entre las
floras y faunas neártica y neotropical, además de tener una larga y compleja historia
geológica de aislamiento en algunas regiones, lo que ha favorecido la evolución de un gran
número de endemismos (Flores-Villela y Gerez, 1994; Soberón y Llorente, 1993; Toledo,
1988). Como resultado, México ocupa el tercer lugar en biodiversidad en el mundo. El
segundo en reptiles (717 especies), el tercero en mamíferos (449), el cuarto en anfibios
(284); el 32% de la fauna es endémica (Williams-Linero et al., 1992) y el cuarto lugar en
diversidad de especies vegetales, resguardando cerca del 10% de la flora del mundo, con un
estimado de 22 411 especies (Magaña y Villaseñor, 2002).
Las cactáceas constituyen un grupo de plantas nativas del continente americano, ya
que se extienden ampliamente por todo el Nuevo Mundo. Durante su evolución se han
diversificando en un gran número de especies y formas de vida. Se estima de forma
conservadora, que las cactáceas incluyen cerca de 110 géneros y 2000 especies, de las
cuales México posee 52 géneros, es decir, el 47% del total reconocido para la familia y 850
especies silvestres, lo que equivale a cerca del 42% de las especies de la familia
(Mandujano et al., 2002; Arias, 1993; Olalde, 2001).
Las cactáceas columnares se encuentran taxonómicamente dentro de la tribu
Pachycereeae, una de las nueve Tribus que conforman a la Subfamilia Cactoideae,
existiendo aproximadamente 170 especies, de las cuales 80 se encuentran en México
(Casas, 2002).
Carnegiea gigantea, los saguaros ó sahuaros, como comúnmente se les conoce, son
las cactáceas columnares típicas de la región del Pinacate, en Sonora, aunque cabe
mencionar que su distribución geográfica está compartida con los Estados Unidos, ya que
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esta especie también se puede encontrar en el desierto que corresponde al estado de Arizona
(Arias, 1997). Otro estudio arroja datos de que se distribuye al suroeste y centro de Arizona
y raramente al sureste de California, Estados Unidos. En Sonora, se distribuye al noroeste
sobre la planicie costera hasta Mesa Masiaca, al sureste de Navojoa (Martin et al., 1998).
También es frecuente en Isla Tiburón (Turner et al., 1995).
Es notable resaltar que esta especie no se encuentra catalogada como amenazada
por la NOM-059-ECOL-2001, ni por la UICN, a pesar de que se sabe del excesivo saqueo
por parte de coleccionistas y personas dedicadas al comercio internacional de especies
ornamentales (Robbins, 2003). Sólo se encuentra catalogada como toda la Familia
Cactaceae en el Apéndice II de CITES.
El género comprende una sola especie, la cual es una cactácea columnar de entre 5-
14 m de altura y 65 cm de diámetro, de tallo simple ó con escasas ramas laterales que salen
de diversas alturas. Costillas de 11-25, obtusas de 1-3 cm de ancho. Areolas de color
pardo, en tallos juveniles distantes entre sí por 2.5 cm; en ejemplares adultos la distancia
disminuye y presentan abundante fieltro de color pardo. Acúleos radiales pueden ser 12 ó
más y las centrales de 3-6 con 7 cm de longitud; 15-30 en las areolas floríferas, situadas
cerca del ápice de los tallos. Son de color pardo y se van volviendo grises a medida que la
planta envejece. Flores infundibuliformes de 8-13 cm de largo, situadas en la parte
subapical del tallo con tépalos cortos, de color blanco ceroso, las anteras de color amarillo,
con olor a putrefacción. Son nocturnas y permanecen activas hasta media mañana
dependiendo de la temperatura ambiental. Fruto oblongo-elipsoide, es una baya de color
rojo por dentro y verde por fuera, la parte de adentro es comestible, escamas distantes, con
1-3 acúleos ó ausentes. Semillas numerosas de 2000-2500 por fruto, de color negras, casi
esféricas de 1.8-2 mm de diámetro (Fig. 1) (Paredes et al., 2000).
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Fig. 1. Carnegiea gigantea. A) Ejemplares adultos, B) Flores, C) Frutos y D)
Semillas.
Los métodos de propagación y almacenamiento in vitro pueden ser empleados como
parte de los programas de conservación ex situ de diferentes especies incluyendo las que se
encuentran en peligro de extinción. En los últimos años, el cultivo de tejidos vegetales ha
emergido como una herramienta para lograr la propagación de varias especies vegetales, ya
que se mantiene una rápida y continua producción de plantas a partir de solo un pequeño
fragmento de tejido, por tanto el potencial de esta técnica en la recuperación de especies
amenazadas resulta trascendente (Malda et al., 1999).
El Cultivo de Tejidos Vegetales es una rama de la Biología que basada en la
totipotencialidad celular ha establecido un conjunto de técnicas que hacen posible dividir a
un organismo en sus bloques constituyentes y cultivar asépticamente in vitro: protoplastos,
células, tejidos, órganos, embriones y plántulas en condiciones controladas (medio
nutritivo, luz, temperatura, atmósfera, pH, reguladores de crecimiento, etc.), permitiendo al
investigador variar las condiciones de cultivo y/ó el tipo de explante y llegar a dirigir las
respuestas morfogenéticas y biosintéticas de las células, pudiendo lograr una gran variedad
de objetivos, entre ellos: almacenamiento ó conservación de germoplasma, nuevos métodos
de hibridación y/ó mejoramiento, investigación básica, propagación, erradicación ó
recuperación de plantas libres de patógenos, esta técnica ha sido empleada en diferentes
especies vegetales con diversos usos (Chávez, 1993).
A B C D
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Las cactáceas representan un grupo taxonómico con un alto número de especies en
peligro de extinción. Éstas, por lo general presentan lento crecimiento, condiciones muy
especificas y esporádicas de floración, producción de semillas, germinación y producción
de descendencia; por ello los métodos convencionales de propagación llevados a cabo
mediante semillas, vástagos, esquejes o injertos, en muchas ocasiones resultan inadecuadas
en especies que no producen brotes, que tienen una tasa de germinación baja y/o lento
crecimiento (Clayton et al., 1990). Algunos investigadores han propuesto el uso del cultivo
de tejidos para propagar especies de esta familia (Mauseth, 1979; Johnson y Emino, 1979).
Estas técnicas representarían una alternativa para el estudio y conservación de
germoplasma valioso (Smith et al., 1991), así como para resolver el problema de satisfacer
la demanda en aquellas especies de interés comercial y de esta forma reducir las presiones
que afectan y merman a las poblaciones silvestres (Fay, 1994).
Con base en la literatura, se puede mencionar que las cactáceas ofrecen amplias
perspectivas para su cultivo in vitro, además de que los resultados obtenidos hasta ahora,
permiten vislumbrar aplicaciones de impacto para la propagación masiva de estas plantas y
su rescate del riesgo de extinción (Rubluo, 1990). El presente estudio exploró la
germinación de C. gigantea, así como el potencial regenerativo de distintos explantes
somáticos de plántulas.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Material vegetal y desinfección
Antes de someter a las semillas al tratamiento de desinfección, se estratificaron a 4 OC durante 24h. Posteriormente se enjuagaron con agua destilada. Se desinfectaron 100
semillas con una solución jabonosa por 5 min, sin enjuagar se sumergieron en alcohol
70% (v/v) 1 min, y se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio (blanqueador
doméstico) al 30% (v/v) 25 min; 50 de las semillas se enjuagaron 3 veces con agua
destilada esterilizada y se sembraron asépticamente en medio de cultivo MS (1962), el
resto de las semillas se enjuagaron de igual manera y se sembraron en una charola con
sustrato esterilizado.
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Germinación in vitro y ex vitro de las semillas.
Se sembraron in vitro 50 de las semillas, en frascos GerberR
con tapas de plástico
que contenían medio MS (1962) 50%, sacarosa 30g/l, pH 5.7, y agar 8.5 g/l. Las semillas
se incubaron a 25 ± 2°C; fotoperiodo 16h luz/8h oscuridad.
Las semillas restantes se sembraron ex vitro en una charola translúcida que
contenía una mezcla cernida de tepojal y tierra negra 1:1 esterilizada. La charola se
mantuvo cerrada, a una temperatura de 32°C, bajo el fotoperíodo natural del día en la
Ciudad de México.
Inducción de explantes de plántulas in vitro
Al término de 9 meses de iniciados los cultivos, aquellas plántulas germinadas in
vitro que tenían una longitud en su tallo entre 0.5 a 1.5 cm les fueron disectados los
cotiledones, raíces, ápices (0.3 a 0.5 cm) y la parte restante del tallo fue dividida
longitudinalmente (bases de tallos) (0.4 a 1.5 cm long). Los explantes fueron sembrados en
medio de inducción MS 100%, pH 5.7, suplementado con ANA/BA (0, 0.1, 0.5, 1.0/0, 0.5,
1.0 1.5, 2.0 mg/L). Los explantes permanecieron en medio de inducción durante 2 meses y
fueron incubados a una temperatura de 25 ± 2°C; fotoperiodo 16h luz/8h oscuridad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Germinación de semillas
El paso inicial para un proceso de regeneración in vitro es el de obtener un cultivo
aséptico de material vegetal. El uso de semillas hace posible utilizar un fuerte proceso de
desinfección superficial, asegurando que las plántulas germinadas in vitro estén libres de
contaminación microbiana (George y Sherrington, 1984). Hay reportes que indican que los
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tejidos jóvenes tienen una mayor capacidad regenerativa en comparación con los presentes
en un individuo adulto (Vyskot y Jara, 1984).
El criterio que se siguió para determinar la germinación de las semillas fue la
emergencia de la radícula. Al término de los primeros 7 días de haber iniciado los cultivos
ya habían germinado 2 semillas (4%); a los 12 días 4 semillas, 8% de germinación. Las
plántulas medían 3-6 mm de longitud, sin tomar en cuenta la raíz y los cotiledones.
Presentaron una coloración rojiza probablemente debido a la presencia de betalaínas
(Fig.3).
Bajo condiciones ex vitro a los 4 días de haber sido sembradas, 4 semillas (8%)
habían germinado; y a los 12 días ya habían germinado 21 semillas (42%). Las plántulas
fueron más grandes que las germinadas in vitro con 6-9 mm de longitud y de un color verde
brillante (Fig. 2).
Cabe resaltar que en ambas condiciones, las semillas germinaron de manera
asincrónica durante un periodo de 90 días. A pesar de que todas las semillas fueron
sometidas al mismo tratamiento de estratificación y de desinfección, fue clara la diferencia
tanto en el porcentaje de germinación como en las características morfológicas de las
plántulas germinadas en las dos condiciones de cultivo. El mayor porcentaje de
germinación así como las mejores características morfológicas en el cultivo ex vitro
pudieron deberse a la temperatura de incubación (32°C), ya que fue mayor en comparación
con la temperatura de incubación in vitro 25°C ± 2°C.
Las cactáceas tienen un amplio intervalo de respuesta a la temperatura, para la
mayoría de las especies los rangos van de 17 a 34ºC, con valores óptimos frecuentemente
de 25ºC (Nobel, 1980). Hay reportes para la germinación de semillas de C. gigantea que
indican una temperatura de 25°C como la óptima y una exposición directa a la luz (Alcorn
y Martin, 1974; Steenbergh y Lowe 1977), sin embargo, en condiciones naturales la
temperatura en el día es mayor, superando los 30°C incluso llegando hasta los 40°C. Por tal
motivo, una mayor temperatura pudo promover una germinación y un crecimiento más
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rápido en las semillas de C. gigantea.
Tabla 1. Porcentajes de germinación de semillas de C. gigantea sembradas ex vitro
(32ºC) e in vitro en medio MS 50%, a una temperatura de 25±2ºC, fotoperiodo de 16 h
luz y 8 de oscuridad. Resultados después de 30, 60 y 90 días.
Condiciones de
siembra
30 días 60 días 90 días
In vitro
16% 40% 44%
Ex vitro
44% 46% 48%
Figura 2. Plántulas de C. gigantea germinadas ex vitro. A) 7 días, B) 60 días), C) 120
días.
A) B) C)
A) C)
D)
B)
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Figura 3. Plántulas de C. gigantea germinadas in vitro. A) 7 días, B) 60 días, C) 120
días.
1b. Inducción de explantes de plántulas in vitro.
Durante el tiempo de inducción, se observaron varias respuestas por parte de los
explantes, la oxidación fue evidente en todos los tratamientos, afectando de manera letal a
los cotiledones y en menor grado a los ápices y bases de tallos (Gráfica 1, Fig. 4). La
coloración del medio o los explantes que se tornan de color café o negros, es un fenómeno
frecuente observado durante el establecimiento de los cultivos con el propósito de la
micropropagación. Cuando los tejidos sufren algún daño, como el causado por la acción del
corte de los explantes, comúnmente se liberan varios compuestos que se oxidan y causan
que el tejido se oscurezca (Preece y Compton, 1991).
Gráfica 1. Porcentaje de oxidación. Resultados al término de 2 meses de iniciados los
cultivos
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Figura 4. Apariencia de los distintos tipos de explante de C. gigantea sembrados en
medio MS después de 1 mes de inducción. A) Ápice, donde eventualmente hubo la
formación de raíces; B) Base de tallo, donde se observa la formación de callo en la
zona de corte y C) Cotiledón oxidado en su totalidad.
Los explantes que tuvieron una respuesta morfogenética, presentaron dentro de los
primeros dos meses de cultivo y aún en medio de inducción, un crecimiento y su coloración
pudo ser café o mantuvieron una coloración verdosa, de aspecto húmedo. Aparecieron
sobre su superficie estructuras nodulares, a manera de pequeños domos que crecieron, se
elongaron y en su ápice llegaron a diferenciar areolas con espinas, evidenciando la
formación de brotes adventicios (Fig. 5).
La mayor formación de brotes se dio a partir de los ápices, seguidos de las bases de tallos y
se observó que correspondían a concentraciones altas de reguladores de crecimiento
(Gráfica 2).
A) C) B)
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Gráfica 2. Formación de brotes por tipo de explante. Resultados al término de 3 meses
de iniciados los cultivos
Fig. 5. Regeneración in vitro de brotes adventicios en A) Ápices y B) Bases de tallo de
Carnegiea gigantea después de 3 meses de cultivo.
La germinación de las semillas no arrojó grandes diferencias numéricas entre las
condiciones in vitro y ex vitro, sin embargo, deben valorarse que ex vitro las plántulas
tuvieron un desarrollo más rápido y de aspecto más normal que in vitro. Por otro lado, las
plántulas in vitro hicieron posible la disponibilidad de material vegetal aséptico que
permitieron la regeneración de muchas más plántulas que las obtenidas directamente de las
semillas. El CTV demostró ser una viable alternativa en el conocimiento de esta especie,
para su conservación y abre la posibilidad de un aprovechamiento que evite seguir
ANA/BA mg/l
0.5/1.5 0/2.0
1.0/2.0 0.1/2.0
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agotando las poblaciones silvestres de este recurso en peligro de extinción.
Referencias bibliográficas
Arias, S. 1993. Cactáceas: Conservación y diversidad en México. Revista de la
Sociedad de Historia Natural. 44: 109-115
Arias, S. 1997. Distribución, grupos taxonómicos y formas de vida. En: Suculentas
mexicanas, Cactáceas. Valles C. (Ed). México, D. F. Pp. 17-25
Casas, A. 2002. Uso y Manejo de Cactáceas Columnares mesoamericanas.
Biodiversitas. Boletín bimestral de la Comisión Nacional para el Conocimiento y
Uso de la Biodiversidad 40:18-22
Chávez, V. M. 1993. Embriogénesis somática a partir de foliolos jóvenes de plantas
maduras de Ceratozamia mexicana var. robusta. (Miq) Dyer (Zamiaceae) especie en
peligro de extinción. Tesis Doctorado (Doctorado en Ciencias (Biología)-UNAM,
Facultad de Ciencias
Clayton, P. W., J. F. Hubtenberger y G. C. Phillips. 1990. Micropropagation of
members of the Cactaceae Subtribe Cactinae. Journal of American Society of
Horticultural Science 115:337-343
Fay, M. F. 1994. In what situations is in vitro culture appropriate to plant
conservation? Biodiversity Conservation. 3: 176-183.
Flores-Villela, O. y P. Gerez, 1994. Biodiversidad y conservación en México:
vertebrados, vegetación y uso de suelo. México. Comisión para el Conocimiento y
Uso de la Biodiversidad y Universidad Nacional Autónoma de México. Pp. 439.
Johnson, J. y E. Emino. 1979. Tissue culture in the Cactaceae. Cactus & Succulent
Journal. 29:102-104
Magaña, P. y J. L. Villaseñor. 2002. La flora de México ¿se podrá conocer
completamente? Ciencias 66: 24-26.
Malda, G., Suzán H., and Backhaus R. 1999. In vitro culture as a potential method
for the conservation of endangered plants possessing crassulacean acid metabolism.
Scientia Horticulturae 81:71-87
Mandujano, M. C., J. Golubov y J. Reyes. 2002. Lo que usted siempre quiso saber
VII Simposio Internacional sobre la Flora Silvestre en Zonas Áridas
Biotecnología Vegetal
185
sobre cactáceas y nunca se atrevió a preguntar. Conabio. Biodiversitas 40: 4-7.
Martin, P. S., D. Yetman, M. Fishbein, P. Jenkins, T. R. Van Devender y R. K.
Wilson. 1998. Gentry`s Río Mayo Plants. The Tropical Deciduous Forest and
Environs of Northwest México. University of Arizona Press, Tucson, Arizona.
Mauseth, J. 1979. A new method for the propagation of Cacti: sterile culture of
axillary buds. Cactus & Succulent Journal 51(42): 18-21
Olalde, P. G. 2001. La familia de las cactáceas. Gaceta de Coapa. Julio-agosto: 6.
Paredes R., Van Devender T. R. y Felger R. S. 2000. Cactáceas de Sonora, México:
su Diversidad, Uso y Conservación. Arizona-Sonora Desert Museum Press. Tucson,
Arizona. 143 p.
Robbins, Christopher S., (Ed.). 2003. Prickly Trade: Trade and Conservation of
Chihuahuan Desert Cacti, por Christopher S. Robbins y Rolando Tenoch Bárcenas
Luna. Norteamérica. Washington D.C.: Fondo Mundial para la Naturaleza.
Rubluo, A. 1990. Aplicaciones biotecnológicas para el rescate de especies en peligro
de extinción. BIOTAM. 1(4)
Smith, R. H., P. J. Burdick, J. Anthony and A. A. Reilley. 1991. In vitro propagation
of Coryphantha macromeris. Hort Science. 26(3): 315.
Soberón, M. J. y J. Llorente. 1993. La Comisión para el Conocimiento y Uso de la
Biodiversidad de México (CONABIO). Rev. Soc. Hist. Nat. Vol. Esp. 44:3-17.
Toledo, V. M., 1988. La diversidad biológica de México. Ciencia y
Desarrollo.81:17-30.
Turner R. M., J. E. Bowers y T. L. Burgess. 1995. Sonoran Desert Plants: An
Ecological Atlas. University of Arizona Press, Tucson , Arizona.
Williams-Linero, G., Halffter, E., Ezcurra (1992). Estado de la biodiversidad en
México. En: G. Halffter (comp.). La diversidad biológica de Iberoamérica 1.
CYTED-D, Instituto de Ecología, SEDESOL.