13t h e m ep i p e t t e – s w i s s l a b o r at o ry m e d i c i n e | www. s u l m . c h n r . 5 | o k t o b e r 2 0 1 3

1 Abteilung Umweltmikrobiologie, Eawag, Das Wasserforschungsinstitut der Bundes, Dübendorf 2 MICROBES-IN-WATER GmbH, General Wille- Strasse 194, 8706 Feldmeilen

die in der mikrobiologischen trinkwasseranalytik eingesetzten plattierungsverfahren sind langsam; resultate sind z.t. erst nach tagen verfügbar. neue durchflusszytometrische Methoden zur Bestim-mung der totalzellzahl und Zellgrösse bewährten sich in der praxis und wurden deshalb ins lebens-mittelbuch aufgenommen.

bis 1%), der anwesenden lebenden Mi-kroorganismen erfasst [1, 2]. Der in der Schweiz in der Hygieneverordnung festgelegten AMK-Toleranzwerte von 20 (nach Behandlung) und 300 KBE/ml (im Verteilnetz) unterschätzen so-mit die Zahl der wirklich vorhande-nen, aktiven Zellen bei weitem. Des-halb muss heute in vielen Ländern die AMK-Zahl zwar noch bestimmt wer-den, ist aber kein hygienerelevanter Parameter mehr [2]. Es besteht daher ein echter Mangel an einfachen, in der Praxis robusten und zugleich schnellen und empfindlichen Methoden für die Detektion und Quantifizierung von mi-krobiellen Zellen in Trinkwasser.

lösung durchflusszytometrie?Die in der Medizin seit langem verwen-dete Methode der Durchflusszytome-trie (DZ) (Abb. 1) wurde in den letz-ten Jahren so weiterentwickelt, dass heute auch kleinste planktonische Bak-terienzellen, ja sogar Viren, nach geeig-netem Anfärben erfasst werden kön-

Im Umfeld von Robert Koch wurden um 1890 Plattenkultivierungsverfah-ren und Konzepte entwickelt, die bis heute weltweit die Pfeiler der Hygiene und mikrobiologischen Routineanaly-tik für Trinkwasser bilden. Die zwei Grundpfeiler sind erstens, die Suche nach Hygiene-«Indikatorkeimen», de-ren Anwesenheit eine Verschmutzung mit Fäkalien und so eine mögliche Prä-senz von Krankheitserregern anzeigen sollen, und zweitens die generelle Be-urteilung der mikrobiologischen Was-serqualität anhand der Gesamtzahl mi-krobieller Zellen [1, 2]. Dabei ging man davon aus, dass alle in einer Probe aktiven Zellen auf geeigneten festen Nährböden zu einer sichtbaren Kolo-nie (sog. KBE, koloniebildende Einhei-ten) heranwachsen. Als «Fäkalienan-zeigerkeim» dient dabei weltweit das Darmbakterium Escherichia coli (als Hygiene-Standard gilt, dass in 100 ml Trinkwasser E. coli nicht nachweisbar sein soll; derselbe Toleranzwert gilt in der Schweiz zusätzlich für fäkale Ente-rokokken). Der generelle Zustand des Wassers wird über die Zahl der KBE aerober, mesophiler Keime (AMK) be-urteilt; sie sollte immer kleiner als 300 KBE/ml sein.

problematikBeide Methoden haben den Nachteil, relativ langsam zu sein; so erhält man beim Suchen nach E. coli ein Resultat erst nach einem Tag, für die AMK-Zahl muss man sich 3 bis 10 Tage gedul-den [2, 3]. Sie wurden seit ihrer Ein-führung nur unwesentlich verbessert, doch während sich die Suche nach E. coli bewährte, erkannte man in letzter Zeit, dass die AMK-Methode nur ei-nen verschwindend kleinen Teil (0,01

nen. Die DZ bietet zudem eine Vielzahl von weiteren Möglichkeiten zur Detek-tion von Zellen und ihrer Eigenschaf-ten (Abb. 2, online): In Kombination mit dem durch die Zelle hervorgeru-fenen Streulicht, oder nach Anfärben mit Aktivitätsfarbstoffen, Markierung mit fluoreszierenden Antikörpern usw., ermöglicht sie gleichzeitig die Erfas-sung mehrerer Parameter und die Dif-ferenzierung unterschiedlicher Zellen. Dies erlaubte ihren Einsatz zuerst für biotechnologische Fragestellungen [4] und dann auch für solche in der aqua-

Thomas Egli1,2

Neuer Wind in der mikrobiologischenAnalyse von Trinkwasser

Un vent nouveau souffle sur l’analyse microbiolo-gique de l’eau potable Les méthodes établies d’analyse de l’eau potable reposent en soi sur la mise en évi-dence d’indicateurs fécaux (E. coli, enté-rocoques) et sur le nombre de germes aérobies mésophiles. Ces méthodes éta-blies résident dans la croissance d’orga-nismes cibles sur des milieux de culture solides pour former une colonie et elles sont par conséquent lentes (>1 jour). C’est pourquoi il existe un besoin urgent de mettre au point des méthodes sensibles plus rapides. D’importants progrès ont été accomplis ces dernières années dans le domaine de la détection de cellules bac-tériennes et de virus au moyen de la cy-tométrie en flux (CMF). La CMF permet de déterminer en moins de 15 minutes le nombre total de cellules, leur taille approxi-mative, leur vitalité, ainsi que d’autres ca-ractéristiques cellulaires après coloration avec des agents fluorescents. Même la mesure en ligne du nombre total de cel-lules est déjà possible. Après avoir fait ses preuves dans la pratique, la détermination par CMF du nombre total de cellules dans l’eau douce, sous la direction de la Société Suisse de l’Industrie du Gaz et des Eaux (SSIGE) et de l’Eawag, a été standardisée et validée, puis intégrée au Manuel suisse des denrées alimentaires (MSDA).

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Abbildung 1

Filter 1 Laser

Glaskapillare

Zellen Filter 2

Detektor 3: Fluoreszenzsignal

520 nm Detektor 1:

Vorwärtsstreulicht 488nm

Detektor 2: Seitwärtsstreulicht

488 nm

(sortieren)

Abfall

DNA-bindender, fluoreszierender Farbstoff

488nm

Abbildung 1: Prinzip der Durchflusszyto-metrie. Nach Anfärben der Zellen mit ei-nem fluoreszierenden Farbstoff können, je nach Gerät und gewünschter Präzision, zwischen 1000 und 100 000 Zellen pro Sekunde detektiert werden. Für die Be-stimmung der Totalzellzahl und Aufnahme des «Fingerabdrucks» des Wassers, wie im SLMB festgelegt [15], braucht man we-niger als einer Viertelstunde. Quelle [15]

14 N R . 5 | o k t o b e R 2 0 1 3p i p e t t e – s w i s s l a b o R at o Ry m e d i c i N e | www. s u l m . c ht h e M e

tischen mikrobiellen Ökologie [5, 6]; sie ist aber auch anwendbar für hygie-nerelevante Fragen, wie z.B. die Detek-tion und das Wachstumsverhalten spe-zifischer Krankheitserreger im Wasser

[7–9]. An der Eawag wurden in den letzten Jahren eine Reihe von auf DZ basierenden Methoden für die schnelle Analyse von Roh- und Trinkwasser ent-wickelt [10 –14]. Einige davon haben sich als aussagekräftig und robust ge-nug für die Routineanalytik und die Praxis erwiesen.

totalzellzahlbestimmung als BasismethodeAls Basismethode und «Arbeitspferd» dient die Bestimmung der Totalzellzahl (TZZ) [10] nach Anfärben mit einem an

Nukleinsäuren bindenden (DNA/RNA) Fluoreszenzfarbstoff. Zur Bestimmung der TZZ in Süsswasser hat sich «SYBR Green I» bewährt [10] (Abb. 3). In Kom-bination mit dem Seitwärtsstreulicht lassen sich in der «dot plot»-Darstel-lung zwei Zellgruppen unterscheiden: Grosse, stark grün fluoreszierende und kleinere, nur schwach fluoresziere Zel-len. Solches «clustering» wurde nicht nur in marinen Wasserproben, sondern auch in Süsswasser beobachtet, und sie werden als «low nucleic acid, LNA»- und «high nucleic acid, HNA»-Zellen bezeichnet [5].

einige anwendungen in der praxisDiese DZ-Methode erlaubt es, gleich-zeitig eine Quantifizierung aller mik-robieller Zellen und einen ersten «Fin-gerabdruck» der anwesenden mikrobi-ellen Gemeinschaft zu erhalten. Nach einigen Jahren Erfahrung dürfen wir feststellen, dass diese beiden Parameter eine realistische Beurteilung des mikro- biologischen Zustands des Trinkwas-sers erlauben [11, 14, 16, 17]. Die TZZ

reagiert sehr empfindlich auf mikro-biell abbaubare Veschmutzungen (as-similierbarer, organischer Kohlenstoff, AOC) [10], da 1 µg AOC im Durch-schnitt zum Aufwachsen von 107 Zel-len führt. Es sind vor allem die grossen HNA-Zellen, welche bei solchen Wie-derverkeimungen die Überhand gewin-nen [11, 16 –18]. In Abb. 3 ist dies ex-emplarisch gezeigt für Wasser in einem Verteilnetz, das mit zellarmem Grund-wasser gespeist wird und über Nacht stagnierte [18]. Auch die Aufbereitung und Verteilung von aus Seewasser pro-duziertem Trinkwasser kann über den einfachen Parameter der TZZ verfolgt werden (Abb. 4, online). Der Desinfek-tionsprozess (Ozonung), wie auch das Wiederaufwachsen in den drei biolo-gischen Filtern und die Stabilität der TZZ im Verteilnetz kann mit der DZ-Methode klar beurteilt werden, wäh-rend die AMK-Methode keine Aussage erlaubt. Auch Hausinstallationen las-sen sich auf diese Weise sehr schnell und klar untersuchen.

An der Eawag wurden in den ver-gangenen zehn Jahren eine Reihe

von Durchflusszytometrie-Methoden für die schnelle Analyse von

Roh- und Trinkwasser entwickelt.

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die ZukunftOnline-Messung der TZZ und des LNA/HNA-Verhältnisses [20], schnelle Detek-tion und Quantifizierung von Krank-heitserregern innerhalb von ein bis zwei Stunden [7, 8], und die Evaluie-rung von Desinfektionsprozessen vom Rohwasser [21–24], über die Aufberei-tung und Verteilung bis ins Haus zum Hahn des Konsumenten, werden heute entwickelt und teilweise auf dem Markt bereits angeboten. Der Autor ist über-zeugt, dass die Aufnahme der TZZ-Ba-sismethode in das SLMB erst der An-fang eines Umbruchs in der mikrobio-logischen Trinkwasseranalytik darstellt, denn das Potential der DZ-Methodik ist bei weitem noch nicht ausgeschöpft.

Korrespondenz: microbes-in-water@bluewin.ch

Standardisierung und Validierung für das lebensmittelbuchBeide Parameter, die Bestimmung der TZZ und des LNA/HNA-Verhältnisses, erwiesen sich für die Trinkwasseraufbe-reitung und -verteilung als so robust und aussagekräftig, dass sich frühe Anwen-der, darunter zwei grosse Wasserver-sorger der Schweiz, unter der Führung der Eawag und des SVGW (Schweize-rischer Verein des Gas- und Wasser-faches) entschieden, die Methode zu standardisieren und validieren. Mit ei-ner durchschnittlichen Standardabwei-chung von ca. 5% für die TZZ und ca. 10% für das Verhältnis LNA/HNA-Zel-len, fiel die Validierung äusserst erfolg-reich aus. Deshalb hat das BAG die TZZ-LNA/HNA-Bestimmung mittels DZ als schnelle Alternative zur traditionel-len AMK-Bestimmung (Nr. 56 / E.1) ins Schweizerische Lebensmittelhandbuch (SLMB) aufzunehmen. Die Methode (Nr. 333 / 1) [15] wird heute vom BAG empfohlen, und ein Handbuch mit Er-klärungen und Tipps ist verfügbar [19].

t h e M e

dank

Finanziert wurden unsere Arbeiten primär durch die Eawag, WV Zürich, EU (TECHNEAU), BAFU, BAG, Velux-Stiftung, BAG, das KTI, Evian-Da-none, AwwaRF, SVGW, und Nestlé Waters. Ihnen, sowie all meinen Mitarbeiter/-innen und beteiligten externen Partnern, danke ich für die langjährige, fruchtbare Zusammenarbeit.

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nukleinsäure-Sequenzierungstechnologien der neusten generation generieren Millionen von Sequen- zen in einem Sequenziervorgang. Schon bald könnte diese technologie zur Beantwortung unter-schiedlicher Fragen in die routine der virologischen und mikrobiologischen diagnostik einzug halten.

Michael Huber, Jürg Böni und Alexandra Trkola1

Molekulare virologische Diagnostik im Wandel

Der modernen Diagnostik steht eine Vielzahl von Methoden für den direk-ten Nachweis von Viren zur Verfügung. Herkömmliche Verfahren (Virusver-mehrung in Zellkultur, Visualisierung von Viren durch Elektronenmikrosko-pie, Detektion von viralen Antigenen) wurden zunehmend durch sequenz-spezifische molekulare Methoden er-gänzt. Sie haben die Diagnostik deut-lich verbessert, da sie den Nachweis viraler Nukleinsäuren und damit die Bestimmung von schwach konzen-trierten und schwer kultivierbaren Vi-ren ermöglichen. Aus Kostengründen muss sich ein Diagnostiklabor auf spe-

zialisierte Analysen der klinisch wich-tigsten Erreger und damit nur auf ei-nen Bruchteil der mehr als 200 derzeit bekannten humanpathogenen Viren [1–3] beschränken. Spezifische mole-kulare Tests stehen daher nur für ein relativ enges Spektrum von Viren zur Verfügung. Neben dem direkten Virus-nachweis ist die Detektion von Muta-tionen zur sequenzbasierten, d.h. ge-notypischen Resistenzbestimmung eine weitere wichtige Anwendung der molekularen Diagnostik.In den letzten Jahren hat die Tech-nologie zur Sequenzierung von Nu-kleinsäuren gewaltige Fortschritte gemacht. Die neuen Methoden, be-kannt als Next Generation Sequen-cing (NGS), zeichnen sich gegenüber

der traditionellen Sanger Sequenzie-rung durch einen viel höheren Out-put an Sequenzen aus. Es sind derzeit verschiedene Verfahren in Gebrauch, die alle auf einem ähnlichen Grund-prinzip basieren: Mehrere Millio- nen von DNA-Molekülen werden auf einem Chip immobilisiert und direkt in situ und individuell sequenziert. Hoch-durchsatzsequenziergeräte generieren dabei mehr als 1000 Mio. Sequenzen pro Analyse, die kompakteren Tischge-räten etwa 10 Mio. Vor allem Letztere sind für den Einsatz in der Diagnostik von Interesse, da sie einen kosteneffi-zienten Einsatz der neuen Sequenzier-technologie bei genügend hoher Kapa-zität erlauben (Tabelle 1). Dieser Tech-nologiesprung eröffnet faszinierende

1 Dr. Michael Huber, PD Dr. Jürg Böni und Prof. Dr. Alexandra Trkola, Institut für Medizinische Virologie, Universität Zürich

Next Generation Sequencing auf dem Weg in die diagnostische Routine?

Abbildung 3

LNA  

HNA  

Grünfluoreszenz  

Netzwasser  stagniert  

LNA  

HNA  

Grünfluoreszenz  

Netzwasser  frisch  

Seitw

ärtsstreulich

t  

1000  

100  

10  

11 10   100   1000  100  1000  1 10  

Abbildung 3: Die «dot plot»-Darstellung der DZ-Resultate einer Wasserprobe nach Anfärben mit SYBR Green I (jeder Punkt entspricht einer Zelle) zeigt die Verände-rung des Fingerabdrucks eines Grund-wassers, das als Trinkwasser direkt ins Netz eingespeist wurde und über Nacht stagnierte. Die Auftragung der Intensität des 488-nm-Laserstreulichts (SSC, side scatter) gegen Grün-Fluoreszenz-Intensi-tät (520 nm) ermöglicht es, grosse, stark fluoreszierende Zellen (HNA) von kleinen, schwach fluoreszierenden Zellen (LNA) zu unterscheiden. Das Aufwachsen der HNA-Zellfraktion nach Stagnation ist klar zu er-kennen. Quelle: [19]

referenzen

Die vollständige Literaturliste und Abbildungen finden Sie online unter: www.sulm.ch/pipette → Aktuelle Ausgabe (Nr. 5-2013)