VILNIAUS UNIVERSITETAS

GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS

Mikrobiologijos ir augalų fiziologijos katedra

BIOCHEMIJOS INSTITUTAS

Vystymosi biologijos skyrius

VAIDA GURSKIENö

NCK ŠEIMOS BALTYM Ų SĄVEIKA SU RAS GTPAZĘ AKTYVUOJAN ČIU

BALTYMU

MAGISTRO DARBAS

(Biologija)

Mokslinis vadovas:

Dr. Mindaugas Valius

Vilnius

2006

2

Turinys

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS 4

1. ĮŽANGA 6

2. LITERATŪROS APŽVALGA 7

2.1 PDGF ir jo receptorius 7

2.2. Signalo perdavimas PDGF receptoriumi β 10

2.2.1. Fosfatidilinozitol 3-kinaz÷ 10

2.2.2. Fosfolipaz÷ Cγ 11

2.2.3. Src tirozino kinaz÷ 11

2.2.4. Adaptorinis baltymas Grb2 12

2.2.5. Tirozino fosfataz÷ SHP-2 12

2.2.6. Transkripcijos faktoriai Stat 12

2.2.7. Mitogenų aktyvuotos proteino kinaz÷s 13

2.3. Kitos signalo perdavime dalyvaujančios molekul÷s 14

2.3.1. Ras ir Ras GTPazę aktyvuojantis baltymas 14

2.3.2. Adaptorinių baltymų Nck-α ir Nck-β vaidmuo signalo perdavime 17

2.4. Tarpbaltymines sąveikas užtikrinantys domenai 20

2.4.1. SH2 domenai 20

2.4.2. SH3 domenai 21

3. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS 23

3.1. Reagentai 23

3.2. GST, GST-Nck baltymų gavimas 23

3.2.1. Ekspresijos vektoriai 23

3.2.2. GST-Nck ekspresija 23

3.2.3. GST-baltymų gryninimas 24

3.3. Nck šeimos baltymų sąveikos su RasGAP tyrimas 24

3.3.1. Ląstelių linijos 24

3.3.2. Laikinoji transfekcija 25

3.3.3. Ląstelių lizatų paruošimas 25

3.3.4. Imunoprecipitacija 26

3.3.5. Precipitacija su rekombinantiniais baltymais 26

3.3.6. “Far western” blotas 27

3.3.7. Testas aktyvuojant kinazę in vitro 27

3

3.3.8. Imunofluorescencija 28

4. REZULTATAI 29

4.1. Su GST sulietų baltymų gavimas 29

4.2. Nck-α ir Nck-β baltymų sąveika su RasGAP in vitro 29

4.3. Nck-α ir Nck-β sąveika su RasGAP in vivo 31

4.4. Tiesiogin÷ sąveika tarp RasGAP ir Nck šeimos baltymų ir jos mechanizmas 34

4.5. Nck-α baltymo sąveika su RasGAP HL-60 ląstelių linijoje 36

4.6. Nck-α ir RasGAP baltymų lokalizacija 39

5. REZULTATŲ APTARIMAS 43

6. IŠVADOS 46

7. LITERATŪROS SĄRAŠAS 47

4

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS

ATF-2 - Aktyvuojantis transkripcijos faktorius 2

BSA - Jaučio serumo albuminas

DAG - Diacilglicerolis

DME - Dulbecc’o modifikuota Eagle terp÷

Cdc42 - Ląstel÷s dalijimąsį kontroliuojantis baltymas 42

EGFR - Epidermio augimo faktoriaus receptorius

eIF2β - Elongacijos iniciacijos faktorius 2β

Elk1 - Trinario komplekso faktorius (TCF)

EphB1 ir EphB2 - Efrino receptorius B1

ERK - Ekstraląstelinių signalų reguliuojama kinaz÷

FAK - Fokalin÷s adhezijos kinaz÷

FBS - Jaučio embriono serumas

GDP - Guanozindifosfatas

GEF - Guanino nukleotidų mainų faktorius

GST - Glutation-S-transferaz÷

Grb2 - Prie augimo faktoriaus receptoriaus prisijungęs baltymas 2

GTP - Guanozintrifosfatas

HA - Hemagliutininas

Hsp25/Hsp27 - Šiluminio šoko baltymas 25/27

IPTG - Izopropil-β-D-tiogalaktozidas

IRS-1 - Insulino receptoriaus substratas-1

JIP1 - Su JNK sąveikaujantis baltymas 1

kDa - Kilodaltonas

MAPKK - MAP kinaz÷s kinaz÷s

MAPKKK - MAP kinaz÷s kinaz÷s kinaz÷

MAPK - Mitogenų aktyvuota proteino kinaz÷

MAPKAP2 - MAPK aktyvuota proteino kinaz÷ 2

MEKK - MAPK/ERK kinaz÷s kinaz÷

MEK1/MEK2 - MAPK/ERK kinaz÷

MKK - MAPK kinaz÷

NAP-1 - Su Nck asocijuotas baltymas 1

5

NIK - Su Nck sąveikaujanti kinaz÷

Pak - p21cdc42/rac aktyvuota kinaz÷

PAP - Su PDGF asocijuotas baltymas

PBS - Fosfatinis druskos tirpalas

PDGF - Plokštelių (trombocitų) kilm÷s augimo faktorius

PDGFR - Plokštelių (trombocitų) kilm÷s augimo faktoriaus receptorius

PH - Plekstrino homologijos domenas

PI3K - Fosfatidilinozitol 3-kinaz÷

PI(4,5)P2 - Fsfatidilinozitol 4,5-difosfatas

PI(3,4,5)P3 - Fosfatidilinozitol 3,4,5,-trifosfatas

PINCH - Ypatingai įdomus naujas cisteino-histidino baltymas

PKA - Proteino kinaz÷ A (nuo cAMP priklausoma proteino kinaz÷)

PKC - Proteino kinaz÷ C

PLCγ - Fosfolipaz÷ Cγ

PLD - Fosfolipaz÷s D

PPII - Kairiojo sukimo antrojo tipo poliprolino spiral÷

PRK2 - Su proteino kinaze C susijusi kinaz÷ 2

Ras - Mažasis G baltymas

RasGAP - Ras GTPazę aktyvuojantis baltymas

RhoGAP - Rho GTPazę aktyvuojantis baltymas

RTK - Receptorius tirozino kinaz÷

Sam68 - Su Src asocijuotas mitoz÷je baltymas 68

SAPK/JNK - Streso aktyvuota proteino kinaz÷/ c-Jun N galin÷ kinaz÷

SDS-PAGE - Natrio dodecilsulfato – poliakrilamidinio gelio elektroforez÷

SEK1 - SAPK/ERK kinaz÷ 1 (dar vadinama MKK4, MAPK kinaz÷ 4)

SH2 - Src homologijos domenas 2

SH3 - Src homologijos domenas 3

SLP-76 - SH2 domeną talpinantis leukocitų baltymas

SOCS3 - Citokinų signalizavimo supresorius 3

TAK1 - TGF-β aktyvuota kinaz÷ 1

TPA - 12-O-tetradekanoilforbol-13-acetatas

VEGFR - Vaskuliarinio endotelinio augimo faktoriaus receptorius

WASp - Wiskott-Aldrich’o sindromo baltymas

WIP - Su WASp sąveikaujantis baltymas

6

1. ĮŽANGA

Eukariotinių ląstelių proliferacija, diferenciacija ir programuota ląstelių mirtis yra

pagrindiniai ląstel÷se vykstantys procesai, užtikrinantys organizmo vystymąsi,

funkcionavimą ir mirtį. Šie procesai ir juos reguliuojančių signalų perdavimas yra

realizuojami tarpbaltymin÷mis sąveikomis. Šių reguliacinių sistemų tyrimas yra

vienas iš pagrindinių ląstel÷s biologijos uždavinių.

Ląstel÷s procesų reguliavime svarbų vaidmenį atlieka augimo faktoriai, kurie

jungiasi prie ląstel÷s paviršiuje esančių tirozino kinazių receptorių. Po sąveikos su

ligandu receptorius tampa aktyviu ir su juo gali sąveikauti citoplazmos molekul÷s,

kurios sąlygoja signalo perdavimą į branduolį ir atitinkamo atsako suformavimą.

Signalo perdavime svarbų vaidmenį atlieka adaptoriniai baltymai. Šie baltymai

veikia kaip tarpininkai užtikrindami sąveikas tarp skirtingų baltymų ir, tokiu būdu,

sąlygodami signalo perdavimą.

Keletas adaptorinių baltymų priklauso Nck baltymų šeimai. Yra žinomas šių

baltymų vaidmuo proliferacijos signalo perdavime, bet mažai ištyrin÷tas jų veikimo

mechanizmas.

Darbo tikslas:

Ištirti Nck šeimos baltymų sąveiką su Ras GTPazę aktyvuojančiu baltymu

(RasGAP).

Uždaviniai:

Nustatyti už Nck-α sąveiką su RasGAP atsakingus Nck-α baltymo domenus ir

ištirti sąveikos mechanizmą.

Įvertinti Nck šeimos baltymų ir RasGAP sąveikos priklausomybę nuo PDGF

receptoriaus-β aktyvacijos.

7

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.2 PDGF ir jo receptorius

Ekstraląstelin÷s signalin÷s molekul÷s, tokios kaip augimo faktoriai (EGF, PDGF,

VEGF), jungiasi prie receptorių tirozino kinazių (RTK). Prisijungus ligandui vyksta

receptoriaus dimerizacija ir tirozinų autofosforilinimas. Prie fosfotirozinų specifiškai

jungiasi SH2 (Src homologijos domenas) domenus turintys baltymai, kurie perduoda

signalą kitoms, signalo perdavime dalyvaujančioms, molekul÷ms.[42] Vienas pirmųjų

augimo faktorių yra plokštelių (trombocitų) kilm÷s augimo faktorius PDGF.

Plokštelių (trombocitų) kilm÷s augimo faktorius (PDGF) pirmiausia nustatytas

kaip kraujo serumo sud÷tin÷ dalis, v÷liau išskirtas iš žmogaus trombocitų.[12, 22]

PDGF yra sintetinamas daugelyje ląstelių. Sintez÷ padid÷ja atsake į išorinius stimulus

tokius kaip žemas deguonies lygis, trombinas, poveikis įvairiais augimo faktoriais ir

citokinais. Dažniausiai ląstel÷je yra sintetinamos abi PDGF izoformos, A ir B, bet

reguliacija transkripciniame ir potranskripciniame lygyje vyksta nepriklausomai.[12]

PDGF yra gaminamas megakariocituose ir po jų diferenciacijos į trombocitus yra

saugomas jų α-granul÷se. Kraujui krešant trombocitai agreguojasi ir degranuliuoja,

PDGF pereina į serumą, iš serumo patenka į audinius ir dalyvauja žaizdų gijimo

procesuose pritraukdamas makrofagus ir inicijuodamas ląstel÷s proliferaciją.[29]

PDGF dalyvauja įvairiuose ląsteliniuose procesuose reguliuodamas ląstelių

proliferaciją, augimą, chemotaksį. Yra svarbus embrioninio vystymosi metu, apsaugo

ląsteles nuo apoptoz÷s, dalyvauja žaizdų gijimo procesuose. Per didelis PDGF

aktyvumas gali sukelti padid÷jusią ląstelių proliferaciją ir išsivystyti įvairūs v÷žiniai

susirgimai (sarkoma, glioma), taip pat fibroz÷s, ateroskleroz÷.[12, 13, 22, 37]

Šiuo metu yra žinomos keturios PDGF izoformos: A, B, C ir D. A ir B izoformų

genai yra išsid÷stę 7 ir 22 chromosomose, atitinkamai. Abu turi 7 egzonus: pirmas

koduoja signalinę seką, 2 ir 3 – koduoja iškerpamas iš pirmtako sekas, 4 ir 5 –

didžiąją dalį baltymo, 7 egzonas daugiausia yra nekoduojantis. 6 egzonas iš B

grandin÷s yra iškerpamas brendimo metu, tuo tarpu A grandin÷ gali tur÷ti šio egzono

koduojamą seką arba ne. PDGF-C ir PDGF-D genai yra 4q32 ir 11q22.3

chromosomose, atitinkamai. PDGF-C genas turi 6 egzonus, PDGF-D – 7.[12, 16]

Polipeptidin÷s grandin÷s yra sintetinamos kaip pirmtakai, kurie patiria proteolitinį

procesingą. Susiformuoja subrendusios molekul÷s. A ir B izoformos sudarytos iš 100

amino rūgščių liekanų ir savo sekomis identiškos 60%.[13] C ir D polipeptidai

8

sudaryti iš 323 ir 348 amino rūgščių liekanų, atitinkamai, ir pasižymi 43% sekų

homologija.[16]

PDGF augimo faktoriai jungiasi prie PDGF tirozino kinaz÷s receptoriaus. PDGF

poveikis PDGF receptoriui yra reguliuojamas augimo faktoriaus sąveikos su matrikso

komponentais bei tirpiais baltymais (pvz., PAP (PDGF-Associated Protein)).

Yra du PDGF receptoriai: PDGFR-α 170 kDa ir PDGFR-β 180 kDa. α

receptoriaus genas yra lokalizuotas 4q12 chromosomoje, o β receptoriaus - 5

chromosomoje.[12]

PDGF receptorius yra transmembraninis polipeptidas. Ekstraląstelin÷ dalis yra

sudaryta iš penkių į imunoglobulinus panašių domenų ir atsakinga už receptoriaus

sąveika su ligandu. Transmembranin÷ dalis yra sudaryta iš hidrofobinių amino rūgščių

sekos, kurios C-gale yra kelios hidrofilin÷s amino rūgštys. Transmembranin÷ dalis

įgalina receptorių migruoti membranoje lateraliai. Viduląstelin÷je dalyje yra

priemembraninis domenas, tirozino kinaz÷s domenas atsakingas už receptoriaus

sąveika su kitomis signalin÷mis molekul÷mis ir C-galo domenas vadinamas

receptoriaus uodega.(Pav.1.)[12, 22]

Pav.1. PDGF receptoriaus β struktūra ir su jo fosfotirozinais sąveikaujantys

baltymai.

Receptoriai gali funkcionuoti kaip homo- (αα ir ββ) ir heterodimerai (αβ), kurie

pasižymi skirtingu specifiškumu ligandui.[22] PDGF A ir B jungiasi prie PDGF

Išorin÷ dalis

Transmembranin÷ dalis

Viduląstelin÷ dalis

Pirmas kinaz÷s domenas

Antras kinaz÷s domenas

Intarpas

Uodega

Priemembranin÷ dalis pY579 Src

pY581 pY716 Grb2 pY740 PI3K pY751 Nck pY771 GAP pY1009 Syp pY1021 PLCγ

9

receptorių α ir β kaip, disulfidiniais tilteliais sujungtos, homo- arba heterodimerin÷s

molekul÷s (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB), o C ir D izoformos tik kaip

homodimerai (PDGF-CC, PDGF-DD). Prisijungus ligandui PDGF receptoriaus

molekul÷s dimerizuojasi. AA, AB ar BB ligandų prisijungimas sąlygoja PDGF

receptoriaus αα, αβ ar ββ dimerų susiformavimą. PDGF-CC homodimeras jungiasi

prie PDGF-α ir sąlygoja homodimero αα susiformavimą, bet nesijungia prie PDGF-β.

Taip pat gali aktyvuoti PDGF-αβ heterodimerų susidarymą. Tuo tarpu PDGF-DD

aktyvuoja tik PDGF-ββ homodimerą ir PDGF-αβ heterodimerą, bet neaktyvuoja

PDGF-αα.[12, 16, 22] Ligando prisijungimui yra svarbiausi trys, labiau į išorę nutolę,

į imunoglobulinus panašūs domenai. Sąveika tarp dviejų receptoriaus polipeptidinių

grandinių yra inicijuojama ligando prisijungimu, o stabilizuojama per ketvirtąjį į Ig-

panašų domeną. Ligando-receptoriaus kompleksas yra stabilizuojamos tiesiogin÷s

sąveikos tarp receptorių.[12, 13]

Po ligandu indukuotos receptoriaus dimerizacijos vyksta receptoriaus

citoplazmin÷je dalyje esančių tirozinų autofosforilinimas. Autofosforilinimas atlieka

dvi svarbias funkcijas. Tirozinų, esančių kinaz÷s domene, fosforilinimas sąlygoja

katalitinį aktyvumą, o fosforilinti tirozinai, esantys už kinaz÷s domeno reikalingi

receptoriaus sąveikai su SH2 domeną turinčiomis citoplazmin÷mis molekul÷mis.

PDGF receptoriaus β tirozino kinaz÷s aktyvumui ir aktyvumo palaikymui yra

reikalingas tirozino Y857, esančio antrajame kinaz÷s domene, fosforilinimas. Šiuo

metu yra žinoma 12 tirozinų esančių priemembranin÷je dalyje, intarpe ar uodegoje

atsakingų už signalo perdavimą kitoms citoplazmin÷ms molekul÷ms. Per 30 min. po

stimuliacijos receptorius endocituojamas ir palaipsniui degraduojamas lizosomose.

[12, 13, 18]

Daugiau nei 10 SH2 domeną turinčių molekulių specifiškai jungiasi prie skirtingų

PDGFR fosfotirozinų. Sąveikos specifiškumą užtikrina 3-6 amino rūgščių liekanos

esančios už fosfotirozino.[13] Kai kurie baltymai sąveikaujantys su PDGFRβ

pasižymi fermentiniu aktyvumu. Tai PLCγ, kuri jungiasi prie pTyr 1021 ir 1009,

PI3K jungiasi prie pTyr740 ir751, tirozino fosfataz÷ SHP-2 – pTyr1009 ir pTyr763,

RasGAP – 771, Src šeimos tirozino kinaz÷s – pTyr579 ir 581. Kiti baltymai

nepasižymintys fermentiniu aktyvumu yra Grb2, kuris sąveikauja su PDGFRβ

pTyr775,716, Grb7 – pTyr775, 716, Shc – 751, 771 ir 579. Prie PDGFRβ pTyr579,

581 ir 775 taip pat jungiasi transkripcijos faktorių Stat šeimos nariai.(Pav.1.)

10

Kiekviena SH2 domeną talpinanti molekul÷, kuri jungiasi prie PDGFRβ inicijuoja

skirtingą signalo perdavimo kelią.(Pav.2.)[8, 12, 13, 30]

Pav.2. Signalo perdavimas PDGF receptoriumi β.

Trys dimerin÷s PDGFR kombinacijos perduoda panašius, bet neidentiškus,

ląstelinius signalus. α ir β heterodimerai perduoda mitogeninius signalus. Tačiau yra

skirtumai įtakojant aktino filamentų sistemą. β receptorius aktyvuoja chemotaksį, o α

receptorius lygiųjų raumenų ląstel÷se ir fibroblastuose chemotaksį slopina. Abu

receptoriai sąlygoja viduląstelinio Ca2+ koncentracijos padid÷jimą.[12, 13]

2.2. Signalo perdavimas PDGF receptoriumi β

2.2.1. Fosfatidilinozitol 3-kinaz÷

PI3K šeimos nariai, kurie jungiasi prie ir yra aktyvuojami tirozino kinazių

receptorių yra sudaryti iš reguliacinio subvieneto p85 ir katalitinio subvieneto p110.

p85 subvienetas sudarytas iš vieno SH2 domeno, kuris jungiasi prie pYXXM motyvo.

Prisijungus PI3K prie PDGFRβ, ji yra fosforilinama ties Tyr508. Pati sąveika sąlygoja

konformacinius pokyčius, kurių pasekoje padid÷ja p85 subvieneto katalitinis

aktyvumas. PI3K substratas yra fosfatidilinozitol 4,5-difosfatas [PI(4,5)P2], kuris yra

PDGF receptorius β

Src

SHP-2

Grb2/Sos

Shc

GAP PI3K PLCγ

Raf-1

MEK

MAPK

Ląstel÷s augimas

Ras

Rho šeima PKC šeima

Akt

Bad

Apoptoz÷ Ląstelių migracija

11

fosforilinamas iki fosfatidilinozitol 3,4,5,-trifosfato [PI(3,4,5)P3]. Yra keletas

skirtingų PI3K efektorinių molekulių. Tai serino/treonino kinaz÷s Akt/PKB, kuriomis

yra perduodamas antiapoptotinis signalas, PKC šeimos nariai (ε, δ, ζ), p70 S6 kinaz÷,

JNK, mažosios Rho šeimos GTPaz÷s, ypač Rac, kuris yra svarbus aktino

reorganizacijos ir chemotaksio procesuose. (Pav.1.)(Pav.2.) PI3K medijuoja daugybę

skirtingų ląstel÷s atsakų į skirtingus ekstraląstelinius signalus, tai aktino

reorganizacija, chemotaksis, ląstel÷s augimas ir antiapoptoz÷.[8, 12, 13, 42]

2.2.2. Fosfolipaz÷ Cγ

Fosfolipaz÷ Cγ yra sudaryta iš dviejų SH2 ir vieno SH3 domenų. Fosfolipaz÷s Cγ

substratas taip pat yra PI(4,5)P2. Jo produktai yra inozitolo 1,4,5,-trifosfatas, kuris

išleidžia viduląstelinį Ca2+ iš endoplazminio tinklo į citoplazmą, ir diacilglicerolis

(DAG) aktyvuojantis PKC šeimos narius. Prisijungus prie PDGF receptoriaus

pY1021 PLCγ yra fosforilinama ir padid÷ja jos katalitinis aktyvumas.(Pav.1.) Pilna

PLCγ aktyvacija priklauso nuo PI3K. PI3K substrato produktas PI(3,4,5)P3 jungiasi

prie PLCγ PH domeno ir tokiu būdu inkaruoja fermentą membranoje. PLCγ dalyvauja

fosfatidilcholinui specifin÷s fosfolipaz÷s D (PLD) aktyvacijoje. Po PLD veiklos

susiformuoja fosfatidin÷ rūgštis, kuri alosteriškai aktyvuoja PLCγ ir gali dalyvauti

mitogeniniame atsake į PDGF stimuliaciją. PLCγ dalyvauja Na+/H+ mainų

aktyvacijoje nuo Ca2+ ir PKC priklausomu mechanizmu.(Pav.2.) PLCγ n÷ra būtina

ląstel÷s augimo ir judrumo stimuliacijai, tačiau kai kurių tipų ląstel÷se gali įtakoti

šiuos atsakus.[10, 12, 13, 42]

2.2.3. Src tirozino kinaz÷

Tirozino kinazių Src šeimos nariai sudaryti iš vieno SH3, vieno SH2 ir katalitinio

domenų. C galin÷je dalyje yra tirozino Y527 liekana. Kai C-galo tirozinas

fosforilinamas, jis sąveikauja su Src SH2 domenu ir inaktyvuoja kinazę. Prisijungiant

Src prie PDGF receptoriaus pTyr579 ar pTyr581 yra defosforilinamas C-galinis Src

tirozinas ir Src aktyvuojama. Aktyvi Src indukuoja c-myc geno ekspresiją, kuri

reikalinga per÷jimui per G1 fazę. Src dalyvauja perduodant mitogeninį atsaką PDGF

receptoriumi β. Tuo tarpu Src prisijungimas prie PDGF receptoriaus α n÷ra svarbus

mitogeniniam atsakui.(Pav.1.)(Pav.2.)[12, 13, 30]

12

2.2.4. Adaptorinis baltymas Grb2

Grb2 (Growth factor receptor bound 2) yra nematodo Caenorhabditis elegans

baltymo Sem-5 homologas. Grb2 yra adaptorin÷ molekul÷ sudaryta iš vieno SH2 ir

dviejų SH3 domenų. SH3 domenai suriša Sos, SH2 domenai reikalingi tiesioginiam

adaptoriaus prisijungimui prie PDGF receptoriaus arba netiesioginei sąveikai per Shc

ar SHP-2. Grb2 SH2 domenas atpažįsta pYXNX motyvą. PDGFRβ tokie motyvai yra

du. Vienas tie Tyr716, kitas ties Tyr775.(Pav1.) Pagrindin÷ Grb2 funkcija yra

aktyvuoti Ras sąlygojant RasGDP virtimą į RasGTP. Aktyvuotas Ras jungiasi prie

serino/treonino kinaz÷s Raf-1, kuri aktyvuoja MAP kinazių kaskadą dalyvaujančią

ląstel÷s augimo stimuliacijos, migracijos, diferenciacijos procesuose.(Pav.2.)[3, 12,

13, 17]

2.2.5. Tirozino fosfataz÷ SHP-2

SHP-2 tai 70 kDa tirozino fosfataz÷ sudaryta iš dviejų SH2 domenų reikalingų

sąveikai su fosforilintais tirozinais, o ši sąveika reikalinga pilnam katalitiniam

aktyvumui. Pagrindin÷ šio baltymo funkcija yra neigiama PDGF receptoriaus signalo

perdavimo reguliacija defosforilinant jo autofosforilintus tirozinus. Už SHP-2 sąveiką

su PDGFRβ yra atsakingi receptoriaus fosfotirozinai pY1009 ir pY763.(Pav.1.)

Prisijungus prie receptoriaus yra fosforilinami SHP-2 tirozinai ir fosfataz÷ gali atlikti

adaptoriaus funkciją surišdama Grb2/Sos ir tokiu būdu dalyvaudama Ras

reguliuojamoje MAP kinazių kaskados aktyvacijoje. Kita svarbi šios fosfataz÷s

funkcija yra Src tirozino kinazių aktyvacija defosforilinant Src C-galinį

tiroziną.(Pav.2.)[12, 13]

2.2.6. Transkripcijos faktoriai Stat

Stat baltymų šeimą sudaro 7 nariai. Stat1, 3, 5α, 5β ir 6 jungiasi prie aktyvuoto

PDGFRβ ir yra fosforilinami. Po tirozino fosforilinimo Stat dimerizuojasi ir

translokuojamas į branduolį kur jungiasi prie DNR ir veikia kaip transkripcijos

faktorius. Stat molekul÷s yra svarbios signalo perdavimui citokinų receptoriais. Jų

vaidmuo signalo perdavime PDGF receptoriumi n÷ra žinomas.(Pav.1.)[12, 13]

13

2.2.7. Mitogenų aktyvuotos proteino kinaz÷s

Mitogenų aktyvuotos proteino kinaz÷s (MAPK) tai serino/treonino kinazių šeima.

Šios kinaz÷s yra aktyvuojamos veikiant įvairiems išoriniams stimulams per įvairius

receptorius (PDGFR, EGFR, FGFR), dalyvauja daugelyje signalinių kelių. Šie

signaliniai keliai randami daugelyje eukariotinių organizmų ir sudaryti iš trijų pakopų:

MAP kinaz÷ (MAPK) yra aktyvuojama MAP kinaz÷s kinaz÷s (MAPKK), kurią

aktyvuoja MAP kinaz÷s kinaz÷s kinaz÷ (MAPKKK). Šis tripakopis veikimas gali būti

reguliuojamas tiesiogiai GTP surišančiu ir hidrolizuojančiu baltymu, GTPaze (pvz.,

Ras) arba netiesiogiai – kai GTPaz÷ aktyvuoja tarpinę, sistemą kontroliuojančią

kinazę. MAP kinazių stimuliacija sąlygoja transkripcijos aktyvaciją.

MAP kiazių šeima yra skirstoma į tris pošeimius: ERK (ekstraląstelinių signalų

reguliuojama kinaz÷), SAPK/JNK (streso aktyvuota proteino kinaz÷/ c-Jun N galin÷

kinaz÷) ir p38. Visos MAPK yra fosforilinamos ties Thr-X-Tyr motyvu, esančiu VIII

kinaz÷s subdomene.[42, 50]

MAP kinazių sistemos yra aptinkamos tiek miel÷se, tiek ir stuburiniuose. Miel÷se

yra aptiktos penkios tokios sistemos veikiančios nepriklausomai viena nuo kitos ir

reguliuojančios atskirus viduląstelinius procesus. Stuburiniuose atrastos bent trys

sistemos dalyvaujančios daugelio procesų reguliacijoje ir n÷ra susijusios su vieno

konkretaus proceso reguliacija.[42, 50]

Geriausiai ištirtas yra ERK pošeimis. Tai pirma kinaz÷ atrasta stuburiniuose

organizmuose. Jis dalyvauja signalin÷se kaskadose sudarytose iš Raf, MEK1/MEK2

(MAPK/ERK kinaz÷) ir ERK1/ERK2. Raf yra aktyvuojamas jį fosforilinant PKC ar

kitais baltymais ir sąveikaujant su RasGTP ir 14-3-3 baltymais. Raf tampriai

asocijuoja ir fosforilina MEK. MEK savo ruožtu fosforilina ERK ties tirozino ir

treonino liekanomis Thr-Glu-Tyr motyve ir tokiu būdu aktyvuoja ERK. ERK kinaz÷s

gali būti aktyvuojamos ir nuo Ras bei Raf nepriklausomu keliu, reguliuojant PKC.

Fosforilinimas, bet ne katalitinis aktyvumas yra reikalingi ERK translokacijai į

branduolį. Aktyvus ERK fosforilina daugelį baltymų, tokių kaip transkripcijos

faktoriai ir kiti branduolio baltymai (Elk1 - trinario komplekso faktorius (TCF),

cMyc, c-Fos). Šis signalinis kelias yra aktyvus neproliferuojančioje ląstel÷je ir yra

stimuliuojamas mitogeniniu signalu. Fibroblastuose ERK sąlygoja į÷jimą į ląstel÷s

ciklą reguliuodamas ciklino D1 transkripciją. [42, 50]

14

SAPK/JNK medijuoja atsakus į ląstel÷s stresą. SAPK/JNK pošeimis yra

fosforilinamas ir tokiu būdu aktyvuojamas dvigubo specifiškumo treonino-tirozino

kinaze SEK1 (SAPK/ERK kinaz÷ 1) ir MKK7 (MAPK kinaz÷ 7). MKK7 aktyvuoja

JNK specifiškai. SEK1 gali būti aktyvuotas MEK kinaz÷mis (MEKK). Kas aktyvuoja

MEKK n÷ra žinoma, manoma, kad tai Pak (p21cdc42/rac activated kinase) kinaz÷, kuri

tiesiogiai sąveikauja su į Ras panašiu baltymu. Už JNK kaskados kinazių aktyvaciją

yra atsakingi baltymai Rac1 ir Cdc42. JNK substratai yra transkripcijos faktoriai c-

Jun, Elk-1 ir ATF-2. JNK fosforilina šiuos faktorius ir taip padidina jų transkripcinį

aktyvumą. [42, 50]

Žinduolių ląstel÷se buvo nustatytas pastolinis baltymas JIP1 (JNK-interacting

protein 1), kuris stabdo JNK translokaciją į branduolį ir slopina JNK aktyvuotą

apoptozę. JNK ir ERK pasižymi priešingu poveikiu reguliuojant apoptozę. [42, 50]

p38 yra Saccharomyces Hog1p baltymo homologas. p38 pošeimio baltymai gali

būti stimuliuojami osmosinio šoko sąlygomis. p38 fosforilinama MKK3 ir MKK6, o

jos savo ruožtu gali būti aktyvuojamos MTK1 (nuo MAP nepriklausoma kinaz÷ 1) ir

TAK1 (TGF-β (Transformuojantis augimo faktorius 1) aktyvuota kinaz÷ 1). p38

substratas yra MAPKAP2 (MAPK aktyvuota proteino kinaz÷ 2), kuri po to fosforilina

šiluminio šoko baltymą Hsp25/Hsp27. PC12 ląstel÷se p38 indukuoja apoptozę, kitose

ląstel÷se apsaugo nuo apoptoz÷s. [42, 50]

ERK, SAPK/JNK ir p38 veikimas priklauso nuo konteksto. Ląstelių sugeb÷jimas

išgyventi ar patirti apoptozę priklauso nuo MAP kinazių signalinių kelių santykio.[42]

2.3. Kitos signalo perdavime dalyvaujančios molekul÷s

2.3.1. Ras ir Ras GTPazę aktyvuojantis baltymas

Ras baltymas dalyvauja daugelyje ląstel÷s procesų tokių kaip proliferacija,

diferenciacija, apoptoz÷, migracija. Tai 21 kDa mažasis G baltymas turintis GTPazinį

aktyvumą reikalingą jo funkcijai atlikti. Yra žinomos trys Ras izoformos: Kirsten-Ras,

Harvey-Ras ir N-Ras, apibendrintai vadinamos p21Ras vardu. Ras baltymai yra

lokalizuoti plazmin÷s membranos citoplazmin÷je dalyje.[45]

p21Ras baltymai būna dviejų būsenų: neaktyvi – prisijungus GDP ir aktyvi –

prisijungus GTP. GTP prisijungimas sąlygoja konformacinius pokyčius, kurie

užtikrina Ras baltymų sąveiką su efektorin÷mis molekul÷mis. Po sąveikos su

15

efektoriumi, pastarasis aktyvuojamas ir signalas yra perduodamas kitoms signalin÷ms

molekul÷ms. Nors ląstel÷je yra žymiai daugiau GTP nei GDP, GDP nuo Ras nelinkęs

disocijuoti, nes RasGDP sąveika pasižymi dideliu giminingumu. GDP/GTP reakciją

stimuliuoja guanino nukleotido mainų faktoriai (GEF baltymai): Vav1, Sos (Son of

Sevenless), Pix. GEF sąveikauja su RasGDP, GDP išsilaisvina ir į jo vietą prisijungia

GTP. Ras baltymai yra inaktyvuojami dalyvaujant RasGAP (GTPazę aktyvuojantis

baltymas), kuris padidina Ras GTPazinį aktyvumą.[45]

Prie aktyvuoto tirozino kinaz÷s receptoriaus fosfotirozino jungiasi adaptorinis

baltymas Grb2 ar SHC/Grb2 kompleksas, kuris pritraukia Sos. Susiformuoja

receptoriaus-Grb2-GEF kompleksas. Tada Sos stimuliuoja RasGDP virtimą į

RasGTP. Ras gali būti aktyvuojamas netiesiogiai per Src tipo tirozino kinazes. Po

aktyvacijos Ras perduoda signalą pasrovin÷ms efektorin÷ms molekul÷ms.

Caenorhabditis elegans, Drosophila ir žmogaus Ras tiesiogiai jungiasi ir aktyvuoja

Raf proteino kinazę, Raf fosforilina ir aktyvuoja MEK, kuri fosforilina ir aktyvuoja

MAP kinazes Erk1 ir Erk2. Aktyvios Erk translokuojamos į branduolį kur fosforilina

ir reguliuoja tam tikrų transkripcijos faktorių aktyvumą.(Pav.2.) Kaip yra stabdomas

Ras signalizavimas n÷ra gerai žinoma. Manoma, kad Raf/MAP kinazių kaskada

fosforilina Sos ir tokiu būdu sukelia Sos-Grb2 komplekso disociaciją. Kitas

mechanizmas gali būti, kad prisijungus Grb2-Sos prie receptoriaus yra aktyvuojamas

RasGAP.[13, 42, 45]

GAP (GTPazę aktyvuojantis baltymas) baltymai atlieka neigiamo G-baltymų

reguliatoriaus funkciją. Jie sąveikauja su daugybe ląstel÷s faktorių ir yra alosteriškai

reguliuojami kovalentin÷mis ir nekovalentin÷mis sąveikomis.[44]

p120GAP (Ras GTPazę aktyvuojantis baltymas, dar vadinamas RasGAP) yra

plačiai ekspresuojamas įvairiose ląstel÷se. Gali būti įvairios šio baltymo izoformos.

Pagrindin÷ RasGAP katalitin÷ funkcija yra vykdyti GTP hidrolizę Ras, R-Ras ir Rab5

baltymuose. RasGAP jungiasi prie Ras efektorinio domeno, tod÷l manoma, kad

RasGAP gali atlikti ne tik GTPazę aktyvuojančią funkciją, bet ir būti Ras efektoriumi.

Buvo parodyta, kad p120GAP specifiškai dalyvauja Ras medijuoto JNK signalinio

kelio aktyvacijoje bei gali dalyvauti kituose, ne MAP kinazių, signaliniuose keliuose

reguliuojamuose Ras.[25, 40, 43]

Kaip ir kiti GAP baltymai, p120GAP turi domeninę struktūrą. C-gale yra RasGAP

domenas (katalitinis domenas) sudarytas iš ~334 amino rūgščių, N-gale yra du SH2

domenai, o tarp jų įsiterpęs vienas SH3 domenas. RasGAP domenas yra būtinas ir

16

pakankamas GTP hidrolizei.[44] Tuo tarpu SH2 ir SH3 domenai yra reikalingi pilnam

katalitiniam aktyvumui. Tarp vidinio SH2 ir katalitinio domenų yra PH (plekstrino

homologijos) domenas, kuris reikalingas sąveikos tarp Ras ir RasGAP reguliacijai ir

Ca2+ bei lipidus surišantis domenas, kuris gali būti reikalingas sąveikai su vidiniu

plazmin÷s membranos paviršiumi. N-gale yra prolinu turtinga seka reikalinga sąveikai

su Src kinazių šeimos nariais.(Pav.3.)

Pav.3. Ras p120GAP baltymo struktūros schematinis vaizdas.

Manoma, kad efektyviai RasGTP hidrolizei plazmin÷s membranos vidiniame

paviršiuje vykti yra būtina p120GAP sąveika su kitais faktoriais. Tai gali būti įvairūs

receptoriai, pavyzdžiui, PDGFR, EGFR ir kt. Tačiau, yra mažai žinoma apie

p120GAP ir aktyvuoto receptoriaus sąveikos mechanizmą ir apie baltymus, kurie

medijuoja GAP jungimąsi prie specifinio receptoriaus. p120GAP SH3 ir SH2 domenų

išsid÷stymas vienas šalia kito sąlygoja sąveikos su signalin÷mis molekul÷mis

įvairovę. D÷l GAP sąveikos su skirtingomis molekul÷mis, jis gali įeiti į įvairius

kompleksus bei išsid÷styti įvairiuose ląstel÷s kompartmentuose priklausomai nuo

komplekso komponentų koncentracijos, kuri gali priklausyti nuo ląstel÷s tipo ir

amžiaus.[25, 45]

RasGAP per savo SH2 domenus jungiasi prie aktyvuoto PDGF-β receptoriaus

pTyr771 (Pav.1.), bet nesijungia prie PDGF-α receptoriaus. Prisijungus prie

tirozinfosforilinto receptoriaus vyksta RasGAP fosforilinamas ir konformaciniai

pokyčiai reikalingi, kad SH3 domenas būtų prieinamas kitoms molekul÷ms, bet n÷ra

žinoma, kad fosforilinimas įtakotų RasGAP aktyvumą.(Pav.2.)[12, 13, 29, 43, 44] Kai

RasGAP yra fosforilintas ties Tyr460 jis sąveikauja su Src šeimos nariais Lyn, Fyn ir

Yes. Tuo tarpu RasGAP-Src sąveika nevyksta, kadangi Src pats sąveikauja su

aktyvuotu PDGFR-β.[35, 40]

RasGAP taip pat sąveikauja su kitais signaliniais baltymais tokiais kaip p190

RhoGAP, p62Dok. p120RasGAP perneša kompleksus į kurių sud÷tį įeina p190

RhoGAP ir p62Dok prie aktyvuotų tirozino kinazių, tai rodo, kad RasGAP atlieka ir

kitas funkcijas nesusijusias su neigiama Ras reguliacija.[40, 43]

SH2 SH3 SH2 PH RasGAP

C N

17

2.3.2. Adaptorinių baltymų Nck-α ir Nck-β vaidmuo signalo perdavime

Pirmą kartą nck genas buvo išskirtas iš žmogaus melanomos cDNR bibliotekos.

Nck baltymų šeimai priklauso du žmogaus baltymai, Nck-α/1 ir Nck-β/2, du pel÷s

ląstel÷se - mNck-α ir mNck-β/Grb4 ir vienas Drozofiloje - Dock. Nck-α ir Nck-β

pasižymi 68% amino rūgščių homologija. Abu Nck baltymus koduoja skirtingi genai.

nck-α genas yra lokalizuotas 3q21 chromosomoje, o nck-β – 2q12. Nck baltymai yra

47 kDa citozolin÷s molekul÷s sudarytos iš trijų SH3 (Src homologijos domenas) ir

vieno SH2 domenų ir nepasižyminčios katalitiniu aktyvumu.(Pav.4.)[3, 5, 17]

Pav.4. Nck baltymų struktūros schematinis vaizdas. SH3 domenai skaičiuojami

nuo N galo. SH3 I – pirmasis SH3 domenas, SH3 II – antrasis, SH3 III – trečiasis. Žvaigždut÷mis pažym÷ti baltymai sąveikaujantys tik su Nck-β.

Abu baltymai yra ekspresuojami daugelyje ląstelių, bet jų ekspresija toje pačioje

ląstel÷je skiriasi.[1, 3] Pagrindin÷ adaptorinių baltymų funkcija yra per savo SH2

domeną prijungti ląstel÷s paviršiaus receptorius prie kitų signalo perdavime

dalyvaujančių molekulių, kurios sąveikauja su adaptorių SH3 domenais.[5, 6]

Nck šeimos baltymai jungiasi prie daugelio augimo faktorių receptorių, tai EGFR

(Epidermal Growth Factor Receptor), VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor

Receptor). [1] Tyrimais in vitro buvo parodyta, kad Nckα sąveikauja su PDGF

receptoriaus-β (Platelet-Derived Growth Factor Receptor) pTyr 751, 740, 771, 1009,

o Nckβ su pTyr1009.(Pav.1.)[1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11] Tuo tarpu S. Frese ir kolegų

tyrimai rodo, kad abu Nck gali sąveikauti su PDGFRβ Y1009, bet n÷ vienas

nesijungia prie Y751.[46] Po stimuliacijos augimo faktoriumi Nck yra fosforilinamas

WA

Sp

IR

S-1

N

IK

DO

CK

*

PIN

CH

*

So

s N

IK

Pak

PR

K2

W

IP

NA

P4

IR

S-1

A

bl

c-Cb

l

Sam

68

A

bl

c-Cb

l N

AP

1

VE

GF

R

HG

FR

PD

GF

R

Ep

hB

1/

2

EG

FR

62

dok

FA

K

Inte

grin

as

SH3 I SH3 II SH3 III SH2

N C

DNR sintez÷ Aktino citoskeletas

Genų ekspresija Transliacija

Baltymų degradacija

18

ties tirozinu, treoninu ir serinu. Nck taip pat yra fosforilinamas atsake į forskolino ir

forbolo esterio poveikį. Tai rodo, kad jis gali būti substratu citozolin÷ms Ser/Thr

kinaz÷ms, tokioms kaip proteino kinaz÷ C (PKC) ir proteino kinaz÷ A (PKA, nuo

cAMP priklausoma proteino kinaz÷). Kai kurie autoriai teigia, kad Nck gali jungtis

prie PDGF receptoriaus tiesiogiai arba per Dok ar SOCS3 (Suppressor Of Cytokine

Signaling 3) baltymus.[9, 24] Nck baltymai per savo SH2 domeną taip pat sąveikauja

su tirozinfosforilintais citoplazminiais baltymais. Tai insulino receptoriaus substratas-

1, Src, p62Dok, FAK, SLP-76.[2, 3, 5, 6, 17] Vienas iš svarbiausių Nck partnerių

sąveikaujančių su Nck SH2 domenu yra Dok (Downstream of trosine kinase). Tai 62

kDa su RasGAP asocijuojantis fosfotirozininis baltymas. Po EphB1 ir EphB2 tirozino

kinaz÷s receptorių stimuliacijos formuojasi kompleksas į kurio sud÷tį įeina Nck, su

Nck sąveikaujanti kinaz÷ (NIK), Dok-1, RasGAP ir nežinomas 145 kDa

fosfotirozininis baltymas. Manoma, kad Dok-1 per savo PH domeną sąveikaudamas

su fosfolipidais pritraukia Nck ir su Nck sąveikaujančius baltymus prie plazmin÷s

membranos.[3, 5, 19]

Daugelis kitų baltymų sąveikauja dažniausiai su visais trim Nck SH3 domenais. O

kai kurių baltymų atveju papildomai reikalingas ir SH2 domenas.(Pav.4.) Kokia tokių

sąveikų reikšm÷ n÷ra žinoma. Daugelis baltymų sąveikauja su abiem Nck

izoformomis, tai WASP, Sos, Abl, dinaminas, Pak1, IRS-1 ir kt. Tiek Nckα, tiek ir

Nckβ susijungęs su v-Abl, Ha-Ras ir Sos reguliuoja ląstelių morfologiją ir indukuoja

genų ekspresiją per transkripcijos faktorių Elk1. Duomenys apie Nck dalyvavimą

Ras/MAPK kaskados aktyvacijoje yra labai prieštaringi. Vieni autoriai teigia, kad Nck

baltymai nedalyvauja Ras/MAPK signalizavime, kadangi Nck neįtakoja ERK

aktyvacijos atsake į EGF stimulus [1, 17]. Tuo tarpu kiti autoriai teigia, kad

nestimuliuotose augimo faktoriumi ląstel÷se Nck lokalizuodamas Sos membranoje

aktyvuoja Ras ir ERK.[3, 27] Tokie prieštaringi duomenys gali kilti d÷l to, kad Nck

n÷ra labai giminingas Sos ir tyrimai dažniausiai atliekami padidinus Nck ar jo

mutantų ekspresiją. Nck sąveika su dauguma baltymų yra pastovi. Su kai kuriais,

PxxP motyvą turinčiais, baltymais, tokiais kaip PAK, PRK2, WASP, PINCH sąveika

yra indukuojama ir vyksta per Nck SH3 domeną.[1, 6, 28] Esant skirtingam

receptoriaus kiekiui, jis gali jungtis prie skirtingų Nck-efektoriaus kompleksų. Nck-

efektoriaus kompleksai gali būti tokie: Nck-Pak1-PIX-GITI, Nck-Pak3, Nck-Prk2,

Nck-NIK, Nck-WASp, Nck-WIP, Nck-NAP-1, Nck-DOCK180, Nck-PINCH. Visi šie

kompleksai potencialiai gali sujungti savo aktyvatorius su aktino citoskeletu bei

19

sąlygoti ląstelių migraciją, adheziją, endocitozę, vystymąsi, proliferaciją. Atskirų

kompleksų susidarymas iš dalies priklauso nuo ląstel÷s tipo. Pavyzdžiui, Nck-WASP

kompleksas dominuoja hematopoetin÷se ląstel÷se, o Nck-NIK – neuronin÷se

ląstel÷se.[6]

PAK1 jungiasi prie Nck SH3 domenų. Yra žinoma, kad PAK1 šeimos

serino/treonino kinaz÷s yra aktyvuojamos prisijungiant prie aktyvių Rho šimos

GTPazių Cdc42 ir Rac (prisijungusių GTP). Nck pritraukia PAK1 prie aktyvuotų EGF

ir PDGF receptorių. PAK1 lokalizacija membranoje sąlygoja MAP kinazių

SAPK/JNK kaskados aktyvaciją. PAK1 sąveika su Nck yra reguliuojama ląstel÷s

adhezijos. Po ląstel÷s atkibimo kompleksas suyra ir greitai atstatomas po pakartotin÷s

adhezijos prie ekstraląstelinio matrikso.[3, 6, 17, 28]

Nck-Prk2 kompleksas gali perduoti signalą Rho-aktyvuojamu signaliniu keliu. Ši

sąveika taip pat svarbi aktino citoskeleto reguliacijai.[6]

Aktino citoskeleto organizacijoje kritinį vaidmenį atlieka WASP (Wiskott-Aldrich

Syndrome Protein) šeimos baltymai. Aktyvuotuose T limfocituose Nck medijuoja nuo

fosfotirozino priklausomo komplekso susirinkimą į kurio sud÷tį įeina WASP, Nck,

SLP-76 ir SLAP (su SLP-76 asocijuojantis baltymas) baltymai.[3] Nckβ ir Grb2

sąlygoja N-WASP aktyvaciją, o N-WASP savo ruožtu indukuoja aktino

polimerizaciją.[15, 23]

Neseniai buvo nustatyta sąveika tarp Nckα ir Ras GTPazę aktyvuojančio baltymo

(RasGAP arba p120GAP), bet šios sąveikos mechanizmas ir biologin÷ reikšm÷ n÷ra

žinomi.[3, 4, 11, 17]

Nck-α ir Nck-β jungiasi prie insulino receptoriaus, kuris gali reguliuoti

efektorinių Nck-α molekulių aktyvumą. Sam68, prie RNR prisijungiantis baltymas,

sąveikauja su Nck-α ir turi būti substratu insulino receptoriui. Sam68 turi dalyvauti

nuo Nck-α priklausomoje baltymų transliacijoje tiesiogiai nukreipdamas specifinę

mRNR į ribosomas per molekulinį kompleksą mRNR-Sam68-Nck-α-eIF2β. Nck-α

sąveikauja su eukariotų iniciacijos faktoriumi 2β, kuris yra eIF2 komplekso, atsakingo

už baltymų sintez÷s iniciaciją, komponentas. Nck-α ir eIF2β lokalizuojasi

ribosomose, kuriose jų lygis yra reguliuojamas insulino.[26]

Šiuo metu yra žinoma tik keletas baltymų specifiškai sąveikaujančių su

Nckβ.(Pav.4.) Tai PINCH ir DOCK180, kurie reikalingi aktino citoskeleto

reguliacijoje.[1, 6] PINCH (for Particularly Interesting New Cys-His Proteins)

20

baltymas yra sudarytas iš penkių LIM domenų ir dalyvauja ląstel÷s adhezijos

procesuose. PINCH sąveikauja su ILK (Integrin-Linked Kinase). Nustatyta, kad Nckβ

specifiškai sąveikauja su ketvirtuoju PINCH baltymo LIM domenu per savo trečiąjį

SH3 domeną. Manoma, kad PINCH funkcija yra sujungti ILK su Nckβ.[3] Per savo C

galinį ir vidurinį SH3 domenus Nckβ jungiasi prie DOCK180, kuris dalyvauja

integrinų signalizavime ir aktyvuoja Rac, kuris indukuoja ląstel÷s migraciją.[6]

Tyrimais in vivo buvo parodyta, kad, priešingai nei Nckα, Nckβ blokuoja PDGF

indukuotą aktino polimerizaciją.[2] Nesenai buvo nustatyta, kad Nckβ sąveikauja su

FAK (Focal Adhesion Kinase), kinaze lokalizuota lamelipodijose, filopodijose ir

dalyvaujančią ląstel÷s jud÷jimo reguliacijoje.[14]

2.4. Tarpbaltymines sąveikas užtikrinantys domenai

2.4.1. SH2 domenai

Specifin÷s baltymų sąveikos, sąveikos su kitomis molekul÷mis, tokiomis kaip

fosfolipidai ar nukleino rūgštys yra svarbios organizuojant ląstel÷s funkcijas ir

duodant specifinį atsaką į išorinius signalus. Sąveikos domenai, specifiniai motyvai

užtikrina eukariotinių ląstelių funkcinę įvairovę.[21]

Src homologijos (SH) domenas 2 buvo nustatytas retroviruso onkobaltyme v-Fps

kaip 100 amino rūgščių seka, kuri atsakinga už baltymo sąveiką su kitais baltymais ir

v-Fps katalitinio aktyvumo reguliaciją. V÷liau SH2 domenas buvo nustatytas

nereceptorinių tirozino kinazių reguliaciniuose regionuose. V÷liau ir negiminingose

signalin÷se molekul÷se, tokiose kaip PLCγ, RasGAP, PI3K p85 subvienete.[21]

SH2 domeną suformuoja dvi α spiral÷s (αA ir αB) tarp kurių yra β klost÷ (βB, βC,

βD). Suformuojama teigiamai įkrauta kišen÷ vienoje β klost÷s pus÷je, kuri užtikrina

sąveiką su motyvu. Kita sąveikos kišen÷ yra atsakinga už sąveiką su amino rūgštimis

esančiomis +3 pozicijoje nuo fosfotirozino. Sąveikos specifiškumą užtikrina į C galą

nuo fosfotirozino esančios 3-6 amino rūgštys.[21, 47, 48]

Skirtingų baltymų SH2 domenai atpažįsta tik specifinius pTyr motyvus. Pvz.,

Grb2 SH2 specifiškai jungiasi prie pTyr-Ise/Val-Asn-X motyvo kuriame kritin÷ yra

hidrofobin÷ amino rūgštis +1 pozicijoje ir asparaginas +2 pozicijoje. Src tirozino

kinaz÷s SH2 domenas specifiškai jungiasi prie pTyr-Glu-Glu-Ile motyvo.[17, 21]

21

Nck šeimos baltymų SH2 domenas priklauso I grup÷s šeimai, turinčiai aromatinę

amino rūgštį fenilalaniną βD5 pozicijoje. SH2 domenas jungiasi prie pY-D-E-(P/D/V)

motyvo tirozinfosforilintuose baltymuose. Sąveikai yra svarbiausios trys amino

rūgštys esančios 0, +1 ir +3 pozicijose. Stipriausia sąveika vyksta esant valinui +3

pozicijoje. +1 pozicijoje esanti asparagino rūgštis yra kritin÷.[3, 17, 46]

2.4.2. SH3 domenai

SH3 domenai yra būdingi daugeliui ląstel÷s baltymų dalyvaujančių signalo

perdavime, citoskeleto organizacijoje, baltymuose įeinančiuose į fermentinius

kompleksus (pvz. fagocitų NADPH oksidaz÷). Pagrindin÷ šių domenu funkcija yra

užtikrinti sąveikas tarp baltymų.[17]

SH3 domenai (Src homologijos domenas) dažniausiai yra sudaryti iš 60 amino

rūgščių. Su SH3 domenais asocijuojantys peptidai turi kairiojo sukimo antrojo tipo

poliprolino spiralę (PPII) su trimis amino rūgštimis vijai. Beveik visi SH3 domenai

atpažįsta konservatyvų motyvą PxxP (P – prolinas, x – bet kokia amino rūgštis). Du

konservatyvūs prolinai yra būtini sąveikai, o X gali būti bet kokia amino rūgštis, bet

dažniausiai tai alifatin÷ amino rūgštis. Kiekviena xP pora suformuoja hidrofobinę

kišenę, kurioje esančios konservatyvios amino rūgštys suteikia pagrindinę energiją

sąveikai. Specifiškumas yra užtikrinamas šonin÷mis amino rūgštimis, K ir R. Buvo

išskirtos dvi tokių motyvų klas÷s: I klas÷ - K/RxxPxxP ir II klas÷ - PxxPxK/R (K ir R

yra būtinos šonin÷s amino rūgštys lizinas ir argininas, x – bet kokia amino rūgštis).

SH3 domenai prie tos pačios amino rūgščių sekos gali jungtis dviem orientacijomis: iš

C galo į N galą ir iš N galo į C galą. Ligandai, kurių sąveikaujančios sekos

pagrindin÷s amino rūgštys yra N gale (I klas÷s ligandas) sąveikauja su SH3 domenu

amino-karboksi orientacija, o turinčios pagrindines amino rūgštis C gale (II klas÷s

ligandas) sąveikauja karboksi-amino orientacija. Keletas SH3 domenų atpažįsta ne

PxxP motyvą. Pavyzdžiui, Eps8 SH3 domenas atpažįsta PxxDY, Gads – RxxK

motyvą, Fus1 – Arg ir Ser turtingas sekas. [17, 20, 49]

Baltymų sąveika per SH3 domenus dažniausiai yra pastovi ir nepriklauso nuo

ekstraląstelinių signalų, kurie dažniausiai reguliuoja sąveikas per SH2 domenus. N÷ra

duomenų, kad sąveikos per SH3 domenus priklauso nuo cheminių modifikacijų (pvz.,

fosforilinimo), bet teoriškai jos gali keisti baltymų konformaciją ir tokiu būdu atskirti

baltymus erdv÷je. Kai kuriuose SH3 domenų liganduose yra nustatytos MAP kinazių

22

fosforilinamos sekos, o tai gali įtakoti sąveiką. Sąveika tarp SH3 domeno ir prolinu

turtingo motyvo yra silpna ir tai užtikrina baltymų sugeb÷jimą greitai keisti sąveikos

partnerius. Sąveikos stiprumui užtikrinti dažnai vienas baltymas talpina keletą SH3

domenų. Tai ypač būdinga adaptoriniams baltymams, kurių pagrindin÷ funkcija yra

sujungti transmembraninius receptorius su viduląstelin÷mis molekul÷mis ir tokiu būdu

užtikrinti signalo perdavimą į ląstel÷s vidų. Pvz., Grb2, Crk baltymai turi po du SH3

domenus, Nck šeimos baltymai tris. Kiekvienas baltymo SH3 domenas gali atpažinti

specifinę prolinu turtingą seką. Nckα antram SH3 domenui yra būtinas serinas antros

klas÷s motyve (PxxPxRxxS), be to n÷ra toleruojamos rūgštin÷s amino rūgštys,

fosfoserinas ir prolinas į C galą nuo šerdinio motyvo.[49]

23

3. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS

3.1. Reagentai

pRK5-HA-Nck-α ekspresijos vektoriai talpinantys laukinio tipo arba muatantinius

Nck genus bei anti-Nckβ antiserumas buvo dovana nuo Wei Li.[2, 5]

Anti-PDGF receptorius-β ir anti-RasGAP antiserumas buvo pagaminti mūsų

laboratorijoje.

Anti-HA (sc-7392) antikūnas, proteinas-A/G sefaroz÷ iš Santa Cruz

Biotechnology, JAV.

PDGF-BB iš Amgene, JAV.

Antriniai antikūnai iš Sigma, JAV.

HepG2 ląstelių linija iš Dr. M. Valiaus asmenin÷s kolekcijos, Lietuva.

FBS iš HyClone, JAV.

3.2. GST, GST-Nck baltymų gavimas

3.2.1. Ekspresijos vektoriai

Rekombinantiniai, su GST sulieti baltymai buvo ekspresuojami pGex tipo

plazmid÷se. Šios plazmid÷s turi tac promotorių (lac ir trp promotorių hibridas) už

kurio yra plokščiosios kirm÷l÷s Schistosoma japonicum GST genas. Baltymo genas

yra įstatomas naudojant už GST geno esantį polilinkerį. GST baltymo ekspresijai

buvo naudojama pGex-6P1 plazmid÷, o rekombinantinių GST-Nck baltymų

ekspresijai naudotos pGex-2T plazmid÷s. Kaip genas markeris pGex plazmid÷se yra

naudojamas atsparumo ampicilinui β-laktamaz÷s genas.

3.2.2. GST-Nck ekspresija

Rekombinantinių GST-Nck baltymų ekspresija, t.y. baltymo gaminimas, buvo

vykdomas E.coli BL21 kamieno bakterijose, auginant jas skystoje LB terp÷je su

ampicilinu. Kadangi GST-baltymo genas yra sulietas su tac promotoriumi, jo

ekspresija yra indukuojama izopropil-β-D-tiogalaktozidu (IPTG). Tai yra laktoz÷s

24

analogas, kuris jungiasi su lac represoriumi atlaisvindamas operoną transkripcijai.

IPTG n÷ra metabolizuojamas, taigi jo koncentracija su laiku nemaž÷ja. Efektyviausiai

baltymas yra gaminamas 30ºC temperatūroje, kai bakterijos yra augimo faz÷je (optinis

tankis 600 nm bangos ilgyje indukcijos pradžioje – 0.6-1), pagaminto baltymo kiekis

tiesiogiai priklauso nuo laiko (iki 18 val.). Ekspresija vykdoma 4-6 val. Bakterijos

nusodinamos centrifuguojant 3000 xg 10 min., nuos÷dose esančios bakterijos

suspenduojamos GST-baltymų sorbcijos buferyje (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 1 mM

EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 15 mM β-merkaptoetanolio, 1% Triton X-100) ir

suardomos ultragarsu (5 min.).

3.2.3. GST-baltymų gryninimas

Rekombinantiniai su GST sulieti Nck baltymai buvo gryninami afinin÷s

chromatografijos būdu naudojant glutationo sefarozę 4B. Sąveikaujant su glutationu

GST-Nck prisikabina prie sefaroz÷s, o po to eliuojamas didesne redukuoto glutationo

koncentracija.

Bakterijų lizatai sorbcijos buferyje inkubuojami su glutationo sefaroze 4B 2 val.

0ºC temperatūroje. Sefaroz÷ nusodinama centrifuguojant 1000 xg 1 min., plaunama

plovimo buferiu (sorbcijos buferis, 0.5 M NaCl), buferiu B (50 mM Tris/HCl, 0.1 mM

EGTA, 10% glicerolio, 15 mM β-merkaptoetanolio, 50 mM NaCl) ir GST-baltymai

eliuojami eliucijos buferiu (buferis B su 20 mM redukuoto glutationo). Baltymo

koncentracija nustatoma SDS-PAG elektroforez÷s būdu kartu leidžiant žinomus BSA

(jaučio serumo albuminas) kiekius. Tuo pačiu nustatomas ir baltymo grynumas.

3.3. Nck šeimos baltymų sąveikos su RasGAP tyrimas

3.3.1. Ląstelių linijos

Tyrimams buvo naudojama substratinių HepG2 ląstelių linija. Tai žmogaus

hematomos ląstelių linija neturinti endogeninio PDGF receptoriaus β. Laukinio tipo

PDGF receptoriaus β genas buvo įvestas į ląsteles pLXSN vektoriaus pagalba [10].

25

Ląstel÷s buvo kultivuojamos Dulbecc’o modifikuotoje Eagle (DME) terp÷je su

10% jaučio embriono serumo (FBS). Ląstel÷s pers÷jamos naudojant standartinę

audinių kultūrų priežiūros techniką.

HL-60 ląstelių linija – tai suspensin÷s promielocitin÷s leukemijos ląstel÷s,

neturinčios endogeninio PDGFRβ. Paveikus ląsteles TPA (forbolo esteris) jos

diferencijuojasi į makrofagus. Ląstel÷s buvo kultivuojamos RPMI-1640 (Roswell

Park Memorial Institute) terp÷je su 10% jaučio embriono serumo (FBS).

3.3.2. Laikinoji transfekcija

Ląstel÷s buvo transfekuojamos su 20 µg pRK5-HA-Nckα, pRK5-HA-Nckα-SH2-

ar pRK5-HA-Nckα-SH2+ konstruktais. Transfekcija buvo atliekama su CaCl2. Po 24

val. CaCl2-DNR precipitatai buvo nuplauti ir ląstel÷s paliktos augti 24 val. DME

terp÷je su 10% FBS užtikrinti efektyvią baltymų ekspresiją.

Imunofluorescencijos tyrimams ląstel÷s buvo transfekuojamos pRK5-HA-Nck-α

naudojant Lipofectamine reagentą pagal gamintojo nurodymus (Invitrogen).

pRK5-HA-Nck-α-SH2- konstrukte SH2 domenas yra inaktyvuotas mutacija

R308K. SH3 domenai pRK5-HA-Nck-α-SH2+ konstrukte inaktyvuojami W38K,

W143K ir W229K amino rūgščių pakeitimais. Tokios pat mutacijos yra ir su GST

sulietuose Nck-α-SH2- ir Nck-α-SH2+ baltymuose.[2, 5]

3.3.3. Ląstelių lizatų paruošimas

Kiekvieno pavyzdžio paruošimui buvo naudojama 2x106 ląstelių. Ląstel÷s buvo

sinchronizuojamos DME arba RPMI terp÷je be serumo 16 val. Po sinchronizacijos

ląstel÷s veikiamos augimo faktoriumi PDGF-BB 50 ng/ml 10 min. 37ºC arba forbolo

esteriu TPA 30 nM 36 val. 37ºC arba neveiktos. Po poveikio ląstel÷s perkeliamos ant

ledo ir plaunamos 3x fosfatiniu druskos tirpalu (PBS). HL-60 ląstel÷s plaunamos

centrifuguojant 500 xg 5 min. Lizuojama EB++ buferyje (10 mM Tris/HCl pH7.4, 50

mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1% Tritono X-100, 1 mM PMSF, 2 mM

Na3Vo4 ). Ląstelių nuolaužos ir branduoliai pašalinti centrifuguojant 20000 xg 15

min. 0ºC. Tyrimams buvo naudojami ląstelių citoplazminiai lizatai.

26

3.3.4. Imunoprecipitacija

Citoplazminiai lizatai inkubuojami su 3 µl PDGFRβ, RasGAP arba Nckα/β

antikūnais 2 val. 0ºC temperatūroje. V÷liau imuninis kompleksas imobilizuojamas ant

15 µl proteinas A sefaroz÷s 1 val. 0ºC temperatūroje nuolat vartant. Susidaręs

imuninis kompleksas plaunamas 4x po 0.5 ml ir 1x po 1 ml EB++ buferio. Kompleksai

išardomi suspenduojant 50 µl 1x SDS-PAG elektroforez÷s buferio ir iškaitinant 100ºC

temperatūroje 1 min. Dalis imunoprecipitatų buvo naudojami “Far western” blotui

bei kinaz÷s aktyvumo testui.

3.3.5. Precipitacija su rekombinantiniais baltymais

Kiekvienam pavyzdžiui buvo paruošta ant glutationo sefaroz÷ 4B imobilizuotų 10

µg GST, GST-Nckα arba Nckβ bei GST-Nckα-SH2- ir GST-Nckα-SH2+ baltymų.

Tam tikslui 15 µl glutationo sefaroz÷ 4B buvo inkubuojama 0,5 ml GST-baltymų

sorbcijos buferio su 10 µg atitinkamo baltymo 2 val. 0ºC nuolat vartant. Po

inkubacijos sefaroz÷ buvo plaunama 4 kartus EB++ buferiu nusodinant 1000 xg 1 min.

0ºC temperatūroje. Sefaroz÷s-baltymų kompleksas inkubuojamas su citoplazminiais

lizatais 2 val. 0ºC nuolat vartant. Po inkubacijos precipitatas buvo plaunamas 4x po

0,5 ml ir 1x po 1 ml EB++ buferio nusodinant ant sefaroz÷s susidariusius baltymų

kompleksus 1000 xg 1 min. 0ºC temperatūroje. Precipitatai sumaišomi su 50 µl SDS-

PAG elektroforez÷s buferio ir kaitinami 1 min. 100ºC temperatūroje.

Precipitatuose esantys baltymai buvo išskirstyti SDS-PAG elektroforez÷s būdu ir

pernešti ant polivinildifluorido membranos (PVDF) bei analizuojami Western bloto

būdu. Membranoje laisvos, baltymais nepadengtos, vietos buvo blokuojamos

blokavimo buferiu (1% lieso pieno miltelių “Gloria”, 0.05% Tween 20, 0.01% NaN3,

0.9% NaCl, 8 mM Tris HCl, 2 mM Tris) kambario temperatūroje 1 val. Po blokavimo

membrana inkubuojama 3 val. su pel÷s (ar triušio) antikūnais atpažįstančiais

analizuojamą baltymą (pirminis antikūnas). Pirminis antikūnas buvo skiedžiamas

blokavimo buferiu santykiu 1:500). Po inkubacijos membrana plaunama 4 kartus

Western rinse (WR) buferiu (0.9% NaCl, 8 mM Tris HCl, 2 mM Tris) ir inkubuojama

antrinio antika no tirpale (1:2000) 1 val. po inkubacijos plaunama 4 kartus WR

buferiu ir vieną kartą šarmin÷s fosfataz÷s buferiu (10 mM Tris, 3 mM MgCl2).

27

Baltymai vizualizuojami dažant NBT/BCIP (nitrom÷lynojo tetrazolio druska ir 5-

bromo-4-chloro-3-indolilfosfatas) dažų rinkiniu.

3.3.6. “Far western” blotas

Imunoprecipitate esantys baltymai buvo suspenduoti 50 µl SDS-PAGE buferio ir

išskirstyti SDS-PA gelyje elektroforez÷s būdu. Gelyje išskirstyti baltymai buvo

pernešami ant PVDF membranos, o baltymais nepadengtos vietos blokuojamos

blokavimo buferyje su 1% BSA (1% BSA, 0.05% Tween 20, 0.01% NaN3, 0.9%

NaCl, 8 mM Tris HCl, 2 mM Tris). Po to membrana inkubuojama su GST, GST-Nck-

α, GST-Nck-α-SH2-, GST-Nck-α-SH2+ ar GST-Nck-β baltymais 15 µg/ml “Far

western” buferyje (22 mM HEPES, 75 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 2.5 mM MgCl2, 1%

BSA, 0.05% NP40, 1 mM DTT) 3 val. kambario temperatūroje. Plaunama 1 kartą

“Far western” buferiu ir 4 kartus Western rinse buferiu ir inkubuojama 1.5 val.

pirminio GST antikūno tirpale (GST antikūnas praskiestas blokavimo buferyje su 1%

BSA santykiu 1:500) ir v÷l plaunama 4 kartus WR buferiu. Inkubuojama antrinio

antikūno tirpale (santykis 1:2000) 0.5 val., plaunama 4 kartus WR, 1 kartą šarmin÷s

fosfataz÷s buferiu ir dažoma NBT/BCIP dažų rinkiniu.

3.3.7. Testas aktyvuojant kinazę in vitro

Neaktyvuotų HepG2 ląstelių citoplazminiai lizatai buvo naudojami

imunoprecipitacijai su 3 µl PDGFRβ antikūno. Imuninis kompleksas imobilizuojamas

ant 15 µl proteinas A sefaroz÷s 1 val. 0ºC temperatūroje. Susidarę imunoprecipitatai

buvo plaunami 2 kartus po 0.5 ml EB++ buferio ir 3 kartus po 0,5 ml kinaz÷s buferio

(10 mM MnCl2, 20 mM PIPES pH 7,0, 20 µg/ml aprotinino). PDGFR-β aktyvuojamas

inkubuojant su 50 µl kinaz÷s buferio su 50 µM ATP 10 min. 30ºC temperatūroje. Po

aktyvacijos imunoprecipitatai buvo plaunami 1 kartą PBS ir inkubuojami su HepG2

arba HL-60 ląstelių citoplazminiais lizatais 1 val. kambario temperatūroje. Po

inkubacijos plaunami 4 kartus po 0,5 ml ir 1 kartą po 1 ml EB++ buferio. Baltyminiai

kompleksai buvo išardyti su 50 µl elektroforez÷s pavyzdžio buferio iškaitinant 1 min.

100ºC temperatūroje. Baltymai išskirstyti SDS-PA gelyje, pernešti ant membranos ir

analizuoti Western bloto būdu.

28

3.3.8. Imunofluorescencija

Kiekvienam pavyzdžiui paruošti buvo naudojama 5x104 ląstelių. Ląstel÷s

auginamos 24 duobučių l÷kštel÷se. Atliekama laikinoji transfekcija su pRK5-HA-

Nckα konstruktais naudojant Lipofectamine reagentą. Po 24 val. ląstel÷s

sinchronizuojamos DME terp÷je be serumo per naktį, daromas arba ne poveikis su

100 ng/ml PDGF-BB. Ląstel÷s fiksuojamos su 4% paraformaldehido tirpalu KRG

buferyje (Ringer’s modifikuotas fosfatinis buferis) (120 mM NaCl, 4.9 mM KCl, 1.7

mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4 7H2O, 8.3 mM Na2HPO4 2H2O, 10 mM glukoz÷s, pH

7.3), plaunamos 1 kartą po 1 ml PBS. Ląstel÷s permeabilizuojamos 0,5 ml PBS/0.15%

Triton X-100 buferyje 3 min. kambario temperatūroje ir plaunamos 3 kartus po 0,5 ml

PBS su 1% BSA. Blokuojama 25 µl PBS/1% BSA tirpalo su 10% ožkos serumo 30

min. 37ºC temperatūroje. Perkeliama į 25 µl pirminio anti-HA arba anti-Nck-α

antikūno tirpalo (antikūnas skiestas PBS/BSA/10% ožkos serumo tirpalu santykiu

1:50) 1 val. 37ºC temperatūroje. Po inkubacijos ląstel÷s plaunamos 5 kartus po 0,5 ml

PBS/BSA ir inkubuojamos 25 µl antrinio antikūno, sujungto su Alexa Fluor 488 dažu

(Invitrogen) arba su FITC dažu, tirpalo (skiedimas 1:125) 30 min. 37ºC

temperatūroje. Anti-RasGAP antikūnas buvo žym÷tas Alexa Fluor 594 dažu. Po

inkubacijos plaunama 5 kartus PBS/1% BSA. Branduoliai buvo dažomi su 300 nM

DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindolas). Duomenys vizualizuojami konfokalin÷s

mikroskopijos metodu naudojant Nikon C1 konfokalinį mikroskopą ir programin÷s

įrangos rinkinį EZ-C1.

29

4. REZULTATAI

4.1. Su GST sulietų baltymų gavimas

Su GST sulieti baltymai Nck-α ir Nck-β, Nck-α-SH2+ ir Nckα-SH2- bei GST buvo

ekspresuojami E.coli BL21 kamieno bakterijose indukuojant IPTG, išvalyti afinin÷s

chromatografijos būdu ir patikrinti SDS-PAG elektroforez÷s būdu. Visi baltymai yra

gerai išgryninti ir atitinka savo mases. Visų baltymų koncentracija yra 2 µg/µl.

(Pav.5.B.) Mutantinių Nck-α baltymų schema pateikta Pav.5.A.

Pav.5. A. Nck-α WT ir SH2 - bei SH2+ mutantų schematinis vaizdas.

Perbraukti domenai rodo, kad juose yra mutacijos. B. Su GST sulietų baltymų elektroforetinis vaizdas.

4.2. Nck-α ir Nck-β baltymų sąveika su RasGAP in vitro

Šio darbo tikslas – patikrinti Nck-α ir Nck-β baltymų specifiškumą sąveikoje su

RasGAP bei sąveikos priklausomybę nuo PDGFR-β. Tam tikslui buvo naudojama

HepG2 ląstelių linija neturinti endogeninio PDGFR-β (N) ir HepG2 ląstel÷s

Nck

-β

Nck

-α

SH

2+

SH

2-

GS

T

47 kDa 34 kDa

A.

SH2 SH3 SH2+ SH3 SH3

SH2 SH3 WT SH3 SH3

SH2 SH3 SH2- SH3 SH3

B.

30

infekuotos laukinio tipo PDGFR-β geną talpinančiais konstruktais arba tuščiu pLXSN

vektoriumi stabiliai PDGF receptoriaus-β ekspresijai.[10] (Pav.6.A. 4, 5, 8, 9)

Ląstel÷s buvo paliktos nestimuliuotos arba stimuliuotos 50 ng/ml PDGF-BB,

lizuojamos. Ląstelių citoplazminiai lizatai buvo naudojami precipitacijai su

rekombinantiniais GST, GST-Nck-α ir GST-Nck-β baltymais.(Pav.6.A.)

Precipitatuose esantys baltymai išskirstyti SDS-PAG elektroforez÷s būdu ir analizuoti

su anti-RasGAP antikūnais.

Duomenys rodo, kad abi Nck izoformos sąveikauja su Ras GTPazę aktyvuojančiu

baltymu panašiu efektyvumu.(Pav.6.A. pavyzdžiai 4, 5, 6, 8, 9, 10) Po PDGF

receptoriaus-β aktyvacijos, ląstel÷se, ekspresuojančiose PDGF receptorių-β, tiek Nck-

α tiek ir Nck-β suriša papildomą RasGAP kiekį. Taigi, Nck baltymų sąveika su

RasGAP yra pastovi, o sąveikos stiprumas priklauso nuo PDGF receptoriaus-β

aktyvacijos. (Pav.6.A. pavyzdžiai 7 ir 11) Galima manyti, kad ši sąveika gali būti

dvejopa: tiesiogin÷ arba netiesiogin÷, dalyvaujant papildomam fosforilintą tiroziną

turinčiam baltymui.

Kitas šio darbo tikslas buvo nustatyti, kuris Nck-α baltymo domenas yra

atsakingas už jo sąveiką su RasGAP ir PDGFR-β. Tam tikslui HepG2 ląstel÷s

ekspresuojančios laukinio tipo PDGF receptorių-β buvo neveiktos arba veikiamos 50

ng/ml PDGF-BB, lizuojamos. Citoplazminis lizatas naudojamas precipitacijai su

GST, GST-Nck-α-WT, GST-Nck-α-SH2- ir GST-Nck-α-SH2+ baltymais.

Precipitatuose esantys baltymai išskirstyti SDS-PAG elektroforez÷s būdu, pernešti ant

membranos ir analizuoti Western bloto būdu su antikūnais atpažįstančiais RasGAP ir

PDGFR-β.(Pav.6.B.)

Duomenys rodo, kad Nck-α baltymo sąveika su PDGFR-β vyksta tik aktyvuotose

augimo faktoriumi ląstel÷se ir yra užtikrinama Nck-α SH2 domeno.(Pav.6.B.10, 14)

O, sąveika su RasGAP, kaip buvo parodyta Pav.6.A, vyksta pastoviai, nepriklausomai

nuo PDGFR-β aktyvacijos, o po receptoriaus aktyvacijos GST-Nck-α baltymas suriša

papildomą RasGAP kiekį.(Pav.6.B. pavyzdys 10) Duomenys rodo, kad precipitatuose

su GST-Nck-α-SH2+ baltymu PDGF-BB aktyvuotose ląstel÷se RasGAP baltymo

kiekis padid÷ja ir yra lygus RasGAP kiekiui esančiam precipitatuose su laukinio tipo

Nck-α iš aktyvuotų PDGF-BB ląstelių. Taigi, Nck-α sąveikai su RasGAP yra

reikalingi SH2 ir vienas arba keli SH3 domenai.

31

Pav.6.A. Nck-α ir Nck-β baltymų sąveikos su GAP priklausomyb÷ nuo PDGFR-β.

HepG2 linijos ląstel÷s, pastoviai ekspresuojančios laukinio tipo PDGF receptorių-β (WT) arba turinčios įvestą tuščią pLXSN vektorių (N) buvo lizuojamos, o lizatai naudojami precipitacijai su 10 µg GST, GST-Nck-α ir GST-Nck-β baltymų. Precipitatuose esantys baltymai išskirstyti SDS-PA gelyje, pernešti ant PVDF membranos ir analizuojami Wester bloto būdu su anti-GAP ir anti-PDGFRβ antikūnais. B. Už sąveika su PDGFR-β ir RasGAP atsakingų Nck-α domenų nustatymas. HepG2 ląstelių linija ekspresuojanti laukinio tipo PDGF receptorių-beta buvo naudota precipitacijai su 10 µg GST, GST-Nck-α-WT, GST-Nck-α-SH2- ir GST-Nck-α-SH2+ baltymų. Ant membranos pernešti precipitatuose esantys baltymai analizuoti su antikūnais atpažįstančiais PDGFR-β ir RasGAP.

4.3. Nck-α ir Nck-β sąveika su RasGAP in vivo

Tyrimais in vitro parod÷me, kad Nck šeimos baltymai sąveikauja su Ras GTPazę

aktyvuojančiu baltymu Ras p120GAP ir nustat÷me už šią sąveiką atsakingus Nck-α

baltymo domenus. Tolesni tyrimai buvo atliekami siekiant nustatyti šią sąveiką in

GAP

- + - + - + - + - + PDGF BB:

WT WT WT N N

GST GST-Nck-α GST-Nck-β

Ląstel÷s:

Precipitacija:

W: anti-GAP

Lizatas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A.

PR-β

Lizatai Precipitatai

PDGF-BB: - - + - + - + - - + - + - +

Precipitacija: GST WT SH2- SH2+

GAP

B.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 W: anti-PDGFR-β

W: anti- GAP

32

vivo. Pirmas uždavinys buvo patikrinti ar endogeniniai Nck-α ir Nck-β baltymai

sąveikauja su RasGAP. Tam tikslui HepG2 linijos ląstel÷s buvo veikiamos arba

neveiktos PDGF-BB, lizuojamos. Citoplazminis lizatas naudojamas

imunoprecipitacijai su specifiniais anti-Nck-α (Pav.7.A. 4, 5) ir anti Nck-β (pav.7.A.

6, 7)antikūnais. Kontrolei buvo atlikta imunoprecipitacija su anti-HA

(hemagliutininas) antikūnais (Pav.7.A. pavyzdys 3). Imunoprecipitatuose esantys

baltymai išskirstyti elektroforez÷s būdu, pernešti ant PVDF membranos ir analizuoti

Western bloto būdu su antikūnais atpažįstančiais RasGAP ir abu Nck šeimos

baltymus.

Gauti duomenys rodo, kad sąveika vyksta ir in vivo. Kaip ir in vitro, RasGAP-

Nck-α/β sąveika yra pastovi, bet neaptikta RasGAP kiekio padid÷jimo

imunoprecipitatuose po stimuliacijos augimo faktoriumi PDGF-BB.(Pav.7.A.

pavyzdžiai 5, 7)

Kadangi parod÷me, jog sąveika vyksta in vivo, kitas tikslas buvo nustatyti Nck-α

sąveikos su RasGAP mechanizmą. Kadangi HepG2 ląstel÷se Nck baltymų kiekis yra

nedidelis, o sąveika silpna buvo atliekama transfekcija su pRK5-HA-Nck-α

konstruktais, kontrolei ląstel÷s buvo paliktos netransferuotos (Pav.7.B. 1, 5). Nustatyti

kuris Nck-α baltymo domenas yra atsakingas už sąveiką su p120 GAP, transfekcija

buvo atliekama naudojant pRK5-HA-Nck-α konstruktus su mutantiniu SH2 domenu

(SH2-) (Pav.7.B. 3, 7) arba su mutantiniais visais SH3 domenais (SH2+) (Pav.7.B. 4,

8).

Iš duomenų matoma, kad imunoprecipitatuose su mutantiniais Nck-α RasGAP

kiekis yra mažesnis lyginant su RasGAP kiekiu imunoprecipitatuose su Nck-α

laukinio tipo baltymu.(Pav.7.B. pavyzdžiai 2, 3, 4) O Nck-α su mutantiniais SH3

domenais suriša mažesnį RasGAP kiekį nei esant mutuotam SH2 domenui.(Pav.7.B.

3, 4)

Galima daryti išvadas, kad Nck-α sąveikai su RasGAP yra reikalingi SH2 ir

vienas arba keli SH3 domenai, bet svarbesni yra SH3 domenai. SH2 domeno

dalyvavimas sąveikos sudaryme gali būti priklausoma nuo kitų tirozinfosforilintų

baltymų, tiek receptorių tiek ir nereceptorinių. Be to, in vitro duomenys rodo, kad

Nck-α SH2 domenas užtikrina trinario komplekso tarp Nck-α, RasGAP ir fosforilintą

tiroziną turinčio baltymo susidarymą. O tyrimai su Nck-α SH2+ baltymu rodo, kad

sąveika su fosfotiroziną turinčiu baltymu yra pastovi. (Pav.6.B. 10, 14) Taigi, Nck-α-

33

RasGAP kompleksas gali dalyvauti mitogeninio signalo, perduodamo PDGF

receptoriumi-β, atsako reguliacijoje.

Pav.7.B. pavyzdžiai 5-8 rodo vienodą RasGAP ir Nck-α baltymų kiekį

citoplazminiuose lizatuose. Pavyzdyje 5 parodyta, kad kontrolin÷se netransfekuotose

ląstel÷se HA-Nck-α baltymo n÷ra.

Pav.7.A. Nck-α ir Nck-β sąveika su RasGAP in vivo. Atliekama imunoprecipitacija su 3 µl specifiniais anti-Nck-α (A. 4, 5) ir anti-Nckβ (6, 7) antikūnais iš stimuliuotų (+) 50 ng/ml 10 min. arba nestimuliuotų (-) PDGF-BB HepG2 ląstelių ekspresuojančių laukinio tipo PDGFR-β. Neigiamai kontrolei buvo atliekama imunoprecipitacija su anti-HA antikūnais (3). Imunoprecipitatuose esantys baltymai išskirstyti SDS-PAG elektroforez÷s būdu. Ant membranos pernešti baltymai analizuojami Western bloto būdu su anti-GAP antikūnais ir anti-Nck-α/β antiserumu (3, 7). B. Nck-α sąveikos su RasGAP in vivo mechanizmas. HepG2 ląstel÷s buvo transfekuotos su pRK5-HA-Nck-α-WT (WT) (2, 6), SH2- (3, 7), SH2+ (4, 8) arba netransfekuotos (kontrolin÷s) (K) (1, 5). Ląstelių lizatai imunoprecipituoti su 3 µl hemagliutinino seką atpažįstančių antikūnų (anti-HA). Išskirstyti gelyje ir ant membranos pernešti baltymai analizuoti su anti-GAP ir anti-HA antikūnais.(1-4) Dalis (~10%) lizatų buvo analizuoti su GAP ir HA antikūnais RasGAP ir HA-Nck-α baltymų kiekio lizatuose nustatymui. (A. 1, 2, B. 5-8)

1 2 3 4 5 6 7

Lizatas

A.

- + + - + - +

Anti- Nck-α

PDGF BB:

IP:

W: anti-GAP GAP

K

Nck-α/β W: anti-Nck-α/β

Anti- Nck-β

1 2 3 4

RasGAP

HA-Nck-α

W: anti-GAP

W: anti-HA

Transfekcija, pRK5-HA-Nck- αααα: K WT SH2- SH2+

5 6 7 8

Lizatai IP: anti-HA

B.

K WT SH2- SH2+

34

4.4. Tiesiogin÷ sąveika tarp RasGAP ir Nck šeimos baltymų ir jos mechanizmas

Tolesni tyrimai buvo atliekami sąveikos tarp Nck šeimos baltymų ir RasGAP

tiesiškumo nustatymui. Tam tikslui buvo atliekamas “Far western” blotas. HepG2

ląstel÷s ekspresuojančios laukinio tipo PDGFR-β buvo neveiktos arba veikiamos 50

ng/ml PDGF-BB. Ląstelių citoplazminiai lizatai naudojami imunoprecipitacijai su

anti-GAP antikūnais. Imunoprecipitatuose esantys baltymai išskirstyti elektroforez÷s

būdu ir pernešti ant membranos. Membranoje esantys baltymai inkubuojami su

rekombinantiniais GST (Pav.8.A. 4), GST-Nck-α (Pav.8.A. 5, 6) ir GST-Nck-β

(Pav.8.A. 7, 8) baltymais. Po inkubacijos baltymai buvo analizuojami Western bloto

būdu su GST atpažįstančiais antikūnais. Dalis citoplazminio lizato ir imunoprecipitato

buvo analizuojami Western bloto būdu su anti-GAP antikūnais, RasGAP baltymo

kiekiui lizatuose ir imunoprecipitatuose nustatyti.(Pav.8.A. 1, 2, 3, apatin÷ dalis) Taip

pat buvo atlikta Western analiz÷ su anti-p190 RhoGAP antikūnais siekiant nustatyti ar

mums nežinomas baltymas tiesiogiai sąveikaujantis su GST-Nck baltymais yra p190

RhoGAP.(pav.8.A. 1, 2, 3, viršutin÷ dalis)

Duomenys rodo, kad Nck-α ir Nck-β baltymai sąveikauja su RasGAP tiesiogiai,

nepriklausomai nuo aktyvacijos augimo faktoriumi.(Pav.8.A. 5-8) Be to, abu Nck

šeimos baltymai tiesiogiai jungiasi prie nežinomų baltymų. Nck-β su 190 kDa

baltymų sąveikauja silpniau nei Nck-α. Su Nck šeimos baltymais sąveikaujantis

nežinomas baltymas poliakrilamidiniame gelyje migruoja kaip ~190 kDa baltymas ir

jo migracijos vieta atitinka p190RhoGAP baltymo migracijos vietą.(Pav.8.A. 5, 6)

Yra žinoma, kad RhoGAP yra tirozinfosforilinamas ir sąveikauja su RasGAP. Tod÷l

galima manyti, kad Nck baltymai sąveikauja su RhoGAP. Bet pradiniais duomenimis

šito įrodyti nepavyko (duomenys neparodyti).

Nustatę, kad Nck baltymai tiesiogiai sąveikauja su RasGAP, toliau siek÷me ištirti,

kurie Nck-α baltymo domenai yra atsakingi už šią sąveiką. Tikslui įgyvendinti

RasGAP baltymo imunoprecipitatai iš HepG2 linijos ląstelių buvo išskirstyti SDS-

PAGE būdu, pernešti ant membranos ir analizuojami “Far western” bloto metodu.

“Far western” blotas buvo atliekamas su GST (Pav.8.B. 3), GST-Nck-α (Pav.8.B. 10),

GST-Nck-α-SH2- (Pav.8.B. 11) ir GST-Nck-α-SH2+ (Pav.8.B. 12) rekombinantiniais

baltymais. Susidarę GST-Nck-α ir ant membranos perneštų baltymų kompleksai buvo

analizuojami Western bloto būdu su anti-GST antikūnais. Dalis lizato ir

35

imunoprecipitato panaudota RasGAP kiekio nustatymui su anti-GAP antikūnais

(Pav.8.B. 1, 2).

Pav.8. Buvo naudojama HepG2-WT ląstelių linija. Ląstel÷s buvo neveiktos (-) arba

veikiamos (+) 50 ng/ml PDGF-BB 10 min., lizuojamos ir citoplazminis lizatas naudojamas imunoprecipitacijai (IP) su anti-PDGFR-β antikūnais. Dalis (10%) imunoprecipitatuose bei lizatuose esančių baltymų analizuoti Western bloto būdu naudojant antikūnus atpažįstančius RasGAP (A. 1,2,3 pavyzdžiai, B. 1,2) ir p190RhoGAP (A.1,2,3 viršutin÷ dalis). Imunoprecipitatuose esantys baltymai buvo išskirstyti SDS-PA gelyje, pernešti ant membranos ir atliktas “Far western” blotas. A. Nck-α ir Nck-β baltymų tiesiogin÷ sąveika su RasGAP. Nck baltymų tiesiogin÷s sąveikos su RasGAP nustatymui membranoje esantys baltymai inkubuoti su rekombinantiniais baltymais: GST (neigiama kontrol÷) (A.4), GST-Nck-α (A.5,6) ir GST-Nck-β (A.7,8). Susidarę baltyminiai kompleksai analizuoti anti-GST antikūnais. B. Tiesiogin÷s sąveikos mechanizmas. Įrodžius sąveikos tarp Nck ir GAP tiesiškumą (A.) tolesnis tikslas buvo nustatyti, kurie Nck-α baltymo domenai atsakingi už šią sąveiką. Tam tikslui “Far western” blotas buvo atliekamas su GST (B.3), GST-Nck-α (B.4), GST-Nck-α-SH2- (B.5) ir GST-Nck-α-SH2+ (B.6) baltymais.

PDGF-BB 50ng/ml: - - 10’ - - 10’ - 10’

Far western: GST Nck-α Nck-β

Lizatas Imunoprecipitatai

GAP

p190 ~190 kDa

Far western

A.

W: anti-p190

W: anti-GAP

1 2 3 4 5 6 7 8

Far western: GST Nck-α SH2- SH2+

W:anti-GAP

Lizatas IP: α-GAP

GAP

~190 kDa

Far western

1 2 3 4 5 6 B.

36

Duomenys rodo, kad už Nck-α tiesioginę sąveiką su RasGAP yra atsakingi vienas

arba keli SH3 domenai, o SH2 domenas šioje sąveikoje nedalyvauja. Nck-α laukinio

tipo baltymas silpniau sąveikauja su RasGAP nei Nck-α su mutantiniu SH2

domenu.(Pav.8.B. 4, 5) Taip pat pastebima priklausomyb÷ tarp šių baltymų sąveikos

su RasGAP ir su nežinomu 190 kDa baltymu. Laukinio tipo Nck-α sąveikauja silpniau

su RasGAP, bet stipriau su 190 kDa baltymu, o Nck-α SH2 domeno mutantas stipriau

sąveikauja su RasGAP, bet silpniau su mums nežinomu baltymu. Tuo tarpu Nck-α

mutantas su mutacijomis SH3 domenuose (SH2+) nesąveikauja su RasGAP, bet taip

pat yra aptinkama sąveika su 190 kDa baltymu ir šios sąveikos stiprumas toks pat kaip

ir SH3 domenų.(Pav.8.B. 3-6)

Taigi, lyginant su duomenimis in vivo ir in vitro, kurie rodo sąveikos

priklausomybę tiek nuo SH2 tiek ir nuo SH3 domenų, galima daryti išvadas, kad Nck-

α baltymo sąveika su RasGAP yra dvejopa: tiesiogin÷ ir netiesiogin÷. Tiesiogin÷

sąveika greičiausiai vyksta pastoviai ir jai reikalingi Nck-α SH3 domenai, o

netiesiogin÷ sąveika greičiausiai reikalinga signalo perdavimui per fosforilintą

tiroziną turintį baltymą ir priklauso nuo Nck-α SH2 ir SH3 domenų.

4.5. Nck-α baltymo sąveika su RasGAP HL-60 ląstelių linijoje

Nck baltymų sąveikos su RasGAP hepatomos ląstelių linijoje (HepG2) tyrimais

buvo nustatytas sąveikos mechanizmas. Toliau nusprend÷me ištirti ar ši sąveika

vyksta specifiškai tik tam tikrose ląstel÷se. Tyrimams buvo pasirinktos HL-60 linijos

ląstel÷s. HL-60 ląstelių linija – tai promielocitin÷s leukemijos ląstel÷s. Ši ląstelių

linija pasirinkta, nes joje n÷ra endogeninio PDGF receptoriaus-β. Paveikus TPA

(forbolo esteris, forbol-12-myristat-13-acetatas) jos diferencijuojasi į makrofagus,

padid÷ja RasGAP baltymo kiekis ir RasGAP subyra į fragmentus.

Nck-α sąveikai su RasGAP nustatyti buvo atlikta precipitacija su GST ir GST-

Nck-α baltymais iš HL-60 ląstelių lizatų neveiktų arba paveiktų TPA.(Pav.9.A. 6, 7,

8) Kontrolei buvo atliekama precipitacija iš HepG2 ląstelių.(Pav.9.A. 4, 5)

Precipitatuose esantys baltymai išskirstyti SDS-PAG elektroforez÷s būdu, pernešti ant

membranos ir analizuoti Western bloto būdu su anti-GAP antikūnais.

Gauti duomenys rodo, kad GST-Nck-α nesąveikauja su RasGAP iš HL-60 ląstelių

in vitro. Tuo tarpu kontrolin÷se ląstel÷se (HepG2) sąveika yra. Galima manyti, kad

37

HL-60 ląstelių linijoje ši sąveika nevyksta d÷l to, kad jose n÷ra PDGF receptoriaus-β,

kadangi buvo parodyta, kad receptorius iš dalies įtakoja Nck-α-RasGAP komplekso

susidarymą. Tik÷tina, kad RasGAP gali būti specifiškai modifikuojamas. Kita vertus,

potenciali Nck-α-RasGAP kompleksų funkcija yra ląstelių adhezijos reguliacija, o

HL-60 yra suspensinių ląstelių linija, kuriai adhezija nebūdinga. Ketvirta galimyb÷

yra ta, kad RasGAP iš HL-60 ląstelių po aktyvacijos yra suskaldomas proteazių, taip

pat dalis baltymo aptinkama suskaldyto ir nestimuliuotose ląstel÷se.

Ląstelių lizatuose esantis baltymo kiekis iš HepG2 ląstelių yra parodytas

Pav.9.A.1, o HL-60 ląstel÷se Pav.9.A. 2, 3.

Kadangi, sąveikos tarp Nck-α ir RasGAP in vitro nenustat÷me, toliau tyr÷me ar ši

sąveika egzistuoja ląstel÷se in vivo. Tam tikslui buvo atliekama imunoprecipitacija su

anti-Nck-α antikūnais iš HepG2 ir HL-60 ląstelių. Imunoprecipitatuose esantys

baltymai išskirstyti poliakrilamidiniame gelyje ir pernešti ant membranos.

Membranoje esantys baltymai buvo analizuojami Western bloto būdu su anti-GAP ir

anti-Nck-α antikūnais. Dalis citoplazminių lizatų buvo panaudota RasGAP ir Nck-α

baltymų kiekio nustatymui.(Pav.9.B. 1, 2)

Duomenys rodo, kad sąveika tarp Nck-α ir RasGAP nevyksta HL-60 ląstel÷se in

vivo.(Pav.9.B.5) Tuo tarpu kontrolin÷se HepG2 ląstel÷se sąveika aptinkama tiek po

stimuliacijos TPA tiek ir nestimuliuotose.(Pav.9.B. 3, 4) Po stimuliacijos TPA yra

matomas Nck-α baltymo mas÷s padid÷jimas, tai rodo, kad Nck-α po stimuliacijos

TPA yra modifikuojama. Greičiausiai tai fosforilinimas ties serinu ar treoninu, bet

kaip įtakoja ši modifikaciją Nck-α baltymo sąveiką su RasGAP n÷ra žinoma.(Pav.9.B.

4, apatin÷ dalis)

Poveikis TPA 30 nM: - - 36h - - - - 36h

GAP

A.

Precipitacija: Lizatai GST Nckα GST Nckα

Ląstel÷s: HepG2 HL-60 HepG2 HL-60

W: anti-GAP

1 2 3 4 5 6 7 8

38

Pav.9. A. Nck-α sąveikos su RasGAP HL60 ląstel÷se in vitro tyrimas. HL-60

ląstel÷s buvo neveiktos arba veikiamos 30 nM TPA 36 val. Indukuojant doferenciaciją. HepG2 ląstel÷s buvo naudojamos kaip kontrolin÷s. Ląstelių lizatai naudojami precipitacijai su 10 µg GST ir GST-Nck-α baltymų. Precipitatuose esantys baltymai išskirstyti elektroforez÷s būdu ir analizuoti su anti-GAP antikūnais. B. Nck-α sąveikos su RasGAP HL60 ląstel÷se in vivo tyrimas. HepG2 ir HL-60 ląstel÷ms buvo daromas poveikis su TPA arba ne (-), ląstel÷s lizuojamos ir lizatas naudojamas imunoprecipitacijai su anti-Nck-α antikūnais. Imunoprecipitatuose esantys baltymai analizuoti Western bloto būdu su anti-GAP ir anti-Nck-α antikūnais.

Kadangi nustat÷me, kad Nck-α nesąveikauja su RasGAP HL-60 linijos ląstel÷se,

tolesnis tikslas buvo ištirti ar GAP iš HL-60 ląstelių n÷ra užblokuotas kitais baltymais

ir d÷l to negali sąveikauti su PDGFR-β ir Nck-α. Tam tikslui buvo atliktas testas

aktyvuojant kinazę in vitro. Neaktyvuotos HepG2 ląstel÷s ekspresuojančios laukinio

tipo PDGFR-β buvo naudojamos imunoprecipitacijai su PDGFR-β antikūnais.

Imunoprecipitatuose esantis PDGFR-β buvo aktyvuotas prid÷jus 50 µM ATP (Pav.10.

4, 6) arba neaktyvuotas (Pav.10. 3, 5) ir inkubuojamas su lizatais iš HepG2

(kontrol÷)(Pav.10. 3, 4) ir HL-60 ląstelių (Pav.10. 5, 6). Susidarę baltyminiai

kompleksai išskirstyti SDS-PA gelyje ir pernešti ant membranos. Baltymai

analizuojami su anti-GAP antikūnais. Gauti duomenys rodo, kad GAP iš HL-60

ląstelių jungiasi prie aktyvuoto PDGFR-β iš HepG2 ląstelių.(Pav.10. 6) Vadinasi,

GAP n÷ra blokuojamas kitų su juo sąveikaujančių baltymų ir potencialiai gali

sąveikauti ir su kitais, abiem ląstelių linijoms būdingais, baltymais.

GAP baltymo kiekio nustatymui dalis HL-60 ir HepG2 ląstelių citoplazminių

lizatų buvo analizuojami Western bloto būdu su anti-RasGAP antikūnais. Kadangi

citoplazminiuose HL-60 ląstelių lizatuose esantis baltymo kiekis yra mažesnis nei

GAP

Nck-α

Poveikis TPA 30nM : - - - 10min -

Ląstel÷s: HepG2 HL60 HepG2 HL60

Lizatai IP:αNckα

IgG

W: anti-GAP

B.

W: anti-Nck-α

1 2 3 4 5

39

HepG2 ląstel÷se, ImageJ programos pagalba apskaičiavome skirtumus ir nustat÷me,

kad GAP kiekis HL-60 ląstel÷se yra 50% mažesnis. Tokį patį skirtumą gavome ir

sulyginę GAP kiekius sąveikaujančius su PDGFR-β po aktyvacijos ATP.

Pav.10. RasGAP specifin÷s modifikacijos tikrinimas HL-60 l ąstel÷se. HL-60 ir HepG2 ląstelių lizatai buvo naudojami imunoprecipitacijai su anti-PDGFR-β antikūnais. Imunoprecipitatuose esantis receptorius buvo aktyvuojamas arba ne su 50 µM ATP. Po aktyvacijos imuninis kompleksas buvo inkubuojamas su HepG2 arba HL-60 ląstelių lizatais. Susidaręs baltyminis kompleksas analizuotas Western bloto būdu su anti-GAP antikūnais. Siekiant gauti vienodą RasGAP baltymo kiekį ÷m÷me tokius ląstelių kiekius: HepG2 ląstelių 1,5x106 (1,5), HL-60 ląstelių 15x106 (15). A. 1, 2, 3, B. 1, 2, C. 1, 2 pavyzdžiuose pavaizduotas RasGAP kiekis citoplazminiuose lizatuose (10%).

4.6. Nck-α ir RasGAP baltymų lokalizacija

Siekiant ištirti Nck-α baltymo lokalizacijos priklausomybę nuo PDGF

receptoriaus-β aktyvacijos buvo atliekamas imunofluorescencijos tyrimas. Tam tikslui

HepG2 ląstel÷s ekspresuojančios laukinio tipo PDGF receptorių-β buvo auginamos 24

duobučių l÷kštel÷se ant dengiamųjų stiklelių. Ląstel÷s buvo transfekuojamos pRK5-

HA-Nck-α konstruktais naudojant Lipofektamine reagentą. Sinchronizuojamos 12 val.

ir stimuliuojamos augimo faktoriumi PDGF-BB 50 ng/ml 10 min. arba paliktos

nestimuliuotos. Ląstel÷s fiksuojamos, permiabilizuojamos ir inkubuojamos su

pirminiu anti-HA antikūnu, po inkubacijos laikomos antrinio antikūno, žym÷to Alexa

Fluor 488 dažu, tirpale. HA-Nck-α baltymo lokalizacija nestimuliuotose ir

stimuliuotose ląstel÷se buvo analizuojama konfokalinio mikroskopo pagalba.

Poveikis ATP: - - - + - + Ląstelių kiekis: 15 1,5 1,5 1,5 15 15

Ląstelių lizatai: HL60 H4 H4 HL60

GAP W: anti-GAP

1 2 3 4 5 6

40

Pav.11. HA-Nck-α baltymo lokalizacija. Siekiant nustatyti Nck-α baltymo

lokalizaciją ląstel÷se priklausomai nuo PDGF receptoriaus-β aktyvacijos atlikome imunofluorescencijos tyrimą. Tam tikslui HepG2 ląstel÷s buvo neveiktos (0 min.) arba veikiamos 50 ng/ml PDGF-BB 10 min., fiksuojamos 4% paraformaldehido tirpalu, permeabilizuojamos ir blokuojamos. Po blokavimo buvo inkubuojama su anti-HA antikūnais ir su antriniais Alexa Fluor 488 dažu (žalia) žym÷tais antikūnais. Duomenys buvo analizuojami konfokalinio mikroskopo pagalba. Rodykl÷mis pažym÷tos Nck-α baltymo lokalizacijos vietos. Baltos rodykl÷s – streso fibril÷s, geltona – membranos susiraukšljimai, raudona – fokalin÷s adhezijos kontaktai, m÷lyna – citoplazminiai granulių pavidalo dariniai.

PD

GF

-BB

10

min

.

PD

GF

-BB

0 m

in.

HA-Nck-α Alexa fluor 488

100 µm

41

Gauti duomenys rodo Nck-α baltymo lokalizacijos priklausomybę nuo PDGF

receptoriaus-β aktyvumo. Nestimuliuotose augimo faktoriumi ląstel÷se didžiausia

Nck-α baltymo frakcija lokalizuojasi įtampos skaidulose (Pav.11. balta rodykl÷) bei

fokaliniuose ląstel÷s kontaktuose (Pav.11. raudona rodykl÷), dalis lamelipodijose bei

filopodijose, ląstel÷s membranos susiraukšl÷jimuose (Pav.11. geltona rodykl÷). Yra

žinoma, kad streso fibril÷s eina per ląstel÷s citoplazmą ir yra prijungiamos prie

plazmin÷s membranos per fokalinius ląstel÷s kontaktus, taip pat yra duomenų apie

Nck-α vaidmenį formuojant fokalinius kontaktus. Tod÷l galima manyti, kad Nck-α

gal÷tų dalyvauti streso fibrilių polimerizacijos link fokalinių kontaktų procecuose.

Taip pat, nestimuliuotose ląstel÷se maža Nck-α baltymo dalis yra aptinkama ląstel÷s

citoplazmoje.(Pav.11. viršutin÷ dalis, m÷lyna rodykl÷) Tuo tarpu po PDGF

receptoriaus-β aktyvacijos Nck-α kiekis citoplazmin÷je ląstel÷s dalyje granulių

pavidalo struktūrose padid÷ja, tačiau į kokių darinių sud÷tį įeina kol kas negalima

pasakyti. Bet galima teigti, kad Nck-α baltymas reguliuoja ląstel÷s procesus

priklausomus nuo PDGF receptoriaus-β aktyvacijos. Po stimuliacijos Nck-α taip pat

yra aptinkamas streso fibril÷se ir fokaliniuose ląstel÷s kontaktuose. Ląstel÷s dalyje,

kuri migracijos metu atsikabina nuo substrato, streso fibril÷s sutrump÷ja ir čia Nck-α

yra aptinkama mažiau. Taigi, gauti duomenys patvirtina, kad Nck-α baltymo viena iš

funkcijų ląstel÷je yra ląstel÷s migracijos reguliacija.

Toliau tyr÷me endogeninių Nck-α ir RasGAP baltymų lokalizaciją HepG2 ląstelių

linijoje. HepG2 ląstel÷s buvo fiksuojamos 4% paraformaldehido tirpalu,

permiabilizuojamos ir blokuojamos. Nck-α lokalizacijai nustatyti, po blokavimo

ląstel÷s buvo inkubuojamos su pirminiais anti-Nck-α antikūnais ir su antriniais

antikūnais sujungtais su FITC dažu.(Pav.12.A.) RasGAP baltymo lokalizacijai

nustatyti ląstel÷s buvo inkubuojamos su anti-RasGAP antikūnais konjuguotais su

Alexa Fluor 594 dažu.

Gauti duomenys rodo, kad Nck-α ir RasGAP baltymų lokalizacijos ląstel÷je

profilis yra panašus. Abu baltymai lokalizuojasi ląstel÷s citoplazmin÷je dalyje, o

didžiausios sąnkaupos aptinkamos šalia branduolio.(Pav.12.A. B.) Tod÷l, galma

manyti, kad šie baltymai lokalizuojasi sudarydami kompleksą. Norint patvirtinti šią

hipotezę būtina atlikti išsamius kolokalizacijos tyrimus.

42

Pav.12. Baltymų lokalizacijai ląstel÷je nustatyti buvo atliekamas

imunofluorescencijos tyrimas. A.Nck-αααα baltymo lokalizacija. HepG2 linijos ląstel÷s buvo fiksuojamos 4% paraformaldehido tirpalu, permeabilizuojamos su 0,15% Triton X-100 ir blokuojamos. Inkubuojamos su pirminiais anti-Nck-α antikūnais ir antriniais Alexa Fluor 488 dažu žym÷tais antikūnais. B. RasGAP baltymo lokalizacija. HepG2 linijos ląstel÷s buvo fiksuojamos, permeabilizuojamos ir inkubuojamos su anti-RasGAP antikūnais žym÷tais Alexa Fluor antikūnais. Duomenys vizualizuojami konfokalin÷s mikroskopijos būdu.

100 µm

A.

B.

43

5. REZULTATŲ APTARIMAS

Šiame darbe buvo tiriamas Nck šeimos baltymų sąveikos su Ras GTPazę

aktyvuojančiu baltymu (RasGAP) mechanizmas. Tam tikslui buvo naudojamos

HepG2 ląstel÷s ekspresuojančios laukinio tipo PDGF receptorių-β. Ląstel÷s buvo

nestimuliuojamos arba stimuliuojamos PDGF-BB siekiant įvertinti Nck šeimos

baltymų sąveikos su RasGAP priklausomybę nuo PDGFR-β.

Iš pradžių parod÷me, kad Nck šeimos baltymai sąveikauja su RasGAP baltymu in

vitro ir in vivo pastoviai per Nck-α SH2 ir vieną arba kelis SH3 domenus. Pastoviai

sąveikai yra svarbūs SH3 domenai. SH2 domeno dalyvavimas sąveikos sudaryme gali

būti priklausomas nuo kitų tirozinfosforilintų baltymų, tiek receptorių tiek ir

nereceptorinių (Pvz., p62Dok)[24]. Po PDGF receptoriaus-β aktyvacijos Nck šeimos

baltymai suriša papildomą RasGAP kiekį ir tam yra reikalingas Nck-α SH2 domenas.

Tokie duomenys gauti atlikus in vitro tyrimus su mutantiniais Nck-α baltymai. Vien

tik SH2 domeną turintis Nck-α suriša padidintą RasGAP kiekį aktyvuotose PDGF-

BB ląstel÷se kaip ir laukinio tipo Nck-α baltymas. Tik SH3 domenus turintis Nck-α

baltymas suriša vienodą RasGAP kiekį tiek aktyvuotose tiek ir neaktyvuotose augimo

faktoriumi ląstel÷se. Tuo tarpu nestimuliuotose augimo faktoriumi arba

neekspresuojančiose receptoriaus ląstel÷se tiek laukinio tipo tiek ir mutantiniai

baltymai suriša vienodą GAP kiekį. Taigi, Nck-RasGAP sąveika iš dalies yra

reguliuojama PDGF receptoriumi-β. Papildomo GAP kiekio surišimas gali būti

sąlygojamas GAP fosforilinimo prisijungus jam prie PDGFRβ, po kurio pakinta GAP

konformacija.[12, 13] Nck-α SH2 domenas gal÷tų jungtis prie GAP fosforilinto

tirozino ir, tokiu būdu, Nck gali dalyvauti sujungdamas RasGAP-PDGFR-β

kompleksą su kitomis pasrovin÷mis molekul÷mis. Papildomas RasGAP kiekis gali

būti svarbus mitogeninio signalo perdavimui.

Tyrimais in vivo parod÷me, kad Nck šeimos baltymai, Nck-α ir Nck-β, sąveikauja

su RasGAP vienodai. Tuo tarpu šios sąveikos priklausomyb÷s nuo PDGFR-β

aktyvacijos neaptikome. Nck-α sąveikai su RasGAP in vivo yra reikalingi SH2 ir SH3

domenai. Per SH2 domeną sąveika yra silpnesn÷ ir greičiausiai vyksta per RasGAP

fosforilintą tiroziną arba kitą, fosfotiroziną turintį baltymą. Fosfotiroziną turintis

baltymas gali būti p62Dok. Yra žinoma, kad RasGAP sąveikauja su fosforilintu

p62Dok ir tokiu būdu yra neigiamai reguliuojamas Ras [19]. Tod÷l galima manyti,

44

kad Nck-α sudarydamas kompleksą su RasGAP ir p62Dok taip pat dalyvauja Ras

inaktyvavimo procese. Kita vertus, RasGAP ląstel÷je gali veikti kaip Ras neigiamas

reguliatorius arba Ras efektorius. Sąveika su Nck gali sąlygoti efektorinę arba

reguliacinę RasGAP funkciją.

“Far western” blotas rodo, kad tiesioginei sąveikai vykti yra reikalingi tik vienas

arba keli Nck-α SH3 domenai. Nck-α baltymas turintis tik SH2 domeną tiesiogiai

nesijungia prie RasGAP, bet sąveikauja su nežinomu fosforilintą tiroziną turinčiu 190

kDa baltymu.

Yra duomenų, kad RasGAP, kaip ir Nck baltymai, yra susijęs su aktino citoskeleto

reguliacijacija [1, 6]. Tod÷l gali būti, kad Nck-α-RasGAP kompleksas taip pat yra

susijęs su šia funkcija. Bet kol kas n÷ra duomenų patvirtinančių šią hipotezę.

Tolesniuose tyrimuose siek÷me nustatyti ar Nck šeimos baltymų sąveika yra

universali arba specifiška tam tikrose ląstel÷se. Tam tikslui atlikome in vitro ir in vivo

tyrimus promielocitin÷s leukemijos ląstelių linijoje neekspresuojančioje PDGF

receptoriaus-β. Duomenys rodo, kad nei in vivo nei in vitro Nck-α sąveika su GAP

HL-60 ląstelių linijoje nevyksta. Tyrimais in vivo nustat÷me, kad šioje ląstelių linijoje

Nck-α sąveikauja su PAK (duomenys nepateikti), tod÷l galima manyti, kad PAK

konkuruoja su GAP d÷l sąveikos su Nck-α. Toliau siek÷me ištirti ar RasGAP iš HL-

60 linijos ląstelių n÷ra užblokuotas kitų pastoviai su juo sąveikaujančių baltymų, kurie

trukdytų jo sąveikai su PDGF receptoriumi-β. Atlikę kinaz÷s aktyvumo testą

nustat÷me, kad GAP iš HL-60 linijos ląstelių sąveikauja su PDGFRβ iš HepG2

ląstelių. Tai rodo, kad GAP n÷ra užblokuotas kitų baltymų ir potencialiai gali

sąveikauti ir su kitomis, abiem ląstelių linijoms būdingomis, molekul÷mis.

Atlikus lokalizacijos tyrimą nustat÷me, kad po aktyvacijos PDGF-BB didel÷ Nck-

α baltymo dalis yra lokalizuojama į ląstel÷s citoplazmą ir aptinkama granulių pavidalo

struktūrose. Yra žinoma, kad Nck-α dalyvauja ląstel÷s nuo PDGF priklausomuose

proliferacijos ir migracijos procesuose, tod÷l galima manyti, kad Nck-α lokalizacijos

pokytis po stimuliacijos augimo faktoriumi yra susijęs su šiais procesais. Po poveikio

augimo faktoriumi Nck-α gali sudaryti kompleksus su kitais baltymais, taip pat

dalyvaujančiais ląstel÷s proliferacijos ar migracijos procesuose. Į šių kompleksų

sud÷tį gal būt įeina ir RasGAP. Yra žinoma, kad d÷l RasGAP sąveikos su

skirtingomis molekul÷mis, jis gali įeiti į įvairius kompleksus bei išsid÷styti įvairiuose

ląstel÷s kompartmentuose priklausomai nuo komplekso komponentų koncentracijos,

45

kuri gali priklausyti nuo ląstel÷s tipo ir amžiaus.[45] Imunofluorescencijos tyrimais

patvirtinome, kad Nck-α tiek aktyvuotose tiek ir neaktyvuotose PDGF ląstel÷se

lokalizuojasi fokalin÷s adhezijos kontaktuose, membraniniuose susiraukšl÷jimuose

bei įtampos skaidulose, bet kiek ši lokalizacija ir su ja susijęs Nck-α baltymo

veikimas priklauso nuo jo sąveikos su RasGAP kol kas pasakyti negalima. Tam

reikalingi tolesni tyrimai.

Imunofluorescencijos tyrimais nustat÷me, kad Nck-α ir RasGAP baltymų

lokalizacijos profilis yra panašus. Abu baltymai lokalizuojasi ląstel÷s citoplazmin÷je

dalyje ypač šalia branduolio. Tod÷l, galima manyti, kad Nck-α baltymas lokalizuojasi

mums nežinomose ląstel÷s struktūrose būdamas komplekse su RasGAP. Tačiau šios

hipotez÷s patvirtinimui yra reikalingi tolesni tyrimai su ląstel÷s struktūroms

specifiniais žymenimis.

Gauti duomenys buvo patvirtinti trijuose ir daugiau nepriklausomuose tyrimuose.

Kadangi nustat÷me Nck-α baltymo sąveikos su RasGAP pagrindinį mechanizmą ir

priklausomybę nuo PDGFRβ aktyvumo, toliau ketiname detaliau tyrin÷ti šios

sąveikos specifiškumą, priklausomybę nuo įvairių aplinkos bei ląstel÷s vidaus

poveikių bei biologinį vaidmenį.

46

6. IŠVADOS

1. Nck šeimos adaptoriniai baltymai sąveikauja su Ras GTPazę

aktyvuojančiu baltymu (RasGAP) pastoviai, ir ši sąveika nepriklauso nuo

PDGF receptoriaus-β aktyvacijos in vitro ir in vivo. Šiai sąveikai yra būtini

Nck-α SH3 domenai ir SH2 domenas.

2. Nck šeimos baltymai gali sąveikauti su RasGAP tiesiogiai ir per

nenustatytą tarpininką (tarpininkus). Už tiesioginę Nck-α baltymo sąveiką

su RasGAP yra atsakingi adaptorinio baltymo SH3 domenai, o už

netiesioginę – SH2 domenas.

3. Promielocitin÷s leukemijos HL-60 ląstelių linijoje RasGAP nesąveikauja

su Nck-α, bet gali sąveikauti su aktyvuotu PDGF receptoriumi.

4. Konfokalin÷s mikroskopijos analiz÷ rodo, kad Nck-α ir RasGAP

lokalizacijos ląstel÷je pobūdis yra panašus.

47

7. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. L. E. Braverman, L.A. Quilliam. Identification of Grb4/Nckβ, a Src homology

2 and 3 domain-containing adapter protein having similar binding and biological

properties to Nck. JBC, 1999; 279 (9): 5542-5549.

2. M. Chen, H.She, W. Li et.al. Nckβ adapter regulates actin polymerisation in

NIH 3T3 fibroblasts in response to platelet-derived growth factor bb. MCB, 2000;

20 (21): 7867-7880.

3. L. Buday, L. Wunderlich, P. Tamas. The Nck family of adapter proteins:

regulators of actin cytoskeleton. Cellular signaling, 2002; 14: 723-731.

4. M. Ger, V. Tunaitis, M. Stoškus, M. Valius. Identification of Ras GTPase

activating protein-binding sites in adaptor protein Nck-α. Biologija, 2005; 1: 35-

37.

5. M. Chen, H. She, W. Li et.al. Identification of Nck family genes,

chromosomal localization, expression, and signaling specificity. JBC, 1998; 273

(39): 25171-25178.

6. W. Li, J. Fan, D. T. Woodley. Nck/Dock: an adapter between cell surface

receptors and the actin cytoskeleton. Oncogene, 2001; 20: 6403-6417.

7. S. Coutinho, T. Jahn, J. Duyster et.al. Characterization of Grb4, an adapter

protein interacting with Bcr-Abl. Blood, 2000; 96 (2): 618-624.

8. R. Nishimura, W. Li, J. Schlessinger et. al. Two signaling molecules share a

phosphotyrosine-containing binding site in the platelet-derived growth factor

receptor. MCB, 1993; 13 (11): 6889-6896.

9. W. Li, P. Hu, J. Schessinger et. al. The SH2 and SH3 domain-containing Nck

protein is oncogenic and a Common target for phosphorylation by different

surface receptors. MCB, 1992; 12 (12): 5824-5833.

10. J.P. Montmayeur, M. Valius, J. Vandenheede, A. Kazlauskas. The platelet-

derived growth factor β receptor triggers multiple cytoplasmic signaling cascades

that arrive at the nucleus as distinguishable inputs. JBC, 1997; 272 (51): 32670-

32678.

11. M. Ger, V. Tunaitis, M. Valius. Elucidation of the complex formation between

Nck-α, RasGTPase activating protein and platelet-derived growth factor receptor-

β. Biologija, 2003; 3: 7-9.

48

12. C. H. Heldin, B. Westermark. Mechanism of action and in vivo role of

platelet-derived growth factor. Physiological reviews, 1999; 79 (4): 1283-1301.

13. C. H. Heldin, A. Ostman, L. Ronnstrand. Signal transduction via platelet-

derived growth factor receptors. Biochimica et Biophysica Acta, 1998; 1378: F79-

F113.

14. S. M. Goicoechae, Y. Tu, Ch. Wu et. al. Nck-2 interacts with focal adhesion

kinase and modulates cell motility. IJBCB, 2002; 34: 791-805.

15. G. M. Rivera, C. A. Briceno, B. J. Mayer et. al. Inducible clustering of

membrane-targeted SH3 domains of the adaptor protein Nck triggers localized

actin polymerization. Current biology, 2004; 14: 11-22.

16. X. Li, U. Eriksson. Novel PDGF family members: PDGF-C and PDGF-D.

Cytocine Growth Factor Reviews, 2003; 14: 91-98.

17. L. Buday. Membrane-targeting of signalling molecules by SH2/SH3 domain-

containing adaptor proteins. Biochemica Et Biophysica, 1999; 1422: 187-204.

18. A. Bernard, A. Kazlauskas. Phosphospecific antibodies reveal temporal

regulation of platelet-derived growth factor β receptor signaling. Experimental cell

research, 1999; 253: 704-712.

19. M. J. Wick, L. Q. Dong, F. Liu et. Al. Insulin receptor-mediated p62dok

tyrosine phosphorylation at residues 362 and 398 plays distinct roles for binding

GTPase-activating protein and Nck and is essential for inhibiting insulin-

stimulated activation of Ras and Act. JBC, 2001; 276 (46): 42843-42850.

20. A. Zarrinpar, R. P. Bhattacharyya, W. A. Lim. The structure and function of

proline recognition domains. Sci. STKE, 2003; 179: re8.

21. T. Pawson, G. D. Gish, P. Nash. SH2 domains, interaction modules and

cellular wiring. TRENDS in cell biology, 2001; 11 (12): 504-511.

22. R. V. Hoch, Ph. Soriano. Roles of PDGF in animal development.

Development, 2003; 130 (20): 4769-4784.

23. S. J. Kempiak, H. Yamaguchi, J. E. Segall et. Al. A neural wiskott-aldrich

syndrome protein-mediated pathway for localized activation of actin

polymerisation that is regulated by cortactin. JBC, 2005; 280 (7): 5836-5842.

24. J. C. Sitko, C. I. Guevara, N. A. Cacalano. Tyrosine-phosphorylated SOCS3

interacts with the Nck and Crk-L adapter proteins and regulates Nck activation.

JBC, 2004; 279 (36): 37662-37669.

49

25. J. K. Drugan, K. Rogers-Graham, G. J. Clark. The Ras/p120 GTPase-

activating protein (GAP) interaction is regulated by the p120 GAP pleckstrin

homology domain. JBC, 2000; 275 (45): 35021-35027.

26. S. Kebache, D. Zuo, E. Chevet, L. Larose. Modulation of protein translation

by Nck-1. PNAS, 2002; 99 (8): 5406-5411.

27. Q. Hu, D. Milfay, L. T. Williams. Binding of Nck to SOS and activation of

ras-dependent gene expression. MCB, 1995; 15 (3): 1169-1174.

28. L. Voisin, L. Larose, S. Meloche. Angiotensin II stimulates serine

phosphorylation of the adaptor protein Nck: physical association with

serine/threonine kinases Pak1 and casein kinase I. Biochem. J., 1999; 341: 217-

223.

29. A. Kazlauskas, A. Kashishian, J. A. Cooper, M. Valius. GTPase-activating

protein and phosphatidylinositol 3-kinase bind to distinct regions of the platelet-

derived growth factor receptor β subunit. MCB, 1992; 12 (6): 2534-2544.

30. K. A. DeMalis, S. L. Godwin, S. P. Soltoff, A. Kazlauskas. Multiple roles for

Src in a PDGF-stimulated cell. Experimental cell research, 1999; 253: 271-279.

31. Y. Tu, D. F. Kucik, Ch. Wu. Identification and kinetic analysis of the

interaction between Nck-2 and DOCK180. FEBS, 2001; 491: 193-199.

32. K. Funa, H. Uramoto. Regulatory mechanism for the expression and activity

of platelet-derived growth factor receptor. Acta Biochimica polonica, 2003; 50

(3): 647-658.

33. A. Kazlauskas, G-S. Feng, T. Pawson, m. Valius. The 64-kDa protein that

associates with the platelet-derived growth factor receptor β subunit via Tyr-1009

is the SH2-containing phosphotyrosine phosphatase Syp. Proc. Natl. Acad. Sci.,

1993; 90: 6939-6942.

34. M. Stoškus, M. Ger, V. Tunaitis, M. Valius. Expression and activity of

platelet-derived growth factor receptor-β in breast carcinoma cells. Biologija,

2005; 1: 61-63.

35. S. Ekman, R. Thuresson, C-H. Heldin, L. Ronnstrand. Increased mitogenicity

of an αβ heterodimeric PDGF receptor complex correlates with lack of RasGAP

binding. Oncogene, 1999; 18: 2481-2488.

36. Y. Tu, F. Li, Ch. Wu. Nck-2, a novel Src homology 2/3-containing adaptor

protein that interacts with the LIM-only protein PINCH and components of

50

growth factor receptor kinase-signaling pathways. Molecular biology of the cell,

1998; 9: 3367-3382.

37. M. Valius, Ch. Bazenet, A. Kazlauskas. Tyrosines 1021 and 1009 are

phosphorylation sites in the carboxy terminus of the platelet-derived growth factor

receptor β subunit and are required for binding of phospholipase Cγ and a 64-

kilodalton protein, respectively. MCB, 1993; 13 (1): 133-143.

38. Y. Tu, L. Liang, S. J. Frank, Ch. Wu. Src himology 3 domain-dependent

interaction of Nck-2 with insulin receptor substrate-1. Biochem. J. 2001; 354:

315-322.

39. M. Valius, J. P. Secrist, A. Kazlauskas. The GTPase-activating protein of Ras

suppresses platelet-derived growth factor β receptor signaling by silencing

phospholipase C-γ1. MCB, 1995; 15 (6): 3058-3071.

40. Th. K. Schlesinger, K.A. demali, A. Kazlauskas et. Al. platelet-derived growth

factor-dependent association of the GTPase-activating protein of Ras and Src.

Biochem. J. 1999; 344: 519-526.

41. J-W. Lee, J-E. Kim, J. Kwon et.al. Two conserved cysteine residues are

critical for the enzymic function of the human platelet-derived growth factor

receptor-β: evidence for different roles of Cys-822 and Cys-940 in the kinase

activity. Biochem. J. 2004; 382: 631-639.

42. P. W. Schenk, B. E. Snaar-Jagalska. Signal perception and transduction: the

role of protein kinases. Biochemica et Biophysica Acta, 1999; 1449: 1-24.

43. A. Bernards. GAPs galore! A survey of putative Ras superfamily GTPases

activating proteins in man and Drosophila. Biochemica et Biophysica Acta, 2003;

1603: 47-82.

44. Sh. Donovan, K.M. Shannon, G. Bollag. GTPase activating proteins: critical

regulators of intracellular signaling. Biochemica et Biophysica Acta, 2002; 1602:

23-45.

45. Y. Takai, T. Sasaki, T. Matozaki. Small GTP-binding proteins. Physiological

reviews, 2001; 8 (1): 153-208.

46. S.Frese, W-D. Schubert, D. W. Heinz et. al. The phosphotyrosine peptide

binding specificity of Nck1 and Nck2 SH2 domains. JBC, 2006; Manuscript

M512917200.

47. M. B. Yaffe. Phosphotyrosine-binding domains in signal transduction.

Molecular Cell Biology, 2002; 3: 177-186.

51

48. T. Pawson, M. Raina, P. Nash. Interaction domains: from simple binding

events to complex cellular behavior. FEBS Letters, 2002; 513: 2-10.

49. B. J. Mayer. SH domains: complexity in moderation. Juornal of cell science,

2001; 114:1253-1263.

50. J. M. Kyriakis, J. Avruch. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal

transduction pathways activated by stress and inflammation. Physiological

reviews, 2001; 81 (2): 807-869.

52

VAIDA GURSKIENö

NCK ŠEIMOS BALTYM Ų SĄVEIKA SU RAS GTPAZĘ AKTYVUOJAN ČIU

BALTYMU

SANTRAUKA

Baltymų tarpusavio sąveika užtikrina įvairių ekstraląstelinių ir viduląstelinių

signalų perdavimą. Sąveikas sąlygoja specializuoti baltymų domenai, vieni

pagrindinių jų yra Src homologijos (SH) domenai, kurie aptinkami daugelyje baltymų.

Nck šeimos baltymai, Nck-α ir Nck-β, yra sudaryti iš trijų SH3 ir vieno SH2

domenų ir neturi jokių katalitinių domenų. Nck veikia kaip tarpininkai per SH2 ir SH3

domenus sujungdami įvairius viduląstelinius procesus reguliuojančius baltymus.

Šiame darbe nustat÷me, kad Nck šeimos nariai sąveikauja su Ras GTPazę

aktyvuojančiu baltymu (RasGAP) pastoviai in vitro ir in vivo, bet po PDGFR-β

stimuliacijos su Nck asocijuojančio RasGAP kiekis padid÷ja. Pastovi sąveika

priklauso nuo Nck-α SH2 ir vieno arba kelių SH3 domenų. Po PDGFR-β aktyvacijos,

už papildomo RasGAP kiekio surišimą yra atsakingas SH2 domenas. Taip pat

nustat÷me, kad Nck baltymai gali sąveikauti su RasGAP tiesiogiai. Vienas arba keli

Nck-α SH3 domenai yra atsakingi už Nck-α tiesioginę sąveiką su RasGAP.

Imunofluorescencijos tyrimais parod÷me, kad Nck-α ir RasGAP baltymų

lokalizacijos profilis yra panašūs.

53

VAIDA GURSKIENö

ASSOCIATION OF NCK FAMILY PROTEINS WITH RAS GTPASE

ACTIVATING PROTEIN

SUMMARY

Extracellular and intracellular signals are mediated by protein-protein

interactions. These interactions are determined by specialized protein domains, for

example, Src homology (SH) domains found in many proteins.

Nck family proteins, Nck-α and Nck-β, are composed of three SH3 and one SH2

domains and have no any putative catalytic domain. Nck proteins act as adaptors by

linking via SH2 and SH3 domains proteins that regulate various intracellular

processes.

Here we show that Nck family proteins associate with RasGAP constantly in

vivo and in vitro, but after PDGFR-β stimulation quantity of Nck-bound RasGAP

increases. Constant interaction depends on Nck-α SH2 and one or several SH3

domains. SH2 domain is responsible for binding of additional RasGAP after PDGFR-

β stimulation. We have also determined that Nck proteins are able to interact with

RasGAP directly. One or several SH3 domains are responsible for Nck-α direct

association with RasGAP. Immunofluorescence assay show that localization patterns

of Nck-α and RasGAP are similar.