Mikrobiyoloji Agar Sayım Biyokimyasal Testler

1

1. Mikrobiyoloj ik Analizler ve G da Güvenir li i

Aç s ndan De erlendir ilm eler i

Sterilize edilmedikçe ve steril ambalaj materyali içinde muhafaza edilmedikçe g dalar çe itli faktörlere ba l olarak de i en say ve cinslerde mikroorganizma içermekte; hasat a amas ndan itibaren her üretim basama nda mikrobiyal kontaminasyona maruz kalmaktad rlar. Kontaminasyon etkeni mikroorganizmalar g da bozulmalar na, g da zehirlenmelerine (intoksikasyon) ve g da kaynakl hastal klara (infeksiyon) neden olmakta, sonuçta önemli ekonomik kay plar ve sa l k sorunlar ortaya ç kmaktad r (Snyder, 1986; 1993). Günümüzde bu sorunlar n giderilmesinde kabul edilen en etkin yakla m HACCP sistemidir. Sistemin prensibi ürünle ilgili tehlikelerin belirlenmesi ve kontrol alt nda tutulabilmeleri için gerekli önlemlerin al nmas d r. HACCP uygulamas nda üretimin belli basamaklar nda fiziksel, kimyasal ve mikrobiyolojik analizlere gereksinim duyulmaktad r. Mikrobiyolojik analizler ürün güvenirli i ve raf ömrünün belirlenmesi aç s ndan büyük önem ta makta, ancak sonuçlar n al nmas için geçen sürenin uzun olmas sorun yaratmaktad r. Bu kapsamda, son y llarda h zl test yöntemleri üzerinde yo un çal malar yap lmakta ve uygulamada ba ar l sonuçlar al nmaktad r. Geli tirilen h zl yöntemler uluslararas resmi kurulu lar taraf ndan da incelemeye al narak, resmi yöntem olarak önerilebilmektedir.

1.1. Ürün Güvenir li inin De erlendir ilm esinde Yararlan lan Mikrobiyoloj ik Analizler

G da analizlerinde sonuçlar n güvenirli i aç s ndan ürün tipine uygun örnekleme planlar n n seçimi büyük önem ta maktad r (ICMSF, 1978). Ürüne uygulanacak mikrobiyolojik analizlerin seçiminde ürünle ilgili resmi kurulu lar taraf ndan önerilen mikrobiyal kriterler dikkate al nmaktad r. Bu amaçla g da maddeleri toplam mikroorganizma say s , indikatör ve patojen mikroorganizmalar, mikrobiyal metabolitler yönünden incelemeye al nmaktad r.

2

Toplam canl mikroorganizma say s n n belirlenmesi: Fermente g dalar d nda g da maddelerinde kalite kriteri olarak kullan l r. Toplam canl mikroorganizma say s ürünün raf ömrü ve ortam ko ullar n n patojen bakteri geli mesi için uygun olup olmad n n bir göstergesidir. Bu amaçla aerobik mezofilik bakteri say m yap l r. Her ne kadar mezofilik bakteri say s ile patojen mikroorganizma say s aras ndaki korelasyon kesin olarak belirlenmemi se de, say n n yüksek olmas genellikle patojen bakteri mevcudiyetini dü ündürmektedir. G da zehirlenmelerine neden olan g dalarda mezofilik bakteri say s nadiren 105/g in alt nda olup, genellikle 106-107/g düzeyindedir (Bourgeois ve Cleret, 1995).

ndikatör mikroorganizma say s n n belirlenmesi: ndikatör mikroorganizmalardan koliform ve di er Enterobacteriaceae grubu bakteriler ürünlerin yetersiz hijyen ko ullar nda i lendi ini göstermektedir (ICMSF, 1978). Escherichia coli ve di er fekal koliformlar do rudan patojen bakteri indikatörleridir. Enterokoklar da indikatör bakteriler aras nda yer almaktad r. Enterokoklar insan ve hayvan ba rsaklar nda bulunan Enterococcus faecium ve E. faecalis den olu maktad r. Genellikle E. faecium insan ve hayvan, E. faecalis sadece insan ba rsa nda bulunmaktad r. Enterokoklar baz durumlarda su analizlerinde fekal kirlenme indikatörü olarak kullan l rlar. E. coli den daha dirençli olmalar avantaj sa lar, ancak E. coli den farkl olarak fekal ortam d ndaki ortamlardan da s kl kla izole edilebilmektedirler. Bu nedenle fekal kirlenme aç s ndan her zaman do ru fikir vermemektedirler (Harrigan, 1998).

G da bozulma etkeni mikroorganizmalar n belirlenmesi: G dalar n mikrobiyolojik analizlerinde ba vurulan di er bir yöntem bozulma etkeni mikroorganizmalar n belirlenmesidir. Bozulma etkeni mikroorganizmalar g da maddelerinin duyusal niteliklerinde olumsuz de i iklere neden olmakta, bozulman n varl n veya olas l n , dolay s yla ürünün ticari kalitesini göstermektedir. G dalarda mikroorganizma say s 106-108/g in üzerine ç kt nda bozulma görsel olarak da izlenebilmektedir (Jay, 1986). Mayalar, baz Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium,

Alcaligenes ve Lactobacillus türleri g da bozulmalar na neden olan mikroorganizmalar aras nda yer almaktad r (Forsythe ve Hayes, 1998).

3

Patojen ve toksik mikroorganizmalar n belirlenmesi: Patojen ve toksik mikroorganizmalar infeksiyon ve intoksikasyon etkeni organizmalardan olu maktad r. Virüslerin hepsi patojen olmakla birlikte, baz lar insanlarda hastal klara neden olurlar. G da maddelerinin tüketici sa l aç s ndan olu turabilecekleri risklerin belirlenmesi amac yla ürün patojen mikroorganizma ve toksin analizlerine tabi tutulur. Bakteriler içinde Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila, Shigella sonnei, S. flexnuri, enteropatojenik Escherichia coli,

Vibrio cholerae ve V. Parahaemolyticus Gram negatif; Staphylococcus

aureus, Streptococcus (enterococci) spp. ve Listeria monocytogenes Gram pozitif; Clostridium perfringens, C. botulinum, ve Bacillus cereus spor olu turan patojenler grubunu olu tururlar. Baz patojen bakteriler g dalarda, baz lar vücutta toksin üretmektedirler (Anon, 1988; Aran, 1993; Doyle ve ark. 1997; Mortimore and Wallace, 1994; Pierson ve Stern, 1985; Tunail, 1999). G da kaynakl küfler de toksik metabolitleri nedeniyle canl sa l n olumsuz etkiledikleri gibi, infeksiyonlara ve alerjik reaksiyonlara da neden olmaktad rlar (Austwick, 1984; Bullerman, 1986; Schlatter, 1988).

Bir g da maddesi patojen mikroorganizmalar veya toksinlerini yüksek düzeylerde içermesine ra men tat, koku ve görünü ünde belirgin bir de i iklik her zaman gözlenmeyebilir. Zehirlenme etkeni mikroorganizmalar n infeksiyon dozlar mikroorganizma ve ki iye ba l olarak de i mekle birlikte, genel olarak 105/g ve üzerindeki düzeylerdedir (Bouergeois ve Cleret, 1995). Bebekler, ya l lar ve hastalar gibi riskli gruplarda çok dü ük kontaminasyon seviyelerinde de (10/g) sa l k sorunlar ortaya ç kabilmektedir (Anon, 1988; Frazier ve Westhoff, 1988; Jay, 1986; Synder, 1986).

Mikrobiyal metabolitlerin analizi: Mikroorganizma geli mesi sonucunda ortamda olu an toksinler, laktik asit, diasetil, uçucu ya asitleri, etanol, merkaptanlar, H2S, serbest amino asitler, asetik asit, amonyak, histamin, tiobarbütirik asit, trimetilamin vb. bile ikler belirlenerek ürünün kalitesi konusunda bilgi sahibi olunabilmektedir. H zl yöntemler bu metabolik ürünler dikkate al narak geli tirilmektedir (Jay, 1986; Sheridan, 1995).

4

1.2. G dalarda Mikroorganizm a Say m Teknikler i

1.2.1. Örnek Alm a ve Örne in Analize Haz r lanm as

Analize al nan örnek al nd g da grubunu temsil etmeli (ICMSF, 1986), analize kadar uygun ko ullarda saklanmal d r. Al nan örneklerin ta nmas nda k r lma riski gözönüne al narak cam malzeme kullan m ndan kaç n lmal , geni a zl , steril, ürün hacmine uygun kaplar veya plastik torbalar (sadece kuru ve dondurulmam g dalar için) kullan lmal d r (Harrigan, 1998).

Örnekler laboratuara orijinal depolama ko ullar na en yak n ko ullarda ta nmal d r. S v g dalardan örnek al n rken ve örnekler laboratuara ula t nda s cakl k ölçümleri yap lmal ve kaydedilmelidir. Dondurulmu ve so utulmu g dalar n s cakl klar nda de i im olmadan laboratuara ta nmalar sa lanmal d r. Örneklerin ta nmas nda kullan lan kaplar dondurucuda bekletilerek so utulmal , dondurulmu ürünler çözünmeden laboratuara ula t r lmal d r (Harrigan, 1998).

Laboratuara getirilen örne in genel fiziksel görünümü kaydedilmeli, mümkünse hemen analize al nmal d r. Örnek hemen analize al nam yorsa dondurulmu g dalar -20°C de, kolay bozulabilen (so ukta muhafaza edilmesi gereken) ürünler 0-4°C de en fazla 36 saat muhafaza edilmelidir (FDA, 1998).

Dondurulmu g dalar çözündürülmeden analize al nabilirler. Ancak blok halindeki g dalardan örnek al m nda örne in çözündürülmesi gerekebilmektedir. Bu amaçla örnek 2-5°C de 18 saat içinde; h zl çözündürme gerekiyorsa örnek 45°C nin alt nda 15 dakikada çözündürülmelidir (FDA, 1998).

1.2.2. Homojenizasyon ve Seyreltim

Toplam canl say m yöntemlerinde g da örne i homojenize edilir, gerek görülürse (kat ise veya s v örnekte de mikroorganizma say s yüksek ise) uygun oranlarda (1:10, 1:100, 1:1000...) seyreltilir. Seyreltimlerde

5

10 gram yerine 25 gram (225 ml steril seyreltim çözeltisi içine) veya 50 gram (450 ml steril seyreltim çözeltisi içine) örnek al m tercih edilmelidir (FDA, 1998; FAO, 1992). Haz rlanan bu 10-1 lik (1:10=1+9) seyreltimden 1 ml al narak 9 ml steril seyreltim çözeltisi içeren tüplere aktar l r (10-2 ). Ayn ekilde ileri seyreltimler haz rlanarak (10-3, 10-4, 10-5...) her seyreltimden uygun besi ortamlar na ekim yap l r, belirli süre ve s cakl kta inkübe edilir. Seyreltimler ayn pipetle yap lmamal , her aktar mda yeni pipet kullan lmal d r. Homojenizasyon çe itli ekillerde yap labilir; ancak, önerilen en uygun yöntem filtreli stomacher torbalar kullan larak stomacher da 2 dakika homojenizasyondur. Seyreltimlerde yayg n olarak peptonlu su (%0,1 lik pepton; pH 6,8-7,0) kullan l r. Son y llarda ISO standartlar nda peptonlu fizyolojik su çözeltisi (%0,1 pepton ve %0,85 sodyum klorür içeren) genel amaçl seyreltim çözeltisi olarak önerilmektedir (Harrigan, 1998).

1.2.3. Besiyer ler inin Haz r lanm as ve Muhafazas

Kurutulmu haldeki besiyerleri higroskopik özellikte olup, s ya, a ve neme duyarl d rlar. Muhafaza ko ullar orijinal kutular üzerinde belirtilmekte olup, genellikle toz besiyerlerinin 25°C nin alt nda, dü ük rutubetli ortamda saklanmalar önerilmektedir. Kullan m s ras nda son kullanma tarihleri dikkate al nmal , belirtilen süre içinde tüketilebilecek miktarlarda sat n al nmal d r. Topaklanm , ak kanl kaybolmu besiyerleri kullan lmamal d r.

Besiyerinin haz rlanmas s ras nda deiyonize, dam t k veya ters osmoz yöntemiyle elde edilmi sular kullan lmal d r. Suyun pH kontrol edilmeli 5,5 de erinin alt nda ise s t larak CO2 uzakla t r lmal d r. Homojen bir kar m sa lanmas , kolay kar t r labilmesi için besiyeri toplam hacminin iki misli hacimde bir erlende haz rlanmal d r.

Besiyeri önce gerekli miktar n yar s kadar su içinde kar t r lmal , geri kalan su erlenin kenarlar na yap an besiyerini y kayacak ekilde erlene ilave edilmelidir. Bu basamak önemlidir, çünkü erlen kenarlar nda kalan toz halindeki besiyerleri otoklavda tam sterilize olmamakta ve kontaminasyona neden olabilmektedir.

6

Agar içeren besiyerleri otoklavlama öncesi, yanmaya neden olmayacak ekilde kaynama noktas na kadar s t larak eritilmelidir.

Otoklavlanmayacak besiyerleri bu kaynatma i lemini takiben petrilere veya uygun muhafaza kaplar na da t ma haz r duruma gelmi olur. Besiyerlerinin ço unlu u 121°C de 15 dakika sterilize edilmektedir. Besiyerleri sterilizasyon sonras 25°C de orijinal ambalajlar üzerinde belirtilen pH de erlerini sa layacak ekilde formüle edilmi tir. Bu nedenle sterilizasyon öncesi pH ayarlamas yap lmamal d r.

Haz rlanan besiyerleri 50°C deki su banyosuna al nmal ve bu s cakl a indikten sonra petrilere dökülmeli, su banyosunda 3 saatten fazla bekletilmemeli ve hava kabarc olu mayacak ekilde kar t r lmal d r. Petri kutular n n kapaklar nda yo unla ma olmas ve foto-oksidasyon sonucunda inhibitör bile ikler olu mas nedeniyle besiyeri içeren petriler güne nda bekletilmemelidir. Is ya duyarl katk lar besiyeri s cakl 50°C ye dü ürüldükten sonra ortama ilave edilmelidir. So uk s v haldeki bir katk ilavesinde agar n kat la abilece i gözönünde bulundurulmal d r. Katk lar n ilavesinden sonra besiyeri iyice kar t r larak (köpük olu turmadan) petrilere veya muhafaza edilecekleri kaplara mümkün oldu u kadar k sa sürede da t lmal d r.

Haz rlanm olan besiyerlerinin muhafaza süreleri besiyeri cinsine göre farkl l klar göstermektedir. A z vidal kapakl kaplarda nutrient broth veya agar 12-16°C de 6 ay muhafaza edilebilmektedir. Besiyerleri ktan korunmal , agarl petri kutular kurumalar önlemek için, hava almayacak ekilde ambalajlanarak, önerilen sürelerde 2-8°C de muhafaza edilmeli

ve hiçbir ekilde dondurulmamal d r. Baz besiyerleri k sa sürede inaktive olan katk içerdikleri için muhafaza süreleri oldukça k sad r. Genel olarak besiyerlerinin fazla bekletilmesinden kaç n lmal d r.

Kullan lan besiyerleri ve di er malzemeler sterilize veya dezenfekte edildikten sonra at lmal , çevrede kontaminasyonlara neden olmamal d r (Bridson, 1998).

7

1.3. lk Yard m Öneriler i

Genel kural olarak çal rken besiyerleri solunmamal , deri ile temastan kaç n lmal d r. Besiyerleri sodium azide , barbiton , cycloheximide vb. toksik bile ikler içerebilirler. Bu nedenle besiyerlerinin haz rlanmas s ras nda gerekli uyar lara dikkat edilmelidir. Herhangi bir kaza durumunda ilk yard m uygulamalar bilinmelidir. Deri ile temasta kontamine giysiler hemen ç kar lmal , etkilenen yüzeyler su ve sabun ile y kanmal , t bbi tedavi uygulanmal ; göz ile temasta su ile y kanmal ve t bbi tedaviye gidilmeli; a z yolu ile al nmas durumunda ½ Litre su içirilmeli ve hemen t bbi tedaviye ba lanmal ; solunum yolu ile al nd ysa ki i o ortamdan uzakla t r lmal , serin bir yerde dinlendirilmeli, t bbi tedaviye ba vurulmal d r. Bu tip bir besiyerinin dökülmesi halinde koruyucu eldiven, gözlük ve maske kullan larak dökülen materyal uygun bir kap içinde toplanmal ve lokal düzenlemelere uygun olarak at lmal , kal nt lar bol miktarda su ile y kanmal d r (Bridson, 1998).

1.4. Haz r lanan Besiyer lerinde Laboratuar Kalite Kontrol Testleri

Haz rlanan her parti besiyerine baz kalite kontrol testleri uygulanmal d r. Bu amaçla önerilen testler a a da verilmi tir (Bridson, 1998):

(i) Besiyerinin pH oda s cakl nda (25°C) kontrol edilmelidir. (ii) Haz rlanan besiyerlerinden al nan örnekler sterilite kontrolu için

2-5 gün 35-37°C de inkübe edilmelidir. (iii) Stok mikroorganizma kültürleri veya taze mikroorganizma

izolatlar ile besiyerinin performans incelenmelidir. (iv) Stabilite testi için depolanm olan besiyerleri ekim i lemine tabi

tutularak önerilen s cakl kta ve ko ullarda inkübe edilmelidir.

1.5. Kullan lan Laboratuar Malzem eler inin Tem izlenm esi ve Sterilizasyonu

Yeni al nan cam malzemenin kullan m öncesi su ve bir temizlik malzemesi ile y kanmas yeterlidir. Kullan lm cam malzeme ve di er

8

aparat için y kama öncesi 121°C de 40 dakika sterilizasyon önerilmektedir. Daha sonra uygun temizlik malzemeleri ile y kanmal ve deterjan kal nt s olmayacak ekilde durulanmal d r. Kullan lan pipetler de dezenfektan çözelti içeren ortama at lmal d r. Bu amaçla kullan labilecek uygun dezenfektanlardan biri Hycolin dir. Pipetler patojen bakteri inokülasyonlar nda kullan ld ise Hycolin , Virkon veya uygun ba ka bir dezenfektan içeren kavanozlara konulmal d r. Analiz bitiminde pipetler de sterilizasyona tabi tutulmal d r.

Plastik petriler, pipetler ve i eler gibi bir kullan ml k malzemeler at lmadan önce otoklavlanabilir plastik torbalarda ( Sterilin vb. marka) 121°C de 40 dakika sterilize edilmelidir.

Mikrobiyolojik analizlerde kullan lan özeler bunzen alevinde kor hale gelinceye kadar yak larak sterilize edilir. Spatül vb. malzeme etanolden geçirildikten sonra alevde yak l r. Cam pipet ve petriler uygun muhafaza kaplar içinde, di erleri mikrobiyolojik analizlerde kullan labilecek ekilde (pamuklanarak, kapaklar ile birlikte vb.) haz rlanarak etüv s cakl 160°C ye ula t ktan sonra minimum 2 saat b rak larak kuru s cakl kta sterilizasyon sa lan r. Otoklavda sterilizasyon daha ziyade besiyerlerinin sterilizasyonunda tercih edilen bir yoldur. (Harrigan, 1998).

1.6. Toplam Canl Say m Yöntem ler i

G da güvenirli ini belirlemede kullan lan en basit ve yayg n analiz yöntemlerinden biridir ve g dadaki mikroorganizma say s n n kabul edilebilir s n rlarda olup olmad konusunda fikir vermektedir. Tek ba na hiçbir besiyeri ve inkübasyon ko ulu mevcut mikroorganizmalar n hepsinin geli ebilece i ortam sa layamamaktad r. Toplam canl say m herhangi bir mikroorganizma grubu belirtilmediyse genellikle toplam bakteri say s n ifade etmektedir. Uygulanan inkübasyon derecesine göre saptanan mikroorganizmalar toplam mezofilik bakteri, toplam psikrofilik bakteri, toplam termofilik bakteri olarak de erlendirilir. Toplam bakteri say s Standard Plate Count (SPC) veya Aerobic Plate Count (APC) olarak da belirtilmekte ve sadece belirtilen ko ullarda geli ebilen mikroorganizma grubunu temsil etmektedir.

9

Toplam canl say m nda kullan lan ba l ca geleneksel analiz yöntemleri koloni say m ve en muhtemel say yöntemleridir. Son y llarda k sa sürede sonuç al nan çe itli h zl analiz yöntemleri, besiyerleri ve kitler geli tirilmi ve uygulamaya geçmi tir.

1.6.1. Koloni Say m Yöntem leri

Aerobik mikroorganizma analizlerinde petriler ekimi takiben; anaerobik analizlerde ise ortamdaki oksijenin çe itli yöntemlerle uzakla t r ld ko ullarda inkübasyona b rak l r. Aerobik bakteri say m için önerilen standart yöntem a a da verilmi tir:

1.6.1.1. Dökme plak yöntemi

1. Steril petrilere 10-1, 10-2, 10-3... lik seyreltimlerden paralelli veya üçlü olarak 1 er ml (inokulum) aktar l r.

2. Agarl kültür ortam su banyosunda veya mikrodalga f r nda eritilir, 44-46°C ye so utulduktan sonra petrilere 10-15 ml dökülür.

3. nokulum ve agarl besiyeri petrilere ileri-geri ve dairesel hareketler uygulayarak 10-15 saniye kar t r l r.

4. Sterilite kontrolu için orijinal besiyeri ve seyreltim s v s ile ayn i lemler tekrarlan larak, inkübasyona tabii tutulur.

5. Besiyerleri kat la t ktan sonra petri kutular ters çevrilerek, önerilen s cakl kta ve sürede inkübe edilir.

6. nkübasyon bitiminde 25 ile 250 (veya 30-300) aras nda koloni içeren seyreltimlerin petrileri seçilir ve say l r. Aritmetik ortalamalar al narak seyreltim faktörü ile çarp l r, örne in gram veya mililitresindeki mikroorganizma say s (kob/g: koloni olu turan birim/gram) olarak belirlenir.

Not 1. Seyreltim ve ekim i lemlerinin 15-30 dakika içinde tamamlanmas önerilmektedir (Harrigan, 1998). Not 2. Normal 8-10 cm çap ndaki petrilerde 25 den az 250 den fazla (30-300) say da koloni olu mu petriler dikkate al nmaz. Ancak yakla k say belirtilmesinde petri kutular dörde veya sekize bölünerek bir

10

de erlendirme yap lmaktad r. Konu ile ilgili dikkat edilmesi gerekli di er hususlar American Public Health Association (APHA) (1993), Association of Official Analytical Chemists (AOAC) (1990) ve Borcakl ve ark. (1994) gibi kaynaklarda yer almaktad r. Not 3. Toplam bakteri say m nda APHA, (1978) taraf ndan farkl s cakl k gereksinimleri olan bakteriler için 5-7 C de 7-10 gün, 20°C de 3-5 gün, 45°C de 2-3 gün veya 55°C de 48 saat inkübasyon önerilmektedir.

1.6.1.2. Yayma plak yöntemi

1. Agarl besi ortam (10-15 ml) steril petrilere dökülür, kat la mas ve yüzeyin kurumas sa lan r.

2. Yukar da belirtildi i ekilde haz rlanan seyreltimlerden 0,1 er ml petrilere ekim yap l r, steril drigalski spatülleri ile besiyeri üzerinde homojen da l m sa lan r.

3. nkübasyon ve say m, dökme plak yönteminde oldu u gibi yap l r. Mikroorganizma say lar n n belirlenmesinde ekimlerin 0,1 er ml yap ld dikkate al narak, bulunan de erler seyreltim faktörü yan nda 10 ile de çarp larak örne in gram veya mililitresindeki mikroorganizma say s olarak belirtilir. (kob/gram)

Not. Staphylococcus aureus gibi baz bakterilerin analizlerinde 3 ayr petriye toplam 1 ml (0,3ml, 0,3ml ve 0,4ml) ekim yap lmas ve sonuçlar n tek bir petri kutusu gibi de erlendirilmesi gerekmektedir (FDA, 1998).

1.6.1.3. Spiral plak yöntemi

Besiyeri içeren petri kutular na spiral eklinde ("Archimedes" spiral), konsantrasyon merkezden kenarlara do ru seyrelecek ekilde ekim yap lmaktad r. Bu yöntemde agarl besi ortam n n her bölmesine b rak lan s v miktar bellidir. nkübasyonu takiben say m sisteme ait bir ablon kullan larak gözle veya lazerle çal an elektronik say c larla yap l r

(Fung, 1995). Yöntem çe itli g da maddelerinde bakteri, maya ve küf analizlerinde AOAC (Association of Official Analiytical Chemists)

11

taraf ndan onaylanm , APHA (American Public Health Assocation) ve FDA taraf ndan da önerilen bir yöntemdir (Karwoski, 1996).

Spiral plak yönteminde ayn petride oldukça geni aral ktaki seyreltim sonuçlar n bir arada görmek mümkündür (500 ile 500 000 kob/ml gibi). Yöntemin ba l ca avantajlar mikrobiyolojik analizlerde ekim i lemlerinin kolayla t r lmas , tekrar say s n n azalmas , kültür ortam tüketiminin %61, petri sarfiyat n n %83 oran nda azalmas olarak s ralanmaktad r (Grappin ve Piton, 1995; Harrigan, 1998).

1.6.1.4. Mem bran filt rasyon tekni i

Membran filtrasyon yöntemi ile klasik say m yöntemlerinden farkl olarak çok daha fazla miktarlarda örnek analize al nabilmekte, dolay s yla örnekte mikroorganizma yükünün çok dü ük düzeylerde olmas durumunda da mikroorganizma say s n n saptanabilmesi mümkün olmaktad r. Membran filtrelerin yap s selüloz asetat, selüloz nitrat veya selüloz ester kar mlar d r. Membran filtrelerin gözenek büyüklükleri 10 nm ile 8 µ m aras nda de i mektedir. Mikrobiyolojik analizlerin ço unlu unda 0,3-0,7 µ m gözenekli filtreler kullan lmaktad r. Örnek do rudan veya seyreltilerek membran filtreden vakum alt nda süzülür, membran n yüzeyinde kalan bakteriler membrana uygun bir besiyeri veya besiyeri emdirilmi absorban ped üzerinde inkübe edilerek saptanmaktad r. Besiyerinden besin elementlerini absorbe eden filtre üzerinde mikroorganizmalar geli me göstermektedirler. Standart besiyerlerinden farkl olarak membran filtrasyon için geli tirilmi besiyerleri vard r. Membran filtreler su, içecekler, eker çözeltileri ve havan n rutin mikrobiyolojik analizlerinde kullan lmaktad r (Harrigan, 1998).

Yöntem, su ve berrak içeceklerin analizlerinde ba ar ile kullan labilmektedir. Kat g dalar n analizlerinde ise seyreltim çözeltisi içindeki partiküller filtrenin t kanmas na neden olabilmektedirler. Bu dezavantajlar n giderilebilmesi için ön filtreler geli tirilmi tir.

12

1.6.2. En Muhtem el Say Yöntem i

G da maddesi 1:10 oran nda % 0.1 lik peptonlu su ile homojenize edilir (10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3,...). Her bir seyreltimden içinde s v kültür ortam bulunan üçer/dörder/be er/onar tüpe 1 er ml inokule edilir. noküle edilen tüp say s artt kça analizin hassasiyeti artmaktad r. Ancak uygulamada yayg n olarak üçlü tüp yöntemi uygulanmaktad r. Ara t r lmakta olan mikroorganizma için tipik geli me gözlenen (bulan kl k, gaz olu umu, renk de i imi vb.) tüplerin say s kaydedilir (FAO, 1992; FDA, 2002; Harrigan, 1998).

Üründe mikroorganizma say s dü ük düzeyde ise tüplere daha fazla miktarda örnek ilave ederek, mikroorganizma say s n tespit etmek mümkün olabilmektedir. Bu durumda s v örneklerde tüplere ilk seyreltim yerine örne in kendisinden 1 er ml (100) ekim yap labilmektedir. Kat örneklerin ise ilk seyreltimlerinden 10 ar ml al narak içinde 10 ml çift güçlü s v besiyeri (orijinal besiyerinin iki misli konsantrasyonunda) bulunan üç veya be tüpe 10 ar ml, tek güçlü 10 ml s v besiyeri bulunan di er üçlü (veya be li) seriler halindeki tüplere ilk ve ileri seyreltimlerden 1 er ml ekimler yap larak uygun ko ullarda inkübe edilir.

Seyreltim oranlar dikkate al narak En Muhtemel Say (EMS) (Most Probable Number=MPN) Çizelgelerinden örnekteki mikroorganizma say s bulunur (FAO, 1992; FDA, 2002; Harrigan, 1998). Seyreltim say s n n üçten fazla oldu u ekimlerde EMS Çizelgesinden seyrelti seçiminde izlenecek yol örneklenerek a a da verilmi tir (FDA, 1998).

Örnek 1 g (100)

0,1 g (10-1)

0,01 g (10-2)

0,001 g (10-3)

0,0001 g (10-4)

Pozitiflerin Kombinasyonu

EMS/g

A 5 5 1 0 0 5-1-0 33

B 4 5 1 0 0 5-1-0 33

C 5 4 4 1 0 4-4-1 40

D 5 5 5 5 2 5-5-2 5400

13

1.6.3. H zl Analiz Yöntemleri

Yeni geli tirilen besiyeri formülasyonlar (MUG, kromojenik agarlar vb.) daha k sa süreler içinde sonuç al nmas na olanak tan maktad r (Boer, 1998; Bridson, 1998).

1.6.4. Yöntem Seçimi

G dalar n laboratuar analizlerinde kullan lan yöntemler farkl l klar gösterebilmektedir. Yöntem seçiminde uluslararas standartlardan (ISO, BSI vb.) uluslararas resmi kurulu lar taraf ndan yay nlanm kitaplardan, veya uluslararas hakemli dergilerde yay nlanm makaleler gibi kaynaklardan yararlan lmal d r. Bu amaçla yararlan labilecek baz kaynaklar a a da verilmi tir:

APHA. 1978. Standart Methods for the Examination of Dairy products . 14th APHA, Washington, D.C.

APHA. 1993. Standart Methods for the Examination of Dairy products 16th Ed. APHA, Washington, DC.

De Boer, E. 1998. Update on media for isolation of Enterobacteriaceae from foods. International Journal of Food Microbiology 45, 43-53

FAO, 1992. Manual of Food Quality Control. 4. Rev. 1. Microbiological Analysis . Food and Agricultural Organization of the United Nations, Rome.

FDA, 1998. Bacterial Analytical Manual . 8th ed., Revision A. AOAC International, Washington D.C.

Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology . Academic Press, San Diego.

ICMSF. 1986. Microorganisms in Foods. 2. Sampling for Microbiological Analysis: Priciples and Specific Applications . 2nd. ed. University of Toronto Press, Toronto.

Pitt, J.I., Hocking, A.D. 1997. Methods for isolation, enumeration and identification. Fungi and Food Spoilage . s. 21-57. Blackie Academic and Professional. London.

Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg, O. 1995. Methods for the detection and isolation of food-borne fungi.

14

Introduction to Food-Borne Fungi . (Ed. Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg, O. ) s. 235-242 Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn.

Konu ile ilgili Türkçe kaynaklar aras nda Türk Standartlar Enstitüsü nün ilgili standartlar ve bu konuda haz rlanm eserlere ba vurulabilir. Bu amaçla yararlan labilecek baz kaynaklar a a da verilmi tir:

Borcakl , M., Kalafato lu, H., Aran, N., Topal,, ., Karaku , M. 1994. G dalarda Temel Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri , TÜB TAK-MAM, G da ve So utma Teknolojisi Bölümü Yay nlar , Yay n No. 128, Gebze-Kocaeli.

Halkman, A., Akçelik, M.A. 1999. G dalar n mikrobiyolojik analizi 1. Temel ilkeler. G da Mikrobiyolojisi ve Uygulamalar . s. 105-126. Ankara Üniversitesi Ziraat

Fakültesi, G da Mühendisli i Bölümü. Armoni Matbaac l k Ltd. ti., Ankara

Halkman G dalar n Mikrobiyolojik Analizi 2. Mikroorganizma say m . G da Mikrobiyolojisi ve Uygulamalar . s. 127-146. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi, G da Mühendisli i Bölümü. Armoni Matbaac l k Ltd. ti., Ankara

Halkman, A.K. G da Mikrobiyolojisi Laboratuar ; Genel Bilgiler. G da Mikrobiyolojisi ve Uygulamalar . s. 91-104.Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi, G da Mühendisli i Bölümü. Armoni Matbaac l k Ltd. ti., Ankara

1.6. 5. Baz G da Gruplar çin Önerilen Mikrobiyoloj ik Analizler

G da maddelerine uygulanacak mikrobiyolojik analizlerin seçiminde ilgili ulusal ve uluslararas standartlardan yararlan lmal d r. A a da baz g da gruplar için önerilen mikrobiyolojik analizlere ait örnekler verilmi tir (Fung, 1995).

G dalar Mikroorganizmalar

Do al Maden Sular

Koliform bakteri Fekal streptokok (enterokok) Anaerobik sülfit indirgeyen bakteri sporlar

Süt ve Süt Ürünleri Peynir Koliform bakteri

Fekal koliform bakteri Patojenik stafilokok Salmonella

15

Süt Tozu Aerobik mezofilik bakteri Koliform bakteri

Dondurma Aerobik mezofilik bakteri Koliform bakteri Fekal koliform bakteri Staphylococcus aureus Salmonella spp.

Et ve Et Ürünleri Aerobik mezofilik bakteri (dondurulm u / so utulm u ) Anaerobik sülfit indirgeyenler

Salmonella spp.

K ym a Aerobik mezofilik bakteri Fekal koliform bakteri Staphylococcus aureus Anaerobik sülfit indirgeyenler Salmonella spp.

Tavuk Eti Aerobik mezofilik bakteri Kemiksiz parça et Fekal koliform bakteri

Staphylococcus aureus Anaerobik sülfit indirgeyenler Salmonella spp.

Bal k Filetosu Aerobik mezofilik bakteri ( taze/ so utulm u ) Fekal koliform bakteri

Staphylococcus aureus Anaerobik sülfit indirgeyenler Salmonella spp.

Kabuklu su ürünleri Fekal koliform bakteri Fekal streptococci Salmonella spp.

Derin Dondurulm u Sebzeler Aerobik bakteri Koliform bakteri Fekal koliform bakteri Anaerobik sülfit indirgeyenler Staphylococcus aureus Salmonella spp. Maya Küf

16

Haz r Yem ekler Aerobik mezofilik bakteri Koliform bakteri Fekal koliform bakteri

Anaerobik sülfit indirgeyenler Staphylococcus aureus Salmonella spp.

Baz g da gruplar nda ve farkl kaynaklarda bu analizler d nda Bacillus cereus, Enterobacteriaceae, Listeria monocytogenes ve Vibrio parahaemolyticus da yer almaktad r.

Yararlan lan Kaynaklar

Anon. 1988. New bacteria in the news. Food Technology (8) 16-26 APHA. 1978. Standart Methods for the Examination of Dairy products .

14th APHA, Washington, D.C. APHA. 1978. Standart Methods for the Examination of Water and

Waste Water . APHA, Washington, D.C. APHA. 1993. Standart Methods for the Examination of Dairy products .

16th Ed. APHA, Washington, DC. Aran, N. 1993. G da kaynakl mikrobiyal toksinler. G da Sanayii 7 (1)

31-46. Aran, N. 1997. G dalar n mikrobiyolojik analiz yöntemlerinde son

geli meler . G da Teknolojisi 1 (10) 55-64. Austwick, P.K.C. 1984. Human mycotoxicoses in the past, present and

future. Chemistry and Industry.6, 547-551. Bell, R.G., Gill, C.O. 1990. Microbiological Applications in Food

Biotechnology. Elsevier Applied Science, London. Borcakl , M., Kalafato lu, H., Aran, N., Topal,, ., Karaku , M. 1994.

G dalarda Temel Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri , TÜB TAK-MAM, G da ve So utma Teknolojisi Bölümü Yay nlar , Yay n No. 128, Gebze-Kocaeli.

Bouergeois, C.M., Cleret, J.J. 1995. Basic principles of industrial Microbiology testing and uses of its findings. Microbiological Control for Foods and Agricultural Products (Ed. D.Y.C.Fung). s. 23-34. VCH Publishers Inc., New York.

Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8th Edition . Oxoid Ltd., Hamshire.

Bullerman, L.B. 1986. Mycotoxins and food safety. Food Technology (7) 59-85.

Doyle, M.C., Beuchat, L.R., Montville, T.J. 1997. Food

17

Microbiology, Fundamentals and Frontiers . ASM Press, Washington, D.C.


FDA, 1998. Bacterial Analytical Manual , 8th ed., Revision A. AOAC International, Washington, D.C.

Forsythe, S.J., Hayes, P.R. 1998. Food Hygiene, Microbiology and HACCP . Aspen Publication, Gaithersburg.

Fung, D.Y.C. 1995. Control for Foods and Agricultural Products . VCH Publishers Inc., New York.

Giese, J 1999 Developments in rapid microbial testing. Food- Technology 53 (5) 88, 89, 91.


ICMSF, 1978. Microorganisms in Foods . Vol. 1. University of Toronto Press, Toronto

ICMSF. 1986. Microorganisms in Foods. 2. Sampling for Microbiological Analysis: Priciples and Specific Applications , 2nd. University of Toronto Press, Toronto.

Jay, J.M. 1986. Microbial spoilage indicators and metabolites. "Foodborne Microorganisms and Their Toxins". (Ed. M.D. Pierson, N.J. Stern). s. 219-241. Marcel Dekker, New York.

Karwoski, M. 1996. Automated direct and indirect methods in food microbiology: a literature review. Food Review International, 12 (2) 155-174.

Mortimore, S., Wallace, C. 1994. HACCP: A Practical Approach . Chapman & Hall, London

Pierson, M. D, Stern, N.J. 1986. Foodborne microorganisms and their toxins: Developing Methodology . Marcel Dekker, New York

Sheridan, J.J. 1995. The role of indicator systems in HACCP operations. Journal of Food Safety 15, 157-180.

Snyder, O.P. 1986. Microbiological quality assurance in foodservice operations. Food Technology 40 (7) 122-130.

Snyder, O.P. 1993. Developing a total quality management based food safety programme for a chilled food system. Cleveland Range, Inc. and Hospitality Institute of Technology and Management, Cleveland.

Tunail, N. 1999. Mikrobiyal enfeksiyonlar ve intoksikasyonlar. G da Mikrobiyolojisi s. 59-90. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi, G da Mühendisli i Bölümü. Armoni Matbaac l k Ltd. ti., Ankara

18

2. Aerobik Bakteri Say m

Toplam bakteri say s ürünün genel mikrobiyolojik kalitesi, raf ömrü ve üretim s ras ndaki hijyen ko ullar n n belirlenmesinde kriter olarak önem ta maktad r (FAO, 1992).

2.1. Standard Plate Count Agar (APHA) (CM463) Besiyerinde Toplam Bakteri Say m

*

Standard Plate Count Agar (APHA)(CM463) besiyerinden 23,5 gram tart l r, 1 litre dam t k su içinde s t larak eritilir ve uygun miktarlarda erlenlere da t l r. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; 50 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda steril petrilere dökülür.

G da maddesi 1:10 oran nda % 0,1 lik peptonlu su ile homojenize edilir (10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3,...). Her seyreltimden besi ortam içeren steril petrilere 0,1-0,5 ml al narak yayma plak yöntemiyle ekim yap l r. Ekimi yap lan petriler 32-35 C de 48 saat inkübasyona b rak l r.

nkübasyon bitiminde besiyerinde üreyen koloniler say l p seyreltim faktörü ile çarp larak bakteri say s saptan r.

2.2. Plate Count Agar (CM325) Besiyerinde Toplam Bakteri Say m

Plate Count Agar (CM325) besiyerinden 17 gram tart l r, 1 litre dam t k su içinde s t larak eritilir ve deney tüplerine (12-15 ml) bölünür. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; Besiyeri 45 C ye so utulur.

* Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8th Edition. Oxoid Ltd., Hampshire

Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8th Edition. Oxoid Ltd., Hampshire

19

G da maddesi 1:10 oran nda % 0,1 lik peptonlu su ile homojenize edilir (10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3,...). Her seyreltimden bo steril petrilere 1 ml al narak üzerine 50 C ye so utulmu 15ml besiyeri dökülür. Ekimi yap lan petriler 32-35 C de 48 saat inkübasyona b rak l r.

nkübasyon bitiminde besiyerinde üreyen koloniler say l p seyreltim faktörü ile çarp larak bakteri say s saptan r.

Not. Farkl inkübasyon s cakl klar uygulanarak sonuçlar aerobik mezofilik bakteri ( 30-37°C / 48 - 72 saat), aerobik psikrofilik bakteri (5-7°C / 7-10 gün), aerobik termofilik bakteri (45°C / 48 - 72 saat veya 55°C / 48 saat) olarak belirtilebilmektedir (APHA, 1978)

Süt ve süt ürünlerinde bakteri say m nda besiyerine %1 lik ya s z süt tozu kat lmas önerilmektedir. Kullan lan ya s z süt tozunun antibiyotiksiz olmas önemlidir. Bu amaçla besiyeri içerisine Skim Milk Powder (L31) kat labilmektedir ya da içeri inde Antibiyotiksiz ya s z süt bulunan Milk Plate Count Agar (CM 681) kullan labilir.


APHA. 1978. Standart Methods for the Examination of Dairy products . 14th APHA, Washington, D.C.


20

3. Enterobacteriaceae Grubu Bakteriler ve Analiz

Yöntemleri

Enterobacteriaceae

familyas safra tuzlar (bile salts) mevcudiyetinde

geli en ve glukozdan asit olu turan bakteriler olarak tan mlanmaktad r. Escherichia ve Enterobacter gibi baz grup üyeleri laktozu da fermente edebilmektedirler. Toplam Enterobacteriaceae say s ile fekal kontaminasyon aras nda yak n bir korelasyon oldu u saptanm t r (Harrigan,1998). Enterobacteriaceae familyas Citrobacter, Escherichia, Enterobacter, Edwardsiella, Erwinia, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Salmonella, Serratia, Yersinia, Vibrio, Aeromonas ve Plesiomonas cinsi bakterileri içermektedir. (Ray, 1996).

Koliform bakteriler

Enterobacteriaceae familyas içinde yer alan indikatör organizmalar olarak tan mlanmaktad rlar. Koliform grubu organizmalar brillant green lactose bile broth ta laktozdan 37°C de 48 saatte asit ve gaz olu turan bakterilerdir. Klebsiella ve Citrobacter de ayn özelliklere sahip olmalar na kar n Escherichia coli ve Enterobacter aerogenes

ba l ca koliform organizmalar olarak dikkate al nmaktad r. Escherichia

coli insan ve di er s cak kanl hayvanlar n ba rsaklar nda, Enterobacter

aerogenes bitkilerde (ender olarak ba rsakta) bulunurlar.

Fekal koliformlar ise 44,5

0,2°C de EC ortam nda laktozdan asit ve gaz olu turan bakteriler olarak tan mlanmaktad r. Inkübasyon s cakl çok kritik olup, test su banyosunda gerçekle tirilmelidir G dalarda fekal kontaminasyonun indikatörü olarak Escherichia coli bakterisi aranmaktad r. E. coli metil red pozitif, Voges-Proskauer negatiftir; sitrat karbon kayna olarak kullanamaz. Indol pozitif tipleri E. coli tip 1 olarak adland r l r. Entropatojen E. coli türleri klasik koliform bakteri analizleri ile de il, özel analiz yöntemleri ile saptanmaktad r (Harrigan, 1998; Forsythe ve Hayes, 1998; FAO, 1992 )

Enterobacteriaceae ve koliform grubu bakteri analizleri ile g dalar n hijyenik ko ullarda i lenip i lenmedi i konusunda de erlendirme

21

yap labilmektedir. Is l i lem görmü g dalarda bu grup organizmalar n bulunmalar (Harrigan, 1998): (i) ba lang ç bakteri say s n n yüksek olmas

nedeniyle s l i lem

uygulamas n n yetersiz kald n , (ii) s l i lem sonras ortam ko ullar n n bakteri say s n n tekrar

artmas na uygun oldu unu, (iii) s l i lem sonras kontaminasyon olu umunu ifade etmektedir.

3.1. Toplam Enterobacter iaceae Say m Yöntem i *

1. G da maddesi 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir ve ayn ekilde ileri seyreltimleri (10-2, 10-3...) yap l r.

2. Her seyreltimden steril petrilere 1 er ml konur, üzerlerine 15 ml 45°C ye so utulmu Violet Red Bile Glucose Agar VRBGA (CM 485) dökülür ve inokulum ile kar m sa lan r.

3. Kar m n kat la mas beklenir ve kat la m yüzeyi tamamen kaplayacak ekilde 5 ml 45°C ye so utulmu VRBGA eklenir. Kat la t ktan sonra ters çevrilen petriler önerilen s cakl k derecesinde inkübe edilirler. ISO standartlar nda belirtilen inkübasyon s cakl klar 35-37°C dir. Ancak baz Enterobacteriaceae familyas üyeleri 35°C ve üzerinde iyi geli me gösteremezler. Bu durumda 30°C de inkübasyon sonucunda daha yüksek bakteri say m sonuçlar elde edilebilmektedir. Gerek görüldü ü takdirde istatiksel bir çal ma ile ürüne uygun inkübasyon s cakl belirlenebilir.

Not. VRBGA agarda koliform bakteriler 1-2 mm çap nda, çevrelerinde mor renkli zon bulunan tipik koloniler olu tururlar. Koloni çaplar genellikle 1-2 mm olmakla beraber çe itli faktörlere ba l olarak de i iklik gösterebilirler, bu nedenle k rm z renkli tüm koloniler say l r (Bridson, 1998).

* ISO 7402: 1993

22

3.2. Koliform Bakteri ve Escherichia coli Analizleri

Koliform organizmalar n varl laktozdan asit ve gaz olu umu ile saptanmaktad r. nkübasyon s cakl tart mal d r ancak 30-37°C aras ndaki s cakl klar yayg n olarak uygulanmaktad r. Koliform bakteri analizlerinde Violet Red Bile Agar VRBA (CM 107), Lauryl Sulphate Tryptose Broth LST (CM 451) , Brillant Green Bile 2% Broth BGLB (CM 031) ve MacConkey Broth(CM 005) gibi besiyerleri kullan lmaktad r (Harrigan, 1998).

Koliform bakteri ve E. coli saptanmas nda yararlan lan h zl test yöntemleri aras nda MUG ilaveli besiyerleri (Modified Lauryl Sulphate Tryptose Broth with MUG - CM 967; FAO, 1992; FDA, 2002) ile kromojen içeren kültür ortamlar (Selective E. coli / Coliform Chromogenic Medium-CM1046, Tryptone Bile X-Glukuronide Medium-CM 945) (Bridson, 1998) da yer almaktad r.

3.2.1. En Muhtem el Say Yöntem i ile Koliform Bakter i ve Escherichia coli Analizleri

FAO (1992), FDA (2002) ve ISO (4831:1991) taraf ndan önerilen koliform bakteri yöntemi Lauryl Sulphate Tryptose Broth ta tahmin, Brillant Green Bile Broth ta do rulama, fekal koliform bakteri yöntemi ise bu testleri takiben 45

0,2°C de EC Broth da inkübasyon testlerini içermektedir. Yöntemin ayr nt lar a a da verilmi tir:

1. G da maddesi 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir ve ayn ekilde ileri seyreltimleri (10-2, 10-3... ) yap l r.

2. Her seyreltimden 10 ar ml Lauryl Sulphate Tryptose Broth içeren üçer tüpe 1 er ml ekim yap l r. Ekim yap lan tüpler 35-37°C de 24-48 saat inkübe edilir (24 saat sonunda gaz olu an tüpler kaydedilir, negatif olanlar 24 saat daha inkübe edilir). Gaz olu umu gözlenen LSTB tüplerinden 10 ar ml Brilliant Green Bile Broth içeren tüplere birer öze dolusu ekim yap l r, tüpler 35-37°C de 24-48 saat inkübe edilir. BGLB ortam nda gaz olu umu koliform bakterilerin mevcudiyetini do rular ve pozitif tüplerin say s kaydedilir.

23

3. Fekal koliform bakteri analizi için pozitif BGLB tüplerinden a a da belirtilen ortamlara öze ile ekimler yap larak inkübasyona b rak l r (Eijkman test). Pozitif sonuçlar genellikle E. coli mevcudiyetini ifade etmektedir:

(i) EC ortam su banyosunda 45,5

0,2°C de 24 saat

inkübe edilir; veya (ii) BGLB 44,0

0,1°C de 24 saat inkübe edilir.

4. Gaz olu umu gözlenen tüplerin say s kaydedilir (Deneylerde inokule edilecek s v ortamlar n önerilen inkübasyon derecelerinde olmalar önerilmektedir). Rutin çal malarda Eijkman testi indol testi ile desteklenerek E. coli tip 1 44-45°C de saptanabilmektedir. Bu amaçla tripton (veya triptoz) (10 g/L) ve sodyum klorür (5 g/L) içeren s v ortama ekim yap larak 24 saat inkübasyona b rak l r ve indol testi uygulan r.

Not.1. Modified Lauryl Sulphate Tryptose Broth (CM 967) ortam triptofan da içermektedir. Bu nedenle inkübasyon bitiminde besiyerine Kovac s ay rac eklenerek indol reaksiyonu da gözlenebilmektedir (Harrigan, 1998). Not 2. Koliform bakterilerin tür düzeyinde belirlenebilmeleri için ekimler yap larak saf kültür elde edilir. Bu amaçla pozitif EC tüplerinden Eosin Methylene Blue (EMB) Agar(CM 069) gibi tipik geli me gözlenebilecek kat besi ortamlar na ekim yap l r. nkübasyondan sonra üpheli E.coli kolonileri (5 adet) e ik Plate Count Agar(CM 325) a aktar l r. 35°C de 18-24 saatlik inkübasyondan sonra safla t r lan kültürlere IMVIC testi (Indol, metil red, Voges-Proskauer ve citrate) uygulan r (FDA, 2002).

BGLB de pozitif sonuç veren tüplerin say s dikkate al narak örnekteki koliform bakteri, EC broth ta pozitif sonuç veren tüplerin say s dikkate al narak örnekteki fekal koliform bakteri miktar En Muhtemel Say Çizelgelerinden (EMS) hesaplan r (FAO, 1992; FDA, 2002; Harrigan, 1998).

Gram boyama sonucunda Gram negatif, k sa çubuk olarak görülen tüm kültürler IMViC testleri ile kontrol edilmelidir.

24

Indol Testi Safla t r lm kültürden Tryptone Water Broth içeren tüplere ekim yap l r ve tüpler 35°C de 24 2 saat inkübe edilir. 0,2-0,3ml Kovac s Reaktifi damlat larak indol olu umu test edilir. Broth yüzeyinde olu en keskin bir k rm z renk, testin pozitif oldu unu gösterir.

Voges-Proskauer (VP) MR-VP tüplerini inoküle edilir ve 35°C de 48 2 saat inkübe edilir. nokülumdan 1ml al n r 13x100mm lik tübe aktar l r. 0,6ml -naphtol

solüsyonu ve 0,2ml %40 l k KOH eklenir ve çalkalan r. Birkaç kristal kreatin ilave edilir. Çalkalay p 2 saat kendi haline b rak l r. Eosin pembesi rengi olu umu pozitif olarak kaydedilir.

Methyl-Red (MR) VP testinden sonra MR-VP tüpleri ayr ca bir 35°C de 48 2 saat daha inkübe edilir. Her bir tüpe 5 damla methyl red solüsyonu eklenir. Keskin k rm z renk olu umu pozitif, sar renk ise negatif sonucu göstermektedir.

Sitrat testi Koser Citrate Broth bulunan tüplere yo un olmayacak ekilde ekim yap l r. Bulan kl k olmas ndan kaç n l r. 35°C de 96 saat inkübe edilir. Bulan kl k olu mas pozitif olarak de erlendirilir(FDA,2002). Yo un ekimlerde kar la labilecek yanl pozitif sonuçlardan kaç nmak için Simmons Citrate Agar (CM 655) kullan labilir. Bu agar Koser Citrate Medium un kat la t r lm halidir. Ayr ca Bromothymol blue indikatörü ilavesi ile pozitif sonucun net ekilde görülmesini sa lar. E ik agara yüzeye çizme yöntemi ile ekim yap l r. Pozitif üreme bazik reaksiyon verir ve besiyerinin rengini parlak ye ilden maviye dönü türür. Negatif sonuçta besiyerinin rengi ayn kal r. (The Manual,1998)

25

3.2.2 MUG laveli Besiyerler i ile H zl Escherichia coli

Say m Yöntem leri

MUG Escherichia coli saptanmas nda kullan lan flöresan veren bir reaktiftir. Oxoid MUG(BR071), 4-methylenebelliferyl- -D-glucuronide subsrat n n 50 mg l k liyoflize formudur.

Besiyerlerinde önerilen MUG konsantrasyonu a a da belirtilmi tir:

Violet Red Bile Agar (CM107) 100 mg/litre MacConkey Agar 100 mg/litre Brillant Green Bile (%2) Broth (CM31) 50 mg/litre MacConkey Broth Purple (CM005) 50 mg/litre Lauryl Tryptose Broth (CM451) 50 mg/litre

Bu besiyerlerine sterilizasyon öncesi ilave edilebilen MUG, E. coli analizlerinde hassasiyeti art rmaktad r. Hassasiyetin yüksek olu u kar k kültürlerdeki anaerogenic(gaz negatif) E. coli türlerinin saptanmas na ba l d r. Formülde bulunan 4-methylenebelliferyl- -D-glucuronide (MUG), -glucuronidaz enzimi taraf ndan parçalan r, UV (ultraviole) (366 nm) alt nda mavi/ye il bir floresans veren bir florofor olan 4-methylumbelliferon aç a ç kar. (Bridson, 1998).

Not. FAO (1992) ve FDA (2002) taraf ndan önerilen standart yöntemlerde de MUG içeren Lauryl Sulphate Tryptose Broth (LST) yer almaktad r. MUG içeren kat besiyeri olarak da VRBA kullan labilece i belitilmektedir (FDA, 2002).

3.2.2.1. Modified Lauryl Sulphate Tryptose Broth (LSTB) with

MUG (Oxoid CM 967) Besiyerinde Koliform Bakteri ve

E. coli Say m *

Tek Güçlü: MUG içeren LST (CM 967) besiyerinden 36,7 gram tart l r, 1 litre dam t k su içinde s t larak eritilir, oda s cakl na so utulduktan sonra durham tüpleri içeren deney tüplerine 10 ar ml da t l r. Tüpler 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.

26

Çift Güçlü: MUG içeren LST (CM 967) besiyerinden 73,4 gram tart l r, 1 litre dam t k su içinde s t larak eritilir, oda s cakl na so utulduktan sonra durham tüpleri içeren büyük deney tüplerine (30-40 ml kapasiteli) 10 ar ml da t l r. Tüpler 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.

lem

1. G da maddesi 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir ve ayn

ekilde ileri seyreltimleri (10-2, 10-3...) yap l r. Her seyreltimden üç veya be adet MUG lu 10 ml LSTB içeren tüplere 1 er ml ekim yap l r ve 30°C de 24-48 saat inkübe edilir Üründeki dü ük bakteri say lar n da saptayabilmek için izlenecek yol çift güçlü LSTB kullan m d r (Bkz. S11).

Sularda koliform bakteri analizlerinde içinde 10 ml çift güçlü Lauryl Tryptose Sulphate Broth bulunan üç veya be tüpe 10 ar ml, tek güçlü 10 ml Lauryl Tryptose Sulphate Broth içeren üç tüpe -veya be tüpe- 1 er ml, di er tek güçlü 10 ml Lauryl Tryptose Sulphate Broth içeren üç tüpe -veya be tüpe- 0,1 er ml ekimler yap larak, analize devam edilmektedir (APHA;1978).

* Oxoid Culture Media Modified Lauryl Sulphate Tryptose Broth Folio No. 653

27

nkübasyon bitiminde tüpler bulan kl k ve gaz mevcudiyeti, floresan ve indol olu umu yönünden de erlendirilir. Tüplerdeki bulan kl k ve gaz olu umu olas koliform varl n , floresan gaz ve indol olu umu olas E.

coli varl n ifade eder.

Alkali pH floresan n iddetini art rmaktad r; bu nedenle gaz olu an tüplere 0,5 ml 0,5 N NaOH ilave edilerek pH nötralize edilmelidir. Uzun dalga boyunda (365 nm-6 watt l k) UV lamba alt nda tüplerde floresan olu umu kontrol edilir.

Floresan veren pozitif tüplere 0,5 ml Kovac s ay rac damlat larak kar t r l r ve 1 dakika sonra olu an k rm z halka indol pozitif olarak de erlendirilir.

Her grup içinde gaz olu an tüpler kaydedilerek kullan lan tüp say s na göre üç veya be li tübe ait EMS Çizelge lerinden koliform bakteri say s belirlenir.

Not 1. Örnekler son seyreltim tüplerinden en az birinde negatif sonuç al nacak ekilde seyreltilmelidir Not 2. Baz camlara üretim s ras nda kalite kontrol amac yla cerium oxide ilave edilmekte, bu tip cam tüpler UV alt nda kendili inden floresans vermektedir. Bu nedenle kullan lan cam tüpler deney öncesi kontrol edilmeli ve floresans veren cam tüpler kullan lmamal d r (FDA, 2002).

3.2.2.2. Violet Red Bile Agar with MUG (CM 978) besiyerinde

Escherichia coli say m *

VRBA (CM107) besiyerinden 38,6 gram tart l r, 1 litre dam t k su içinde kaynat larak eritilir, (otoklavda sterilize edilmez) ve 48 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda petrilere dökülür.

* Oxoid Culture Media VRBA with MUG Lauryl Tryptose Broth with MUG Oxoid

Folio No. 655,

28

MUG çeren VRBA (CM978) besiyerinden de 38,6 gram tart l r, 1 litre dam t k su içinde kaynat larak eritilir, (otoklavda sterilize edilmez) ve 48 C ye so utulur.

1. G da maddesi 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir ve ayn ekilde ileri seyreltimleri (10-2, 10-3... ) yap l r.

2. Her seyreltimden steril petri kutular na 1 er ml konur, üzerlerine 10-15ml 45°C ye so utulmu Violet Red Bile Agar (VRBA) dökülür ve kar m sa lan r. Kar m n kat la mas beklenir, daha sonra kat la m yüzeyi tamamen kaplayacak ekilde 45°C ye so utulmu MUG içeren 5-10 ml VRBA eklenir. Kat la t ktan sonra ters çevrilen petriler süt ürünleri için 32 C, di er ürünler için 35 C de 18-24 saat inkube edilir.

Laktoz pozitif bakteriler < 0,5-2,0 mm çap nda mor (koyu k rm z ) renkte, çevrelerinde ayn renkte zon bulunan tipik koloniler olu tururlar. Ayn petriler 366 nm dalga boyunda UV lambas alt nda incelenir, floresan veren koloniler E.coli olarak de erlendirilir.

Kolonilerin Koliform oldu unu do rulamak için en az 10 koloninin her biri BGLB broth içerisine al n r. Tüpler 35 C de 24-48 saat inkube edildikten sonra gaz olu umu kontrol edilir.

29

Not: Gaz pozitif tüplerde pelikül olu ursa gaz olu umunun Gram pozitif, laktozu fermente eden basillerden kaynaklanmad ndan emin olmak için Gram boyama yap l r.

3.2.3. Kromojenik Besiyerlerinde Koliform Bakteri ve

Escherichia coli Analizleri

3.2.3.1. Chrom ogenic E. coli / Coliform Medium (CM956) da

Escherichia coli Say m *

Chromogenic E.coli / Coliform Medium besiyeri E. coli ve di er koliformlar n ay rdedilmesi için -glukuronidaz ve -galactozidaz enzimlerine spesifik kromojenik iki substrat içermektedir. Besiyerinde kromojene ba l olarak ekerler bulunmakta, bu ekerler bakteri hücresi taraf ndan tüketilmek üzere hücre içine al nmaktad r. Hücre içine al nan kromojen- eker molekülündeki ekerler enzimler taraf ndan parçalan r, renkli kromojen hücre içinde birikir. Kromojen eker komplekslerinden biri E.coli nin % 97 sinin üretti i -glukuronidaz enzimi taraf ndan parçalanarak kolonilerin mor renk almas n sa larken, di er kromojen eker kompleksi koliformlar n büyük ço unlu unun üretti i -

galaktozidaz enzimi taraf ndan parçalanarak kolonilerin pembe renk almas n sa lar. Bu nedenle E.coli su lar mor renkte gözlenirken, koliform bakteriler pembe renkte, geli me gösterebilen di er organizmalar ise renksiz olarak gözlenmektedir.

Chromogenic E.coli / Coliform Medium (CM 956) besiyerinden 55,8g tart l r, 1 L dam t k su içinde s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; 50 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda petrilere dökülür.

G da maddesi 1:5 veya 1:10 oran nda 0,1% (a rl k/hacim) steril peptonlu su (CM9) ile homojenize edilir. Bu seyreltimlerden besiyerleri üzerine 0,5 veya 1 ml aktar larak yüzeye sürme yöntemi ile ekim yap l r.

30

Petriler 18-24 saat 37 C de inkübasyona b rak l r. nkübasyon sonras besiyerinde üreyen mor ve k rm z /pembe koloniler say l p seyreltim faktörü ile çarp larak koliform bakteri, mor koloniler say l p seyreltim faktörü ile çarp larak E.coli miktar bulunur.

3.2.3.2. Selective E. coli / Coliform Chromogenic Medium

(CM1046) da Escherichia coli Say m

Selective E.coli/Chromogenic Besiyeri (CM 1046) de iki kromojen içerir: Pembe renkli Rose Gal kromojeni : -galactosidase aktivitesini tespit eder. Mavi renkli X-Glu kromojeni : -glucuronidase aktivitesini tespit eder. Koliformlar Rose-Gal kromojenini parçalad ktan sonra çözünmeyen pembe kromofor hücre içerisinde birikir ve Koliform kolonilerinin pembe renkli görünmesine sebep olur. E.coli türlerinin her iki kromojeni parçalamas tipik kolonilerin (pembe+mavi =) mor renkli görünmesini sa lar.

Chromogenic E.coli / Coliform Medium (CM 1046) besiyerinden 28,1 gram tart l r, 1 litre dam t k su içinde tamam yla çözününceye kadar kaynat l r, 50 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda petrilere dökülür ya da dökme plak yöntemi için 45°C de erimi olarak tutulur.

G da numunesi %0,1 lik steril peptonlu su (CM 009) ile 1:5 ya da 1:10 oran nda seyreltilir ve Stomacher ya da blender yard m ile homojenize edilir. Yüksek düzeyde kontamine olmu su örnekleri, koloni say lar say labilir (örne in 20-100 koloni) olmas amac ile öncelikle Ringer s Solution (BR 052) ya da Maximum Recovery Diluent (CM 733) içerisinde seyreltilmelidir. At k sular santrifüj yard m ile ya da membran filtre kullanarak konsantre edilmelidirler.

A a daki ekim tekniklerinden herhangi biri uygulanabilir:

* Oxoid Culture Media Chromogenic E.coli Coliform Medium, Oxoid Folio No. 536

Oxoid Culture Media Chromogenic E.coli Coliform Medium, Folio.

31

1. Yayma Plak : Haz rlanm petrilerin yüzeyi kurutulur. 0,1ml seyreltilmi numuneyi petri üzerine koyun ve yüzeye yayd r n. Petriler 37°C de 24 saat inkübe edilir.

2. Dökme Plak: 1ml seyreltilmi numuneyi bo bir petri içerisine koyun. 15-20ml haz rlanm ve 45°C ye so utulmu besiyeri üzerine dökülür ve yava ça zemin üzerinde daire çizerek kar t r l r. Petriler 37°C de 24 saat inkübe edilir.

3. Membran Filtrasyon metodu: Haz rlanm petrilerin yüzeyi kurutulur. Uygun miktarda numuneyi filtreden süzdürülür. Membran alt nda hava kabarc kalmayacak ekilde agar yüzeyine yerle tirilir.

Organizma -glucuronidase -galactosidase

Koloni rengi

E.coli + + Mor

Koliformlar - + Pembe

Di er organizmalar

- +

- -

Renksiz Mavi

3.2.3.2. Tryptone Bile X-glukuronide Medium (TBX)(CM945) da

Escherichia coli Say m *

* Trptone Bile X-glucorinide Medium (TBX). Oxoid Folio No. 535

32

G dalardan E. coli izolasyonu ve say m için, Tryptone Bile Agar (TBA) (CM 595) baz al narak geli tirilmi olan kromojenik bir besiyeridir. TBA özellikle donmu g dalar olmak üzere baz g dalardan mikroorganizmalar n daha iyi geri kazan m n sa lamaktad r. Ayr ca laktoz fermentasyonu zay f olan E.coli türlerinin tespitinde de h zl ve do ru sonuç vermesi nedeniyle geleneksel E. coli analiz yöntemlerine alternatif olarak geli tirilmi tir. TBX besiyeri içerisinde TBA n n bu özelliklerine ilaveten glukuronidaz aktivitesini belirleyen 5-bromo 4-chloro-3 indolyl-beta-D-glucuronide (X-glucuronide) kromojeni bulunur. Glukuronidaz enzimi MUG reaktifi taraf ndan belirlenen enzimle ayn olup, E. coli için oldukça spesifiktir. Ancak, özellikle E. coli O157:H7 olmak üzere E. coli türlerinin %3-4 ü glukuronidaz negatiftir. TBX besiyeri içinde serbest hale geçen kromofor MUG dan farkl olarak çözünmez ve hücre içinde birikir. Böylece renkli hedef koloniler kolayl kla ortamda ay rdedilir.

TBX Medium (CM945) besiyerinden 36,6 g tart l r, 1 L dam t k su içinde s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; 50 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda steril petrilere dökülür.

33

G da maddesi 1:5 veya 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir. Bu seyreltimden besiyerleri üzerine 0,5 veya 1 ml aktar larak yüzeye sürme yöntemi ile ekim yap l r. Petriler önce 30 C de 4 saat, daha sonra 44 C de 18 saat inkübasyona b rak l r. nkübasyon süresi bitiminde olu an mavi/ye il koloniler say l r ve seyreltim faktörü ile çarp larak örnekteki E.coli miktar saptan r.



Forsythe, S.J., Hayes, P.R. 1998. Food Hygiene, Microbiology and HACCP . Aspen Publishers, Gaithersburg.



Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology", Academic Press, San Diego.

Ray, B. 1996. Characteristics of predominant microorganisms in food. Fundamental Food Microbiology . s. 10-30.CRC Press, Boca Ralton.

34

4 . Staphylococcus aureus ve Analiz Yöntemleri

Staphylococcus aureus fakültatif aerob, spor olu turmayan Gram pozitif, mikroskop alt nda üzüm salk m eklinde gözlenen bakterilerdir. Is ya dayan kl toksin olu tururlar. Bakteri s l i lemle (66°C/10 dak.) kolayl kla tahrip edilerken, toksin 100°C de (30 dak.) aktivitesini koruyabilmektedir. Kusma, mide kramplar , diyare ve kar n a r s eklindeki zehirlenme semptomlar 2-6 saat aras nda ortaya ç kmakta, 6-

24 saat sürmektedir. nsanlar n %70 inin bo az ve burunlar nda S.

aureus bulundu u, buradan kolayl kla özellikle eller olmak üzere cilde bula t belirtilmektedir. S. aureus hayvanlarda ve sütte de bulunabilmektedir. G dalara genellikle çal an personel vas tas yla (eller, öksürme, hap rma vb. yollarla) geçebilmektedir.

G da zehirlenmesine neden olan g dalar aras nda so uk etler ve di er et yemekleri, sütlü tatl lar, kekler, krema ilk s ralarda yer almakta; çi etlerin de %38 inde saptand belirtilmektedir (Gaman ve Sherington, 1998).

S. aureus bakterilerinin yakla k %50 sinin toksin üretme özelli inde oldu u saptanm t r. Analiz yöntemleri bakteri say s n n tespiti ve enterotoksin analizi olmak üzere ba l ca iki grup alt nda toplanabilmektedir (Forsythe ve Hayes, 1998 s.163). G dalarda S. aureus say s 105/g n üzerine ç kt nda toksin riski olu maktad r (Jablonski ve Bohach, 1997 s. 365).

Baird-Parker besiyeri hasar görmü hücreler de dahil olmak üzere S.

aureus un g dalardan do rudan izolasyonuna olanak tan yan bir ortamd r (Forsythe ve Hayes, 1998). FDA (2002) ve FAO (1992) taraf ndan da önerilen besiyeridir. FAO ve ISO/DIS6888-1 de önerilen yöntemde Baird-Parker da say m takiben do rulama için koagulaz ve termonükleaz testleri yer almaktad r (Harrigan, 1998).

35

4.1. Baird-Parker Agarda (Oxoid CM 275) Staphlococcus aureus Say m *

Baird-Parker Agar, g dalardan Staphylococcus aureus izolasyonu ve say m için seçici bir besiyeridir. Formülü Baird-Parker taraf ndan geli tirilen besiyerine, hasar görmü hücreleri korumak ve üremesine yard mc olmak amac yla sodyum piruvat, tan amaçl madde olarak yumurta sar s emülsiyonu, örnekte mevcut di er bakterilerin geli imlerini önlemek için de tellürit ve lityum eklenmi tir. Besiyeri, eklenen yumurta sar s emülsiyonu nedeniyle sar renkte ve opak görünümdedir. S. aureus tellüritin indirgenmesi nedeniyle gri-siyah renkte, yumurta sar s ndaki lesitinaz reaksiyonu nedeniyle de etraf nda effaf zon bulunan koloniler olu turur (Anon., 1998).

Baird-Parker Agar (CM275) besiyerinden 63 gram tart l r, 1 litre dam t k su içinde s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; sterilizasyon sonras 50 C ye so utulan besiyerine, oda s cakl na getirilmi olan Egg Yolk Tellurite Emulsion (SR 54) dan 50 ml eklenir ve homojen bir kar m sa lan r. Petrilere dökülen besiyeri 4°C de muhafaza edilebilir.

G da maddesi 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir (10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3,...). Her seyreltimden besi ortam içeren steril petri kutular na 0,1-0,5 ml al narak yüzeye yayma metoduyla ekim yap l r. Ekimi yap lan petriler 35-37 C de 24-48 saat inkübasyona b rak l r. S.aureus 48 saat inkübasyon sonras nda yuvarlak, 2-3 mm çap nda, düzgün kenarl konveks gri/siyah renkli opak bir halka içinde ve etraf nda effaf bir zon bulunan tipik koloniler olu turur. Ancak baz S. aureus su lar lesitinaz aktivitesi göstermedi inden (özellikle süt ürünlerinde rastlan r) effaf zon görülmeyen, atipik koloniler de olu turabilir. Besiyerinde gözlenen tipik ve atipik koloniler say l r. Tipik ve atipik kolonilere koagülaz testi uygulanmal d r. Koagülaz pozitif olan koloniler say l r ve seyreltim faktörü ile çarp larak örnekteki S. aureus say s belirlenir.

* Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8th Edition . Oxoid Ltd., Hamshire.

36

4.2. Koagülaz Testleri

Baird Parker Agardan izole edilen kültürlere koagülaz testi uygulanarak do rulama yap l r. Bu amaçla Staphylase Test (Oxo d DR595), Staphytect Plus (Oxoid DR 850) veya Dryspot Staphytect Plus (Oxoid DR100M) kullan labilmektedir.

4.2.1. Staphytect Plus (Oxo d DR 850) *

Staphytect Plus DR 850 testi ile S. aureus su lar n n koagülaz enzimi üretip üretmedi i tav an plazmas olmaks z n 20 saniye içinde lateks aglütinasyon prensibine göre saptan r. Reaksiyon kart nda S. aureus kolonileri ile lateks test reaktifi kar la t nda mikroorganizmada mevcut ba l koagülaz, fibrinojenle birle erek gözle de görülebilen bir aglütinasyon olu turur. Kontrol reaktifi ile ise baz stafilokok su lar n n olu turabilece i otoaglütinasyon saptan r. nsan kaynakl S. aureus türlerinin yakla k %97 si ba l durumdaki

koagülaz ve ekstraselüler (hücre d ) stafilokoagülaz içermektedir.

Protein A, insan kaynakl S. aureus türlerinin yakla k %95 inin hücre yüzeyinde bulunmakta olup immunoglobulin G nin (IgG) Fc k sm n ba lama özelli ine sahiptir.

* Staphylase Test The Oxoid Folio No. 346

37

Staphytect Plus, bu ay rdedici özelliklerden yararlan larak domuz vb. hayvanlara ait fibrinojen ve tav an IgG ile kaplanm ve S. aureus kapsüler polsakkaritlerine reaksiyon veren spesifik poliklonal antikorlar içeren mavi lateks partikülleri kullan larak tasarlanm t r.

Staphytect Plus n bir di er özelli i de Metisiline Dirençli S.

Aureus(MRSA)lar n kapsüler polisakkaritlerine kar spesifik antikorlar içermesidir. Bu özellik sayesinde di er koagülaz testleri ile tespit edilemeyen MRSA lar da yakalar.

Kit içer i i

Tek kullan m l k reaksiyon kart lar DR500

Staphytect Plus test reaktifi DR 851 M

Staphytect Plus kontrol reaktifi DR 852 M

Kulan m k lavuzu

Kullan m

1. Lateks reaktifleri oda s cakl na getirilir ve kuvvetlice kar t r larak (vortekste) homojenizasyon sa lan r.

2. 1 damla Test Reaktifi kart üzerindeki test halkalalar ndan birine damlat l r.

3. Steril bir öze ile petriden 5 üpheli koloni al n r.

4. Koloniler test halkas na yayd r larak Test Reaktifi ile iyice kar t r l r. Öze yak l r.

5. Kart 20 sn dairesel olarak hareket ettirilerek normal k alt nda aglütinasyon olup olmad gözlenir. Sonuç pozitif ise test 1. ad mdan 5. ad ma kadar, Kontrol Reaktifi ile tekrar edilir.

6. Test bitiminde reaksiyon kart uygun bir dezenfektan içine at l r.

38

ncelenen kolonilerde lateks test reaktifi ile aglütinasyon olu tu u gözlenirken, kontrol reaktifi ile aglütinasyon gözlenmiyorsa izole edilmi olan S.aureus un koagülaz pozitif su oldu u do rulanm olur. Kontrol reaktifi ile aglutinasyon olu mamal d r; her iki reaksiyonun pozitif olmas testin do ru uygulanmad n göstermektedir. Bu gibi durumlarda test tekrarlanmal d r. lem bittikten sonra reaksiyon kart dezenfektan içine at lmal veya otoklavda dekontamine edilmelidir.

4.2.2. Dryspot Staphytect Plus (Oxoid DR100M) *

Dryspot Staphytect Plus belli baz kapsüler polisakkaritlere sahip stafilokoklar di erlerinden ay rdetmek için kullan lan lateks slide aglütinaston testidir. Staphytect Plus (DR 850) den fark reaktiflerin kart üzerinde kurutulmu olmas d r. Bu özellik kitin daha uzun süre kullan lmas n ve oda s s nda muhafaza edilebilmesini sa lar.

Kit içer i i (120 testlik)

DR 101M Dryspot Staphytect Plus reaksiyon kart lar

Her bir i 10 kart ve nem em ici torba içeren 4 po et

Aç lan po et ler in kapat lm as için plast ik po et klipsler i

Her bir inde 3 test 3 kont rol reaksiyon alan olan kartlar

* Staphytect Plus The Oxoid Folio 561; Kullanma k lavuzu

39

Gerekli malzemeler

Fizyoloj ik tuzlu su (% 0,9 a r l k/ hacim )

Laboratuar saati

Pipet veya dam lal k (50 l)

Öze

Laboratuar dezenfektan

lem

1. Alüminyum po eti bir makasla açma çizgisi boyunca kesin.

2. Paket içerisinden gerekli miktarda reaksiyon kart ç kar n ve paketi kit içerisinde bulunan k skaç ve çubukla tekrar kapat n.

3. Oval test ve kontrol halkalar n n alt k sm nda yeralan küçük daire içerisine bir damla tuzlu su damlat n

40

4. Steril bir öze yard m ile petriden 3-5 tipik koloni al n.

5. Kültürden al nan numuneyi tuzlu su ile homojen süspansiyon elde edinceye kadar kar t r n.

6. Tuzlu su-kültür kar m n reaksiyon halkas içerisine yayarak

kurutulmu latex reaktifi ile kar t r n

7. Kart 20 sn. çevirin ve normal k alt nda aglütinasyon olu up olu mad n inceleyin. Test sonunda test kart n dezenfektan içerisinde bekleterek at n

41

Sonuçlar n de erlendir ilm esi:

20 saniye içinde test dairesinde gözlenen aglutinasyon S.aureus un koagulaz pozitif su oldu unu gösterir, 20 saniye geçtikten sonra olu an aglutinasyon dikkate al nmamal d r. Kontrol halkas nda aglutinasyon olu mamal d r. Her iki halkada da aglutinasyon gözlendi inde test tekrarlanmal d r. Reaksiyon kart i lem bittikten sonra dezenfektan içine at lmal veya otoklavda dekontamine edilmelidir.


FAO, 1992. Manual of Food Quality Control. 4. Rev. 1. Microbiological Analysis .Food and Agricultural Organization of the United Nations, Rome.



Jablonski, L.M. Bohach, G.A. 1997. Staphylococcus aureus. Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers (Ed. M.C. Doyle, L.R. Beuchat, T.J. Montville), s. 353-375. ASM Press, Washington.

Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology Academic Press, San Diego.

5 . Salmonella spp. ve Analiz Yöntemleri

Salmonellae aerob, spor olu turmayan Gram negatif bir bakteridir. G da zehirlenmelerinde infektif doz yakla k 106 olarak belirtilmektedir. Vakalardan s kl kla izole edilen Salmonella türleri S. typhimurium ve S.

enteridis dir. Hastal n inkübasyon süresi 12-36 saat aras nda

42

de i mekte, kar n a r s , diyare, kusma, ba a r s ve ate gibi belirtiler göstermektedir. Hastal k 1 ile 8 gün (bazen 14 gün) sürebilmektedir. Bebek, çocuk, ya l ve hasta bireyler riskli grubu olu turmaktad r (Gaman ve Sherington, 1996).

Salmonellae insan ve bir çok hayvan n ba rsaklar nda bulunmakta ve d k yla at lmaktad r. ki tip ta y c vard r:

(i) Sa l kl ta y c lar: Herhangi bir hastal k belirtisi göstermeyen sa l kl bireyler.

(ii) Hastal geçirmi olan ta y c lar: Hastal k geçtikten sonra aylar, hatta y llarca bakteriyi ta yan bireyler.

Salmonellae et ve sakatatta, özellikle tavuklarda yayg n olarak, bazen yumurtan n d yüzeyinde ve içinde bulunabilmektedir. G dalara ha ere ile, insanlar vas tas yla ve kontamine hammadde ile bula abilmektedir (Gaman ve Sherington, 1996).

5.1. Geleneksel Salmonella spp. Analiz Yöntemleri *

G dalardan Salmonellae izolasyonunda önemli 5 a ama vard r:

(i) Selektif olmayan zenginle tirme. (ii) Selektif besiyerinde zenginle tirme. (iii) Selektif kat kültür ortam na ekim. (iv) Biyokimyasal analizler. (v) Serolojik testler.

Selekt if olm ayan ön zenginle t irm e

1.1.1. Az say daki veya zarar görmü hücrelerin de izole edilebilmesi için 25 gram örnek aseptik ko ullarda 225 ml tamponlanm peptonlu su (buffered pepton water-CM 509) içine al n r ve 24 saat 37°C de inkübe edilir. Süttozu, kuru bebek mamalar gibi çözünebilir kat madde oran yüksek g dalardan 25 gram dam t k

* ISO 6579:1993

43

su içine al n r, hacim 250 ml ye tamamlan r ve 24 saat 37°C de inkübe edilir.

1.1.2. Donmu ve s l i lem görmü g da numunelerinde zarar görmü hücrelerin geri kazan labilmesi için 25 g (veya 10 g) g da örne i 250 ml (veya 100 ml) özel besi ortamlar içine al nabilir. Analize al nan g da maddesinin özellikleri dikkate al narak farkl ön zenginle tirme ortamlar kullan labilir. (ICMSF, 1978) (Çizelge 1).

Not: Ortam pH s 6,8-7,0 de erleri aras nda de ilse steril 1 N sodyum hidroksit veya 1 N hidroklorik asit kullan larak 6,8-7,0 de erlerine ayarlanmal d r.

Çizelge 1 Salmonella analizlerinde baz g da gruplar na uygulanabilecek ön zenginle tirme ortamlar

G da maddesi Ön zenginle tirme ortam

Yumurta ve ürünleri, bisküvi, Bebek mamalar , et, makarna, boyalar

Lactose Broth veya Buffered Peptone Water

Kuru maya (inaktif) Dam t k su Ya s z süt tozu, süt %0,02 Brillant Green içeren

dam t k su ekerlemeler Brillant Green içeren ya s z süt

Et ürünleri, hindistan cevizi %1 Tergitol içeren Lactose Broth veya %0,22 tergitol içeren peptonlu su

Jelatin %0.25 jelatinaz(*) içeren Lactose Broth

(*) %5 lik jelatinaz çözeltisinden 5 ml 225 ml Lactose Broth a kat larak haz rlan r.

Selekt if zenginle t irm e

1.2.1. Ön zenginle tirme ortam ndan 10 ar ml al narak 100 ml selenite cystine broth ve 100 ml Rappaport Vassiliadis-RV Broth (CM 669) ortam na ekim yap l r.

44

1.2.2. Ön zenginle tirmeye gerek görülmeyen g dalarda ise 25 g örnek 250 ml Selenit Cystine Broth a, ayn ekilde 5 g örnek 500 ml RV ortam na al n r. Selenit Cystine Broth 37°C de 48 saat, RV ortam 42°C de 24 saat inkübe edilir. Seçici kat ortamlara 18-24 saat ve tekrar 48 saat sonra sürme ekimler yap l r.

FDA (1998) taraf ndan önerilen yöntemde selektif olmayan ön zenginle tirmeyi takiben yap lan selektif zenginle tirme a amas nda uygulanan i lemler a a da verilmi tir:

(i) Çi et ve kontaminasyon düzeyi yüksek g dalardan Salmonella izolasyonunda selektif olmayan ön zenginle tirme ortam ndan 0,1 er ml al narak 10 ar ml Rappaport-Vassiliadis (RV) ve tetrathionate (TT) broth içeren ortamlara; di er g dalardan Salmonella izolasyonunda ise selektif olmayan ön zenginle tirme ortam ndan 1 er ml al narak 10 ar ml selenite cystine (SC) broth ve TT içeren ortamlara ekim yap lmaktad r.

(ii) Belirtilen inkübasyon ko ullar , çi et ve kontaminasyon düzeyi yüksek g dalardan yap lan ekimlerde RV için su banyosunda 42

0,2°C de 24 2 saat, TT için su banyosunda 43

0,2°C de 24 2 saat; di er g dalardan yap lan ekimlerde ise SC ve TT için 35°C de 24 2 saattir.

Selekt if kat ortam lara ekim

Her zenginle tirme ortam ndan öze ile Brillant Green Phenol Red agar (BGPRA) ve Taylor s Xylose Lysine Desoxycholate agar (XLD) agara ekim yap l r. Üçüncü bir seçici ortama gerek görülüyor ise Hektoen Enteric Agar, Salmonella-Shigella agar veya Blair s Bismuth Sulphite Agar (BS) kullan labilir. Petriler 24 ile 48 saat 37°C de inkübe edilir ve tipik koloni olu umu incelenir. Tipik Salmonella kolonileri BGPR agar da, pembe veya k rm z (nadiren renksiz) renkte, çevrelerinde k rm z bir zon olu turararak üreme gösterirler. XLD ortam nda merkezleri siyah pembe koloniler olu tururlar (baz

türler tamamen siyah koloniler olu turabilir).

45

Atipik baz Salmonella türleri ise sar renkli, merkezi bazen siyah koloni geli imi gösterebilir. BS Agar da koloniler kahverengi, gri veya siyah

renkte üreyebilirler, bazen metalik bir parlakl k da gösterebilirler. Koloni çevreleri ba lang çta kahverengiyken, zamanla siyaha dönü ür. Baz türler çevrelerinde koyu renk bir zon olu turmadan ye il koloniler olu turabilmektedir.

Biyokimyasal ve serolojik testler

Salmonella analizlerinde biyokimyasal testlerde Triple Sugar Iron (TSI) agar, Urea agar, Lysine Decarboxylase ortam kullan lmakta; -galactozidaz; VP ve indol testlerinden yararlan lmaktad r. Do rulamada alternatif olarak kitler de kullan lmaktad r. ( O.B.I.S. Salmonella gibi ) Serolojik testlerde taze kültürler kullan lmal , gerekirse nutrient agara ekilerek, 35°C de 24 saat inkübe edilmek suretiyle taze kültür haz rlanmal d r. Polyvalent 0 (somatik), Polyvalent H (flagellar) ve vi antijenleri ile serolojik testler uygulanarak do rulama testleri gerçekle tirilir (Borcakl ve ark. 1994; Harrigan, 1998; ICMSF, 1978).

O.B.I.S. Salmonella Kiti

Özellikle Citrobacter, Proteus ve Morganella kolonileri besiyerinde Salmonella ile kar t r labilir ve yanl pozitiflik verebilirler. Bu tür üpheli kolonilerin Salmonella olup olmad n anlamak için daha ileri do rulama

46

testlerine gidilmesi gerekmektedir. Geleneksel biyokimyasal ve serolojik yöntemlerde sonuçlar 24 saatlik bir inkübasyondan sonra elde edilmektedir. Bu kromojenik test ile bu koloniler 5 dakikada negatif sonuç vermektedir.

OBIS Salmonella test kart n n üzerinde iki basit biyokimyasal reaksiyon gerçekle ir: Bunlardan birincisi olan PYR, Citrobacter lerdeki PYRase aktivitesini tespit eder. PYRase aktivitesi ile hidroliz meydana geldi inde, olu an mor renk kolayl kla ay rt edilebilir. Fig. 2a. (PYR: L-pyrrolindonyl arylamide) kinci reaksiyon olan NPA, Proteus ve Morganella türlerinin özelli i olan

deaminase aktivitesini temsil eder. Pozitif reaksiyon test halkas nda keskin bir turuncu renk ile gözlenir. Fig. 2b. (NPA:p-nitrophenylalenine deaminase.

5 .2 . I SO Salm onella standard ndaki de i ik lik ler

ISO standartlar nda (6579:2002) belirtilen zenginle tirme besiyerlerinde ve içeriklerinde baz de i iklikler vard r. ISO da belirtilen Buffered Peptone Water n formülasyonunda enzimatik olarak parçalanan kazein bulunmaktad r ve pH 7.2 den 7.0 ye dü ürülmü tür. Rappaport Vasiliadis besiyerinin içerisine ortam tamponlamak için di-potassium hydrogen phosphate ilavesi uygun görülmü , böylelikle haz rlanm broth un saklanmas s ras nda pH n sabit kalmas sa lanm t r. ISO (6579:2002) standartlar nda Selenite Cystine Broth yerine Mueller Kaufmann Tetrathionate - Novobiocin Broth (CM1048) kullan lmas da önerilmektedir.

I SO Buffered Peptone Water (CM 1049) in haz rlanm as :

20 gram toz besiyeri, 1 litre dam t k suda çözündürülür. Çözülmesi için iyice kar t r l r ve kaplara da t l r. Otoklavda 121°C de 15 dakika sterilize edilir.

Rappaport Vasiliadis Soya (RVS) Peptone Broth un haz rlanm as :

47

26.8 gram toz RVS Broth CM 866, 1 litre dam t k suda çözündürülür çözülmesi için yava ça s t l r. Kaplara da t l r ve otoklavda 115°Cde 15 dakika sterilize edilir.

Mueller Kaufmann Tetrathionate - Novobiocin Broth(CM1048) un

haz rlanm as :

89,5 gram CM 1048, 1 litre dam t k su içerisinde çözündürülür, iyice kar t r l r ve kaynay ncaya kadar s t l r. 45°C ye so utulur. Kullan mdan hemen önce 20ml önceden haz rlanm iodine-iodide solüsyonu* eklenir. 4 adet suland r lm Novobiocin Selective Supplement (SR 181e) içeri i ilave edilir. yice kar t r l r ve steril kaplara bo alt l r.

*iodine-iodide solüsyonu : 10ml su içerisinde çözündürülmü 25 gram potasyum iyodür içerisine 20 gram iyot eklenir ve steril su ile 100ml ye tamamlan r.

Haz rlanm olan MKKTn Broth (CM 1048 + SR 181 + iyot/potasyum iyodür) iyot/potasyum iyodür eklendikten hemen sonra kullan lmal d r. Katk lar olmadan besiyeri oda s cakl nda 2 haftaya kadar saklanabilir.

5.3. Salmonella H zl Test Yöntem i

Salmonella analizlerinde k sa sürede sonuç veren baz test sistemleri geli tirilmi tir. Oxoid Salmonella Rapid Test, g da ham maddelerinde, son üründe ve çevreden al nan örneklerde hareketli Salm onella lar n saptanmas amac yla kullan lan, Association Française de Normalisation Tour Europe AFNOR ve AOAC taraf ndan onaylanm , 42 saat gibi k sa sürede (geleneksel yöntemlerde pozitif sonuç al nmas için geçen süre be gündür) sonuç veren ve kolayl kla uygulanabilen bir yöntemdir.

Kit, A ve B olarak adland r lan iki tüp içeren bir kültür kab ndan olu maktad r. Her tüp gözenekli bir yap yla birbirinden ayr lan, altta seçici , üstte indikatör özellikte bir besiyeri içerir. A tüpünün alt k sm nda Modified Rappaport Vassiliadis Medium, üst k sm nda Lysine Iron Cystine Neutral Red Medium; B tüpünün alt k sm nda Lysine Iron Desoxycholate Medium, üst k sm nda Modified Brilliant Green Medium

48

bulunmaktad r. Homojenize edilerek uygun bir ortamda ön zenginle tirmesi yap lm g da örne i Salmonella Elective Medium ve A, B olarak belirtilen iki adet tüp içeren kültür kab na inoküle edilir. Salmonella lar alttaki seçici ortamdan, üstteki indikatör ortama aktif olarak hareket ederler ve varl klar renk de i ikli i olarak belirir. Hareketli Salmonella su lar n n Elektive mediumdan seçici indikatör ortamlara geçi i ve geli meleri, A tüpünde H2S olu umuna ba l siyah renk olu umu, B tüpünde ise laktoz fermentasyonunun negatif oldu unu gösteren k rm z renk olu umu eklinde gözlenir. Hareketsiz su olan S.

pullorum ve S. gallinarum tipleri ise bu yöntemle saptanamamaktad r.

Analiz 18 saatlik ön zenginle tirme a amas dahil 42 saatte tamamlan r. Pozitif reaksiyon gözlenen tüpler daha sonra Oxoid Salmonella Latex Test kullan larak 2 dakika içinde do rulan r.

Bu yöntemle analizi yap labilecek g dalar aras nda su, süt, peynir, margarin, tereya , yo urt, so utulmu tatl lar, hayvansal, ve bitkisel kökenli g da ham maddeleri, kuru g dalar, bal k ve bal k ürünleri ve baz dondurulmu g dalar ve hayvan yemleri gibi çe itli g dalar yer

49

almaktad r.

Kit içer i i

Kültür kaplar (be li po et içerisinde)

Novobiocin disk (FT207)

Kapak açm a anahtar

Enjektör ve ucu

Bu kitle birlikte besiyeri olarak Buffered Pepton Water (CM509) veya uygun bir ön zenginle tirme ortam (Çizelge 1) ile Salmonella Rapid Test Elective Medium (SRTEM) (CM 857) kullan lmaktad r.

1. Buffered Pepton Water (CM509) dan 20 g tart larak 1 L dam t k su içinde eritilip, 225 er ml olarak erlenlere da t l r,121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.

2. Salmonella Rapid Test Elective Medium ( SRTEM) (CM 857) besiyerinden 61 g tart larak 1 L dam t k su içinde s t larak eritilir ve 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir.

18-20 C de kuru ortamda saklanan kültür kaplar po etinden ç kar l r ve kalanlar n nem almamas için po et kapat l r. Kültür kab belirli bir aç alt nda laboratuar tezgah n n kenarlar na vurularak, yap m besiyerlerinin kap çeperlerinden ayr lmas sa lan r ve kab n kapa aç l r.

50

Kültür kab n n üzerinde i aretlenmi 1 numaral seviyeye kadar steril dam t k su konur (yakla k 27 ml) Kap içerisinde yer alan A ve B tüplerinin tabanlar n n su seviyesinin alt nda kal p kalmad kontrol edilir.

Kit paketinde yer alan steril enjektörle kültür kab n n üzerinde i aretlenmi 3 numaral seviyeye kadar A ve B tüplerine su çekilir. Bu i lem yakla k 5 saniyede tamamlanmal d r. Enjektör i nesinin tüpler içindeki ortamlara de memesine, tüplerin kap içinde yerlerinden oynamamas na ve kapaklar n n

gev ememesine dikkat edilmelidir.

Kültür kab n n kapa kapat l r ve kap, tüp kar t r c (vorteks mikser vb.) ile kar t r l r. Burada önemli olan husus tüplerin içindeki s v n n yakla k 5 saniye kadar kuvvetlice çalkalanmas d r. Kar t rma i lemi sonras kap kar t r c dan al n r ve en az 5 dakika dinlendirilir. Dinlendirme süresi 4 saati geçmemelidir.

51

Kültür kab n n kapa dikkatlice aç l r, steril ve oda s cakl ndaki (18-25°C) Salmonella Rapid Test Elective Medium (SRTEM) kab n geni haznesi içine 2 numaral seviyeye kadar bo alt l r.

Bir adet Novobiocin diski aseptik ko ullarda kültür kab na ilave edilir. Kit paketinde yer alan anahtar ile tüplerin kapaklar aç l r. Kapaklar el yard m yla açmak da mümkündür. Burada dikkat edilecek nokta, kültür kab n n içine veya tüplere do rudan temastan kaç n lmas d r. Kültür kab n n kapa kapat l r ve böylece kap kullan ma haz r hale gelir.

52

1. 25g örnek 225 ml Buffered Pepton Water içinde homojenize edilir,

35°C de18 saat inkübasyona b rak l r. Yeni haz rlanm kültür kab na örne in tan mlanmas için gerekli bilgiler (örnek ad , tarih vb.) yaz larak yap t r l r.

2. Kültür kab n n kapa aç l r ve ön zenginle tirme yap lm kültürden

kap içine 1 ml aktar l r. Kültür kab n n a z kapat larak 41°C de 24 saat inkübasyona b rak l r.

24 saatlik inkübasyon süresi sonunda kültür kab inkübatörden al n r ve iyi k alan bir ortamda kap içindeki tüplerin üst k sm ndaki indikatör bölümleri renk de i ikli i yönünden kontrol edilir (bu i lem asla tüpler kap içinden ç kar larak yap lmamal d r). Muhtemel Salmonella varl indikatör ortamda renk de i ikli ine neden olur (bir tüpte renk de i ikli inin olmas bu sonuç için yeterlidir).

TÜP A

nkübasyon sonras A tüpünün üst bölmesindeki renk de i imleri ve de erlendirilmeleri a a da verilmi tir:

1. nkübasyon öncesi alt bölme mavi, üst bölme k rm z d r. 2. Negatif sonuç -siyahla ma yok 3. Pozitif sonuç: -hafif siyahla ma 4. Pozitif sonuç: -kuvvetli siyahla ma

53

TÜP B

nkübasyon sonras B tüpünün üst bölmesindeki renk de i imleri

ve de erlendirilmeleri a a da verilmi tir:

1. Ünitenin orijinal rengi 2. Negatif sonuç -de i iklik belirgin de il 3 ve 4. Negatif sonuç -sar , üstü ye il 5. Pozitif sonuç -sadece k rm z la ma 6. Pozitif sonuç -hafif k rm z la ma ve siyahla ma 7 ve 8. Pozitif sonuç -k rm z ve siyah renk olu umu

54

Pozitif reaksiyon veren tüplerdeki kültürlere OXOID Salmonella Latex Test (FT 203) kullan larak aglutinasyon testi uygulanmal d r.

8.2.2. Do rulam a Test i (Aglüt inasyon Test i) *

Oxoid Salmonella Rapid Test (FT201) den izole edilmi olas Salmonella

spp. nin do rulanmas için uygulanan bir testidir. Bu amaçla Oxoid Salmonella Latex Test (FT203) kullan labilmektedir.

Kit içer i i

Test Lateks (FT 204) Kontrol Lateks(FT205)

Pozitif Kontrol Süspansiyonu (FT206)

Reaksiyon Kart lar

1. Lateks i eleri oda s cakl na getirilir ve kuvvetlice çalkalan r (vortekste).

2. Reaksiyon kart ndaki dairelerden birine bir damla test lateksi damlat l r.

3. Yan ndaki daire içine bir damla kontrol lateksi damlat l r. 4. Steril bir öze kullan larak her iki tüpte pozitif ise A tüpünden, A tüpü

negatif ise B tüpünden bir öze kültür al n p test lateksine kar t r l r, i lem 10-15 saniye sürdürülür, daha sonra kar m öze ile dairenin içine yay l r.

5. Öze yak l p, so utulur (so utma i lemi tüpün iç yüzeyinin s v kenar na özeyi de direrek yap l r). Pozitif tüpten bir öze al n p kontrol lateksi ile kar t r l r, i lem 10-15 saniye sürdürülür. Daha sonra kar m öze ile dairenin içine yay l r. Karta iki dakika boyunca dairesel hareket yapt r l r (süre 2 dakikay geçmemelidir).

* Oxoid Salmonella Latex Test kullan m K lavuzu X4991A

55

Not. Test lateksinde aglütinasyon, kontrol lateksinde negatif sonuç gözlendi inde kültür Salmonella spp. POZ T F olarak de erlendirilir (aglütinasyonu gözlemlemek için büyüteç veya mikroskop kullan lmamal d r).

Not. Kullan lm kültür kaplar at lmadan önce otoklavda sterilize edilmelidir


Gaman, P.M., Sherrington, K.B. 1996. Food poisoning. The Science of Food . 235256. Pergamon Press

Borcakl , M., Kalafato lu, H., Aran, N., Topal,, ., Karaku , M. 1994. G dalarda Temel Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri ,

TÜB TAK-MAM, G da ve So utma Teknolojisi Bölümü Yay nlar , Yay n No. 128, Gebze-Kocaeli. 53.


Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology , Academic Press, San Diego.

ICMSF, 1978. Microorganisms in Foods. Vol. 1 . University of Toronto Press, Toronto

6 . Sülfit ndirgeyen Anaerobik Bakteriler

Sülfit indirgeyen bakteriler g dalarla ilgili çe itli mikrobiyal kriterlerde yer alan Gram pozitif, endospor olu turan anaerobik çubuk eklindeki bakterileridir. Bu grupta yer alan g da kaynakl zehirlenme etkeni ba l ca bakteriler Clostridium perfringens ve Clostridium botulinum dur. Sülfit indirgeyen bakteriler g dalarda hijyenik kalite belirlenmesinde kontaminasyon indikatörleri olarak de erlendirilirler. Say mlar nda kullan lan kullan lan kültür ortamlar ve inkübasyon s cakl klar daha ziyade C. perfringens üzerinde yo unla m t r (Poumeyrol ve Billon 1995).

6.1. Clostridium perfringens ve Analiz Yöntemleri

C. perfringens Gram-pozitif, spor olu turan, anaerobik, hareketsiz ve çubuk eklinde bir bakteridir. Ancak di er anaerobik bakterilere göre oksijene daha toleransl d r (McClane, 1997). Yüksek s cakl klarda (28°C)

56

aerobik ko ullarda da h zl geli me gösterebilmektedir (Juneja ve ark.1994a,b) Toprak kökenli olup, çevreden, çi et, insan ve hayvan ba rsaklar ndan izole edilmektedir. Enterotoksin A, C ve D tipi C.

perfringens türlerinden izole edilmektedir. A tipi daha hafif seyreden klasik g da zehirlenmesine neden olurken, C tipi nekrotik enteritis olarak adland r lan önemli sa l k sorunlar na neden olabilen zehirlenme etkenidir. C. perfringens A tipi zehirlenme belirtileri kar n a r s , diyare, bulant ve ate eklinde, kontamine g day (106-107 hücre/g) tüketimden 8-12 saat (6-24 saat) sonra ortaya ç kmaktad r. G da ile vücuda al nan hücrelerden mideyi geçerek canl kalanlar ince ba rsakta ço almakta ve spor olu turmaktad r. Baz ülkelerde C. perfringens in Salmonella dan sonra en önemli g da zehirlenme etkeni oldu u belirtilmektedir. Nekrotik enteritis ise daha seyrek görülmekte beraber s kl kla ölümle sonuçlanmaktad r. Belirtileri iddetli kar n a r s ve diyare (ço unlukla kanl ), bazen kusma ve ince ba rsakta tahri eklindedir (Granum, 1990).

Perfringens zehirlenmesi genellikle s l i lemi takiben uygun ko ullarda so utulmayan g dalardan kaynaklanmaktad r. Et ve et ürünleri riskli g da gruplar n olu turmaktad r. Hastadan al nan fekal materyalde veya bakteri izolatlar n n kültür s v lar nda enterotoksin analizi zehirlenme tan s nda önemli rol oynamaktad r.

G dalardan dü ük düzeylerde C. perfringens izole edilmesi her zaman g da zehirlenme riskini göstermez. Ancak yüksek miktarlarda mevcudiyeti tehlikenin varl n ifade etmektedir. Bu nedenle say m yöntemi bu mikroorganizma için özellikle önemlidir. C. perfringens g dalardan Tryptose Sulphite Iron Citrate Cyloserine (TSC) agar (ISO 7937:1977) veya neomycin içeren kanl agar kullan larak 35-37°C de 20-24 saat anaerobik ko ullarda inkübasyon ile izole edilebilmektedir (Forsythe ve Hayes, 1998; Harrigan, 1998). Do rulamas hareketlilik, nitrat indirgeme, laktoz metabolizmas ve gelatin testleri ile yap l r. C.

perfringens antitoksini içeren egg yolk agar kullan m da alternatif bir do rulama yöntemi olarak önerilmektedir (Forsythe ve Hayes, 1998).

57

Selektif ortamlar kullan larak çoklu tüp yöntemi ile C. perfringens say m mümkündür (Harrigan, 1998).

C. perfringens hücreleri so uk muhafaza ve donmaya kar çok hassas olmalar na ra men sporlar canl l klar n korumaktad r. Ön zenginle tirme gerekti inde Cooked Meat Medium veya Reinforced Clostridial Medium kullan m önerilmektedir (Forsythe ve Hayes, 1998).

Analize al nacak örnekler dondurulmadan, yakla k 10°C de ta nmal , 8 saat içinde analize al nmal , aksi takdirde tamponlanm gliserin-tuz çözeltisi içinde bekletilmelidir. Bu amaçla 25 g örnek gliserin-tuz çözeltisi içine al n r, ortamdan oksijen uzakla t r larak aseptik ko ullarda ambalajlan r. S v örnekler de ayn ekilde e it hacimdeki gliserin-tuz çözeltisine konularak kar t r l r. Haz rlanan örnekler 20 ile 30°C deki derin dondurucuya al n r veya kuru buz içinde dondurulur. Örnekler analize al n ncaya kadar bu s cakl kta muhafaza edilmelidir. Analiz s ras nda homojenizasyon k sa sürede gerçekle tirilmeli, hücrelerin oksijenle temas minimum seviyede tutulmal d r (FAO, 1992)

Tryptose-Sulphide- Cycloserine Agarda ( Oxoid CM 5 8 7 ) Clostr idium perfr ingens Say m *

Besiyeri Perfringens Selective Medium a (CM587), Perfringens (TSC) Selective Supplement B (SR88), Egg-Yolk Emulsion (SR47) ilavesi ile haz rlan r. C. perfringens bu besiyerinde siyah renkli ve çevresinde opak zon bulunan koloniler olu turur. Siyah renk, besiyeri içinde bulunan sülfitin indirgenmesi, opak zon ise lesitinaz aktivitesi nedeniyle olu maktad r. Ancak, lesitinaz negatif C. perfringens su lar n n da bulundu u dikkate al narak siyah renkli di er tipik koloniler de do rulama testlerinde dikkate al nmal d r. Besiyerine D-cycloserine kat lmas ise besiyerine seçicilik kazand rmaktad r. Besiyeri istenirse egg yolk emulsiyon kat lmadan da kullan labilir, bu durumda olu an koloniler daha küçüktür ve say m kolayla maktad r.

* Hamshire.Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8th Edition . Oxoid Ltd.,

58

Perfringens Selective Medium (CM587) besiyerinden 23 gram tart l r, 500 ml dam t k su içinde s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; sterilizasyon sonras 50 C ye so utulan besiyerine, 2 ml steril dam t k su içinde çözündürülmü bir vial Perfringens Selective Supplement B (SR88) ve 25 ml egg yolk emulsion (SR47) ilave edilir, kar t r l r ve aseptik ko ullarda steril petrilere dökülür. Ekim yap lan petrilerin üzerine ikinci bir tabaka olu turmak üzere haz rlanan TSC agara egg yolk emulsion ilave edilmez. Haz rlanan besiyeri 2-8°C de muhafaza edilmelidir.

1. G da maddesi 1:10 oran nda (25gram/225 ml, 50gram/450ml) seyreltilerek homojenize edilir ve ayn ekilde (10-2, 10-3...) oranlar nda ileri seyreltimleri yap l r.

2. Her seyreltimden egg yolk emulsiyon içeren TSC agar üzerine sürme yöntemi ile 0,1 ml ekim yap l r. Yay lan seyreltim absorbe olduktan sonra yüzey tabakas olu turmak üzere egg yolk emulsiyon içermeyen TSC agardan yakla k 10 ml kadar ilave edilir. Bu i leme alternatif olarak dökme plak yöntemi ile de ekim yap labilir. Haz rlanan seyreltimlerden steril petri kutular na 1.0 er ml inokule edilir, üzerlerine 25 ml 45°C ye so utulmu egg yolk emulsiyon içermeyen TSC agar dökülür ve inokulum ile kar m sa lan r. Bu teknikle C. perfringens kolonilerinde lesitinaz aktivitesinin gözlenmesi zordur.

3. Petriler anaerobik kavanozda Gas Generating (BR38) kit ve katalizör (BR 042) kullan larak 35 C de 18-24 saat inkübasyona b rak l r. Alternatif olarak Anaerogen AN025A veya AN035A kullan labilir. Anaerogen su veya katalizör ilavesi gerektirmez.

Anaerobik kavanozun bulunmad durumlarda ortam gaz s zd rmayan Anaerobik po etlerde(AG 020) gerçekle tirilebilir. Bu po etler içerisine ortam olu turmak için Anaerogen Compact AN 010 konulmas ve po etlerin a z n n Sealing Clips (AN005) ile kapat lmas gerekir. Bu po etler 4 petri alabilmekte, böylece inkübatörde yer kaplamamaktad r. Ayr ca effaf olduklar için üremenin istenildi i zaman kontrol edilebilmesini sa lar.

59

Anaerobik ko ullar n sa land ndan emin olmak için indikator olarak ortama Oxoid Anaerob c Indicator BR55 konulabilir. Anaerobic Indicator striplerindeki renk de i imi ortam n olu tu unu gösterir.

C. perfringens, egg yolk emulsiyon içeren TSC agarda etraf nda opak zon bulunan, 2-4 mm çap nda siyah koloniler olu tururken, egg yolk emulsiyon içermeyen TSC agarda sadece küçük siyah renkli koloniler gözlenir. Besiyerinde üreyen tüm siyah koloniler do rulama testlerine al nmal d r.

Do rulama testi için seçilen koloniler Thioglycollate Broth a (CM 173) al n r, 35 C de 18-24 saat inkübasyona b rak l r. Daha sonra üreme gözlenen tüplerden boyama yap larak mikroskopta incelenir. Gram pozitif, k sa ve kal n çubuk eklindeki bakteriler saf kültür halinde ise biyokimyasal testlere geçilir. Kültür saf de ilse tekrar TSC agarda safla t r ld ktan sonra testlere devam edilir.

Do rulama testleri için International Comission on Microbiological Specifications for Foods taraf ndan önerilen biyokimyasal testlerden yararlan l r. Nitrat indirgeme (pozitif), laktoz fermentasyonu (pozitif), jelatin eritme (pozitif) ve hareket (hareketsiz) testleri uygulan r.

Bu testlerle do rulanan koloni say lar seyreltim faktörü ile çarp larak sonuç kob/g olarak bulunur.

60

Not. Tryptose-Sulphide-Cycloserine Agar FDA (1998) ve FAO(1992) taraf ndan da besiyeri olarak önerilmektedir.




Granum, P.E. 1990. Clostridium perfringens toxins involved in food poisoning. International Journal of Food Microbiology 10, 101-112.


Juneja, V.K., Marmer, B.S. and Miller, A.J. (1994a) Growth and sporulation potential of Clostridium perfringens in aerobic and vacuum packaged cooked beef. Journal of Food Protection 57, 393-398.

Juneja, V. K., Call, J.E., Marmer, B.S. and Miller, A.J. (1994b) The effect of temperature abuse on Clostridium perfringens in cooked turkey stored under air and vacuum. Food Microbiology 11, 187-193.

McClane, B.A. 1997. Clostridium perfringens. Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers (Ed. M.C. Doyle, L.R. Beuchat, T.J. Montville), s. 305-326. ASM Press, Washington.

Poumeyrol, M., Billon, J. 1995. The genus Clostridium and sulfite- reducing anaerobes. Microbiological Control for Foods and Agricultural Products . s. 347-360. VCH Publishers, New York.

61

7. Bacillus cereus ve Analiz Yöntemleri

Bacillus cereus Gram pozitif ve spor olu turan g da zehirlenme etkeni bakteriler aras nda yer almaktad r. Sporlar s l i leme oldukça dirençlidir. Genellikle 107/g düzeylerinde intoksikasyon etkenidir. Emetik ve diyaretik tipte olmak üzere iki ayr enterotoksin üretir. (Notermans ve Batt, 1998). Do ada yayg n olarak bulunur, çe itli g dalarda dü ük miktarlarda saptanabilmektedir. zolasyonunda do rudan ekim yöntemi ve Mannitol Egg-yolk Phenol red Polymixin (MYP) Agar gibi selektif ortamlar kullan lmas önerilmektedir. Kültür ortam ISO 7932:1993 say l ISO standard nda tan mlanm t r. Ancak MYP besiyerininin asit tamponlama özelli i dü ük oldu u için ortamda mannitolu fermente eden bakteriler (B. cereus mannitolu fermente edemez) kolayl kla geli ebilmektedir. Bu nedenle ekimlerde Oxoid taraf ndan üretilen Polymixin Pyruvate Egg-yolk Mannitol Bromthymol blue Agar n da

(PEMBA) paralel olarak kullan m avantaj sa lamaktad r. Piruvat ve pepton içermesi nedeniyle bu ortamda lesitinaz aktivitesi ve spor olu umunu te vik edilmektedir. Ancak bu ortam n da tamponlama özelli i dü ük oldu u için sonuçlar 24 saatlik inkübasyon sonucunda de erlendirilmelidir. Analiz edilecek g da maddesinden yap lan seyreltimler (10-4 e kadar) MYP Agar ve PEMBA besiyerlerine 0,1 er ml paralelli olarak ekilmekte, 30°C de 24 ve 48 saat inkübe edildikten sonra

62

sonuçlar de erlendirilmelidir. MYP Agar üzerinde muhtemel B. cereus kültürleri yüzeyleri kuru ve pürüzlü, tersi mor-k rm z ve etraflar nda zon bulunan koloniler olu turmaktad r. PEMBA üzerinde ise turkuaz mavi renkli, etraflar nda presipitasyon bulunan koloniler eklinde üreme gözlenmektedir.

Do rulama testleri Hugh Leifson s besiyeri kullan larak, glukozun anaerobik disimilasyonu, gelatin hidrolizasyonu, nitrat indirgeme testleri, mannitol ve glukozu fermente etmeme özellikleri incelenerek yap lmaktad r. G dalarda B. cereus enterotoksini Reversed Passive Latex Agglutinasyon kitleri kullan larak do rudan saptanabilmektedir (Harrigan, 1998).

7.1. Mannitol Egg Yolk Polymixin Agarda (MYP) (CM929) Bacillus cereus Say m

*

Mannitol Egg Yolk Polymixin Agar (MYP) içeri indeki mannitol, yumurta sar s ndaki lesitin ve polymyxin B nedeniyle Bacillus cereus için oldukça seçici bir besiyeridir. Mannitolu kullanmayan B. cereus su lar besiyerinde pembe koloniler olu turmakta, lesitinaz aktivitesinden dolay koloni etraf nda presipitasyon sonucu opak bir zon gözlenmektedir. Mannitol pozitif bakteriler ise phenol red indikatöründen dolay farkl renkte koloniler olu tururlar. Polymyxin B ise Gram- negatif bakterileri inhibe ederek besiyerine seçicilik kazand r r.

Mannitol Egg Yolk Polymixin Agar (MYP) (CM929) besiyerinden 21,5 gram tart l r, 500 ml dam t k su içinde s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Sterilizasyon sonras besiyeri 50 C ye so utulduktan sonra oda s cakl na getirilmi 50 ml Egg Yolk Emülsiyon (SR47) ile 2ml dam t k su içerisinde çözündürülmü bir vial Bacillus cereus Selektif Supplement (SR99) eklenerek kar t r l r, petrilere yakla k 20 er ml da t l r.

* Monograph No.4 Oxoid Folio No.569

63

G da maddesi 1:10 oran nda % 0.1 lik peptonlu su (Oxoid CM 009)ile homojenize edilir (10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3, 10-4 ....). Her seyreltimden besiyeri içeren steril petri kutular na 0,1-0,5 ml al narak yayma yöntemiyle ekim yap l r. Petriler 18-40 saat 30 C de inkübasyona b rak l r.

Petri yüzeyinde 5 mm çap nda, pembe/mor renkli, etraf opak zon ile çevrilmi , kuru, yüzeyi pürüzlü tipik koloniler say l r. Tipik kolonilerden be er adet al narak Nutrient Agar da (CM4) geli tirilir.

7.2. Bacillus cereus Selective Agarda (PEMBA) (CM617) Bacillus cereus Say m

Bacillus cereus Selective Agarda (PEMBA)(CM617) besiyerinden 20,5 gram tart l r, 475 ml dam t k su içinde tamam yla çözününceye kadar s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Sterilizasyon sonras besiyeri 50 C ye so utulduktan sonra oda s cakl na getirilmi 25 ml Egg Yolk Emülsiyon (SR47) ile 2ml steril dam t k su içerisinde çözündürülmü bir vial Bacillus cereus Selektif Supplement (SR99) eklenerek kar t r l r, petrilere da t l r.

G da maddesi 1:10 oran nda % 0.1 lik peptonlu su (CM 009) ile homojenize edilir (10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3, 10-4 ....). Her seyreltimden besiyeri içeren steril petri kutular na

64

0,1-0,5 ml al narak yayma yöntemiyle ekim yap l r. Petriler 24 saat 35 C de inkübasyona b rak l r. nkübasyondan sonra petriler incelenir. Tipik B.cereus kolonileri say l r. Petriler oda s cakl nda bir 24 saat daha b rak larak tüm B.cereus kolonileri gözlenir. üpheli kolonilere anaerobik glukoz fermentasyonu, nitrat indirgeme ve Voges-Proskauer testleri uygulan r. Pozitif reaksiyonlar B. cereus varl n ifade eder.

Not: Kurutulmu g dalar 90 ml Tripton-tuz çözeltisi içerisine 20 gram konularak oda s cakl nda 50 dakika kadar iyice slat l r. (Tripton-tuz çözeltisi haz rlamak için %0,3 oran nda Tryptone LP 042 ve %0,8 oran nda Sodium Chloride LP 005 kullan l r.) 90ml %0,1 lik peptonlu su bu çözeltiye ilave edilerek 10-1 lik dilüsyon yap l r.

7.3. Chromogenic Bacillus cereus

Agarda Koloni Say m

20.5 gram Chromogenic bqacillus cereus Agar ( CM 1036) 500 ml dam t k su içerisinde çözündürülür. yice kar t r l r ve tamam yla çözünmesi içi,n kaynay ncaya kadar s t l r. 121 C de 15 dakika sterilize edilir. 50 C ye so utulduktan sonra aseptik ko ullarda 1 vial Chromogenic Bacillus cereus Selective Supplement (SR0230) eklenir. yice kar t r ld ktan sonra steril petrilere dökülür.

G da maddesi 1:10 oran nda % 0.1 peptonlu su ile homojenize edilir( 10-

1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r(10-1, 10-2, 10-3,.....) . Her seyreltimden besiyeri içeren steril petri kutular na 0,1-0,5 ml al narak yayma yöntemiyle ekim yap l r. Petriler 24 saat 35 C de inkübasyona b rak l r. nkübasyondan sonra petriler incelenir.

65

Yararlan lan kaynaklar


Notermans, S., Batt, C.A. 1998. A risk assessment approach for food-borne Bacillus cereus and its toxins. Journal of Applied Microbiology Symposium Supplement 84, 515-615

8 . Listeria monocytogenes ve Analiz Yöntemleri

Listeria monocytogenes bakterisinin neden oldu u g da kaynakl listeriosiz vakalar n n %30 unun ölümle sonuçlanmas , g dalarda L.

monocytogenes analizlerinin de önem kazanmas na neden olmu tur (Gaman ve Sherington, 1996; Harrigan, 1998). Ancak Listeria

monocytogenes analizi Salmonella ve Campylobacter analizlerinden çok daha komplikedir.

lk listeriozis vakas I. Dünya Sava nda ortaya ç km t r. Ancak görülme s kl çe itli etkenlere ba l olarak art göstermi ve son on y lda en önemli g da kaynakl hastal k etkenleri aras nda yer alm t r. Listeriozis çe itli belirtilerle ortaya ç kan bir hastal kt r. Hamile kad nlar s kl kla hamileliklerinin ilk üç ay nda etkilenmekte, hastal k ate ve ba a r s ile seyretmekte ölü do umlar, dü ükler ve menenjit gibi sa l k sorunlar na neden olmaktad r. Di er bireylerdeki listeriozis vakalar nda merkezi sinir sistemi etkilenmekte, menenjit ve septisemi s kl kla gözlenmektedir (Gaman ve Sherington, 1996; Roccourt ve Cossart, 1997). L.

monocytogenes i g da kaynakl patojenlerin büyük ço unlu undan ay ran ba l ca özellikleri do ada yayg n olarak bulunu u, dü ük pH ve yüksek NaCl konsantrasyonlar na dirençlili i, mikroaerobik ve psikrotrofik özellikte olu udur. Dü ük s cakl klarda (2-4°C) geli me özeli ine sahiptir. Böylece g da üretim zincirinin her a amas nda ürüne bula mas söz konusudur. L. monocytogenes do ada toprak ve su kaynaklar ndan

66

s kl kla izole edilebilmekte, g da i letmelerinde kontaminasyonlar çal an personel, ekipman ve hammaddeden kaynaklanmaktad r. L.

monocytogenes çi ve i lem görmü g dalarda yayg n olarak gözlenmektedir. Riskli g da gruplar aras nda süt ve süt ürünleri, et ve et ürünleri, lahana, salatal k ve patates gibi dü ük asitli sebzeler ve su ürünleri ilk s ralarda yer almaktad r (Roccourt ve Cossart, 1997). Baz yumu ak peynir çe itleri ile et ürünlerinde ve tüketime haz r salatalarda yüksek miktarlarda (106/g) L. monocytogenes saptanabilmektedir. Öte yandan g dalar n büyük ço unlu unda dü ük miktarlarda bulunmaktad r (Harrigan, 1998a). nsanlardan izole edilen L. monocytogenes serotiplerinin %95 ini 1/2a, 1/2b ve 4b olu turmaktad r (Roccourt ve Cossart,1997). L. monocytogenes in infeksiyon dozu çe itli faktörlere ba l olarak de i iklik göstermektedir. Bu konuda yap lan de erlendirmelerde genellikle g dalardaki 100 kob/g n üzerindeki kontaminasyon düzeylerinde hastal n ortaya ç kabildi i belirtilmektedir. Ancak daha gerçekçi de erlendirmeler yap labilmesi için daha fazla epidemiyolojik verilere gereksinim duyulmaktad r (Roccourt ve Cossart, 1997).

Baz mikrobiyolojik standartlarda bakterinin say s , baz lar nda 25 g g da örne inde Listeria monocytogenes bulunup bulunmad belirtilmektedir. Say sal de er elde edilmesi gerekti inde ön zenginle tirme ve zenginle tirme a amalar uygulanmamaktad r. Listeria monocytogenes analizlerinde FDA, USDA (Forsythe ve Hayes, 1998) ve ISO taraf ndan onaylanm kültürel yöntemler ile resmi kurulu lar taraf ndan onaylanm h zl test kitleri kullan labilmektedir .

8.1. Koloni Say m Yöntem i *

1. 25 gram g da örne i tart l r, 225 ml Fraser broth a al n r ve stomacher da kar t r l r.

2. Pepton (%0,1) içeren seyreltim çözeltisi kullan larak seyreltimler yap l r.

3. PALCAM veya Oxford agar içeren petrilere 0,1 ml ekim yap l r.

* ISO 11290-2:1997 (Harrigan, 1998)

67

4. Petriler 37°C de 48 saat inkübe edilir. Oxford agar petrileri aerobik, PALCAM agar mikro aerobik (%5-10 oksijen ve %10 karbon dioksit içeren atmosfer) ko ullarda inkübe edilmelidir. Mikro aerobik ko ullar Oxoid Campylobacter Gas Generating Kit (BR56 3,5 litrelik anaerobik kavanoz için ve BR60 2,5 litrelik anarobik kavanoz için) kullan larak ayarlanabilmektedir.

Not: Campylobacter Gas Generating Kit yerine CN 025 veya CN 035 de kullan labilir.

8.2. Zenginle t irm e Yöntem iyle Listeria monocytogenes Analizi *

1. 28,7 gram Fraser Broth Base (CM 895) 500 ml dam t k su içerisinde çözündürülür. 121C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. 50C ye so utulduktan sonra içerisine suland r lm 1 vial Half Fraser Supplement (Oxoid SR 166) ilave edilerek ön zenginle tirme çözeltisi olan Half Fraser Broth haz rlan r. 225 ml lik kaplara da t l r

2. 28,7 gram Fraser Broth Base (CM 895) 500 ml dam t k su içerisinde çözündürülür. 121C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. çerisine suland r lm 1 vial Fraser Supplement (Oxoid SR 156) ilave edilerek ikinci zenginle tirme çözeltisi olan Fraser Broth haz rlan r. 10ml lik tüplere da t l r. Otoklavda sterilize edilir.

3. 27,75 gram Oxford Agar Base (CM 856) 500 ml dam t k su içerisinde çözündürülür. Çözününceye kadar s t l r. 121C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. 50C ye so utulduktan sonra aseptik ko ullarda içerisine 5 ml etanol:steril dam t k su(1:1) kar m ile suland r lm 1 vial Oxford Selective Supplement (SR 140) eklenir. Petrilere dökülür.

68

4. 34,5 gram Palcam Agar Base (CM 877) 500 ml dam t k su içerisinde çözündürülür. Tamam yla çözünebilmesi için kaynay ncaya kadar s t l r. 121C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. 50C ye so utulduktan sonra çerisine 2ml dam t k su ile suland r lm 1 vial Palcam Selective Supplement (SR 150) eklenir.

25 gram g da numunesi 225ml Half Fraser broth içerisine al n r. ..C de .. saat inkübe edilir.

(a) nkübasyon bitiminde ön zenginle tirme ortam ndan bir öze gözü Oxford agara, bir öze gözü PALCAM agara ekim yap l r. Oxford agar petrileri aerobik, PALCAM agar microaerobik (%5 -10 oksijen ve %10 karbon dioksit içeren atmosfer) ko ullarda inkübe edilmelidir. Bu atmosfer ko ullar n sa lamak amac yla 2,5 litrelik anaerobik kavanozla birlikte Campygen (CN 025) kullan labilir.

(b) Ön zenginle tirme ortam ndan 0,1 ml al narak 10 ml Fraser broth içeren ikinci zenginle tirme ortam na aktar l r. 35 veya 37°C de 48 saat inkübe edilir. nkübasyon bitiminde ikinci zenginle tirme ortam kullan larak (a) da belirtilen uygulama tekrar edilir.

69

8.3. Listeria monocytogenes Do rulam a Test i *

Oxford agar üzerindeki tipik koloniler 2-3 mm çap nda, etraf nda koyu kahverengi veya siyah zon bulunan (eskülin hidrolizine ba l olarak), ortas çukur görünümdedir. Listeria PALCAM agar üzerinde ise 1,5-2 mm çap nda, ye il renkli ve siyah zonla çevreli (merkezleri de siyah olabilir) koloniler olu turmaktad r. Do rulama testinde kültür safla t r l r, Henry I kland rma sistemi kullan larak mavi, mavi-ye il veya mavi-gri renkte ve granüler yap daki koloniler seçilir, kültüre hareketlilik ve Gram boyama testleri uygulan r. Patojen Listeria türlerinin yuvarlanarak hareket etmesi onlar h zl ve do rusal hareket eden patojen olmayan Listeria türlerinden ay r m n sa lar. Listeria yap kan, k sa, Gram- pozitif, spor olu turmayan çubuk eklindedir. Katalaz ve oksidaz testleri yap l r. Listeria katalaz pozitif, oksidaz negatiftir. Daha sonra D-glukoz, D-salisin, L-ramnoz ve D-ksiloz testleri, nitrat indirgeme, ve Staphylococcus aureus ve Rhodococcus equi ile CAMP testleri uygulan r. Alternatif olarak kit sistemleri de kullan labilmektedir.

O.B.I.S. Mono

Listeria seçici besiyerindeki benzer görünü lerden dolay Gram-pozitif, katalaz pozitif, oxidase negatif koloniler Listeria türlerinden biri olabilir. Listeria monocytogenes in do rulanmas ise uzun süren pek çok identifikasyon i lemi gerektirmektedir. O.B.I.S mono ile bu ihtiyaca hemen cevap verebilmek mümkündür.

* ISO 11290-1:1997 (Harrigan, 1998)

70

OBIS Listeria monocytogenes d ndaki tüm Listeria türleri taraf ndan üretilen mono D-alanyl aminopeptidase (DALAase) i tespit eder. Bu enzimin varl üpheli kolonilerin Listeria monocytogenes olmad n do rulayan keskin bir renklenme ile belirginle ir. Renklenme olmamas durumunda üpheli koloniler Listeria monocytogenes olarak ele al nmal d r.

Lister ia Biyokim yasal dent ifikasyon Kit ler i Listeria n n tür tayini için ticari olarak identifikasyon kitleri bulunmaktad r. Bunlardan biri de Oxoid Microbact Listeria Kiti dir. (Microbact 12 L) Bu sistem klinik ve g da numunelerinden izole edilen Listeria spp. in identifikasyonu için kullan l r.

A a daki türler Microbact 12L sistemi kullan larak tan mlanabilir.

L.monocytogenes

L.innocua

L.seeligeri

L.ivanovii

L.welshimeri

L.grayi

Microbact 12 L Sistemi Listeria spp. nin identifikasyonu için kullan lan geleneksel biyokimyasal substratlara benzeyen standardize edilmi mikro-substrat sistemidir. Her bir identifikasyon sistemi 12 testten olu ur (11 farkl eker kullan m testi ve h zl hemoliz testi). ekerlerin ya da koyun k rm z kan hücresinin bulundu u

kuyucuklarda inkübasyon periyodu s ras nda olu an reaksiyonlar renk de i imi ile gözle görünür hale gelir.

Microbact 12L tek bir koloniyi 18-24 saat inkübe ederek kullan labilece i gibi, inokülum 0,5 MacFarland a ayarland nda, 4 saatlik h zl bir test olarak da kullan labilir.

nkübasyon sonras nda, reaksiyonlar ç plak gözle okunabilir ve bilgisayar program ile yorumlanabilir.

71

Organizman n identifikasyonu, yay nlanm referans metodolojilerde bahsedildi i gibi pH de i iklikleri ve substrat kullan m esas na dayand r lm t r(1,2). Her bir kuyucuktaki substrat, reaksiyon prensibi ve renk de i imleri için a a daki reaksiyon tablosuna bak n z.

REAKS YON TABLOSU

Reaksiyon sonucu

Kuyucuk

No Substrat Reaksiyon

Negatif Pozitif

Yorum

1 Esculin Esculin hidrolizi

Sar

Siyah 2 Mannitol

Mor Sar

3 Xylose Mor Sar

4 Arabitol Mor Sar

5 Ribose Mor Sar

6 Rhamnose Mor Sar

7 Trehalose Mor Sar

8 Tagatose Mor Sar

9 Glucose-1- Phosphate

Mor Sar

10 Methyl-D- Glucose

Mor Sar

11 Methyl-D-Mannose

Spesifik ekerlerin

kullan m asit özelli i ta yan son ürünlerin olu mas na sebep olur.

Mor Sar

Bromocresol Purple indikatörü asitli ortamda renk de i tirir.

NOT: 4 saatlik inkübasyonun ard ndan pozitif reaksiyon pozitif sar ya geçi gösteren kahverengi/saman sar s renk sergileyebilir

12 Hemoliz K rm z kan hücrelerinin hemolizi

K rm z hücre

Kahve rengi

E er hemolizin varsa, kuyucukda kahverengile me ile sonuçlanan k rm z hücre hemolizi gerçekle ir. *

72

* Hemolizinin yoksa bozulmam k rm z hücreler kuyucu un alt na çöker ve k rm z tortu olu ur. 8.4. Listeria spp. H zl Analiz Yöntem leri

H zl tarama testlerinde ön veya ikinci zenginle tirme ortam ndan al nan kültür uygun bir ELISA kiti kullan larak analiz edilebilir (Harrigan, 1998).

Oxoid Listeria Rapid Test K T ( FT4 0 1 ) ile Lister ia Analizi *

Oxoid Listeria Rapid Test kolay uygulanabilen ve g dalardan ve çevreden al nan örneklerde 43 saat içerisinde kesin sonuç veren, AOAC ve AFNOR (Association Française de Normalisation Tour Europe) taraf ndan onaylanm bir yöntemdir.

Testte Listeria türlerinin ortamdan maksimum düzeyde geri kazan lmas ve flagella geli iminin sa lanmas amac yla iki a amal zenginle tirme i lemi uygulanmaktad r. Her biri 21 saat süren zenginle tirme i lemlerinden sonra s t l p ard ndan so utulmu olan örnek test ünitesi üzerindeki bölmeye aktar l r ve 20 dakika içinde sonuç al n r. Ba l ca Listeria türleri di er bakterilerden farkl olarak ortak bir B flagella antijeni içerirler. Is l i lem (80 C) uygulamas ile Listeria bakterileri içindeki flagellin proteininin aç a ç kmas sa lan r.

Oxoid Clearview Listeria Test Ünitesi gözenekli bir membran eritten olu maktad r. Bu erit üç pencereden ibaret olan plastik bir k l f içerisindedir. Bu pencerelerden birincisi örne in eklenmesi, ikincisi test sonucunun gözlenmesi, üçüncüsü ise test ünitesinin do rulu unun kontrolu içindir. Test ünitesi Listeria türlerine özgü B flagella antijenlerine spesifik monoklonal antikorlar içerir. Ekstrakte edilen antijen, membran üzerindeki; antikor ile i aretlenmi mavi lateks içeren örnek penceresine ilave edildi inde antijen/lateks kompleksi olu ur. Bu kompleks hat üzerinde k lcal hareket ile sonuç penceresindeki sabitlenmi monoklonal anti-flagellin antikoruna do ru yönelir. Antijen/lateks kompleksi ve

* The Oxoid Listeria Rapid Test incorporating ClearviewTM Listeria , Folio No:460,

461 (**)Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8th Ed., Oxoid Ltd., Hampshire.

73

sabitlenmi spesifik monoklonal antikor aras nda reaksiyon olu tu unda sonuç penceresinde mavi bir hat gözlenir. E er hiç flagella ant jeni yok ise sonuç penceresinde renk de i imi gözlenmez. Antijen ile kompleks olu turmayan antikor ile i aretlenmi mavi lateks fazlas hat üzerinde ilerlemeye devam eder ve kontrol penceresinde sabitlenmi spesifik olmayan poliklonal antikor ile reaksiyona girerek kontrol penceresinde mavi bir hat olu turur. Kontrol penceresinde olu an bu mavi hat testin do ru ekilde uyguland n gösterir.

Kit içer i i

Oxoid Half Fraser Supplement (SR 166M)

Clearview Test Üniteleri

Pozitif Kontrol Reaktifi

Kullan lan besiyerler i ve gerekli m alzem eler

Oxoid Fraser Broth (CM 895)

Oxoid Buffered Listeria Enrichment Broth (BLEB) (CM 897)

Oxoid Listeria Selective Enrichment Supplement (SR 141E)

nkübatör 30 2°C

Su banyosu 80 2°C

Cam tüpler 5-8 ml kapasiteli

Ster il su/ etanol kar m 1: 1 (hacim / hacim )

1. Ön Zenginle t irm e: Oxoid Fraser Broth (CM895) besiyerinden 28,7 g tart larak 500 ml dam t k su içinde s t larak eritilir, erlenlere 225 er ml da t l r ve 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. 225 ml Fraser broth içerisine; Listeria rapid test kiti içinde bulunan Half Fraser Supplement (SR166M), 4 ml distile su/etanol (1:1) kar m nda eritilerek ekimden hemen önce ilave edilir (Half Fraser Broth). G da örne inden 25 g tart larak, Half Fraser Broth a ilave edilir ve homojenize edilerek 30 C de en az 21, en çok 24 saat olmak üzere inkübasyona b rak l r.

74

2. kinci Zenginle t irm e: Oxoid Buffered Listeria Enrichment Broth (CM897) besiyerinden 23,5 g tart larak 500 ml dam t k su içinde s t larak eritilir, deney tüplerine 10 ar ml da t l r ve 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. 10 ar ml lik Buffered Listeria Enrichment Broth ortam na, % 70 lik 2 ml etanolde eritilerek haz rlanm olan 40 l Listeria Selective Enrichment Supplement (SR 141E) eklenir. Haz rlanan bu ikinci zenginle tirme ortam na ön zenginle tirme ortam ndan 0,1 ml inoküle edilir ve 30 C de en az 21, en çok 24 saat olmak üzere inkübasyona b rak l r.

75

nkübasyon sonras

ikinci zenginle tirme ortam n n üst k sm ndan

sarsmadan 2 ml al n p küçük bir deney tübüne ( 5 ml lik ) aktar l r ve 80 C de su banyosunda 20 dakika tutulurak flagella antijeninin ekstraksiyonu sa lan r. Daha sonra su banyosundan al narak oda s cakl na kadar so umas beklenir.

1. Test kiti orijinal ambalaj ndan ç kar l r, düz bir zemine konularak oda s cakl na gelmesi beklenir. Test kitinin alt penceresine, yukar da belirtildi i ekilde s l i lemden geçirilerek haz rlanm olan ekstrakttan mikro pipetle 135 l (pencere d na ta rmadan) aktar l r ve 20 dakika içinde reaksiyon vermesi beklenir.

76

Sonuç penceresinde mavi hat olu uyorsa Listeria pozitiftir. Kontrol penceresinde ise her zaman mavi hat olu ur; bu durum kitin çal t n gösterir. Sonuç ve kontrol pencerelerinde geli en mavi hatt n renk yo unlu u farkl olabilir, ancak bu farkl l k sonuçlar n de erlendirilmesinde dikkate al nmamal d r. Çok az bir olas l kla da olsa sonuç penceresinde kuvvetli bir mavi hat olu mas na kar l k kontrol penceresinde mavi hat görülmemesi flagella antijeninin oldukça yüksek düzeyde oldu unu gösterir. Bu durumda kontrolün sonuç vermesi için ekstrakt tamponlu Listeria zenginle tirme besiyeri ile 1:10 oran nda seyreltilerek test tekrar edilir. Ekstrakt n bir saatten fazla beklememi olmas na dikkat edilmelidir.

Not: Çal maya ba lamadan önce kitin denenmesi için test paketi içinden ç kan ve liyofilize flagella antijenini içeren pozitif kontrol tüpü 2 ml steril su içinde çözündürülür ve test kitinin alt penceresine 135 l aktar l r. ki pencerede de mavi hat olu umu beklenir.

Pozitif sonuçlarda Listeria n n tür düzeyinde belirlenmesi istendi inde ikinci zenginle tirme besiyerinden Oxford Agar (CM 856) veya PALCAM Agar (CM 877) gibi selektif bir agara ekim yap l r, üreyen tipik koloniler seçilerek biyokimyasal testlere geçilir.




Gaman, P.M., Sherrington, K.B. 1996. Food poisoning The Science of Food . s. 235-256. Pergamon Press


Roccourt, J., Cossart, P. 1997. Listeria monocytogenes. Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers (Ed. M.C. Doyle, L.R. Beuchat, T.J. Montville), s. 337-352. ASM Press, Washington D.C.

77

9. Escherichia coli O157:H7 ve Analiz Yöntemleri

Escherichia coli nin baz alt türleri patojendir. Enterovirulent E. coli (EEC) olarak adland r lan bu türler çe itli alt gruplara ayr l r. Patojen özellikteki E. coli tipleri ve neden olduklar hastal klar a a da verilmi tir (Doyle ve ark., 1997; FDA, 1998):

E. coli Neden Olduklar Hastal klar

Enterotoksijenik E. coli (ETEC) Mide ba rsak rahats zl klar Enterotopatojenik E. coli (EPEC) Bebeklerde diyare Enterotohemorajik E. coli (EHEC/VTEC) Kolit Enterotoinvazif E. coli (EIEC) Basilli dizanteri Enteroadharent E. coli (EAEC) Enteroaggregative E. coli (EaggEC)

EHEC kolit benzeri hastal k etkenidir. Üretti i verotoksinin kanl diyare ve iddetli kar n a r lar na neden oldu u belirtilmektedir. Bakterinin ba l ca

bula ma yollar yeterince pi irilmemi et ve et ürünleridir. Verotoksijenik E. coli O157:H7 (EHEC/VTEC) bakterisi 44°C de çok zay f geli me göstermektedir. Taksonomistlerin ço unlu u enteroinvasif E. coli nin (EIEC) belli Shigella türleri ile benzer özellikte oldu unu belirtmektedirler. EIEC hareketsiz olup, laktozu çok yava fermente etmekte veya hiç etmemektedir. VTEC ve EIEC koliform bakteri analiz yöntemleri ile saptanamamakta, özel test yöntemlerine gereksinim duyulmaktad r (Harrigan, 1998).

lk izole edilen insan patojeni E. coli VTEC tir ve çe itli ülkelerde kaydedilen vaka say lar nda art lar görülmektedir. Neden oldu u hastal klar n ciddiyeti dikkate al narak çe itli g da gruplar nda ara t r lmas büyük önem ta maktad r. Bu amaçla çok say da teknik geli tirilmi ve geli tirilmektedir. Ancak, infeksiyon dozunun dü ük olmas laboratuar çal anlar için de bir tehlike kayna olu turmakta, laboratuar kaynakl vakalar da kaydedilmektedir (Harrigan, 1998).

78

E. coli O157:H7 analizi yap lacak örnekler laboratuarda hemen analize al nmal , örne in dondurulmas ndan kaç n lmal d r. Örnek mikrobiyolojik bozulmaya u rayabilecek nitelikte ise so ukta bekletilmelidir. Ancak, patojen tiplerinin büyük ço unlu u canl l klar n 6°C de kaybedebilmektedirler (FDA, 1998).

9 .1 . Koloni Say m Yöntem i

E. coli O157:H7 izolasyonunda laktoz yerine %1 sorbitol içeren MacConkey s agar (Oxoid CM 813) kullan labilmektedir. Bu ortam Cefixime-Tellurite Supplement (SR 172) ilave edilerek (CT-SMAC) daha seçici bir hale getirilebilmektedir. Petriler 37°C de inkübe edilmeli ve sorbitolü fermente etmeyen koloniler incelenmelidir. Hafnia ve Escherichia hermanii de ayn reaksiyonu gösterdikleri için E. coli O157:H7 nin do rulanmas için serolojik testlere gereksinim duyulmaktad r. Laboratuar incelemelerinde sorbitol pozitif E. coli O157:H7 mutantlar seçilmelidir (Harrigan, 1998).

Dü ük miktarlardaki E. coli O157:H7 say mlar nda g da maddesinin VCC (vancomycin-cefixime-cefsulodin) Selective Supplement (SR 190) ya da Novobiocin Supplement (SR 181) içeren Modified Tryptone Soya Broth (CM 989) ile 10-1 lik seyreltimi haz rlan r, 37°C de inkübe edilir ve ard ndan CT-SMAC üzerine ekim yap l r. En hassas sonuçlar n s v zenginle tirme ortam ndan immunomanyetik ay rma ve ard ndan manyetik bilyeleri CT-SMAC üzerine inokule ederek al nd belirtilmektedir (Harrigan, 1998).

9.1.1. Sorbitol Mac Conkey Agar (SMAC) with BCIG (Oxoid CM 981)

Besiyerinde Escherichia coli O157: H7 Say m

*

* Oxoid Culture Media Sorbitol Mac Conkey Agar (SMAC) with BCIG Oxoid Folio No.657

79

Besiyeri , -glucuronidaz enzimi için bir substrat görevi yapan 5-bromo 4-chloro-3-indol - - D-glucuronide (BCIG) içerir. E. coli O157:H7 su lar nda -glucuronidaz enzimi yoktur. E.coli O157:H7 su lar besiyerindeki sorbitolu fermente edememeleri ve -glucuronidaz enzimi içermemeleri nedeniyle aç k sar (saman) renkli koloniler olu turmaktad rlar. -glucuronidaz aktivitesine sahip olan mikroorganizmalar BCIG substrat n parçalayarak indoksil (halojen indoksil) olu umuna neden olurlar. Olu an indoksil de oksitlenerek kolonilerin mavi/ye il renk almas n sa lar. Besiyerindeki sorbitol pozitif koloniler pembe-k rm z ; glukuronidaz pozitif koloniler mavi, sorbitol pozitif / glucuronidaz pozitif koloniler ise mor renk olu tururlar.

Sorbitol Mac Conkey Agar (SMAC) with BCIG (CM981) besiyerinden 51,6 g tart l r, 1 L dam t k su içinde s t larak eritilir. Daha sonra 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; 50 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda steril petrilere dökülür.

Not: E.coli O157:H7 aranacak örnekte yüksek say da Gram negatif bakterilerin bulunabilece i tahmin ediliyorsa ortama Cefixime tellurit selektif katk maddesi (SR172) ilave edilerek besiyeri daha seçici hale getirilebilir. Bu amaçla sterilizasyon sonras 50 C ye so utulan 500 ml SMAC besiyerine 2 ml dam t k su içinde eritilmi olarak 1 vial SR172 kat l r.

G da maddesi 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir (10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3,...). Her seyreltimden besiyeri içeren steril petri kutular na 0,1-0,5 ml al narak yüzeye yayma yöntemiyle ekim yap l r. Petriler 24 saat 35-37 C de inkübasyona b rak l r.

Sorbitol Mac Conkey Agar (SMAC) with BCIG besiyerinde E.coli O157:H7 su lar sorbitolu fermente etmez ve renksiz koloni olu tururken di er E.coli su lar sorbitolu fermente eder ve pembe renkli koloniler olu tururlar. Saman sar s renkteki sorbitol negatif ve glucuronidaz negatif koloniler E.coli O157:H7 Latex Test (DR 620) veya Dryspot E.coli O157:H7 (DR120M) de do rulanmal d r. Do rulama i leminden sonra

80

saman sar s koloniler say l r ve seyreltim faktörü ile çarp larak E.coli 0157:H7 say s belirlenir.

9.1. Dryspot E.coli O1 5 7 Latex Test ( DR 1 2 0 M) ile Do rulam aTest i *

Dryspot E.coli 0157 latex test, sorbitolu fermente etmeyen renksiz E.coli O157 kolonilerinin aglutinasyon testi ile do rulanmas esas na dayan r. DR 121M kartlar antikor emdirilmi mavi lateks partikülleri ile kaplanm t r. E. coli O157:H7 antijenleri ile reaksiyonlara giren antikorlar kart üzerinde aglütinasyon (p ht la ma) olu tururlar. Dryspot lateks kitleri k sa sürede sonuç veren bir yöntem olmas yan nda, oda s cakl nda saklanabilmesi, raf ömrünün uzunlu u ve ayr bir lateks ve kontrol aglutinasyon çözeltisine gerek duyulmamas gibi avantajlara sahiptir.

Kit içer i i

DR 121 M Dryspot E.coli O157 reaksiyon kart lar

DR 122M Pozit if kont rol er it ler i (st r ips)

DR 123M Negat if kont rol er it ler i

Kar t rm a çubuklar

Plast ik po et klipsler i

1. DR 121M kartlar po et üst k s mdan aç larak ç kar l r, gerekli miktarda kart al nd ktan sonra nem almamas için po etin a z kitin içinden ç kan klipslerle kapat l r.

81

2. Reaksiyon kart nda bulunan test ve kontrol dairelerine birer damla fizyolojik tuzlu (%0,85 NaCl a rl k/hacim ) su damlat l r .

3. Steril öze kullanarak üpheli kolonilerden 2-5 adet al n r, test halkas ndaki ve kontrol halkas ndaki fizyolojik tuzlu su içinde parçac k kalmayacak ekilde süspanse edilir. Bu i lemler s ras nda her iki dairedeki kültür ayr bir öze ile kar t r lmal d r.

* Dryspot E.coli 0157:H7 latex test Oxoid Folio No. 650, (**)Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual, 8th Edition . Oxoid Ltd., Hampshire

82

4. Kitin içinden ç kan kar t rma çubuklar yard m yla fizyolojik tuzlu su ve kültür süspansiyonu kurutulmu mavi parçac klar ile halkan n ucuna kadar yay l r. Kart 60 saniye boyunca dairesel olarak kar t r l r ve normal k alt nda aglutinasyon incelenir.

60 saniye içinde test halkas nda gözlenen aglutinasyon su un E. coli O157 oldu unu gösterir. 60 saniye geçtikten sonra olu an aglutinasyon dikkate al nmamal , kontrol halkas nda aglutinasyon olu mamal d r. Her iki halkada da aglutinasyon gözlendi inde test tekrarlanmal d r. lem bittikten sonra reaksiyon kart dezenfektan içine at lmal veya otoklavda dekontamine edilmelidir.


Doyle, M.P., Zhao, T., Meng, J., Zhao, S. 1997. Escherichia coli O157:H7.. Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers (Ed. M.C. Doyle, L.R. Beuchat, T.J. Montville), s. 171-191. ASM Press, Washington, D.C.


Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology Academic Press, San Diego.

Roberts, D., Hooper, W., Greenwood, M. 1995. Practical Food Microbiology. Public Health Laboratory Service, London (Al nm t r; Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology , Academic Press, San Diego).

83

10. Campylobacter jejuni ve Analiz Yöntemleri

Campylobacter A.B.D. de pek çok barsak hastal n n en önemli unsuru olarak dü ünülmektedir. (20,26). Campylobacter türleri hafif ishal ya da kanl ishale kadar iddetli ishale sebep olabilir. nsanlardan elde edilen izolatlar n %99 undan fazlas n C. jejuni, C. coli, ve C. lari olu turmaktad r. (C. jejuni %90). Campylobacter türlerinin enfeksiyon yap c özellikleri oldukça yüksektir. C. jejuni nin hastal k yapma dozu su a, çevresel etkilerden dolay zarar görmü olmas na ve ki inin hassasiyetine ba l olarak 500 ile 10.000 hücre aras nda de i mektedir. Enfeksiyonlar menenjit, pnömani, dü ük ve Guillain-Barré sendromunun iddetli bir formudur. Hastalardan C. fetus un 42°C de üreyen s ya

toleransl su lar izole edilmi tir. Campylobacterler pek çok vah i ve evcil hayvan n özellikle ku lar n barsaklar nda bulunur. Campylobacter ili kili hastal klar n %70 i bu hayvanlardan bula m g da ve sular n tüketilmesinden kaynaklanmaktad r. Bu g dalar aras nda pastörize edilmemi süt, et, tavuk, kabuklu deniz hayvan , meyve ve sebze bulunmaktad r. C. jejuni nemli, 4°C de, dü ürülmü oksijen ko ullar nda 2-4 hafta canl l n devam ettirebilir. -20°C de 2-5 ay dayanabilirler , ancak oda s cakl nda yaln z birkaç gün ya ayabilirler. Havaya maruz kalmak, kurutma, dü ük pH, s tma, dondurulma ve uzun süreli saklama gibi çevresel etkiler hücrelere zarar verir ve bakterinin izolasyonu zorla r. Daha eski ve çevresel etki alt ndaki organizmalar yava yava koka benzer ekil al r ve besiyeri ortam nda izole edilmesi zorla r. Önzenginle tirme, ve mikroaerobik ko ullar n sa lanmas n n yan s ra besiyerinde hemin ve kömür gibi oksijen giderici maddeler Campylobacter in geri kazan m n art r r.

Süt Ürünleri

Örne in pH 7,6 ya getirilir. 12,000xg de 40 dakika Santrifüj yap l r. Süpernatan at l r. Çöken k s m 10 ml Antibiyotikli Bolton Broth içerisine al n r. 90 ml Bolton Broth içerisinde 35 C de mikroaerobik ko ullarda 4

84

saat önzenginle tirme yap l r. 42 C de mikroaerofilik ko ullarda 20-44 saat zenginle tirme için inkübasyonda tutulur.

11. Vibrio parahaemolyticus ve analiz yöntemleri

Vibrio ailesi Gram negatif, iki türü d nda Oksidaz pozitif çubuk ya da k vr ml çubuk eklinde fakültatif anaeroblard r. Pek çok Vibrio türü insanlarda hastal k yap c d r ve g da zehirlenmelerinde rol oynar. V.cholerae ve V.mimicus d ndaki Vibrio türleri sodyum klorürün az bulundu u besiyerlerinde geli emez, bu sebeple halofilik bakteriler olarak nitelendirilirler.

Vibrio parahaemolyticus analizi

30 gram toz Alkaline Peptone Water (CM 1028) 1 litre dam t k su içerisinde çözündürülür. yice kar t r l r ve 9 ar ml olacak ekilde tüplere aktar l r. Otoklavda 121 °Cde 15 dakika sterilize edilir. 88 gram toz TCBS Medium (CM 333) 1 litre dam t k su içerisinde çözündürülür. Tamam yla çözünmesi için kaynay ncaya kadar s t l r. Otoklavda sterilize edilmez. Petrilere dökülür.

Aseptik ko ullarda 50 gram deniz ürünü 450 ml %2-3 lük dilüsyon s v s ya da PBS (pH: 7,2-7,5)içerisine al n r, steril bir blend r kab nda 2 dakika yüksek h zda çevirilerek homojenize edilir. PBS kullan larak ileri seyreltimleri yap l r. EMS yöntemi ile ekim yap l r, her bir seyreltimden 1ml al narak 10ml Alkaline Peptone Water içeren 3 er adet tüpe aktar l r.Tüpler 16-18 saat 35-37Cde inkübe edilir.

Not: Tüplere yap lan ekimin seyreltim haz rland ktan 15-20 dakika içerisinde gerçekle mesi gerekmektedir.

nkübasyondan sonra tüpler sallanmamal d r. Vibrio parahaemolyticus izolasyonu için bulan k bir tüp içeren tüm dilüsyonlar ve en az bir dilüsyon büyü ü herbir zenginle tirme besiyerinin üstünden 1 öze dolusu al narak TCBS Agar petrilerine çizilir. TCBS petrileri 35-37Cde 18-24 saat inkübe edilir. nkübasyonun ard ndan TCBS agar petrileri kontrol edilir. Her bir petriden 3 ya da daha fazla tipik, üpheli koloni al n r ve ileri testlere geçilir.

85

11. Bakteriyel Toksin Analizleri

Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ve C. perfringens enterotoksinleri gibi toksin analizlerinde kullan lan kitler immunolojik teknikler esas al narak haz rlanmaktad r. Bu amaçla ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) veya RPLA (reversed passive latex agglutination assay) yöntemlerinden yararlan lmaktad r. ELISA yönteminde kullan lan baz kitler microtitre plaklardan olu urken, di er kitlerde kaplanm tüpler veya polistren bilyeler kullan lmaktad r. Sonuçlar gözle (pozitif/negatif) veya bir cihazdan yararlan larak de erlendirilmektedir. RPLA sisteminde spesifik bir antikorla veya normal serumla kaplanm lateks boncuklar örne in mikrotitre plak içindeki seyreltimlerine ilave edilir. Antijen mevcutsa lateks boncuklar antijen-antikor reaksiyonuna ba l olarak kafes eklinde, yoksa dü me eklinde bir yap olu maktad r. Kontrol ve duyarl hale getirilmi lateks aras ndaki fark gözle izlenebilmektedir (Brett, 1998).

10.1. Staphylococcus aureus Enterotoksinleri Analiz Yöntemi

10.1.1. SET - RPLA (TD 900) Kiti ile Stafilokok Enterotoksinleri A, B, C

ve D Analizi *

SET-RPLA Testi pek çok g dada ve kültür filtratlar ndaki S. aureus izolatlar nda enterotoksin varl n saptamak için kullan lan bir yöntemdir. Testin duyarl l 0.5 ng/ml dir.

Polistren lateks partikülleri safla t r lm A, B, C ve D tipi stafilokok enterotoksinleri ile immünize edilmi tav anlardan elde edilen safla t r lm antiserumla duyarl hale getirilmi tir. Bu lateks partikülleri enterotoksinlerin varl nda aglütinasyon olu turur. Kontrol reaktifi ise immunize edilemeyen tav an globülinleri ile duyarl hale getirilmi lateks partikülleri içerir. Test V kuyucuklu mikrotitre plaklar nda gerçekle tirilir. G da ekstraktlar n n veya kültür filtratlar n n seyreltimleri, kuyucuklar n be s ras kullan larak yap l r, uygun hacimde lateks suspansiyonu her bir

* SET-RPLA Staphylococcal Enterotoxins A, B, C and D Test Kit, Folio No. 255A

86

kuyucu a ilave edilir ve kar t r l r. Stafilokok enterotoksinlerinden biri mevcutsa kafes yap l aglütinasyon olu ur, kuyucu un taban nda yay lm bulan k bir tabaka meydana gelir. Stafilokok enterotoksinleri yok ise veya konsantrasyonu testin saptama limitinden daha dü ükse, kafes yap s olu maz, s k yap l dü me görünümünde bir yap gözlenir. Kitin içinde bulunan seyreltim s v s , g da matriksi bile enleri ile olu abilecek spesifik olmayan reaksiyonlar n görülme s kl n azaltan sodyum hekzamatafosfat içermektedir.

Kit içer i i

TD 901 anti-enterotoksin A ile duyarl hale get ir ilm i lateks

TD 902 anti-enterotoksin B ile duyarl hale get ir ilm i lateks

TD 903 anti-enterotoksin C ile duyarl hale get ir ilm i lateks

TD 904 anti-enterotoksin D ile duyarl hale get ir ilm i lateks

TD 905 Lateks kontrol

TD 906 Staphylococ enterotoksin A kontrol

TD 907 Staphylococ enterotoksin B kontrol

TD 908 Staphylococ enterotoksin C kontrol

TD 909 Staphylococ enterotoksin D kontrol

TD 910 Dilüent (seyrelt im s v s )

Gerekli ekipman ve malzemeler:

Blender vb. homojenizatör

Mikrot it re plaklar ( V kuyucuklu ) ve kapaklar

Mikropipet (50µl), Santrifüj 0,2 0,45 µm gözenekli membran filtre (Millipore SLGV gibi)

Sodyum klorür çözeltisi (% 0,85 a rl k/ hacim )

Sodyum hipoklor it çözelt isi ( > % 1,3 a r l k/ a r l k)

1 N hidroklorik asit

G dalardan toksin ekst raksiyonu

1. 10 g örnek üzerine 10 ml % 0,85 lik NaCl çözeltisi eklenir,

87

kar t r l r/ homojenize edilir. 2. So utmal santrifüjde 900g de 30 dakika 4°C kar m satrifüj

edilir (so utmal santrifüj yoksa kar m önceden 4°C ye so utularak i lem yap l r).

3. Üstteki k s m (yüzen k s m) 0,2-0,45 m gözenekli filtreden süzülür.

4. Elde edilen filtrat toksin analizinde kullan l r. Kültürden toksin ekstraksiyonu

1. zole edilen mikroorganizmalar Tryptone Soya Broth a (CM129)

inokule edilerek tercihan çalkalanarak 18-24 saat 37 C de inkübe edilir.

2. Geli me gözlendikten sonra örnek 900g de 20 dakika santrifüje edilir veya 0,2-0,45 m gözenekli dü ük protein-ba layan membran filtreden süzülür.

3. Elde edilen filtrat toksin analizinde kullan l r.

Kontrol

Her toksin kontrol solüsyonu kendine uygun duyarl lateks ile aglütinasyon olu turur. Toksin kontrol solüsyonlar , pozitif sonuçlar bulundu u zaman referans olarak kabul edilebilecek gözlem sa lamak veya test lateksinin do ru çal p çal mad n do rulamak amac yla kullan lmal d r.

lem

1. Lateks reaktifleri (TD901, 902, 903, 904, 905) ve seyreltim s v s (TD910) kullan lmak üzere haz rlan r. Lateks reaktifleri kullan lmadan önce iyice çalkalanarak homojenize edilmelidir. Kontrol reaktiflerini suland rmak için her bir vial içerisine 0,5 ml seyreltim çözeltisi ilave edilir ve tamamen çözününceye kadar çalkalan r.

2. Her bir s ra 8 kuyucuk içerecek ekilde microtitre plaklar düzenlenir. Her bir numune için bu ekilde düzenlenmi 5 s raya ihtiyaç vard r.

3. Mikropipet kullan larak 25 µ l seyreltim s v s 5 s ran n her bir kuyucu una bo alt l r.

88

4. 5 s ran n her birisinin ilk çukuruna 25 µ l test örne i eklenir. 5. Pipet veya seyreltim s v s kullan larak her bir s ran n ilk

kuyucu undan ba layarak 25 µ l al n p her 5 s ra boyunca paralelli seyreltim yap l r. Son kuyucuk yaln z seyreltim s v s içerecek ekilde 7. çukurda i lem durdurulur.

6. Birinci s radaki her bir kuyucu a 25 µl anti-enterotoksin A'ya duyarl lateks eklenir.

7. kinci s radaki her bir çukur içerisine 25 µ l anti-enterotoksin B'ye duyarl lateks eklenir.

8. Üçüncü s radaki her bir çukur içerisine 25 µ l anti-enterotoksin C'ye duyarl lateks eklenir.

9. Dördüncü s radaki her bir çukur içerisine 25 µl anti-enterotoksin D'ye duyarl lateks eklenir.

10. Be inci s radaki her bir çukur içerisine 25 µ l kontrol lateksi ilave edilir.

11. Kuyucuk içeriklerini kar t rmak için mikrotitre plak mikromikserle veya elle çalkalan r.

12. Buharla madan sak nmak için, mikrotitre plak bir kapak ile örtülür veya nemli bir ortama yerle tirilir. Plak 20-24 saat boyunca oda s cakl nda sa lam bir zemin üzerine sars lmayacak ekilde b rak l r. Mikrotitre pla n siyah bir ka t üzerine yerle tirilmesi sonuçlar n kolayl kla gözlenebilmesi aç s ndan yarar sa layacakt r.

13. Her s rada kuyucukda aglütinasyon olup olmad siyah zemin üzerinde kontrol edilir.

14. Deneylerde kullan lan santrifüj tüpleri, membran filtreler, mikrotitre plaklar , kapaklar ve pipet uçlar 121°C 'de 15 dakika otoklavda sterilize edilmeli veya at lmadan önce hipoklorit solüsyonu (%1,3 a rl k/a rl k) içinde dezenfekte edilmelidir. Kültür ve g da ekstraktlar , numuneler ve toksin kontrolleri de hipoklorit çözeltisinde dekontamine edildikten sonra at lmal d r.

Sonuçlar n de erlendir ilm esi

Dü me görünümü negatif, a /kafes eklindeki bulan k görünüm pozitif olarak yorumlanmal d r. Kontrol lateksi içeren son kuyucuklar negatif olmal d r. Aglütinasyon olu umu a a daki örnek dikkate al narak

89

de erlendirilmelidir.

(+) , (++) ve (+++) olarak s n fland r lan sonuçlar pozitif olarak kabul edilir

Not: Baz Staphylococcus su lar n n birden fazla enterotoksin üretebildi i, ayr ca koagülaz (-) stafilokoklar n da enterotoksin olu turabildi i dikkate al nmal d r. Testin duyarl l test ekstrakt nda 0,5 ng/ml dir. G da ekstrakt 1:1 oran nda seyreltilerek haz rland nda duyarl l k 1 g g da matriksi için 1 ng olmaktad r. Testin saptama limiti g da matriksinin türüne ba l olarak belirlenen seyreltim oranlar na göre de i ecektir. G da ekstrakt nda bulunan enterotoksin konsantrasyonu, uygulanan ekstraksiyon metodunun farkl l ndan (örne in ultrafiltrasyon) etkilenebilmektedir.

Stafilokok kültürlerinin enterotoksin üretimleri geli me ko ullar na ba l d r. Kültür ortam nda bir veya daha çok Stafilokok enterotoksini üreten su lar n, in vivo olarak da bu seviyelerde toksin üretimi olaca n göstermez.

10.2. Clostridium perfringens Enterotoksin Analiz Yöntemi

C. perfringens den kaynaklanan vakalar n belirlenmesinde g dan n en az 105 kob/g C. perfringens içermesi veya d k da enterotoksin saptanmas olmak üzere ba l ca iki kriter dikkate al nmaktad r. C. perfringens in serotiplerinin belirlenmesi dünyada birkaç laboratuarda yap labilmekte, organizma so uk muhafazada canl l n k sa sürede yitirebilmekte ve ya l bireylerde hastal k gözlenmese de d k da yüksek düzeylerde C.

perfringens saptanabilmektedir. Bu nedenle toksin analizi bir g da

90

zehirlenme vakas nda zehirlenme etkeni g dan n bulunmamas , antibiyotik tedavisi gibi durumlarda yararlan labilecek en güvenilir yöntem olarak ortaya ç kmaktad r (Brett, 1998).

10.2.1. PET-RPLA (TD 930) Kiti ile Clostridium perfringens

Enterotoksin Analizi *

PET-RPLA test kiti bakterilerin kültür filtratlar nda veya fekal materyalde C. perfringens tip A enterotoksininin h zl ve güvenilir olarak belirlenmesi amac yla geli tirilmi tir. Fekal materyal toksini yüksek miktarlarda içerdi i için bakteri kültürüne göre daha fazla tercih edilen analiz materyalidir. Test, standart aglutinasyon testlerine göre daha duyarl d r. Standart aglütinasyon testlerinde çözünebilir antikorun spesifik bir antijen ile reaksiyonu, RPLA testinde ise lateks partiküllere ba l antikorlar n çözünebilir antijen ile reaksiyonu esas al n r. Lateks partikülleri reaksiyona kat lmazlar, ancak antijen-antikor reaksiyonunu belirginle tirirler. Polistren lateks partikülleri safla t r lm C. perfringens A tipi enterotoksin ile immünize edilmi tav anlardan elde edilen safla t r lm antiserumla duyarl

hale getirilmi tir. Bu lateks partikülleri enterotoksinlerin varl nda aglütinasyon olu turur. Kontrol reaktifi ise immünize edilemeyen tav an globülinleri ile duyarl hale getirilmi lateks partikülleri içerir. Test V kuyucuklu mikrotitre plaklar nda gerçekle tirilir.

Kit içer i i

Duyarl hale get ir ilm i lateks TD 931

Kontrol Lateks TD 932

Kontrol Enterotoksin TD 939

Seyreltim çözeltisi TD 934

Kültür s v s nda enterotoksin olu turulm as

1. Seçici bir ortamdan izole edilen C. perfringens kolonisi, Cooked Meat Medium a (CM81) al n r ve 37 C de 18-20 saat inkübe edilir. Bu süre

91

sonunda üreme gözlenen deney tüpleri merkezi s cakl klar 75 C (su banyosunda) olacak ekilde s l i leme tabii tutulur ve 20 dakika bu s cakl kta bekletilerek vejetatif hücreler inaktive edilir.

2. naktive edilen hücrelerde sporulasyonun te viki için Duncan and Strong ortam na 1:20 oran nda inokulasyon yap larak 37 C de 24 saat inkübasyona b rak l r.

3. nkübasyon sonras test örne i santrifüj edilerek veya membran filtreden süzülerek ekstrakte edilir.

lem

1. Reaktifler h zla kar t r l r. 2. Her bir s ra 8 kuyucuktan olu acak ekilde (her örnek için iki s raya

gerek duyulmaktad r) mikrotitre plaklar düzenlenir. 3. Her s ran n 1. kuyucu u hariç, iki s ran n her kuyucucu una 25 l

seyreltim çözeltisi (diluent) konur. 4. Her bir s ran n 1. ve 2. kuyucu una 25 l test örne i ilave edilir. 5. 2. kuyucuktan al nan 25 l hacim ile 7. kuyucu a kadar paralelli

seyreltimler yap l r. Son kuyucuk yaln z seyreltim s v s içerecek ekilde 7. çukurda i lem durdurulur. 8. kuyucukta seyreltim

yap lmaz, bu kuyucukta sadece seyreltim çözeltisi bulunur. 4. 1.s ran n her bir kuyucu una 25 l antikor ba lanm lateks (TD932)

ilave edilir. 5. 2.s ran n her bir kuyucu una 25 l kontrol lateks ilave edilir.

6. Kuyucuk içeriklerini kar t rmak için mikrotitre plak mikromikserle veya elle çalkalan r.

7. Mikrotitre plak bir kapak ile örtülür ve 20-24 saat boyunca sa lam bir zemin üzerine sars lmayacak ekilde b rak l r.

8. Mikrotitre pla n siyah bir ka t üzerine yerle tirilmesi sonuçlar n kolayl kla gözlenebilmesi aç s ndan yarar sa layacakt r. Deneylerde kullan lan santrifüj tüpleri, membran filtreler, mikrotitre plaklar , kapaklar ve pipet uçlar at lmadan önce hipoklorit solüsyonu (%1,3 a rl k/a rl k) içinde dezenfekte edilmelidir. Kültür ve g da ekstraktlar , numuneler ve toksin kontrolleri de hipoklorit çözeltisinde dekontamine edildikten sonra at lmal d r.

* PET RPLA Closridium perfringens Enterotoxin Test Kit Oxoid Folio No. 257B

92


Dü me görünümü negat f, a /kafes eklindeki bulan k görünüm pozitif olarak yorumlanmal d r. Kontrol lateksi içeren son kuyucuklar negatif olmal d r. Aglütinasyon olu umu a a daki örnek dikkate al narak de erlendirilmelidir.


Not. Duncan and Strong Medium un bile imi a a da verilmi tir.

Modified Duncan and Strong Medium

g/L dam t k su

Yeast extract (Oxoid L21) 4,0 Proteose pepton (Oxoid L85) 15,0 Soluble starch 4,0 Sodium thoglycollate 1 Na2HPO4.7H2O 10,0

121°C de 15 dakika otoklav edilir. pH 7,8

0,1 olacak ekilde filtre-sterilize 0,66M sodyum karbonat ilave edilir

10.3. Bacillus cereus Enterotoksin Analiz Yöntemi

93

10.3.1. BCET RPLA ( TD 950) ile Bacillus cereus Enterotoksin Analizi *

Polistren lateks partikülleri safla t r lm Bacillus cereus diyare enterotoksiniyle immünize edilmi tav anlardan elde edilen safla t r lm antiserumla duyarl hale getirilmi tir. Bu lateks partikülleri benzer enterotoksinlerin varl nda aglutinasyon olu turur. Kontrol reaktifi ise immunize edilemeyen tav an globulinleri ile duyarl hale getirilmi lateks partikülleri içerir. Test V kuyucuklu mikrotitre plaklar nda gerçekle tirilir. G da ekstraktlar n n veya kültür filtratlar n n seyreltimleri, kuyucuklar n iki s ras kullan larak yap l r, uygun hacimde lateks suspansiyonu her bir kuyucu a ilave edilir ve kar t r l r. B. cereus enterotoksini mevcutsa kafes yap l aglütinasyon olu ur, kuyucu un taban nda yay lm bulan k bir tabaka meydana gelir. B. cereus enterotoksini yok ise veya konsantrasyonu testin saptama limitinden daha dü ükse, kafes yap s olu maz, s k yap l dü me görünümünde bir yap gözlenir.

Gerekli ekipman ve malzemeler :

Blender veya hom ojenizatör (sadece g da örnekler i için)

Mikrot it re plaklar ( V kuyucuklu ) ve kapaklar

Mikropipet (25µl )

Santrifüj

0,2 0,45 µm gözenekli membran filtre (Millipore SLGV gibi )

Brain Heart Infusion Besiyeri (Oxoid CM 225)

Sodyum klorür çözelt isi (% 0,85 a rl k/ hacim )

Sodyum hipoklor it çözelt isi ( > % 1,3 a r l k/ a r l k)

Kit içer i i

TD 951 Duyarl hale get ir ilm i Lateks

TD 922 Kontrol Lateks

TD 910 Seyreltici

G da m addelerinden toksin ekst raksiyonu

* BCET-RPLA TD950 Toxin Detection Kits, Folio No. 539

94

1. 10 g örnek 10 ml % 0,85 lik sodyum klorür çözeltisi içinde homojenize edilir.

2. So utmal santrifüjde 30 dakika 900g de kar m santrifüj edilir (so utmal santrifüj yoksa kar m önceden 4 C so utularak bu i lem yap l r).

3. Üstteki s v k s m (supernatant) 0,2-0,45 m gözenekli ve protein ba lama kapasitesi dü ük filtreden süzülür. Önemli husus ekstrakt n berrak olmas ve ya içermemesidir.

Kültürden toksin ekstraksiyonu

1. Selektif besiyerinden izole edilen B.cereus su u Brain Heart Infusion besiyerine (CM 225) inokule edilir ve 32-37 C de çalkalamal inkubatörde 250 devir/dakika h zda 6-18 saat inkube edilir.

2. nkübasyon sonras kar m 4°C de 20 dakika 900g de kar m santrifüj edilir veya 0.2-0.45 m gözenekli ve protein ba lama kapasitesi dü ük filtreden süzülür.

Not. B.cereus NCTC 11145 gibi enterotoksin üretti i bilinen standart bir kültürle kültürel yöntemin kontrolu önerilmektedir.

Kontrol

Toksin çözeltisi duyarl lateksi aglutine etmektedir, bu nedenle kontrol numunesi olarak kullan lmamal d r. Toksin kontrolu pozitif sonuçlar n de erlendirilmesinde referans olarak kullan labilmektedir. Kontrol zaman zaman test lateksinin do ru çal p çal mad n n do rulanmas için kullan lmal d r. Miktar belirlemede toksin kontrolu bir anlam ifade etmez.

lem

1. Lateks reaktifleri (TD 951 ve TD 952) ve seyreltim çözeltisi (TD 954) kullan ma haz r hale getirilir. Lateks reaktifleri kullan lmadan önce iyice çalkalanarak homojenize edilmelidir. Toksin kontrol reaktiflerini (TD953) suland rmak için her bir vial içerisine 0,5 ml seyreltim

95

çözeltisi ilave edilir ve tamamen çözününceye kadar çalkalan r. 2. Mikrotitre plaklar her s ra 8 kuyucuktan olacak ekilde düzenlenir. 3. Mikropipet kullan larak her bir s ran n birinci kuyucu u hariç iki

s radaki bütün kuyucuklara 25 µ l seyreltim çözeltisi konur. 4. Her iki s ran n birinci ve ikinci kuyucu una 25 µ l test örne i ilave

edilir. 5. 25 µl test örne i her bir s ran n ilk çukuruna eklenir. Her bir s ran n

2. kuyucu undan ba lanarak mikropipet ile 25 µ l al n r ve 7. kuyucu a kadar paralelli seyreltimler yap l r. Son kuyucuk yaln z seyreltim s v s içerecek ekilde 7. çukurda i lem durdurulur. 8. kuyucukta seyreltim yap lmaz, bu kuyucukta sadece seyreltim çözeltisi bulunur.

6. Birinci s radaki her kuyucu a 25 µ l duyarl lateks (TD951) eklenir. 7. Birinci s radaki her kuyucu a 25 µ l kontrol lateks (TD951) eklenir. 8. Mikrotitre plaklardaki kuyucuk içerikleri mikromikser veya elle

kar t r l r. Kuyucuk içeriklerinin dökülmemesine özen gösterilmelidir. 9. Buharla madan sak nmak için, mikrotitre plak bir kapak ile örtülür

veya nemli bir ortama yerle tirilir. Plak 20-24 saat boyunca oda s cakl nda sa lam bir zemin üzerine sars lmayacak ekilde b rak l r. Mikrotitre pla n siyah bir ka t üzerine yerle tirilmesi sonuçlar n kolayl kla gözlenebilmesi aç s ndan yarar sa layacakt r.

10. Her s radaki kuyucukda aglütinasyon olup olmad siyah zemin üzerinde kontrol edilir.

11. Deneylerde kullan lan santrifüj tüpleri, membran filtreler, mikrotitre plaklar , kapaklar ve pipet uçlar 121°C 'de 15 dakika otoklavda sterilize edilmeli veya at lmadan önce hipoklorit solüsyonu (%1,3 a rl k/a rl k) içinde dezenfekte edilmelidir. Kültür ve g da ekstraktlar , numuneler ve toksin kontrolleri de hipoklorit çözeltisinde dekontamine edildikten sonra at lmal d r.

12. Kültür ve g da ekstraktlar , örnekler ve toksin kontrollar da hipoklorit solüsyonu (%1,3 a rl k/a rl k) içinde dezenfekte edilmelidir.


Dü me görünümü negat f, a /kafes eklindeki bulan k görünüm pozitif olarak yorumlanmal d r. Kontrol lateksi içeren son kuyucuklar negatif

96

olmal d r. Aglütinasyon olu umu a a daki örnek dikkate al narak

de erlendirilmelidir.


Not. Testin duyarl l n n 2 ng/ml oldu u belirtilmektedir. G da örne i 1:1 oran nda seyreltilerek haz rland nda duyarl l k 4 ng/g eklinde olacakt r. G da ekstrakt nda bulunan enterotoksin konsantrasyonunun, kullan lan ekstraksiyon metodunun farkl l ndan (örne in ultrafiltrasyon) etkilenebilece i gözönünde bulundurulmal d r. Bacillus cereus enterotoksinlerinin olu umu ortam ko ullar na ba l d r. Kültür ortam nda Bacillus cereus enterotoksini üreten su lar, in vivo olarak ayn seviyelerde toksin üretmeyebilmektedir.


Brett, M.M. 1998.Kits for the detection of some bacterial food poisoning toxins: problems, pitfall and benefits. Journal of Applied Microbiology Symposium Supplement 84, 11S-118S.

Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology, Academic Press, San Diego.

97

11. Küf ve Maya Analiz Yöntemleri

G dalarda küf kontaminasyonu üretimin çe itli basamaklar nda ortaya ç kabilmektedir. Küf geli imi için uygun olan s cakl k ve ba l nem ko ullar nda sert kabuklu meyvelerde, ya l tohumlarda, tah llarda, baklagillerde, çe itli sebzelerde ve meyvelerde de mikotoksin olu umu s kl kla gözlenebilmektedir (Moss, 1996).

Mikotoksin üreten g da kaynakl küflerin ba l calar l man iklimlerde Fusarium graminearum, F. culmorum, Penicillium verrucosum, P. freii,

P. cyclopium, P. expansum; (sub)tropikal iklimlerde Aspergillus flavus,

Fusarium verticillioides ve di er Fusaria, P. aurentiogriseum, P. citrinum,

P. crustosum, P. polonicum, P. viridicatum ve P. oxalicum dur (Frisvad, 1988).

Küf analizlerinde do rudan ekim ve seyreltim yöntemleri uygulan r. Do rudan ekimde tah l kuru meyve vb. g dalar besiyeri üzerine yerle tirilir, 25°C de 5 gün inkübasyona b rak l r. Ürüne özgü floran n belirlenmesi amac yla yap lan çal malarda yüzeysel kontaminasyonlar gidermek için ürüne yüzey dezenfeksiyonu uygulan r. Küf say mlar nda uygulanan di er yöntem seyreltim yöntemidir. Seyreltimlerde %0,1 lik peptonlu su, homojenizasyonda stomacher kullan m (2 dk.) önerilmektedir. Sert kabuklu meyveler, tah llar gibi sert taneli ürünlerin 30 dakika ile 3 saat aras nda de i en sürelerde suda slat lmas ve homojenizasyonda blender kullan m (60 saniye) tavsiye edilmektedir (Pitt ve Hocking, 1997).

Kuru g dalardan veya meyve konsantrelerinden maya izolasyonunda %20-30 glukoz, sakaroz veya gliserol içeren seyreltim çözeltileri kullan larak mikroorganizma hücrelerinin osmotik oktan korunmalar sa lanm olur (Pitt ve Hocking, 1997).

Küf analizlerinde de seyreltimler di er mikrobiyolojik analizlerde oldu u gibi yap l r. Ancak, küf sporlar çok kolay dibe çökerler, bu nedenle ekimin mümkün oldu u kadar k sa sürede, tercihan bir dakika içinde

98

yap lmas önerilmektedir. Sürme yöntemi ve optimum 0,1 ml lik ekimler tercih edilmektedir. 10-15 ile 150 aras nda küf içeren petriler say mlarda dikkate al n r. Maya say mlar küflere göre daha kolayd r. Ortamda flamentli küf bulunmad takdirde 30 ile 300 aras nda koloni içeren petriler de erlendirmeye al n r (Pitt ve Hocking, 1997).

Standart inkübasyon ko ullar 25°C de 5 gündür. Küf ve maya say mlar nda genel amaçl olarak kullan labilecek ba l ca besiyerleri Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) agar ve Dichloran

18% glycerol (DG18) agard r (Pitt ve Hocking, 1997).

DRBC agar daha ziyade taze ve yüksek su aktivitesindeki g dalar n analizlerinde tercih edilir. 25 mg/litre rose bengal, 50 mg/litre chloramphenicol içermesi nedeniyle yayg n üreme göstererek petri yüzeyini kaplayan küflerde geli meyi s n rlayarak say m kolayla t rmaktad r. Bakteri geli iminin yo un oldu u g da gruplar nda chloramphenicol yan nda chlortetracycline (50 mg/kg) kullan m ile ba ar l sonuçlar al nd belirtilmektedir (Samson ve ark. 1995).

Rutin kullan mda haz rlanm olan DRBC plaklar n n 25°C de 5 gün k almayacak ekilde muhafaza edilebilece i belirtilmektedir. I a iki saat maruz kalmas durumunda önemli düzeylerde toksik bile ikler olu tu u saptanm t r (Samson ve ark. 1995).

DG18 depolanm tah l, f nd k, un vb. kuru g dalar n (aw >0,90) analizleri ve kserofilik küflerin izolasyonu için geli tirilmi bir besiyeridir (Pitt ve Hocking, 1997).

99

11.1.Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agarda (DRBC) ( CM7 2 7 ) Küf ve Maya Say m Yöntem i *

DRBC agar bile iminde bulunan Chloramphenicol sayesinde örneklerde mevcut bakteri geli imini önleyerek küf ve maya izolasyonuna ve say m na olanak sa layan bir besiyeridir.

DRBC agar (CM727) besiyerinden 15,75 g tart l r, 500 ml dam t k su içinde s t larak eritilir; besiyerine 3 ml etanolde çözündürülmü bir vial Chloramphenicol Supplement (SR78) kat l r ve kar t r l r. Daha sonra

121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; 50 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda steril petrilere dökülür

G da maddesi 1:10 oran nda seyreltilerek homojenize edilir (10-1) ve ayn ekilde ileri seyreltimleri yap l r (10-2, 10-3,...). Her seyreltimden besiyeri içeren steril petri kutular na 0,1-0,5 ml al narak yüzeye yayma metoduyla ekim yap l r. Petriler 25°C de inkübe edilir, 3., 4. ve 5.

günlerde incelenir. Petri yüzeyinde uygun say m aral ndaki (10-100) üremeler say l p, seyreltim faktörü ile çarp larak küf-maya say s ayr ayr , veya toplam olarak saptan r.

* Bridson, E.Y. 1988. The Oxoid Manual 8th Edition. Oxoid Ltd., Hampshire.

100

11.2. Dichloran Glycerol Agarda (DG18) (CM729) Küf ve Maya Say m Yöntem i

DG18 agar dü ük su aktivitesine sahip kuru ve yar kuru g dalarda kserofilik küflerin say m amac yla kullan l r. Kuru meyveler, baharatlar, ekerlemeler, tah llar, kurutulmu et ve bal k ürünlerinden kserofilik küf

izolasyonu için ideal bir ortamd r. DG18 agar (CM727) besiyerinden 15,75 gram tart l r, 500 ml dam t k su içinde s t larak eritilir; besiyerine 110 gram gliserol (analitik safl kta) ve 3 ml etanolde çözündürülmü bir vial Chloramphenicol Supplement (SR78) kat l r ve kar t r l r. 121 C de 15 dakika otoklavda sterilize edilir; 50 C ye so utulan besiyeri aseptik ko ullarda steril petrilere dökülür. lem DRBC agardaki gibidir.

101


Frisvad, J.C., Thrane, U. 1995. Mycotoxin production by food-borne fungi. (Ed. Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg). Introduction to Food-Borne Fungi . s. 251-260. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn.

Frisvad, J.C. 1988. Fungal species and their specific production of Mycotoxins. (Ed. Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg). Introduction to Food-Borne Fungi. s. 239-249. Centraalbureau voor Schimmelculture

Moss, M.O. 1996. Mycotoxins. Mycological Research 100 (5) 513- 523. Pitt, J.I., Hocking, A.D. 1997. Methods for isolation, enumeration and

identification. Fungi and Food Spoilage , s. 21-57. Blackie Academic and Professional. London

Samson, R.A., Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., Filtenborg, O. 1995. Methods for the detection and isolation of food-borne fungi. Introduction to Food-Borne Fungi . s. 235-242. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn.

This document was created with Win2PDF available at http://www.daneprairie.com.The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.

http://www.daneprairie.com

Documents

Mikrobiyoloji Agar Sayım Biyokimyasal Testler