SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU

POLJOPRIVREDNI FAKULTET

BORIS RAVNJAK

Preddiplomski studiji, smjer Hortikultura

MIKROBNE KULTURE U PROIZVODNJI SIREVA

ZAVRŠNI RAD

Osijek, 2013.g

SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU

POLJOPRIVREDNI FAKULTET

BORIS RAVNJAK

Preddiplomski studiji, smjer Hortikultura

MIKROBNE KULTURE U PROIZVODNJI SIREVA

ZAVRŠNI RAD

Osijek, 2013.g

SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU

POLJOPRIVREDNI FAKULTET

BORIS RAVNJAK

Preddiplomski studiji, smjer Hortikultura

MIKROBNE KULTURE U PROIZVODNJI SIREVA

ZAVRŠNI RAD

Povjerenstvo za ocjenu i obranu završnog rada:

1. prof. dr. sc. Zvonimir Steiner, predsjednik

2. doc. dr. sc. Suzana Kristek, mentor

3. prof. dr. sc. Drago Bešlo, član

Osijek, 2013.g

SADRŽAJ

1. UVOD................................................................................................................................1

2. ULOGA KULTURE BAKTERIJA MLIJEČNE KISELINE..........................................2

2.1. Putevi metabolizma bakterija mliječne kiseline.........................................................7

3. ULOGA KULTURE BAKTERIJA PROPIONSKE KISELINE...................................11

4. ULOGA KULTURE BAKTERIJA BREVIBACTERIUM LINENS.............................14

5. ULOGA KULTURE S PLEMENITIM PLIJESNIMA.................................................16

6. ZAKLJUČAK..................................................................................................................19

7. LITERATURA.................................................................................................................20

8. SAŽETAK........................................................................................................................21

9. SUMMARY......................................................................................................................22

10. POPIS SLIKA................................................................................................................23

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

1. UVOD

Mikrobne kulture u proizvodnji sira imaju višestruku ulogu, a njihova aktivnost,

ovisno o primijenjenoj vrsti mikroorganizama, može biti: proizvodnja kiseline, tvorba tvari

arome, tvorba plina, proteoliza, lipoliza te inhibicija nepoželjnih mikroorganizama.

Ovisno o tipu sira, koriste se kulture u čijem se sastavu mogu naći:

-bakterije mliječne kiseline, odgovorne u prvom redu za tvorbu kiseline, a potom

za tvorbu arome, a neke vrste proizvode i CO2 ;

-bakterije propionske kiseline, odgovorne za tvorbu specifične arome veće

količine CO2 ;

-sojevi bakterije Brevibacterium linens, odgovorne za tvorbu karakteristične

sluzavosti ("maža") na površini sira, a utječu na boju i tvorbu tipične arome sira ;

-plemenite plijesni, odgovorne su za rast bijele plijesni na površini ili rast plavo-

zelene plijesni unutar sira, a utječu na tvorbu intenzivnog okusa i mirisa tih sireva.

U proizvodnji bilo koje vrste sira uvijek se primjenjuju kulture bakterija mliječne

kiseline. Ovisno o vrsti sira, koriste se: mezofilne ili termofilne kulture bakterija mliječne

kiseline, a kombiniraju se i međusobno ili s kulturom drugih vrsta bakterija te s kulturom

plemenitih plijesni.

Primarna je uloga kulture bakterija mliječne kiseline u proizvodnji svih sireva, a

djelovanje ostalih kultura dolazi do izražaja tek u fazi zrenja sira u zrionici, pri uvjetima

optimalnim za određenu vrstu, uz stalnu kontrolu i pravilno njegovanje sira.

Slika 1. Sir kamamber

(http://static.mondo.rs/Picture/13423/jpeg/)

1

2. ULOGA KULTURE BAKTERIJA MLIJEČNE KISELINE

U proizvodnji sira koriste se selekcionirane bakterije mliječne kiseline što mogu biti

mezofilne ili termofilne bakterije, a neke od njih potječu iz probavnog sustava, te imaju

izražena antimikrobna ili ljekovita svojstva. Posebno se izdvajaju Lactobacillus

acidophilus i Bifidobacterium bifidum, kao terapijske bakterije mliječne kiseline. Koriste

se u proizvodnji svježih mekih sireva koji se nalaze na europskom tržištu. Najčešće se u

svježem siru primjenjuju u kombinaciji kao A/B kultura te radi terapijskih svojstava u

procesu probave. Koriste se također za izbjegavanje naknadnog zakiseljavanja u

proizvodnji svježeg sira blaga okusa.

Slika 2. Lactobacillus acidophilus

(http://cahoney-l-acidophilus.pbworks.com/w/page/6327467/Structure)

Slika 3. Bifidobacterium bifidum

2

(http://microbewiki.kenyon.edu/images/4/46/Bifidobacterium_longum.png)

Mikrobne kulture bakterija mliječne kiseline namijenjene za proizvodnju pojedinih sireva

mogu biti:

-potpuno definirane i u njima je poznat broj prisutnih vrsta i sojeva

-nedefinirane smjese ili mješavine u kojima nije deklariran broj prisutnih vrsta.

U većim, suvremenim siranama koriste se definirane mikrobne kulture, a u manjim se

uglavnom koriste miješane kulture, nedefinirane smjese.

Mezofilne kulture bakterija mliječne kiseline, ovisno o prisutnosti određenih

bakterija koje proizvode tvari arome u sastavu kulture, mogu se razvrstati :

"L" tip kulture: koje sadržavaju heterofermentativne vrste roda Leuconostoc (cit+

bakterije);

"D" tip kulture: koje sadržavaju homofermentativne cit+ vrste bakterija (Lactococcus

lactic ssp. diacetylactis);

"LD" tip kulture: sadržava obje vrste (cit+ bakterije)

"O" tip kulture: sadržava homofermentativne vrste roda Lactococcus, a ne sadržava cit+

vrste bakterija.

U proizvodnji većine sireva primjenjuju se mezofilne bakterije mliječne kiseline,

dok se u njihovoj proizvodnji pri višim temperaturama dogrijavanja gruša koriste

uglavnom termofilne bakterije mliječne kiseline (ementaler, grojer, grana, parmezan, Paški

sir, čedar, provolone, mocarela).

Najvažnija je zadaća mikrobne kulture bakterija mliječne kiseline proizvodnja kiseline,

prvo mlijeka, a potom u grušu sira. Za proizvodnju kiseline uglavnom su odgovorne

homofermentivne bakterije mliječne kiseline, a bakterije Lactobacillus proizvode više

mliječne kiseline od bakterija Lactococcus, tj. mezofilnih mliječnih streptokoka koje su

promijenile naziv. Poslije kultura osigurava uvjete za tvorbu svojstvene arome sirnoga

gruša za što su više odgovorne heterofermentativne bakterije mliječne kiseline, osobito

vrste koje metaboliziraju citrate. To su vrste Leuconostoc i Cit+ vrste Lactococcu.

Aktivnost bakterija mliječne kiseline u proizvodnji sira u početku je rezultat rasta

bakterija i djelovanja njihovih enzima. Tako se tijekom proizvodnje sira bakterijska kultura

razmnožava od otprilike 107 živih stanica po mililitru mlijeka od 108-109 živih stanica po

gramu sirnog gruša.

Proizvodnja kiseline tada, tijekom pojedinih faza proizvodnje sira, ima višestruko

djelovanje.

3

Proizvedena mliječna kiselina u prvom redu utječe na svježi okus sirnog gruša,

što je posebno važno u proizvodnji svježih mekih sireva kada se grušanje mlijeka i odvija

djelovanjem kiseline. Mliječna kiselina isto tako potpomaže djelovanje pripravaka sirila

tijekom enzimskoga grušanja mlijeka. Osim toga kiselina uzrokuje stezanje gruša i

omogućuje bolje odvajanje vode te uvjetuje svojstvenu teksturu gruša i osigurava uvjete za

tvorbu tipične arome sira. Postupci obrade gruša također utječu na rast i djelovanje

bakterija mliječne kiseline.

Pri nižoj toplinskoj obradbi gruša, zadržat će se više vode ili sirutke, a time i više

laktoze u grušu. Zbog toga je veća tvorba kiseline u mekšim sirevima, a sazrijevanje sirne

mase puno brže. Obrnuto, pri višoj toplinskoj obradbi gruša nastaje čvršći gruš (manje

vode i laktoze), pogodan za dulje čuvanje, jer su daljni procesi sazrijevanja gruša tada

kudikamo sporiji. Osim toga, utjecaj viših temperatura na proteine pogoduje nastanku više

elastičnog, gipkog tipa gruša (kao što se zahtijeva za sireve tipa ementaler). Tvorba

kiseline također utječe na promjene unutar čestica kazeina. Kiselina uzrokuje otapanje

jednog dijela Ca-fosfata iz kazeina, pa sirutka, uključujući laktozu, difundira unutar čestica

gruša.

Slika 4. Struktura kazeina

(http://www.tehnologijahrane.com/wp-content/uploads/2008/01/struktura-kazeinske-

micele.jpg)

4

Tako rast bakterija mliječne kiseline određuje stupanj sinereze gruša, difuziju laktoze

u gruš, a i stupanj naknadnog zakiseljavanja, tijekom daljnje proizvodnje sira. U sirišnom

grušu kazein se nalazi u obliku Ca-parakazeinata.

Nastala mliječna kiselina otapa dio vezanog kalcija iz gruša (demineralizacija gruša), što se

može prikazati sljedećim reakcijama:

Ca-parakazeinat + mliječna kiselina monokalcijev-parakazeinat + Ca-laktat

2NH2R(COO)6Ca3 + 10C3H6O3 [NH2R(COOH)5COO]2Ca + 5Ca(C3H5O3)2

Zbog toga u sirevima, u kojima nastaje više kiseline u grušu, bit će manje kalcija

vezanog na kazein. Nasuprot tome, u čedru i ementaleru gruš kazeina sadržava više kalcija,

što utječe na strukturu gruša, te na kakvoću tijesta sira.

Stupanj i dinamika tvorbe kiseline, tijekom proizvodnje sira, uvjetuju okus, svojstvenu

konzistenciju i teksturu tijesta te omogućuje nastanak određenih značajki sira. Bakterije

mliječne kiseline koje troše citrat utječu na tvorbu arome plina (CO2) što uvjetuje

nastajanje sirnih rupica u nekih polutvrdih sireva (gouda, edemac, trapist). Zbog toga se u

sastavu mezofilne kulture bakterija mliječne kiseline uglavnom nalazi oko 90%

mikroflore odgovorne za tvorbu kiseline, a oko 10% odgovorne za tvorbu arome i plina.

Termofilne kulture bakterija mliječne kiseline u svom sastavu većinom sadrže

Streptococcus thermophilus, te različite vrste iz roda Lactobacilllus koje proizvode više

kiseline od bakterija Streptococcus, ali nešto kasnije (Lb. bulgaricus, a potom tek Lb.

helveticus). Proizvodnja kiseline pod utjecajem termofilnih bakterija mliječne kiseline

počinje tek u kadi za sirenje, a potom tijekom tlačenja sira. Pri povoljnim uvjetima

kiselina tada brzo nastaje prvo pod utjecajem bakterija Streptococcus koje su odgovorne

za nastanak povoljne pH-vrijednosti gruša (0,8-0,9% mliječne kiseline). Tada neće doći

do razgradnje kazeina, nego tek pod utjecajem bakterija Lactobacillus, a za to je pogodan

Lactobacillus helveticus koji proizvodi najviše kiseline i čija aktivnost dolazi do izražaja

tek pri nastanku oko 2% mliječne kiseline (metabolizira i galaktozu, Gal+).

Njegova jača proteolitička aktivnost može dodatno tijekom sekundarnog zrenja čak

uzrokovati mane sira. Količina inokuluma termofilne kulture u proizvodnji ementalera i

grojera nešto je manja (za 3-10%) od količine koja se rabi u proizvodnji sira čedar. Pod

određenim uvjetima u proizvodnji modificiranog sira čedar (SAD) može se unutar

termofilne mikrobne kulture uklopiti bakterija Enterococcus faecium, koja pridonosi

aromi sira, a koja uglavnom nije u široj uporabi.

5

Slika 5. Lactobacillus helveticus

(http://jpkc.njau.edu.cn/spwswx/imgbank/tuku/Lactobacillus%20%20helveticus.jpg)

Rast i aktivnost bakterija mliječne kiseline, tj. mala pH-vrijednost gruša, potiskuje

također razvoj patogenih i plinotvornih bakterija, te povoljno utječe na trajnost sira. U

sastavu kultura ponekad se koriste selekcionirani sojevi bakterija mliječne kiseline, koji

imaju izrazito antimikrobno djelovanje na neželjene onečišćavače sira. Osim njihova

nespecifičnog inhibitornog utjecaja: proizvodnja organske kiseline, apsorpcija 0 2 bitna je

proizvodnja H2O, a osobito proizvodnja specifičnih inhibitora neželjenih bakterija

bakteriocina. Nizin je najpoznatiji bakteriocin kojega proizvode sojevi Lactococcus

lactis subsp. lactis, a vrlo je djelotvoran inhibitor rasta za enterobakterije, stafilokoke,

klostridije te listerije. Nizin se proizvodi i u komercijalne svrhe kao prehrambeni aditiv

(prihvatila ga je 1969.godine Svjetska zdravstvena organizacija). Može se stoga koristiti

i kao dodatak u proizvodnji sira ako to dopuštaju propisi pojedine zemlje. Dodatak nizina

obično se koristi u proizvodnji sirnih namaza iii topljenih sireva i to pri zaštiti njihove kore.

Slika 6. Struktura nizina

(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f0/Nisin_2d_amino_structure.JPG)

6

Posebno još treba istaknuti da je bitno u sastav kulture za sir uključiti fag-rezistentne

bakterije mliječne kiseline. Rast neželjene mikroflore može spriječiti određena količina soli

u siru, što je vrlo bitno za sireve tipa edamac i gouda, jer sadržavaju više vode i imaju više pH-

vrijednosti, što pogoduje rastu mikroorganizama. Međutim, nakon prešanja i soljenja sira

mnoge bakterije mikrobne kulture također ugibaju pogotovo u siru već pri početnoj fazi

zrenja u zrionici. Zbog toga se daljnji biokemijski procesi u siru tijekom trajanja zrenja u

zrionici nastavljaju djelovanjem njihovih egzogenih enzima. Bakterije mliječne kiseline

imaju slabo proteolitičko djelovanje (vidi metabolizam proteina), a osobito slabo lipolitičko

djelovanje, ali aktivnost njihovih egzogenih enzima pomaže daljnje procese u siru u

uvjetima zrionice, uz naknadno kemijsko međudjelovanje nastalih produkata razgradnje.

2.1. Putevi metabolizma bakterija mliječne kiseline

Metabolizam laktoze

Za rast i aktivnost u mlijeku ili tijestu sira, bakterije mliječne kiseline troše laktozu

koju unose u stanicu gdje ju preko svojih enzima prvo hidroliziraju u monosaharide, a

nastale šećere metaboliziraju s pomoću brojnih enzima različitim putovima, uz

proizvodnju različite količine metabolita.

Način prijenosa laktoze u stanicu bakterije i putevi metabolizma u stanici različiti su

ovisno o vrsti bakterija mliječne kiseline.

Bakterije Lactococcus za prijenos laktoze u stanicu koriste specifični prijenosni

sustav koji uključuje fosfoenolpiruvat fosfotransferazni sustav (PTS). Laktoza se pri

tome fosforilira u laktoza-fosfat (laktoza-P).

laktoza + fosfoenolpiruvat PTS aktoza-fosfat + piruvat Mg 2+

Međutim vrste Leuconostoc, Lactobacillus i Streptococcus thermophilus prevode u

stanicu nepromijenjenu laktozu. Za prijenos koriste sustav protonske motorne sile

(PMS) sto uključuje pokretačke sile drugih molekula, unutar ili izvan stanice, a s

pomoću specifično smještenih u membrani protein prijenosnika nazvanih "sustav

specifičnih permeaza".

Vrste bakterija Leuconostoc i termofilne kulture prenesenu laktozu u stanici

cijepaju s pomoću β-galaktozidaze u glukozu i galaktozu. Metabolizam glukoze u vrste

7

Leuconostoc teče fosfoketolaznim putem, a primjenom termofilne kulture glikoliznim

putem.

Poznato je da bakterije mliječne kiseline mogu mijenjati metabolizam, ovisno o

uvjetima i kapacitetu enzimskog sustava. Promjene se najčešće odnose na metabolizam

piruvata, i to uglavnom na uporabu vanjskih akceptora elektrona. Osnovna je uloga

bakterijskog vrenja oksidacija supstrata i nastanak intermedijera bogatih energijom koji

se mogu upotrijebiti za proizvodnju ATP-a, zbog fosforilacije substrata. Oksidacija

rezultira nastankom NADH od NAD+, koji se može regenerirati za stanicu tijekom vrenja.

Piruvat je ključni međuproizvod mnogih vrsta vrenja i sluzi kao akceptor elektrona (ili

vodika) za početni korak regeneracije NADH. Neka se od tih međudjelovanja mogu

odvijati čak u normalnim uvjetima vrenja, a u nedostatku supstrata može doći do

promjene od homolaktičkog do heterolaktičkog vrenja. Tada konačni proizvod može biti

laktat, acetat, format i etanol, kao pri metabolizmu piruvata u bakterija Lactococcus

ssp.

Slika 7. Metabolizam šećera s pomoću bakterija Lactococcus,Leuconostoc I

termofilne kulture

8

(Ljubica Tratnik: Mlijeko-tehnologija,biokemija i mikrobiologija. Hrvatska mljekarska

udruga,Zagreb 1998.)

Metabolizabm citrata

Iako je mala količina citrata u mlijeku (0,02% limunske kiseline), metabolizam

je citrata u nekih vrsta bakterija vrlo bitan u određivanju teksture i okusa sira.

Između bakterija mliječne kiseline jedino proizvođači tvari arome (Cit+ bakterije)

u sastavu mezofilne kulture metaboliziraju citrate. Cit+ bakterije mliječne kiseline ne

koriste citrate kao izvor energije, nego kao akceptore elektrona i metaboliziraju ih naglo

u prisutnosti fermentabilnih ugljikohidrata.

Citrati se prenose u stanicu bakterije s pomoću plazmidom kodirane citrate -

permeaze i bivaju hidrolizirani s pomoću citrat-liaze do acetata i oksalacetata.

Citrat -liaza je prisutna u Cit + vrste Lactococcus , a može biti inducirana u

vrste bakterija Leuconostoc . Za aktivaciju je potrebna acetilacija s pomoću drugog

enzima ligaze citrate -liaze.

Proizvodnja CO2 odgovorna je za oblikovanje sirnih rupica, dok je proizvodnja

diacetila i acetata odgovorna za okus i miris svježih (nezrelih) sireva, a drži se da je

diacetil jedan od bitnih sastojaka tvari arome svih vrsta sireva. Proizvodnja CO2 je

ponekad neželjena, ali CO2 može biti proizveden i pri metabolizmu laktoze

djelovanjem bakterija Leuconostoc (heterofermentativne).

U nekih heterofermentativnih vrsta Lactobacillus uporaba citrata teče zajedno s

uporabom glukoze, pa osim laktata i acetata nastaje još i sukcinat.

Metabolizam proteina

Mlijeko ne sadržava dostatnu količinu slobodnih aminokiselina i ima malu količinu

niskomolekularnih peptida, potrebnih za rast bakterija mliječne kiseline. Da bi se

postigao veliki broj stanica u mikrobnoj kulturi ili siru, bakterije mliječne kiseline

moraju imati aktivni sustav proteinaza da hidroliziraju proteine mlijeka do

aminokiselina i peptida. Kazein ima otvorenu, sekundarnu i tercijarnu strukturu koja ga

čini više osjetljivim na proteolizu od proteina sirutke koji imaju visoki stupanj

sekundarne i tercijarne strukture. Postoje 4 preduvjeta za dobar rast bakterija

mliječne kiseline u mlijeku:

sustav proteinaza, koji hidrolizira kazein do oligopeptida;

sustav peptidaza, koji nastavljaju hidrolizu oligopeptida do još

9

manjih peptida i aminokiselina ;

sustav prijenosa za unos aminokiselina i peptida u stanicu;

intracelularne peptidaze za hidrolizu peptida do sastojaka aminokiselina (unos

peptida esencijalan je za rast nekih bakterija mliječne kiseline u mlijeku).

Mezofilne bakterije - kao vrste Lactococcus sadržavaju proteolitičke enzime

(proteinaze i peptidaze) koji se nalaze u različitim dijelovima stanice. Vrste

bakterija Leuconostoc slabije rastu u mlijeku kao pojedinačni sojevi, a u zajednici

s bakterijama Lactococcus njihov rast stimuliraju hidrolizirani proteini,

pripremljeni proteolitičkom aktivnosti bakterija Lactococcus.

Termofilne bakterije - mliječne kiseline svojom biokemijskom aktivnošću povećavaju

količinu topljivog kazeina i slobodnih aminokiselina i tako poboljšavaju

simbiozne odnose.

Bakterije Lactobacillus proizvode aminokiseline, osobito glicin, histidin i

valin, koje stimuliraju rest bakterija Streptococcus i vjerojatno je proteinazna

aktivnost obuhvaćena tim procesom.

10

3. ULOGA KULTURE BAKTERIJA PROPIONSKE KISELINE

Bakterije propionske kiseline koriste se u proizvodnji tvrdih sireva pri

visokim temperaturama dogrijavanja gruša pa se dodaju u kombinaciji s

termofilnim bakterijama mliječne kiseline. Kulture bakterija propionske kiseline

odgovorne su za razvoj osebujnog okusa i mirisa i razvoj "sirnih rupica" to se

dodaju u mlijeko za proizvodnju švicarskih sireva (ementaler i grojer).

Nekoliko se vrsta bakterija propionske kiseline može koristiti u pro izvodnji

kultura, ali najčešće:

Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii

Propionibacterium freudenreichii ssp. globosum

Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii

Međutim, i druge se vrste bakterija propionske kiseline često pojavljuju kao sekundarna

mikroflora nekih sireva: Propionbacterium acidipropionici, Propionibacterium jenseni,

Propionibacterium thoenii.

Stoga, nekoliko manjih sirnih rupica u siru goudi zbog pojave bakterija propionske

kiseline ne ubrajaju se u mane goude, ali se ubrajaju u mane edamca.

Bakterije propionske kiseline su gram-pozitivni, kratki štapići koji rastu pretežno

anaerobno ili samo uz malu koncentraciju kisika.

Od male količine kulture, koja se inokulira u mlijeko (0,1-0,25 mL/ 100 L), u

proizvedenom se siru, pri višim temperaturama u zrionici (18-25 °C), razmnoži

oko 108 - 109 bakterija /g sira.

Nakon djelovanja termofilnih bakterija mliječne kiseline, pod utjecajem bakterija

propionske kiseline nastavlja se transformacija nastalih laktata u propionat,

acetat i CO2, ali još uvijek u primarnoj fazi zbivanja tijekom zrenja sira u zrionici.

Rezultat propionsko-kiselog vrenja:

bakterije

3CH3-CHOH-COO - propionske kiseline 2 CH3-CH 2-COO- + CH3-COO- +CO2 + H2O

(laktat) (propionat) ( acetat)

Proizvedene kiseline, propionska i octena, najviše pridonose nastanku svojstvenog

okusa i mirisa u vrstama švicarskih sireva, a tvorba CO2 pridonosi oblikovanju

sirnih rupica.

11

Slika 8. Proizvodnja CO2 i oblikovanje sirnih rupica

(Ljubica Tratnik: Mlijeko-tehnologija, biokemija i mikrobiologija. Hrvatska mljekarska

udruga, Zagreb 1998.)

Na oblikovanje sirnih rupica utječu:

vrijeme, količina, i intenzitet proizvodnje CO2

tekstura tijesta i temperatura,

mjesto i veličina područja za oblikovanje budućih sirnih rupica to

pritisak CO2 i stupanj difuzije (unutar ili izvan sira)

Veća koncentracija soli i kiseline u tijestu sira inhibiraju rast bakterija

propionske kiseline, a također utječu na gubitak elastičnosti tijesta, koje pri

oblikovanju sirnih rupica puca umjesto da se rasteže. Obrnuto će pri manjim

koncentracijama soli ili kiseline u tijestu sira rast bakterija propionske kiseline biti

ubrzan, što mote rezultirati većim brojem, manjih sirnih rupica.

Bakterije propionske kiseline imaju vrlo slabu proteolitičku aktivnost, jer ne

sadržavaju proteinaze, ali imaju peptidaze, i to veći broj u unutrašnjosti stanice.

Bakterija Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii odgovorna je za veću

12

koncentraciju prolina u zrelom ementaleru, koji bitno pridonosi njegovu slatkastom

okusu.

Lipoliza je u tim vrstama sira nepoželjna, jer uzrokuje atipično užegli okus.

Međutim, ponekad se vjeruje da blaga hidroliza masti u mlijeku pridonosi razvoju

svojstvenog okusa i mirisa sirovog mlijeka koje se koristi za tipove švicarskog sira.

13

4. ULOGA KULTURE BAKTERIJA BREVIBACTERIUM LINENS

Bakterija Brevibacterium linens glavni je sadržaj mikroflore u vrstama sira sa

zrenjem bakterija, uglavnom na površini. Nije potpuno poznata precizna uloga sojeva

Brevibacterium linens pri zrenju tih sireva, ali zasigurno one imaju glavni doprinos pri

stvaranju karakteristične "maže" ili sluzi na površini sira. Pojavljuju se neki sojevi i u

tradicionalnim plemenitim vrstama sira uz rast plijesni na površini, nakon povećanja pH,

ali u manjem broju (kamamber, bri), to mogu izazvati crveno-smeđu prošaranost po-

vršine sira.

Sojevi B. linens mogu se pojaviti i u sluzi polutvrdih sireva s ispranom korom.

Ovisno o tehnologiji proizvodnje i promjenama tijekom zrenja, utjecaj maza ili sluzi na

senzorska svojstva sireva može biti: (Reps, 1993.)

važan (tilsit, grojer)

jako važan (trapist, brik, plavi sirevi)

prijeko potreban (romadur, Saint Paulin).

Najpopularniji meki sirevi uz nastanak površinskog maza u Europi su : limburger,

romadur, te potpuno zreli kamamber i bri. Od polutvrdih sireva s mazom, vrlo

popularan u Sjedinjenim Američkim Državama je sir brik (Brick). Zbog kraćeg zrenja,

relativno lake probavljivosti to jače arome, meki i polutvrdi sirevi s površinskim

mazom zavređuju pozornost.

Meki sirevi tog tipa zriju od površine prema unutrašnjosti, uglavnom pod utjecajem

enzima izlučenih od bakterija prisutnih u karakterističnoj sluzi sira.

Polutvrdi sirevi pak zriju kombinirano, aktivnošću enzima prisutnih u siru i izlučenih

enzima od mikroorganizama prisutnih u površinskoj sluzi (brik, tilsit).

Brevibacterium linens aerobna je bakterija, odgovorna za intenzivnu proteolizu na

površini sira to za tvorbu svojstvenog crveno-narančastog maza, koji utječe na svijetlo-

rumenu boju sira. Od izoliranih vrsta (150) neki sojevi proizvode narančasti pigment

samo pod utjecajem svjetla (72 soja). Optimalno raste pri 21-30 °C, a i pri 8 i 37 °C.

Podnosi veću koncentraciju soli (neki sojevi čak i do 15%). Raste pri višim pH-

vrijednostima sira (pH = 6,0 -9,0), a prestaje rasti pri pH 5,0.

Brevibacterium linens ima vrlo aktivni proteolitički sustav proteinaza, iako se peptidazna

aktivnost tih bakterija posebno uvažava. B. linens ima jaču proteolitičku aktivnost na

kazein nego na proteine sirutke.

Stupanj daljnjeg zrenja i aktivnost površinske mikroflore sira ovisi o količine vode u

14

njemu, načinu njegova soljenja (vrsti sira), temperature zrenja, pa njegov okus i miris

može biti različitog intenziteta. Najbolji rast B. linens uočen je na siru limburger, koji

zbog toga ima jaču aromu, a čija konzistencija nakon duljeg zrenja (6-8 tjedana)

postaje slična toplom maslacu. Razvoj maza na površini sira pridonosi razvoju

karakteristične arome to utječe na boju sira.

Tijekom zrenja B. linens aktivira razgradnju aminokiselina uz proizvodnju amine,

hlapljivih kiselina, NH3 i CO2.

15

5. ULOGA KULTURE S PLEMENITIM PLIJESNIMA

Kulture plemenitih plijesni aktivno djeluju tek u sekundarnim biokemijskim

procesima pre zrenju sireva u zrionici, tj. nakon porasta bijele plijesni, na površini sireva

(kamamber, bri) ili plavo-zelene plijesni unutar sira (rokfor, gorgonzola, danski plavi)

ili nakon kombiniranoga taste (plavi bri). Kulture plijesni koriste se u proizvodnji

plemenitih sireva zajedno s mezofilnom kulturom bakterija mliječne ki seline ,a

ponekad i s termofilnom kulturom kao u proizvodnji gorgonzole ili u proizvodnji

sireva kamamber i bri. Tijekom procesa proizvodnje plemenitih sireva glavnu ulogu u

primarnim biokemijskim procesima (zrenje mlijeka, gruša ili sira) imaju

uporabljene kulture mezofilnih bakterija mliječne kiseline, koje najprije moraju

stvoriti uvjete u siru da bi se omogućio rast plijesni i njihova aktivnost tijekom

sazrijevanja sira u uvjetima zrionice. Međutim, esencijalna je uloga kulture plijesni za

razvoj senzorskih osobina, svojstvenih za pojedinu vrstu tih sireva. Plijesni su aerobne,

optimalno rastu pri većoj vlažnosti, povećanoj kiselosti (pH oko 4-5) i pri temperaturi

oko 20 °C, ali dobro rastu i pri nižoj temperaturi tijekom zrenja sireva. Za pravilan rast

plijesni bitno je osigurati jednoličan pristup zraka na površini sira (bijele plijesni) iii

unutar sira (plave plijesni).

Plijesni Penicillium roqueforti kao i Penicilium camemberti imaju vrlo moćan

proteolitički sustav. Plijesni izlučuju kisele i neutralne metaloproteinaze i nekoliko

aminopeptidaza i karboksipeptidaza.

Micelij također sadržava intracelularne proteinaze i peptidaze koje se vjerojatno

izlučuju kada plijesni ugibaju ili liziraju.

16

Slika 9. Penicillium roqueforti

(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f6/

Blue_Stilton_Penicillium.jpg/240px-Blue_Stilton_Penicillium.jpg)

U sireva sa zrenjem uz bijele plijesni na površini, prethodno nastale laktate

u siru prisutna kultura plijesni (Penicilliacm camemberti) intenzivno metabolizira

tijekom zrenja u zrionici. Često najprije prevladava to aktivnost i rast plijesni

Geotrichum candidum i kvasaca, a nakon toga rast Penicillium camemberti uz

proizvodnju CO2 i H2O, što uzrokuje povećanje pH-vrijednosti na površini sira.

Kombinirana akcija: povećanje pH, gubitak kalcija iz unutrašnjosti sira i

proteoliza tijekom zrenja dovode do bitnog omekšavanja sireva uz plemenite

plijesni na površini. Zreli sir tada sadržava veću koncentraciju kalcija i fosfora

(za 80 i 50%) na površini kore s bijelom plijesni, pa hranjiva vrijednost plemenitih

sireva ovisi o tome konzumira li se ili odbacuje kora sira.

Sirevi sa zrenjem uz plave plijesni unutar sira, kada se stvore povoljni uvjeti,

moraju se više puta probušiti iglama da bi se osigurao izlaz CO 2 i ulaz zraka

potreban za rast plijesni. Tijekom zrenja pH sira od nastale vrijednosti oko 4,5-

4,7 (za 24 sata) postupno raste do pH oko 6 (za 2-3 mjeseca) zbog meta bolizma

laktata u plijesni Penicillium roqueforti. Ubrzo, kada nastane plijesan unutar sira,

zbiva se pojačana hidroliza kazeina djelovanjem proteinaza plijesni i bitno

17

poveća količina aminodušika u siru. Proteolitička je aktivnost plijesni značajna

u području pH = 5,3-7,0, a optimalna je pri pH = 6,0. Istodobno, pri zrenju tih

sireva, djelovanjem kiselih ili alkalnih lipaza plijesni, dolazi do hidrolize masti i

pri većem oslobađanju masnih kiselina ponovo se smanjuje pH-vrijednosti sira.

Pod utjecajem lipaza plijesni u ciklusu P-oksidacije masnih kiselina mogu nastati

metal-ketoni, koji prevladavaju u stvaranju okusa i svojstvene arome tih sireva.

U obje vrste plemenitih sireva vrlo je važna razgradnja aminokiselina, a zbiva

se tek u poodmakloj fazi zrenja.rezultat tih zbivanja mogu biti: amini, amonijak,

kiseline, ketokiseline, karbonilni spojevi, druge aminokiseline, H 2S, metantiol,

tioesteri i drugi spojevi sa sumporom.

Mnogi produkti tih reakcija bitni su za:

- promjene pH vrijednosti u siru -

okus i miris

18

6. ZAKLJUČAK

Na temelju pisanja i istraživanja ovog prediplomskog rada došao sam do nekoliko

zaključaka. Cilj ovog rada bio je razmotriti ulogu mikrobnih kultura u proizvodnji sireva.

Mikrobne kulture su medij koji sadrži specifične mikroorganizme sastoje od neškodljivih

aktivnih organizama koji svojim rastom i razmnožavanjem u siru osiguravaju željeni okus i

teksturu. Na temelju više segmenata rekao bih zasigurno da su kulture bakterija mliječne

kiseline najvažnije zato što imaju važnu ulogu u proizvodnji bilo koje vrste sira. Rast i

aktivnost bakterija mliječne kiseline, tj. mala pH-vrijednost gruša, potiskuje također razvoj

patogenih i plinotvornih bakterija. Svojim djelovanjem utječu povoljno prvenstveno na

svježi okus te na sveopće promjene određenog sira. Daljnje,posebice bih naglasio izrazito

važnu ulogu bakterije Brevibacterium linens kao glavni sadržaj mikroflore u vrstama sira u

kojima je prisutno zrenje bakterija. Bakterije te kulture imaju glavni doprinos pri stvaranju

karakteristične “maže” o kojoj sam detaljnije pisao. Kroz rad, posebice me zaintrigiralo

djelovanje kultura plemenitih plijesni koje djeluju tek u sekundarnim biokemijskim

procesima. Okarakterizirao bi ih specifično također zbog svoje kombinacije s kulturama

mliječne kiseline pri proizvodnji sira. Plijesni izlučuju kisele metaloproteinaze ali i

neutralne, te nekoliko aminopeptidaza i karboksipeptidaza.Upravo ta kultura ima velik

ulogu u hranjivoj vrijednosti sireva, ovisno naravno o konzumaciji kore sira. Na koncu,vrlo

važno je napomenuti da je u obje vrste plemenitih sireva izrazito važna razgradnja

aminokiselina kao i produkti istoimenih zbivanja. Spomenuti produkti bitni su posebice za

promjene pH vrijednosti u siru, a prije svega osobito za okus i miris što bih kao nama

konzumentima izdvojio možda i kao najvažnije.

19

7. LITERATURA

1. Ljubica Tratnik: Mlijeko-tehnologija,biokemija i mikrobiologija. Hrvatska mljekarska

udruga,Zagreb 1998.

2. http://www.vuka.hr/index.php?id=349

3. http://www.tehnologijahrane.com/casopis/mljekarstvo-201303

4. http://www.pbf.unizg.hr/hr/content/download/6464/37058/versi

20

8. SAŽETAK

Za proizvodnju sira koriste se kulture u čijem se sastavu mogu naći bakterije

mliječne kiseline, bakterije propionske kiseline,sojevi bakterije Brevibacterium linens i

plemenite plijesni. U proizvodnji sira koriste se selekcionirane bakterije mliječne kiseline

što mogu biti mezofilne ili termofilne bakterije,posebno se izdvajaju Lactobacillus

acidophilus i Bifidobacterium bifidum koje se koriste se u proizvodnji svježih mekih

sireva. Mezofilne kulture bakterija mliječne kiseline mogu se razvrstati : "L" tip kulture,

"D" tip kulture, "LD" tip kulture i "O" tip kulture. U proizvodnji sireva primjenjuju se

mezofilne bakterije mliječne kiseline, dok se u njihovoj proizvodnji pri višim

temperaturama dogrijavanja gruša koriste uglavnom termofilne bakterije mliječne kiseline

Termofilne kulture bakterija mliječne kiseline u svom sastavu većinom sadrže

Streptococcus thermophilus, te različite vrste iz roda Lactobacilllus. Rast i aktivnost

bakterija mliječne kiseline, tj. mala pH-vrijednost gruša, potiskuje također razvoj

patogenih i plinotvornih bakterija, te povoljno utječe na trajnost sira. Bakterije propionske

kiseline koriste se u proizvodnji tvrdih. Kulture bakterija propionske kiseline odgovorne su

za razvoj osebujnog okusa i mirisa i razvoj "sirnih rupica" to se dodaju u mlijeko za

proizvodnju švicarskih sireva. Bakterija Brevibacterium linens glavni je sadržaj mikroflore

u vrstama sira sa zrenjem bakterija, uglavnom na površini. Glavni im je doprinos pri

stvaranju karakteristične "maže" ili sluzi na površini sira. Kulture plijesni koriste se u

proizvodnji plemenitih sireva zajedno s mezofilnom kulturom bakterija mliječne kiseline ,a

ponekad i s termofilnom kulturom kao u proizvodnji gorgonzole ili u proizvodnji sireva

kamamber i bri.

21

9. SUMMARY

Cultures which contian lactic acid bacteria, propionic acid bacteria, Brevibacterium

linens strains as well as blue mold strains are used for the production of cheese. In the

cheese manufacture, the selected lactic acid bacteria, mesophilic and thermophilic, are

used. Among them, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum are the most

prominent ones, and they are used in the production of soft fresh cheeses. Mesophilic

cultures of lactic acid bacteria are divided into type L, type D, type LD and type O. In the

manufacture of cheese, mesophilic lactic acid bacteria are used, while in the cheese

manufacture at higher temperatures while heating the curd mostly thermophilic lactic acid

bacteria are used. Thermophilic lactic acid bacteria contain predominantly Streptococcus

thermophilus as well as various types of Lactobacilllus strains. The growth and activity of

lactic acid bacteria, i.e. the low pH value of curd, creates a barrier for the development of

pathogenic and gas-producing bacteria, and favourably affects the cheese stability.

Propionic acid bacteria are used in the production of hard cheeses. Cultures of the

propionic acid bacteria are responsible for the peculiar taste and smell as well as the

develoment of cheese holes. They are added to milk for the production of Swiss cheese.

Brevibacterium linens bacterium is the major component of the mostly surface microflora

of the bacteria-ripened cheeses. They contribute mainly to the production of a

characteristic smear on the cheese surface. Mold cultures are also used in the manufacture

of blue cheeses, alongside the culture of mesophilic lactic acid bacteria and sometimes the

thermophilic culture, such as in the manufacture of Gorgonzola, Camembert and Brie.

22

10. POPIS SLIKA

Slika 1. Sir kamamber............................................................................................................1

Slika 2. Lactobacillus acidophilus.........................................................................................2

Slika 3. Bifidobacterium bifidum............................................................................................2

Slika 4. Struktura kazeina......................................................................................................4

Slika 5. Lactobacillus helveticus…………………………………………………………..6

Slika 6. Struktura nizina ……………………………………………………………………..6

Slika 7. Metabolizam šećera s pomoću bakterija Lactococcus, Leuconostoc i termofilne

kulture…………………………………………………………………………………….. 8

Slika 8. Proizvodnja CO2 i oblikovanje sirnih rupica..........................................................12

Slika 9. Penicillium roqueforti……………………………………………………………17

23

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICASveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku Završni radPoljoprivredni fakultet u OsijekuSveučilišni preddiplomski studij, smjer Hortikultura

Boris Ravnjak

Mikrobne kulture u proizvodnji sireva

Microbial cultures in chesee production

Sažetak:

Za proizvodnju sira koriste se kulture u čijem se sastavu mogu naći bakterije mliječne kiseline,

bakterije propionske kiseline,sojevi bakterije Brevibacterium linens i plemenite plijesni. U proizvodnji sira

koriste se selekcionirane bakterije mliječne kiseline što mogu biti mezofilne ili termofilne bakterije,posebno

se izdvajaju Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium bifidum koje se koriste se u proizvodnji svježih

mekih sireva. Mezofilne kulture bakterija mliječne kiseline mogu se razvrstati : "L" tip kulture, "D" tip

kulture, "LD" tip kulture i "O" tip kulture. U proizvodnji sireva primjenjuju se mezofilne bakterije mliječne

kiseline, dok se u njihovoj proizvodnji pri višim temperaturama dogrijavanja gruša koriste uglavnom

termofilne bakterije mliječne kiseline. Termofilne kulture bakterija mliječne kiseline u svom sastavu većinom

sadrže Streptococcus thermophilus, te različite vrste iz roda Lactobacilllus.Bakterije propionske kiseline

koriste se u proizvodnji tvrdih. Kulture bakterija propionske kiseline odgovorne su za razvoj osebujnog okusa

i mirisa i razvoj "sirnih rupica" to se dodaju u mlijeko za proizvodnju švicarskih sireva. Bakterija

Brevibacterium linens glavni je sadržaj mikroflore u vrstama sira sa zrenjem bakterija, uglavnom na površini.

glavni im je doprinos pri stvaranju karakteristične "maže" ili sluzi na površini sira. Kulture plijesni koriste se

u proizvodnji plemenitih sireva zajedno s mezofilnom kulturom bakterija mliječne kiseline ,a ponekad i s

termofilnom kulturom kao u proizvodnji gorgonzole ili u proizvodnji sireva kamamber i bri.

Ključne riječi: sir, mliječne kiseline, mezofilne kulture, bakterije, kiseline

Summary:

Cultures which contian lactic acid bacteria, propionic acid bacteria, Brevibacterium linens strains as well as

blue mold strains are used for the production of cheese. In the cheese manufacture, the selected lactic acid

bacteria, mesophilic and thermophilic, are used. Among them, Lactobacillus acidophilus and

Bifidobacterium bifidum are the most prominent ones, and they are used in the production of soft fresh

cheeses. Mesophilic cultures of lactic acid bacteria are divided into type L, type D, type LD and type O. In

the manufacture of cheese, mesophilic lactic acid bacteria are used, while in the cheese manufacture at higher

temperatures while heating the curd mostly thermophilic lactic acid bacteria are used. Thermophilic lactic

acid bacteria contain predominantly Streptococcus thermophilus as well as various types of Lactobacilllus

strains.Propionic acid bacteria are used in the production of hard cheeses. Cultures of the propionic acid

bacteria are responsible for the peculiar taste and smell as well as the develoment of cheese holes. They are

added to milk for the production of Swiss cheese. Brevibacterium linens bacterium is the major component of

the mostly surface microflora of the bacteria-ripened cheeses. They contribute mainly to the production of a

characteristic smear on the cheese surface. Mold cultures are also used in the manufacture of blue cheeses,

alongside the culture of mesophilic lactic acid bacteria and sometimes the thermophilic culture, such as in the

manufacture of Gorgonzola, Camembert and Brie.

Key words:cheese, lactic acid, mesophilic cultures,bacteria, acid

Datum obrane:__________________________________________________________________________

24