UNIVERZITET ˝DŽEMAL BIJEDIĆ˝ U MOSTARUNASTAVNIČKI FAKULTET

ODSJEK: BIOLOGIJA

Mikroorganizmi u farmaceutskoj industriji

Seminarski rad

Student: Predmetni nastavnik:

Mirela Salčin Doc.dr Lejla Riđanović

Mostar, 2012.god.

Sadržaj

Uvod .............................................................................................................................. 3

1. Mikroorganizmi u farmaceutskoj industriji ............................................................. 4

1.1. Kontrola kvaliteta u farmaceutskoj

industriji ......................................................... 4

1.2. Prevencija kontaminacije farmaceutskih

proizvoda ............................................... 5

1.3. Mikrobiološki monitoring vazduha i

sredine ......................................................... 8

1.4. Mikroorganizmi koji najčešće kontaminiraju farmaceutske

preparate .................. 9

2. Escherichia-coli ........................................................................................................... 9

3. Antibiotici .................................................................................................................. 10

3.1. Penicilin ...............................................................................................................

12

3.2. Način određivanja i izražavanja aktivnosti penicilina .........................................

13

3.3. Štetna djelovanja zajednička svim penicilinima ..................................................

13

3.4. Skupine

penicilina ................................................................................................ 14

4. Zaključak ................................................................................................................... 15

Literatura ................................................................................................................... 16

1

Sažetak

Važnost mikroorganizama u ljudskom tijelu i njihova korisnost u medicini često nisu dovoljno uočene. Mikrobna konkurencija između naše osnovne flore i patogena mahom spriječava infekciju. Mnogi patogeni u toj konkurenciji ne uspijevaju ili zbog ograničena prostora ili su inhibirani antimikrobnim hemijskim spojevima što ih sintetiziraju mnogi predstavnici normalne flore.

Kada mikroorganizam koristi zdravlju ljudi, a kada je nagovjestitelj bolesti? Razlikovanje između zdravlja i bolesti uvelike je ravnoteža između prirodne odbrane organizma i osobina mikroorganizama da prouzroče bolest. Mikroorganizmi ulaze u naše tijelo uvijek kada udišemo, gutamo, ozlijedimo kožu ili u nekom drugom dodiru s ostalim ljudima ili životinjama. Neki mikroorganizmi uzrokuju bolest napadom na tkiva organizma, ostali napadaju neizravno proizvodeći toksine. Najčešće, za uzrokovanje bolesti nužan je golem broj mikroorganizama. Da bi naše tijelo svladalo ofanzivne taktike pojedinih mikroorganizama, nužno je biti rezistentan na bolesti. Važna prirodna otpornost osigurana je kožom kao barijerom, sluzničkim membranama, trepetljikama, želučanom kiselinom i anti-mikrobnim hemijskim agensima kao što je interferon. Mikroorganizme mogu razoriti bijela krvna tjelešca, povišena temperatura i snažni imunološki sistemi. Katkad, kada naša prirodna odbrana nije dovoljno snažna da nadvlada invaziju mikroorganizama, ona se nadoknađuje antibioticima i ostalim lijekovima.

Objektivan promatrač spoznaje praktično značenje mikroorganizama ponajprije po štetama što ih uzrokuju u ljudi, životinja i biljaka. Iako su mikroorganizmi nepoželjni i u ostalim područjima u prirodi i industriji, nema dvojbe da prevladava njihova korisna uloga. Mikroorganizmi već odavno imaju čvrstu poziciju u domaćinstvu i industriji; bez njihova korisnog utjecaja prestao bi na Zemlji i život viših organizama. Njihova je primjena sve veća, i to od oplemenjivanja primarnih poljoprivrednih proizvoda pa do katalize čitava niza različitih hemijskih reakcija. Kao primjer može se navesti proizvodnja piva s pomoću kvasaca, dobivanje mliječnih proizvoda s pomoću bakterija mliječne kiseline, proizvodnja konzumnog octa s pomoću bakterija octenokiselog vrenja, pa postaje jasno da se mikroorganizmi ubrajaju među najstarije organizme koje je čovjek počeo iskorištavati.

Nova epoha liječenja započela je pronalaskom antibiotika. Pronalaskom penicilina i ostalih produkata metabolizma gljiva i bakterija, čovječanstvo je dobilo gotovo nepogrešiva sredstva u borbi protiv bolesti što ih uzrokuju bakterije.

Hemičari upotrebljavaju mikroorganizme kao katalizatore u biosintezama; pretvorbe s pomoću mikroorganizama premašuju hemijske pretvorbe i specifičnošću i iskorištenjem. Kao primjer može se navesti primjena enzima za hidrolizu škroba, proteaza u industriji kože i pektinaza za bistrenje voćnih sokova. Spomenuti enzimi, a i čitav niz ostalih enzima, dobivaju se iz kultura mikroorganizama.Valja istaknuti da se neke sirovine što se nalaze u golemim

2

količinama (zemni plin, nafta i celuloza npr.) mogu samo s pomoću mikroorganizama pretvoriti u stanični materijal (biomasu) ili u međuprodukte što ih ćelija izlučuje u okolinu. Stoga mikroorganizmi imaju, tokom ˝oplemenjivanja˝ nafte, zemnog plina i ugljena, monopoliziran položaj.

Ključne riječi

Mikroorganizmi, Eserihija koli, penicilin, bakterije, farmaceutski proizvodi, antibiotici, Aleksandar Fleming, kontrola kvalitete, sterilnost, gram negativne bakterije, farmakopeja, β-laktamski prsten, Louis Pastour, minimalna inhibitorna koncentracija, HVAC sistemi.

Uvod

Slučajno otkriće Alexandra Fleminga, koji je po povratku sa odmora u nečistoj „petrijevoj zdjelici“ otkrio pencilin promijenilo je historiju čovječanstva i sigurno predstavlja jedno od najvećih otkrića uopće. Nakon njega, hiljade manjih sličnih otkrića predstavljaju historiju farmaceutske industrije, koja je svojim radom doprinijela da ljudi žive duže i zdravije (Brkić, 2012).

Mikroorganizmi mogu biti male biološke tvornice koje proizvode komercijalno korisne produkte, kao što su dodaci hrani, stabilizatori hrane, začini i hemijski spojevi što se upotrebljavaju za liječenje bolesti. Pored životinja i biljaka, mikroorganizmi predstavljaju najmnogobrojniju i najraznovrsniju grupu živih bića na zemaljskoj kugli. Mikroorganizmi su najstariji stanovnici zemlje i predhodnici su svih živih organizama. Moglo bi se reći da su kosmopolitni organizmi rasprostranjeni u svim životnim sredinama i klimatskim zonama, u zraku, vodi i zemljištu.

Slika 1. Predstavnici mikroorganizama- bakterije, plijesni, kvasci (Milenković, 2010)

Danas je poznato, da u prirodi postoji više od sto hiljada vrsta mikroorganizama, koji su podijeljeni u bakterije, aktinomicete, kvasce i gljive pljesni (Slika1). Od bakterija najširu primjenu su našle bakterije mliječno kiselinskog vrenja iz roda laciobacilus i Laciococcus i bakterije sirćetnog vrenja (Gluconobacter i Acetobacter). Aktinomicete (Streptomyces i Actinomyces) našle su veoma široku primjenu za dobivanje bioindustrijskom proizvodnjom čitavog niza antibiotika. Gljive ili plijesni su našle veoma široku primjenu za dobivanje čitavog niza enzima i organskih kiselina pri čemu su od posebnog značaja vrste iz roda Penicillium i Aspergilus. Od kvasaca najširu primjenu u bioindustrijskoj proizvodnji ima Saccharomyces cerevisiae. Sojevi iz ove vrste su našli najširu primjenu u pekarstvu, vinarstvu, pivarstvu i u novije vrijeme u proizvodnji bioetanola. Pored toga, mikroorganizmi

3

su našli veoma široku primjenu u proizvodnji raznih primarnih i sekundarnih metabolita npr. antibiotici, aminokiseline, alkaloidi, antioksidansi, polisaharidi, herbicidi, insekticidi, steroli, lipidi, hormoni itd (Popov,2007).

1. Mikroorganizmi u farmaceutskoj industriji

1.1. Kontrola kvaliteta u farmaceutskoj industriji

Farmaceutski proizvodi pored svog terapijskog efekta, treba da ispune osnovni zahtjev koji se odnosi na njihovu bezbjednost, odnosno neškodljivost za pacijenta. Mikrobiološki kvalitet farmaceutskih preparata zavisi od uslova (faktora spoljašnje sredine) u kojima se odvija njegova proizvodnja, kao i sastavnih komponenti koje se koriste u njegovoj formulaciji. Mikroorganizmi koji se mogu naći u finalnom proizvodu najčešće potiču iz/sa sirovina, opreme, vazduha, osoblja, ili ambalaže. Pojedine vrste patogenih mikroorganizama imaju sposobnost rasta i u prisustvu konzervanasa koji se dodaju u farmaceutske preparate.

Sastavni dio svake farmaceutske industrije je Sektor kontrole kvaliteta. Kontrola kvaliteta je onaj dio Dobre proizvođačke prakse-GMP (Good Manufacturing Practice) koji se bavi uzorkovanjem, ispitivanjem, kao i organizacijom postupaka koji obezbjeđuju vršenje potrebnih i relevantnih ispitivanja. Materijali se ne odobravaju za upotrebu, a sirovine se ne puštaju u promet dok se njihov kvalitet ne ocijeni kao zadovoljavajući (Milenković, 2010).

Zadatak mikrobiološke laboratorije je da razvije, primjeni i validira mikrobiološke testove koji se mogu primijeniti na farmaceutske proizvode. U kontroli je potrebno potvrditi da sirovine, poluproizvodi i gotovi proizvodi nisu kontaminirani nedozvoljenim brojem mikroorganizama i da u njima nema nepoželjnih i patogenih mikroorganizama koji bi negativno mogli da utiču na zdravlje korisnika.Važna uloga mikrobiološke laboratorije je i kontrola sredine (vazduha, opreme) u proizvodnim pogonima.

Mikroorganizmi su prisutni u različitim sredinama, ima ih u vodi, vazduhu i zemljištu. Jedan od osnovnih razloga za njihovu široku rasprostranjenost je sposobnost da koriste različita neorganska i organska jedinjenja kao metabolički supstrat i izvor energije. Mikroorganizmi preživljavaju u uslovima koji su minimalni u pogledu koncentracije hranljivih materija, a neke vrste kao što su Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Burkholderia spp. i Stenotrophomonas spp., su izrazito prilagodljive i koriste brojna organska i neorganska jedinjenja kao izvor energije.

U procesu proizvodnje ATP-a mikroorganizmi mogu koristiti oksidativne ili fermentativne metaboličke procese. Respiracija se kod bakterija može odvijati kao aerobna (kada je krajnji akceptor elektrona-kiseonik) ili anaerobna kada su krajnji akceptori elektrona različita neorganska jedinjenja. Neke bakterije preživljavaju kako u prisustvu tako i u odsustvu kiseonika (fakultativni anaerobi) (Milenković, 2010).

Faktori koji utiču na distribuciju i rast mikroorganizama su : temperatura voda

4

koncentracija organskih materija pH koncentracija neorganskih materija redoks potencijal (Eh) pritisak svjetlost (intenzitet svjetlosti)

Navedeni faktori spoljašnje sredine se stalno mijenjaju a mikroorganizmi se adaptiraju i preživljavaju u izmjenjenim uslovima. Razvili su brojne strategije da prežive pod nepovoljnim uslovima. Najčešće je to minimalno korištenje energije, sporiji metabolizam i rast, obrazovanje endospore pod nepovoljnim uslovima, obrazovanje biofilma i dr. Populacija mikroorganizama ne raste i ne razmnožava se kontinuirano u svježem medijumu. U prvoj fazi prilagođavanja (Lag faza) nema rasta već dolazi do sinteze neophodnih enzima.

Faza eksponencijalnog rasta slijedi ubrzo nakon prve faze kada dolazi do eksponencijalnog rasta i u idealnim uslovima Escherichia coli se dijeli svakih 20 minuta, dok je vrijeme diobe u nepovoljnim okolnostima za rast daleko duže (Milenković, 2010).

Jedan od mehanizama preživljavanja u nepovoljnim uslovima je sposobnost nekih bakterija da obrazuju sporu (Bacillus spp., Clostridium spp.). Ovo se najčešće dešava kada u spoljašnjoj sredini nema dovoljno hranljivih materija ili usljed porasta temperature. Sporogeni oblici mikroorganizama kao što su gore navedeni Bacillus spp. i Clostridium spp. su također široko rasprostranjeni u vazduhu, vodi i zemljištu. U uslovima koji su optimalni za rast spore germinacijom prelaze u vegetativni oblik bakterija. U odgovoru na promjenjene uslove sredine, neke vrste mijenjaju profil svojih enzima i strukturnih proteina. Ove promjene su karakteristične za Acinetobacter spp., Arthrobacter spp., Pseudomonas spp. i familiju Enterobacteriaceae. U nepovoljnim uslovima kada je niska koncentracija hranljivih materija, navedeni mikroorganizmi sintetišu nove tipove enzima i proteina, koji su od vitalnog značaja za održanje bakterijske populacije.

Slijedeća strategija preživljavanja pod nepovoljnim uslovima je smanjenje veličine ćelije i redukcija metaboličkih procesa. Arhtrobacter spp. je dobar primjer kako bakterije mijenjaju svoje morfološke osobine pod različitim uslovima. Prelazak iz forme bacila u koke se uočava kada kultura prelazi iz eksponencijalne u stacionarnu fazu rasta. U nekim slučajevima je to povećana adhezivnost bakterija za površine što dovodi do formiranja biofilma u kome je korištenje hranljivih materija optimalno, a bakterije su zaštićene od dejstva nepovoljnih faktora (Milenković, 2010).

Metode koje se pored standardnih koriste u identifikaciji mikroorganizama su: genske probe; PCR (polymerase chain reaction); sekvencioniranje DNK; ekstrakcija nukleinskih kiselina iz različitih uzoraka.

Biomasa mikroorganizama se može odrediti: direktnim brojanjem mikroorganizama; određivanjem ATP-a i totalnog adenilata; detekcijom komponenti ćelijskog zida (lipida i muraminske kiseline); određivanjem bakteriohlorofila i drugih pigmenata; detekcijom DNK; detekcijom proteina.

Primjenom navedenih metoda utvrđeno je da je većina mikroorganizama iz spoljašnje sredine nekultivabilna ali vijabilna. Kod direktne mikroskopije ukupan broj mikroorganizama obuhvata i mrtve i žive ćelije jer se ovom metodom one ne mogu diferencirati. Pored

5

svjetlosne mikroskopije mogu se koristiti i metode direktne imunofluorescencije. Za izolovanje mikroorganizama iz vode i vazduha pogodniji su medijumi sa niskim sadržajem organskih materija (Milenković, 2010).

1.2. Prevencija kontaminacije farmaceutskih proizvoda

Farmaceutski proizvodi moraju odgovarati zahtjevima koje propisuje farmakopeja. Farmakopeja je zbirka propisa, metoda i normi kojima podliježu farmaceutski proizvodi, a ima snagu zakona. U farmaceutskoj proizvodnji za neke lijekove i preparate osnovni zahtijev je da budu sterilni. Sterilnost je odsustvo svih oblika života (vegetativnih i sporogenih formi mikroorganizama). Sterilnost se ispituje precizno propisanim testom koji se izvodi na uzorku koji mora biti reprezentativan da bi rezultat bio validan. Nije obavezno da svi lijekovi budu sterilni. Neki lijekovi i drugi farmaceutski preparati ne moraju biti sterilni, nego bakteriološki ispravni. To znači da ne smiju sadržati patogene mikroorganizme, a broj saprofitnih organizama ne smije preći određene granice, što je takođe propisano farmakopejom. U tom smislu, lijekovi i pomoćna ljekovita sredstva podjeljeni su u 4 kategorije:

1. U kategoriju I klasifikovani su preparati koji moraju da budu sterilni.2. U kategoriju II – preparati za spoljnu upotrebu i neki preparati za primjenu duž

respiratornog trakta.3. Kategorija III sadrži podgrupe A i B : U podgrupu A spadaju preparati za oralnu i rektalnu primjenu. U podgrupu B svrstani su preparati koji sadrže sirovine prirodnog porijekla.4. Kategorija IV se odnosi na biljne preparate. U zavisnosti od načina njihove primjene

kategorija IV takođe sadrži dvije podgrupe. U podgrupu A kategorije IV spadaju oni biljni preparati kojima se prije upotrebe

dodaje ključala voda (infuzi i dekokti). U podgrupu B kategorije IV spadaju svi ostali biljni preparati.

Za farmaceutske preparate koji se pe os primjenjuju dozvoljeno je prisustvo maksimalno do 103 aerobnih bakterija i 102 gljivica/gr preparata, a ne smije biti prisutna Escherichia coli. Farmaceutski proizvod može biti kontaminiran na više načina i na različitim mjestima tokom proizvodnje. Mikrobiološki kvalitet farmaceutskog proizvoda je pod uticajem sredine u kojoj se proizvodi i materijala koji se koriste u njegovoj formulaciji. Mikroflora finalnog proizvoda može sadržati kontaminante porijeklom iz sirovine, opreme koja se koristi u proizvodnji, atmosfere-sredine u kojoj se odvija proces, osoblja ili finalnog suda u koji je proizvod upakovan. Prisustvo mikroorganizama u farmaceutskim preparatima može dovesti do ozbiljnih posljedica po zdravlje pacijenta ili smanjiti očekivani terapijski efekat. Vrsta mikroorganizama, njihov broj kao i put administracije lijeka kao i opšte stanje pacijenta utiču na krajnji efekat primjene farmaceutskih preparata koji su kontaminirani mikroorganizmima (Milenković, 2010).

Prisustvo mikroorganizama u farmaceutskim preparatima može dovesti do:1. izmjene sastava preparata; 2. smanjenja njihove terapijske efikasnosti 3. može imati ozbiljne posljedice po zdravlje korisnika.

Farmaceutski preparati se primjenjuju na različite načine (intravenski, per os, kao preparati za lokalnu primjenu na koži...) tako da su posljedice po zdravlje pacijenta uslovljene načinom aplikacije lijeka, vrstom i brojem mikroorganizama kao i opštim stanjem pacijenta. Osnovni zahtjev za svaki lijek je da bude efikasan i bezbjedan, a to u velikoj mjeri zavisi od mikrobiološke ispravnosti preparata. Zbog toga je jedan od značajnih procesa u toku

6

proizvodnje u farmaceutskoj industriji mikrobiološka kontrola koja se odvija u toku proizvodnje (Milenković, 2010).

Kako mikroorganizmi dospijevaju u farmaceutski proizvod i koji su potencijalni izvori kontaminacije?1. Sirovine biljnog ili životinjskog porijekla koje se koriste u farmaceutskim formulacijama, nisu sterilne i mogu predstavljati izvor kontaminacije. Sirovine prirodnog porijekla češće mogu dovesti do kontaminacije jer imaju veće biološko opterećenje, od sirovina dobijenih sintetičkim putem. Tako korištenje skroba i šećera u suhom stanju može povećati broj gljivica. Osnovni zahtjev u pogledu mikrobiološke ispravnosti navedenih sirovina je da ne smiju da sadrže:

Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Salmonella spp.

U sirovinama prirodnog porijekla često su prisutni: Lactobacillus spp. Pseudomonas spp. Bacillus spp. Escherichia spp. Clostridium spp. Streptococcus spp. Agrobacterium spp. i pljesni: Cladosporium spp. i Fusarium spp (Milenković, 2010).

2. Vazduh u prostorijama također može biti izvor kontaminacije. Vazduh nije prirodna sredina za rast i razmnožavanje mikroorganizama ukoliko ne sadrži neophodnu količinu vlage i hranljivih sastojaka u formi u kojoj ih oni mogu iskoristiti. U vazduhu su često prisutne gljivice: Penicillium spp., Aspergillus spp., Mucor spp., Rhodotorula spp. Mikroorganizmi se nalaze u vazduhu suspendovani na česticama prašine, kosi ili odjeći, kapljicama vlage ili kapljičnim jezgrima (Flügge-ove kapi) koje nastaju prilikom pričanja, kašljanja ili kihanja. Mikrobiološki sadržaj vazduha može biti povećan tokom rada sa kontaminiranom sirovinom, tokom razmjeravanja, mljevenja ili dodavanja praškastih supstanci u formulaciju.

Ventilacioni sistemi u farmaceutskim fabrikama su tako konstruisani da minimiziraju preživljavanje, prenošenje i rast mikroorganizama. U farmaceutskim pogonima se primjenjuju takozvani HVAC sistemi (humidity, ventlation and air conditionic units) za kontrolu navedenih parametara. Vazduh se propušta kroz kroz filtere čiji je promjer pora 0,5 μm što smanjuje na minimum mogućnost kontaminacije proizvoda iz vazduha. Protok i pritisak vazduha su kontrolisani da bi se isključila mogućnost dospijevanja mikroorganizama u kritične zone. Kontroliše se također i vlažnost vazduha jer što je veća vlažnost vazduha veća je i mogućnost preživljavanja mikroorganizama. Za redukovanje broja mikroorganizama u vazduhu u farmaceutskoj industriji se primjenjuju UV lampe. U uzorcima vazduha koji se ispituju u toku redovne mikrobiološke kontrole često se mogu naći sljedeće vrste:

Bacillus spp. Staphylococcus spp. Corynebacterium spp. i pljesni: Penicillium spp., Cladosporium spp. i Aspergillus spp. (Milenković, 2010).

3. Čovjek može biti izvor kontaminacije farmaceutskih proizvoda odnosno fiziološka mikroflora koja potiče sa kože i sluznica zaposlenog osoblja. Na koži zdravih osoba često se

7

nalazi bakterija iz roda Staphylococcus (S. aureus, S. epidermidis). Ima je na rukama, licu, u dubokim slojevima kože. Gram negativni bacili kao što su Acinetobacter spp., Alcaligenes spp. mogu se naći na vlažnim i seboroičnim dijelovima kože. Na koži su često prisutni difteroidi, Sarcina spp. i dermatofiti iz rodova Trichophyton, Epidermophyton i Microsporon.Predstavnici fiziološke mikroflore kože čovjeka su:

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus capitis Staphylococcus hominis Propionibacterium spp. Propionibacterium acnes Micrococcus spp.

U usnoj duplji i na nazofaringsu najčešće su prisutni: Streptococcus salivarius Streptococcus mutans difteroidi, najserije, Candida albicans i dr.

U kritičnim zonama osoblje nosi sterilnu odjeću i obuću (rukavice, kape, maske, mantile) kako bi se spriječila kontaminacija farmaceutskih proizvoda (Milenković, 2010).

4. Voda je također potencijalni izvor kontaminacije farmaceutskih proizvoda. Da bi se broj patogenih mikroorganizama u vodi redukovao primjenjuju se različiti hemijski i fizički postupci a zatim se voda dalje tretira kako bi se eliminisali mikroorganizmi, endotoksini, organske i neorganske supstance. Što je veća koncentracija organskih materija u vodi veća je i vjerovatnoća da se mikroorganizmi nalaze u njoj. Bakterije koje se mogu izolovati iz uzoraka vode su:

Pseudomonas spp. Alcaligenes spp. Stenotrophomonas spp. Serratia spp. Flavobacterium spp (Milenković, 2010).

5. Izvor kontaminacije farmaceutskih proizvoda može biti oprema, podovi, plafoni i zidovi prostorija u kojima se odvija proizvodnja. Sva oprema i mašine u farmaceutskom pogonu moraju se pravilno čistiti i održavati kako ne bi došlo do kontaminacije proizvoda. Bakterije koje se mogu izolovati iz briseva uzetih sa mašina i radnih površina su:

Pseudomonas spp. S. Epidermidis Bacillus spp.

Na zidovima i plafonu mogu se naći pljesni kao potencijalni kontaminanti. a uklanjaju se redovnim pranjem i dezinfekcijom. Čiste sobe su kontrolisana sredina u kojima se odvija proces proizvodnje. Za one u kojima se proizvode farmaceutski preparati postoje posebni zahtijevi u pogledu koncentracije čestica (nežive ćelije) i koncentracije mikroorganizama (žive ćelije). Međunarodni priznati standard za čiste sobe ISO 14644 ih definiše kao prostorije u kojima je koncentracija čestica vazduha kontrolisana, koje su konstruisane i koriste se na način kojim se smanjuje unošenje, stvaranje i zadržavanje čestica unutar prostorija. Temperatura, vlažnost i pritisak su u čistim sobama strogo kontrolisani (Milenković, 2010).

1.3. Mikrobiološki monitoring vazduha i sredine

8

Mikrobiološki monitorig vazduha je metod kojim se u definisanoj zapremini vazduha sakupljaju i broje mikroorganizmi.To je zahtjev Dobre proizvođačke prakse (GMP) i veoma je bitan u svim industrijama koje imaju čiste sobe sa filtriranim vazduhom. Mikrobiološka kontrola proizvodne sredine predstavlja skup metoda kojima se prate uslovi sredine i ujedno spriječava njihov nepovoljan uticaj na kvalitet i čistoću farmaceutskih preparata. Za monitoring sredine značajna je identifikacija izolata i formiranje˝in house" sojeva čija je svrha identifikacija i upoznavanje domaćih sojeva, a u cilju praćenja vrsta koje se nalaze u datom okruženju da bi se kontinuiranim nadzorom uočila pojava novih ili patogenih sojeva. Izolati koji se sreću u uzorcima sredine najčešće su mikroorganizmi koji pripadaju fiziološkoj mikroflori kože (Staphylococcus spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. i Candida albicans) (Milenković, 2010).

1.4. Mikroorganizmi koji najčešće kontaminiraju farmaceutske preparate

Farmaceutske proizvode mogu kontaminirati striktno patogene (npr. Clostridium tetani, Salmonella spp.) i uslovno-patogene vrste mikroorganizama (Klebsiella spp., Bacillus subtilis). Primjena kontaminiranih farmaceutskih proizvoda može dovesti i do pojave epidemija kao što je to bio slučaj u Švedskoj šezdesetih godina prošlog vijeka, kada je upotreba tableta kontaminiranih salmonelama dovela do pojave salmoneloze kod dvije stotine pacijenata. Opisane su i ozbiljne infekcije oka kod devet pacijenata koji su koristili hydrocortison mast za oči koja je bila kontaminirana bakterijom Pseudomonas aeruginosa. Kontaminacija talk pudera bakterijom Clostridium tetani dovela je do smrtnog ishoda novorođenčadi kojima je na kožu aplikovan kontaminiran preparat. Kritična infektivna doza mikroorganizma koja će dovesti do patološkog procesa nije poznata i različita je čak i u okviru jedne iste vrste mikroorganizma (Milenković, 2010).

2. Escherichia-coli

Ešerihija koli pripada grupi bakterija koje su normalni stanovnici crijeva i vrlo je korisna jer proizvodi vitamin K, kao i neke vitamine B kompleksa neophodne za normalnu funkciju digestivnog trakta. Problem nastaje kada počne nekontrolisano da se razmnožava jer tada izaziva infekcije, najčešće urinarnog i digestivnog trakta. Ukoliko je riječ o urinarnim infekcijama, javlja se učestalo, bolno mokrenje praćeno peckanjem, urin je obično zamućen i neprijatnog mirisa, a ponekad sadrži i krv. Crijevne infekcije izazvane ešerihijom uzrokuju povišenu tjelesnu temperaturu, proljev, povraćanje i, posljedično, dehidrataciju. Stolica je vodenasta, zelenožute boje, ponekad sa primjesama sluzi.

U liječenju ovih oboljenja najčešće se primjenjuju antibiotici, uz obavezan antibiogram, da bi se ustanovila koja je vrsta lijeka najefikasnija, jer ešerihija ima izraženu sposobnost mutiranja i vrlo brzo postaje otporna na medikamente. Međutim, valja imati na umu da antibiotici imaju i štetno dejstvo jer uništavaju i korisne mikroorganizme u crijevima, pa se uz redovnu terapiju predlaže konzumiranje određenih vrsta povrća i primjena preparata od ljekovitog bilja (Hasanagić, 2008).

9

Slika 2. Prikaz građe bakterije e-coli (Hasanagić, 2008)

E. coli čini znatan dio fiziološke mikroflore crijevnog trakta ljudi i životinja. Prvenstveno boravi u debelom crijevu. Escherichia coli je vrsta bakterije iz roda Escherichia i porodice Enterobacteriaceae i široko je rasprostranjena u prirodi. Ubraja se u grupu tzv. koliformnih bakterija tj. bakterija koje se redovno ili veoma često nalaze u ljudskoj stolici i koje pri sanitarnim pregledima vode za piće i namirnica služe kao indikatori fekalne kontaminacije.

E.coli je aerobna i fakultativno anaerobna bakterija, dobro uspijeva u laboratorijskim uslovima, većini serotipova je optimalna temperatura za razmnožavanje oko 37°C. Pripada prilično otpornim bakterijama: mjesecima može živjeti u vodi i zemlji, a dugo na raznim predmetima. U različitim vrstama hrane i namirnica lako se i brzo razmnožava. Topota od 60°C ubija ih nakon 15 min. Većina tipova E. coli je bezopasna za čovjeka, ali neki kod ljudi mogu da izazovu različite bolesti. Sve te bolesti mogu se podijeliti u dvije velike grupe: grupa crijevnih bolesti i grupa piogenih bolesti.

Piogene infekcije izazivaju uglavnom sojevi E. coli koji se nalaze u mikroflori zdravog ljudskog organizma. Oni su uglavnom oportunisti-budući da normalno žive u crijevima čovjeka, izazivaju bolest samo uz određene preduslove, ako dospiju iz crijeva u neke druge organe i tkiva. Najčešće piogene bolesti koje izazivaju su infekcije mokraćnih i spolnih organa (Hasanagić, 2008).

Slika 3. Prikaz bakterije E-coli pod mikroskopom (3D Science.com)

3. Antibiotici

Antibiotici predstavljaju produkte bakterija, gljivica, plijesni koji imaju dejstvo da u malim količinama inhibiraju rast i razvoj mikroba ili ih ubijaju. Da bi neka tvar bila antibiotik ona mora u malim koncentracijama spriječavati rast i razvoj mikroorganizama, djelovanje se ne smije smanjivati na povišenoj temperaturi, djelovanje antibiotika mora biti brzo, ne smije narušavati imunološki sistem, ne smije razvijati rezistenciju, a proizvodnja antibiotika mora

10

biti omogućena u velikoj količini. Rezistencija može biti stečena i prirodna i u direktnoj je vezi sa širinom i načinom primjene antibiotika. Najčešće nastaje radi mutacije u genetskom materijalu bakterije ili zbog njene adaptacije na djelovanje određene tvari. Veliki broj bakterija danas je rezistentan uglavnom zbog stečene rezistencije. Primjena antibiotika je danas nekontrolisana i ovo dovodi do rezistencije. Mogu se davati oralno ili parentalno. Anti-biotici se uglavnom dobivaju biosintezom ili polusintetski a veoma rijetko sintetskim putem. Najčešći proizvođači antibiotika su bakterije-75%. Polusintetska proizvodnja antibiotika se odvija kroz 4 faze: laboratorijska, predfermentacija, fermentacija, separacija i izolacija.

U prvoj fazi u odgovarajući inokulum se uvodi odgovarajući soj bakterija i stvaraju se povoljni uslovi da se poveća koncentracija bakterija. Kad su narasle u dovoljnoj količini prenose se u predfermentator - zatvoreni prostor gdje se kontrolira temperatura, vlažnost i dotok zraka i gdje se omogućava rast bakterija koje se kasnije prenose u fermentator i tu se kontroliše rast do određenog stepena. Iz ovoga, se onda, vrši izolacija odgovarajućeg antibiotika. Ovo je veoma skup način proizvodnje, posebno faza fermentacije.

Danas ih se dosta dobiva biosintezom; posebno penicilinski preparati, jer je većina antibiotika optički aktivna tvar i aktivna je samo jedna djelotvorna forma. Antibiotici dobiveni biosintezom se mogu različitim hemijskim procesima prevesti u druge spojeve i tako se dobivaju polusintetski preparati (Šalković-Petrišić i Bradamante, 2010).

Podjela:1. Prema spektru djelovanja:

a) Širokog spektra – djeluju na G+ i G- mikroorganizme i na neke viruse. Takvi su: hloramfenikol, tetraciklini, azalidi...

b) Uskog i proširenog spektra – djeluju na G+ bakterije, šigele, protozoa, salmonele. Takvi su penicilini.

c) Uskospecifični–djeluju na određene sojeve npr.Streptomycin,cikloserin, kanamicind) Fungicide – nistatin, grizofluvin, anfotericine) Citostatici – daurorubicinf) Virustatici (Wiley&Sons, 2005).

Slika 4.Podjela antibiotika prema spektru djelovanja (Wiley&Sons, 2005)

2. Prema mehanizmu djelovanja:

a.) Antibiotici koji djeluju na biosintezu ćelijskog zida; a to su: β-laktami i to: penicilini i cefalosporini: bacitracin, novobiocin i vankomicin.

b.) Antibiotici koji povisuju permeabilitet ćelijske membrane: poliniksin i polienski antibiotik

11

c.) Antibiotici koji inhibiraju sintezu protein: Aminoglikozidi (50s, 30s), steptomicin (50s), Kloramfenikol (50s), tetraciklini, makrolidi, eritromicin, vankomicin i klindamicin.

d.) Antibiotici koji inhibiraju sintezu nukleinskih kiselina: citostatici, rifampicin, grizeofluvin, novobicin, norfloksacin (Wiley&Sons, 2005)

Slika 5. Podjela antibiotika prema mehanizmu djelovanja (Wiley&Sons, 2005)

3.1. Penicilin

Penicilini su danas jedni od najvažnijih antibiotika koji se odlikuju snažnim antimikrobnim djelovanjem uz vrlo malu izravnu toksičnost i relativno veliku terapijsku širinu, zbog čega su lijekovi prvog izbora u infekcijama uzrokovanim osjetljivim uzročnicima. Penicilini su grupa beta-laktamskih antibiotika koji se koriste u liječenju infekcija izazvanih bakterijama. Na dejstvo penicilina osjetljivi su prevashodno Gram-pozitivni patogeni, dok je jedan broj polusintetskih penicilina efikasan i protiv Gram-negativnih bakterija. Prirodni penicilini su proizvod metabolizma gljivica iz roda Penicillium. Danas se široko upotrebljavaju, ali njihov terapijski značaj opada usljed rastuće učestalosti pojave rezistentnih spojeva (Mediko portal, 2009).

Penicilin je u vodi netopljiva, slaba organska kiselina, derivat 6-aminopenicilanske kiseline, koja sadrži dva prstena, četveročlani β-laktamski i peteročlani tiazolidinski prsten (Slika 6). β-laktamski prsten nosi sekundarnu amino grupu (RNH-), čija je zamjena postraničnim lancima različite hemijske strukture na položaju R, odgovorna za antibakterijski spektar i farmakodinamska obilježja penicilina. Enzim amidaza cijepa peptidnu vezu i odvaja postranične lance od 6-aminopenicilanske kiseline, koja je zapravo osnova prirodnih penicilina (penicilin G) i mora biti strukturno cjelovita i sadržavati oba, nepocijepana prstena, jer samo takva ima biološku aktivnost. Ona je također ishodišna tvar za dobivanje polusintetskih penicilina. Nasuprot cijepanju molekule putem amidaze, djelovanjem β-laktamaza dolazi do hidrolize i cijepanja β-laktamskog prstena, pri čemu nastaje peniciloinska kiselina koja nema antibakterijsku aktivnost ali ima ulogu u nastajanju alergijskih reakcija na peniciline (Šalković-Petrišić i Bradamante, 2010).

12

Slika 6. Struktura penicilinskog jezgra (Šalković-Petrišić & Bradamante, 2010)

Tiazolidinski prsten sadrži karboksilnu skupinu (-COOH) u kojoj se vodik može zamijeniti drugim ionima. Ova supstitucija vodika mijenja fizikalno-hemijska i farmako-kinetska svojstva penicilina, posebno njihovu topljivost u vodi, način primjene te brzinu apsorpcije. Zamjenom vodika natrijem dobiva se dobro topiva sol (kristalinični penicilin G) koja se brzo apsorbira, a može se primijeniti intravenski. Supstitucija vodika s organskim bazama, prokainom ili benzatinom, stvara soli koje nisu topljive u vodi, te se u obliku suspenzija primjenjuju u intramuskularnim injekcijama kao depo preparati jer se penicilin iz njih otpušta vrlo sporo i dugotrajno (Šalković-Petrišić & Bradamante, 2010).

3.2. Način određivanja i izražavanja aktivnosti penicilina

Način određivanja aktivnosti penicilina ovisi o tome radi li se o prirodnim ili polusintetskim penicilinima. Prirodni penicilini, od kojih je najpoznatiji penicilin G, dobivaju se fermentacijom odgovarajućih plijesni, pri čemu se stvaraju i neki drugi penicilini (penicilin V, X i K), a zbog ovih primjesa potrebna je biološka standardizacija i određivanje aktivnosti pomoću internacionalnih jedinica koje se mogu preračunati u težinske jedinice. Polu-sintetskim pencilinima se aktivnost ne izražava u internacionalnim jedinicama, već je doza izražena samo težinski, u miligramima ili gramima.

Za izražavanje djelotvornosti antibiotika, pa tako i penicilina, koristi se pojam tzv. minimalne inhibitorne koncentracije (MIC), odnosno najniže koncentracije antibiotika koja će spriječiti rast mikroorganizama. Obično se izražava u μg/ml. MIC vrijednost je klinički važna za određivanje osjetljivosti uzročnika na određeni antibiotik, određivanje doze te praćenje djelotvornosti, odnosno rezistencije na taj antibiotik tokom terapije. Što je MIC vrijednost za određeni mikroorganizam niža, antibiotik je djelotvorniji, odnosno, uzročnik je osjetljiviji. Važno je, stoga, da antibiotik nakon apsorpcije postigne serumsku koncentraciju koja je barem 2 puta veća od MIC vrijednosti, određene in vitro. Drugo je pitanje da li se takva koncentracija antibiotika obzirom na njegove farmakokinetske značajke i terapijsku širinu može ili smije postići na mjestu infekcije. tj. mjestu djelovanja antibiotika (Šalković-Petrišić & Bradamante, 2010).

13

Slika 7. Prikaz presjeka penicilina (Mediko portal, 2009)

3.3. Štetna djelovanja zajednička svim penicilinima

Jedan od razloga zašto se penicilini preferiraju nad drugim antibioticima u liječenju infekcija osjetljivim uzročnicima je njihova vrlo mala izravna toksičnost. Najčešće nuspojave penicilinske terapije su reakcije preosjetljivosti, a istovremeno, od lijekova općenito, penicilini najčešće uzrokuju reakcije preosjetljivosti. Imunogena svojstva povezana su s cijepanjem β-laktamskog prstena i nastajanjem peniciloil formacije koja je glavna determinanta imunogenosti. Pojam glavne determinante odnosi se na učestalost kojom se formiraju protutijela na ovaj hapten, ali ne određuju ozbiljnost alergijske reakcije. Za nastajanje reakcije preosjetljivost važne su i druge, tzv. sporedne determinante, koje su odgovorne za nastajanje anafilaktičke reakcije. Reakcije preosjetljivosti mogu nastati pri bilo kojem načinu primjene i na bilo koju vrstu penicilina, a ukupna učestalost im se kreće od 0,7 - 10 %. Zbog velike strukturne sličnosti same penicilinske jezgre, među različitim vrstama penicilina postoji ukrižena preosjetljivost.

Međutim, hemijska jezgra cefalosporina u dovoljnoj je mjeri različita od jezgre penicilina, da pojedine osobe s alergijom na penicilin dobro podnose cefalosporine i mogu dobivati cefalosporinsku terapiju za osjetljive uzročnike. Učestalost ukrižene alergije između ove dvije grupe beta-laktamskih antibiotika kreće se između 5-10%. Ipak, smatra se da se bolesnicima s anafilaksom na penicilin u historiji bolesti, ne smiju davati niti cefalosporini. Ponekad alergijske reakcije mogu nastati i nakon prve primjene lijeka jer je prvi kontakt s penicilinom prošao neprimijećeno. Premda su alergijske reakcije na peniciline česte, prema nekim referentnim izvorima, u svega 10% slučajeva doći će do ponovne alergijske reakcije pri sljedećoj primjeni penicilina (Šalković-Petrišić & Bradamante, 2010).

Unatoč tome, ipak se osobama s alergijskom reakcijom na penicilin u anamnezi, preporuča propisati drugu vrstu antibiotika sa sličnim antimikrobnim spektrom. Mogući su različiti oblici reakcija preosjetljivosti; makulopapularni osip, urtikarija, vrućica, bronho-spazam, vaskulitis, serumska bolest, eksofolijativni dermatitis, Stevens-Johnsonov sindrom i anafilaksa. Najteži su simptomi anafilakse koja može završiti smrtnim ishodom (anafilaktički šok, angioneurotski edem), a učestalost ove alergijske reakcije kreće se između 0,004-0,04%. Hematološka toksičnost je rijetka, neutropenija je moguća gotovo kod svih vrsta penicilina, a mehanizam nastanka nije jasan. Nefrotoksičnost je kod penicilina načelno rijetka, varijabilna i reverzibilna, od mogućnosti nastanka alergijskog angitisa do intersticijalnog nefritisa kod meticilina koji se više zbog toga ne koristi. Zbog mogućnosti nastanka alergijske reakcije težeg oblika nakon lokalne primjene, lokalni se pripravci penicilina ne proizvode, a lokalna primjena penicilina na kožu i sluznice te udisanjem aerosola, smatra se stručnom pogreškom (tzv. vitium artis). Svi oralno primijenjeni penicilini mogu dovesti do poremećaja normalne crijevne flore te eventualnog, antibioticima uzrokovanog kolitisa s Clostridium difficile.

14

Gubitak normalne crijevne flore dovodi do kolonizacije s rezistentnim gram-negativnim bacilima ili gljivicama (Šalković-Petrišić & Bradamante, 2010).

3.4. Skupine penicilina

Obzirom na hemijsku strukturu postraničnog lanca koji se veže za 6-aminopenicilansku jezgru (na R položaj), penicilini se dijele u tri osnovne skupine, a neke od njih dalje u podskupine, koje se međusobno razlikuju primarno po svom antimikrobnom spektru:

1. Penicilini s klasičnim uskim spektrom (penicilin G, prokain-penicilin G, benzatin-penicilin G, penicilin V).

2. Penicilini djelotvorni protiv stafilokoka koji produciraju β-laktamazu (nafcilin, kloksacilin, dikloksacilin, flukloksacilin).

3. Penicilini proširenog spektra djelotvorni protiv gram-negativnih mikroorganizama (aminopenicilini: ampicilin i amoksicilin, karboksipenicilini: karbeniclin indanil natrij i tikarcilin, ureidopenicilini:azlocilin i piperacili) (Šalković-Petrišić&Bradamante, 2010).

4. Zaključak

Veliki znanstvenik, Louis Pasteur je rekao: Mikroorganizmi su svugdje. Mikroorganizmi su svemoćni. Mikroorganizmi će imati posljednju riječ. Doista, bakterije žive svuda – u zraku, zemlji, vodi, u drugim živim organizmima, na sniježnim prostranstvima i u termalnim vrelima. Bakterije imaju izrazito važnu ulogu u kruženju tvari u prirodi jer sudjeluju u razgradnji uginule organske tvari, a u tom nizu imaju posljednju riječ.

Na površini tijela čovjeka, životinja, biljaka i drugih predmeta koji nas okružuju, mnoge vrste mikroorganizama su redovni stanovnici. Još uvijek nije određen tačan broj mikroorganizama, ali po dosadašnjim podacima postoji oko 100 000 vrsta gljiva, 1600 vrsta bakterija, 17 000 vrsta algi, više od 2000 virusa, itd. Identifikacija vrsta još uvijek nije potpuna, ali i ovi podaci govore nam o veličini bogatstva svijeta mikroorganizama. Gledajući Zemlju i njena različita prostranstva, mikroorganizme nalazimo i u pustinjama, i na dnu dubokih oceana i u vječnom snijegu i ledu i na najvišim stjenovitim planinama. Naravno i na svim onim mjestima gdje i čovjek ugodno živi. U zemlji, zraku, biljkama, ljudima, životinjama... To pokazuje kako su mikroorganizmi različiti.

Mikroorganizmi su obavljači raznih industrijski poželjnih procesa, primjerice u: prehrambenoj industriji: proizvodnja mliječnih prerađevina, proizvodnja piva, vina i

alkohola, farmaceutskoj industriji: proizvodnja lijekova, najčešće antibiotika, poljoprivredi: obogaćivanje tla dušikovim spojevima preko sadnje djeteline ili

mahunarki koje u korijenu sadrže dušik-fiksirajuće bakterije, pročišćavanju otpadnih voda.

15

S obzirom na njihove ekološke odlike, široke ekološke valence i dobru prilagodljivost novim uslovima života, mikroorganizmi su rasprostranjeni u svim sferama životne sredine. Pored toga mikroorganizmi koriste kao staništa druge organizme. Mikroorganizmi su najstariji stanovnici zemlje i predhodnici su svih živih organizama. Moglo bi se reći da su kosmopolitni organizmi rasprostranjeni u svim životnim sredinama i klimatskim zonama, u zraku, vodi i zemljištu.

Antibiotici su savremena sredstva u borbi protiv infekcija i infekcionih bolesti i u tom smislu niti jedna druga supstanca ne može se mjeriti sa njihovim terapijskim efektom. Interesantno je da su antibiotici otkriveni kao prirodni dio ekološkog odnosa između dva mikroorganizma, a ne izumljeni što je vjerovatno i razlog njihove visoke efikasnosti. Suština djelovanja antibiotika zasniva se na međusobnom antagonističnom odnosu dva mikro-organizma; naime jedan mikroorganizam proizvodi određenu antibiotsku materiju koja kod drugog dovodi do inhibicije nekih enzimskih sistema i njegovog brzog umiranja. Priroda je dugo modifikovala i usavršavala ove agresivne mikrobicidne molekule i stoga nije čudno što nakon njihovog otkrića u modernoj medicini više ništa nije isto.

Penicilini su danas jedni od najvažnijih antibiotika koji se odlikuju snažnim antimikrobnim djelovanjem uz vrlo malu izravnu toksičnost i relativno veliku terapijsku širinu, zbog čega su lijekovi prvog izbora u infekcijama uzrokovanim osjetljivim uzročnicima.

Dobre osobine penicilina jesu da imaju širok spektar djelovanja, malo su toksični a terapeutski indeks je širok, te se mogu davati u velikim dozama, a najveći nedostatak im je pojava alergija. Nikad se ne zna kad će se pojaviti alergija na peniciline - zato se uvijek moraju davati sa oprezom. Za sve penicilinske preparate važi pravilo ukrštene alergije - ako smo alergični na jedan alergični smo i na sve peniciline.

Literatura

Milenković, M., 2010: Mikroorganizmi i njihov uticaj na proces proizvodnje

farmaceutskih preparata, Zagreb.

Šalković-Petrišić, M., Bradamante, V., 2010: Penicilini, Zagreb

Popov, S., 2007: Biotehnologija, Novi Sad.

Duraković, S.,1996.: Primjenjena mikrobiologija, Zagreb.

Duraković, S., 1997: Opća mikrobiologija, Zagreb.

Majetić, R., 2008: Otkriće penicilina, Zagreb

Veličković, R., 2008: Pravilna primjena antibiotika, Beograd

Kršev, Lj., 1989: Mikrobne kulture u proizvodnji mliječnih proizvoda, Zagreb

Vranešić, D., 2009: Probiotici i prebiotici

www.wikipedia.com/bakterije.htm

www.wikipedia.com/Escherichia-coli

16