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MIN – Untersuchungen beim sporadischen MIN – Untersuchungen beim sporadischen NierenzellkarzinomNierenzellkarzinomZwischenergebnisseZwischenergebnisse
• Was ist Mikrosatelliteninstabilität (MIN) ?• Was ist Alu/AP - PCR ?• Methoden/ Materialien• Ergebnisse• Ausblicke
Was ist Was ist MMikrosatellitenikrosatellitenininstabilität ( MIN ) ?stabilität ( MIN ) ?
Mikrosatelliten: kurze polymorphe Tandemrepeats,1% des GenomsMono-,Di-,Tri-,Tetra - Nukleotidsequenzen
10-50 Kopien von 1-6 Basenpaarmotiven ( Cunningham et al. IOS Press, 1999) treten ungefähr aller 100000 Basenpaaren einmal auf
fungieren vermutlich als Promotoren, Bindungsstellen für Topoisomerasen
Relativ konstant übers Genom verteilt, zu 90 % heterozygot, Brauch et al.
Vorwiegend in intronischen DNA - Abschnitten gelegen
Längenveränderungen dieser DNA – Abschnitte (MIN/ Replication Error Phänotyp) verweisen auf genetische Instabilität
Expansionen/ Kontraktionen während Replikation
ReplikationReplikation
ExpansionExpansion
KontraktionKontraktion
Fehlpaarungen
(Mismatches)
Fehlpaarungen
(Mismatches)
Historie von MINHistorie von MIN
MIN wird ursprünglich 1993 beim HNPCC - Syndrom (hereditäres nicht polypöses Kolonkarzinom) beschrieben (Aaltonen et al. Science 260; Ionov et al.Nature 363, Thibodeau et al. Science 260)
HNPCC assoziierte Tumore weisen zu 80 - 90% MIN auf
Physiologisches Auftreten von Fehlpaarungen (Mismatches) im Bereich einfach - repetitiver Sequenzen während der DNA - Replikation bei Bakterien/ Hefen
Mismatch-Reparaturenzyme korrigieren Replikationsfehler
6 DNA - (mismatch) Reparaturgene 3 homolog zum bakteriellen MutS: hMSH2hMSH2, hMSH3, hMSH6
3 homolog zum bakteriellen MutL: hMLH1hMLH1, hPMS1, hPMS2
Historie von MINHistorie von MIN
1993 Klonierung des ersten Mismatch-Repairgen hMSH2 hMSH2 (Fishel
et al) aus Kolonkarzinom - DNA Keimbahnmutation ist wesentlicher Faktor für HNPCC - Syndrom
Voraussetzung für MIN - positive Karzinome ist Inaktivierung beider Allele eines Mismatch-Repairgens (“two – hit” Modell nach
Knudson, PNAS 68)
Diagnostik bei HNPCC mittels MIN - Analyse mit immunhistochemischer Repairgen - Expressionsbestimmung (anti - hMSH2, anti - hMLH1 am Tumor) : positiv Sequenzierung von hMSH2, hMLH1 in Normal - DNA
5 Mikrosatelliten: BAT 25, BAT 26, D5S346, D17S250, D2S123
MIN in Nicht - HNPCC assoziierten sporadischen MIN in Nicht - HNPCC assoziierten sporadischen TumorenTumoren
Tumortyp Anzahl anTumoren
Anzahl anMarkern
% an Tumorenmit MIN
Referenz
Prostata 66 8 12 Egawa et al. Cancer Res 55
Blase 73 1 1,3 Orlow et al. Cancer Res 54
Niere 36 7 11,1 Uchida et al. Cancer Res 54
Hoden 86 7 0 Peltomäki et al.Cancer Res 53
Modifiziert nach Cunnigham et al. IOS Press 1999Modifiziert nach Cunnigham et al. IOS Press 1999
AP - PCR:
Unterschied zu gewöhnlicher PCR: Generierung einer reproduzierbaren Schar von Produkten (genomischer DNA- Fingerabdruck) mit einem Primer
Voraussetzung: Alu- Verdau, ~ 450 bp große Fragmente
AluAlu - Sequenz: 5% des Genoms, assoziiert mit 50 - 80% bestimmter Mikrosatelitten am 3 ‘ Ende auf
somatische Mutationen von Di- und Trinukleotiden treten mit veränderten AluAlu - Sequenzen auf Sood und Buller (Oncogene 13): 36 von 68 Ovarialtumoren mit MIN
weisen veränderte Alu/ AP - PCR Bandenmuster
Methoden und MaterialienMethoden und Materialien
Blut - DNA
Methoden und MaterialienMethoden und Materialien
Ablauf: DNA - Isolation aus Gefriermaterial mittels Salzextraktion (Tumor-, Normalgewebe)
Konzentrationsmessung a) 20 ng - Verdünnung für Mikrosatelitten - PCR b) DNA - Verdau mit ALU 1 für AP - PCR c) Kontrolle der PCR - Produkte im Agarose - Gel Denaturierung mittels Hitze und Formamid -
Puffer Auftragen der PCR - Produkte auf PAA - Gel mit anschließender Silberfärbung Vergleich des Bandenmusters von Normal- und Tumorgewebe
Probleme: nach absoluten Schwierigkeiten mit AP - PCR muß diese für die ersten 100 Patienten abgearbeitet werden
Name (locus) Chrom.Lokaisation
Repeat - Motiv Größe(bp)
Referenz
BAT 25 4q12 TTTT.T.TTTT.(T)7.A(T)25 ~ 90 Papadopoulos et al. Science 268
BAT 26 2p (T)5…….(A)26 ~ 80 – 100 Papadopoulos et al. Science 268
MYCL1 1p32 GAAAA(GAAA)2TAAA(A/G)10GAAAGA(GAA)14 140 – 209 Mazela et al. Hum Mol Genet 1
REN 1q32 ( TCTG )9 251 – 271 Edwards et al. Genomics 12
Tp53Alu 17p13.1 (AAAAT)8(A)7GAAAA ~ 400 Futureal et al. Nucleic Aids Res 19
RB 13q14 (CTTT)13CTTTT(CTTT)CTTTT(CTTT)4 CC(T)13 260 – 300 Huang et al Cancer Res.52
Methoden und MaterialienMethoden und Materialien
Einsatz von 6 Mikrosatellitenmarkern:
Dietmaier et al. Cancer Res 57, 1997Dietmaier et al. Cancer Res 57, 1997
40 Patienten mit 5 Markern untersucht BAT 25, Bat 26, REN, MYCL1, tp53Alu (RB wird
optimiert)
Patient 13 und 40 bei tp53Alu/ MYCL1 auffällig
ab Patient 41 nur noch: REN, MYCL1, tp53Alu
100 Patienten mit MYCL1 und tp53Alu untersucht nur noch Patient 41 bei tp53Alu/ MYCL1 auffällig
(REN steht bei Patient 72)AP – PCR:
PCR klappt nach größeren Problemen Auftragen der Proben auf PAA – Gel zeigt erwartetes Ergebnis
ErgebnisseErgebnisse
ErgebnisseErgebnisse
• MIN bei Pat. 13, 40, 41
• auffällige Marker: tp53Alu
MYCL 1
Vergleich +/ - MIN bei Pat.13/ 14Vergleich +/ - MIN bei Pat.13/ 14
LOH
MYCL1
T 13 N 13 T 14 N 14
Expansion
ErgebnisseErgebnisse
tp53ALU
T 41 N 41
MYCL1
T 41 N 41
LOH AP - PCR
N 13T 13
shift
ErgebnisseErgebnisse
sensitiver Nachweis von gemischten DNA - Mengen möglich (schwache PCR - Produkte sind nicht kritisch für MIN -
Nachweis)
Verdünnungsreihe der PCR - Produkte für tp53Alu (µl PCR - Produkt zur Fällung)
10 5 5 5 5 510 10 10 101 1 1 1 12 2 2 2 20,5 0,5 0,5 0,5 0,5
100 b
p
Leit
er
Standards 63
ng
12
5
ng
25
0 n
g5
00
ng
75
0 n
g
T 4
0
N 4
0
von 50 µl Gesamtansatz 10 µl auf Agarosegel
10 µl auf PAA - Gel
Einsatz eines alten PCR - Produktes als Template in neue AP - PCR altes PCR - Produkt wurde verdünnt: 1:101: 50 1: 00
jeweils 2 µl von Verdünnung eingesetzt
Resultat: reproduzierbares Bandenmuster unabhängig von Templatemenge stabile Nachweismethode genetischer Instabilität
ErgebnisseErgebnisse
1:1
0
1:5
0
1:1
00
AusblickeAusblicke
Verwendung neuer Marker im Bereich von Tumorsuppressorgenen des Chromosoms 3:
• 2 Marker der VHL - Region
D3S1560, D3S1317
• 2 Marker der FHiT - Region
D3S1300, D3S4260
AusblickeAusblicke
Auskunft über postoperative klinische Daten Rückantwortbrief an niedergelassenen Urologen/ Hausarzt(Korrelation zw. Patientenkarriere und MIN ?)
Immunhistochemie der Mismatch - Reparaturenzyme Zusammenarbeit mit Thomas
mRNA - Expressionsprofile: Wahrscheinlichkeit einer umfassenden genomischen Instabilität von bekannten Markern
anvisiertes Ende der Experimente: Ende 2002Ende 2002