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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
ZELMA BERNARDES COSTA
PREVALÊNCIA E INCIDÊNCIA DA INFECÇÃO PELO HIV-1 E FATORES DE RISCO ASSOCIADOS EM GESTANTES NO
ESTADO DE GOIÁS
Orientadora: Professora Doutora Celina Maria Turchi Martelli
Co-orientadora: Professora Doutora Mariane Martins de Araújo Stefani
TESE DE DOUTORADO
Goiânia-GO, 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
ZELMA BERNARDES COSTA
PREVALÊNCIA E INCIDÊNCIA DA INFECÇÃO PELO HIV-1 E FATORES DE RISCO ASSOCIADOS EM GESTANTES NO
ESTADO DE GOIÁS
Orientadora:
Profa. Dra. Celina Maria Turchi Martelli
Co-orientadora: Prof. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani
Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública na área de Epidemiologia.
Projeto aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana e Animal do Hospital das Clínicas da UFG (CEPHA/HC/UFG) sob o número 174/08. Apoio financeiro do PPSUS/FAPEG (008/2009).
Goiânia-GO, 2012
iii
iv
DEDICATÓRIA Aos meus pais Almir e Idelma, meus amores, meus conselheiros, meu porto seguro. Aos meus irmãos Carlos, Betânia e Almir que sempre estão por perto. Ao meu esposo Walter e aos meus filhos Walter e Mariana, minha preciosa família, motivo dos meus sonhos e do meu trabalho.
v
AGRADECIMENTOS
Ao senhor meu Deus, pela minha saúde e disposição e por tantas oportunidades e bênçãos. Aos meus pais que sempre acreditaram que eu seria capaz. A toda minha família, meus irmãos, sobrinhos, minha sogra e cunhadas (os) pelo estímulo em todos os momentos e pela torcida calorosa e sincera. A minha querida co-orientadora, professora e doutora Mariane Martins de Araújo Stefani, minha amiga, impecável, extremamente capaz e eficiente que coordenou com maestria os vários processos do laboratório e viabilizou a nossa pesquisa. Sempre pertinente e disposta a orientar, ajudar e a fazer! Muito, muito obrigada! A professora doutora Marília Dalva Turchi, pelos importantes comentários que muito aprimoraram essa dissertação. Ao doutor Wayner Souza, estatístico acima da média. Que tranqüilidade poder contar com você! A Yanna Lima, doutoranda em epidemiologia, pelos momentos no trabalho de campo, por dividir as tarefas, pela sua cordialidade e disponibilidade. Também pela eficiente realização dos inúmeros testes laboratoriais do estudo.
vi
Ao grupo da Universidade Federal de Pernambuco, especialmente ao doutor Ricardo Ximenes e as doutoras Noêmia e Joana pelo auxílio importantíssimo em várias etapas desse trabalho. Ao Dr. Clidenor Gomes Filho pela concessão na utilização do Banco de dados do PPG-GO e pela confiança no nosso trabalho. A Apae de Goiânia, nas pessoas da Dra. Ana Lúcia Minuzzi e Dr. José Vicente Macedo pelo empenho em disponibilizar as amostras em papel filtro, os exames e os relatórios para a realização dessa pesquisa. Ao meu filho Walter, digitador exímio, excelente na pesquisa informatizada. Sempre pronto a ajudar em tudo e a qualquer momento. Ao amigo João Borges que muito nos auxiliou no preparo técnico da tese. Ao grupo de trabalho da Clínica Fértile, doutoras Jucyara, Lilian, Melina, Lorrane, Amanda e Camila pelo carinho, preocupação e interesse para que tudo desse certo. Sempre dispostas a ajudar quando o assunto era doutorado! Ao Dr. Luiz Augusto, Waldemar, Rui Gilberto, Juarez e Washington por compartilharem comigo os caminhos árduos desse trabalho. Obrigado pela torcida sincera. Ao meu marido Walter que nunca foi obstáculo nos meus estudos, na minha pós-graduação. Ao contrário, sempre um facilitador, um amigo. Sem alarde, em silêncio, sempre esteve do meu lado... E fielmente vivenciou comigo o stress da finalização. Serei eternamente grata!
vii
Aos meus filhos, por serem o maior motivo da realização desse doutorado. Desejo-lhes sorte no trabalho dentro da medicina, mas também que vocês sintam vontade de avançar na vida acadêmica, na pesquisa, porque ela é fantástica, ela preenche a alma, ela tem uma história sem fim... Que eu possa, de alguma forma, lhes servir de exemplo. Por fim, à minha orientadora, professora doutora Celina Maria Turchi Martelli. Se hoje compreendo, se posso ter um julgamento crítico de algo que leio, foi você quem ensinou! Tudo que aprendi de epidemiologia, de todas as etapas na realização de um estudo científico, tudo passou por você! Enfim, se consegui finalizar meu mestrado e agora meu doutorado, foi graças a você! Minha mais profunda gratidão, meu respeito, meus constantes pensamentos lhe desejando somente o bem, minha eterna amizade. Muito obrigada!
viii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
Ag Antígeno
AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome
ARV Anti-retroviral
BED-CEIA BED Capture Enzyme Immunoassay
CDC Centers for Disease Control and Prevention
cDNA complementary Desoxiribonucleic Acid
DST Doença Sexualmente Transmissível
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
HAART Highly Active Antiretroviral Therapy
HCV Vírus da Hepatite C
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
HIV-1 Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1
IC95% Intervalo de Confiança 95%
Idp/Apae Instituto de Diagnósticos e Prevenção da Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
NNRTI Non Nucleoside Analogs Reverse Transcriptase Inhibitors
nOD normalised Optical Density
NRTI Nucleotide and Nucleoside Analogs Reverse Transcriptase Inhibitors
OD Optical Density
ONGs Organizações Não Governamentais
ix
PPG-GO Programa de Proteção à Gestante de Goiás
RNA Ribonucleic Acid
SIDA/aids Síndrome da Imunodeficiência Adquirida/acquired immunodeficiency syndrome
STARHS Serologic Testing Algorithm for Recent HIV Seroconversion
TARV Terapia Anti-retroviral
T-CD4 Linfócitos T Cluster of Diferenciation 4
TR Transcriptase Reversa
PR Protease
x
SUMÁRIO
Dedicatória ........................................................................................................... iv
Agradecimentos ....................................................................................................v
Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos ........................................................... viii
Sumário .................................................................................................................x
Lista de Figuras e Tabelas ................................................................................... xi
Resumo .............................................................................................................. xiii
Abstract .............................................................................................................. xvi
APRESENTAÇÃO ................................................................................................ 1
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 4
1.1. Contextualização da Epidemiologia do HIV/aids ................................... 4
1.2. Dinâmica da infecção pelo HIV ............................................................. 8
1.3. Estimativas da incidência do HIV-1 para vigilância e monitoramento . 12
1.4. Aspectos da Epidemiologia Molecular do vírus HIV-1 ......................... 23
1.5. Epidemiologia da sífilis e da coinfecção HIV e sífilis ........................... 29
2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................. 36
3. OBJETIVOS ................................................................................................... 39
4. ARTIGOS ....................................................................................................... 40
Manuscrito 1: Estimated HIV-1 incidence and genotypes among
pregnant women in central Brazil .............................................. 41
Manuscrito 2: Transmitted resistance among pregnant young women
infected with HIV-1 ..................................................................... 67
Manuscrito 3: Prevalence and risk factors for HIV and Syphilis
infections among pregnant women attending ante-
natal public health clinics in central Brazil .................................. 78
5. CONCLUSÕES .............................................................................................. 94
6. RECOMENDAÇÕES ...................................................................................... 95
7. REFERÊNCIAS .............................................................................................. 96
8. ANEXOS ...................................................................................................... 113
xi
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Tese Figura 1. Evolução típica dos principais marcadores sorológicos e
virais durante as primeiras semanas subsequentes à infecção pelo
HIV-1 (diagrama esquemático). .......................................................................... 11
Figura 2. Esquema de detecção dos biomarcadores no STARHS ...................... 14
Figura 3. Princípios que determinam o algoritmo de testagem
sorológica para infecção recente pelo HIV - STAHRS ........................................ 16
Manuscrito 1
Table 1. Prevalence of HIV-1 infection in pregnant women screened in
antenatal clinic in central Brazil, 2011 ................................................................. 63
Table 2. Estimation of HIV-1 incidence among pregnant women in
central Brazil, 2011 ............................................................................................. 64
Figure 1. Screening strategy for HIV-1 infection among pregnant
women attending antenatal clinic, central Brazil .................................................. 65
Figure 2. Duration of HIV infection in years among pregnant women
according to age, central Brazil ........................................................................... 66
Manuscrito 2
Table 1. HIV-1 infected pregnant women with recent and long-term
seroconversion .................................................................................................... 75
Figure 1. Phylogenetic classification of 16 HIV-1 isolates from
pregnant woman in PR and RT genes. The GeneBank accession
numbers of subtypes B, used in the comparative phylogenetic
analysis are indicated. The simian immunodeficiency virus sequence
from chimpanzee (SIV cpz) was used as the outgroup ....................................... 77
xii
Manuscrito 3
Table 1. Association of demographic and gestational factors of
pregnant women and HIV-1 and syphilis infections, central Brazil,
2011 .................................................................................................................... 89
Table 2. Multivariate analysis of demographic and gestational
characteristics of pregnant women associated with HIV-1 and syphilis
infections, central Brazil, 2011 ............................................................................ 90
xiii
RESUMO
A infecção pelo HIV e a sífilis são consideradas problemas de saúde pública, e
o rastreamento universal dessas doenças sexualmente transmissíveis (DSTs)
no pré-natal é essencial para a prevenção da transmissão mãe-filho e para a
redução dos níveis endêmicos das mesmas. As infecções pelo HIV e T.
pallidum apresentam rotas comuns de transmissão e existem potenciais
interações biológicas em indivíduos coinfectados. As mutações de resistência
transmitida aos antirretrovirais (ARVs) podem comprometer a prevenção da
transmissão vertical sendo importante o monitoramento de cepas de resistência
do HIV em gestantes.
O estudo incluiu 54.139 gestantes que receberam assistência pré-natal em
serviços de saúde pública no ano de 2011, no estado de Goiás, Brasil. A
incidência da infecção pelo HIV-1 foi estimada utilizando o teste BED-CEIA
(BED-Capture Enzyme Immunoassay) na metodologia do algorítmo de
testagem sorológica de soroconversão recente (<155 dias) pelo HIV
(STARHS). Foi calculada a incidência anual da infecção pelo HIV com as
fórmulas de ajuste. Foi realizada a análise molecular do gen pol e a resistência
antirretroviral transmitida foi avaliada usando-se a ferramenta de bioinformática
"Calibrated Population Resistance Tool" e a lista de mutações principais
estabelecidas pela "International AIDS Society”/EUA. O critério de definição de
sífilis foi a positividade a dois testes treponêmicos (ELISA and FTA-Abs).
Foram analisados fatores de risco associados à infecção pelo HIV e à sífilis em
análise uni e multivariada.
Aproximadamente 25% das participantes tinham menos de 20 anos, cerca de
40% estavam na primeira gestação. Oitenta e seis mulheres foram positivas ao
HIV-1, com prevalência de 1,58 por 1000 mulheres (IC 95% 1,3–2,0). Houve
aumento da prevalência com a idade refletindo a exposição cumulativa ao
vírus. Entre as gestantes soropositivas 20% foram consideradas infectadas
recente pelo BED-CEIA. A incidência da infecção pelo HIV-1 foi de 0,47 por
1000 pessoas/ano (IC95% 0,26-0,68) após aplicação de fórmula de ajuste. Em
xiv
relação à sífilis, 660 (1,2%) foram positivas. A prevalência de sífilis foi 7,5
vezes maior que a infecção pelo HIV-1. A análise multivariada mostrou que
mulheres jovens, entre 20 e 29 anos de idade e que se referiam como de raça
negra ou parda apresentaram risco significativamente maior de infecção pelo T.
pallidum.
Na determinação da diversidade genética, entre as 18 gestantes submetidas à
genotipagem, 12 foram do subtipo B, seguido pelo subtipo C (n=3), BF1
recombinante (n=2) e F1 (n=1). Dados moleculares de 15 gestantes que nunca
haviam recebido tratamento antirretroviral indicaram cinco gestantes (33,3%)
com mutações de resistência transmitida aos antirretrovirais. Entre essas cinco
gestantes, duas apresentaram mutação a uma única classe de antirretrovirais
(NRTI) (mutações T215S e T69S). Em três pacientes foram identificadas
mutações a duas classes de medicamentos: PI+NRTI (L90M+M41L, T215C) e
uma apresentou mutações aos PI+NNRTI (A71V+V106I).
Esse estudo evidencia o potencial de se utilizar estimativas de incidência
derivadas de programas em grande escala de rastreamento pré-natal do HIV. A
taxa de infecção recente pelo HIV-1 em mulheres jovens em fase reprodutiva
representa um alerta de saúde pública para a implementação de medidas
preventivas. A alta prevalência de sífilis, além da associação dessa infecção
com ser de raça negra ou parda indica um grupo mais vulnerável para
direcionamento de medidas preventivas. A detecção de mutações de
resistência transmitida aos antirretrovirais entre mulheres jovens aponta para o
risco de comprometimento das medidas de prevenção da transmissão mãe-
filho do HIV.
Palavras chave: HIV; incidência; gestantes; genótipo; sífilis.
xv
ABSTRACT
HIV infection and syphilis are considered a burden to public health and
universal screening for these sexually transmitted diseases (STD) in pre natal
care is essential for the prevention of mother-to-child transmission (MTCT) and
the reduction of the endemic levels. HIV and T.pallidum infections share
common routes of transmission and there is a potential for the biological
interaction between the co-infected cases. Transmitted HIV-drug resistance
mutation detected in naïve pregnant women can compromise MTCT prevention,
thus it is important to monitor HIV drug resistant strains in pregnant women.
The study included 54,139 pregnant women who received antenatal HIV
screening from a network of public healthcare centers in 2011 in Goias state,
Brazil. The incidence of HIV-1 infection was estimated using the Serological
Testing Algorithms for Recent (<155 days) HIV Seroconversion (STARHS)
methodology by BED-Capture Enzyme Immunoassay (BED-CEIA). The yearly
incidence of HIV was calculated, and adjusted incidences of HIV infection were
estimated. HIV-1 molecular analysis of the pol gene was performed and
transmitted drug resistance was analyzed using Calibrated Population
Resistance Tool and the International AIDS Society-USA major mutation lists.
Pregnant women were diagnosed as positive for syphilis when two different
treponemal tests (ELISA and FTA-Abs) were positives. Risk factors associated
with HIV-1 or syphilis infections were performed in univariate and multivariate
analysis.
Of the participants, 25% had a pregnancy before age of 20; approximately 40%
were experiencing their first pregnancy. Of the 54,139 pregnant women
screened, 86 had a confirmed HIV-1 diagnosis, yielding an overall prevalence of
1.58 cases per 1000 women (95% CI 1.3–2.0). A higher prevalence was
detected in older age groups, reflecting cumulative exposure to the virus over
time. Among the infected pregnant women 20% were considered recently
infected by BED-CEIA. The incidence was 0.47 per 1000 person-years (95% CI
xvi
0.26-0.68) after corrections. Regarding syphilis, 660 (1,2%) pregnant women
were positives. Prevalence of syphilis was 7.5 times higher than prevalence of
HIV-1 infection. The multivariate analysis showed that young women (20-19
years old) and self-refereed black or biracial were a significant risk factor for T.
pallidum infection.
Regarding HIV diversity, 12 out of 18 pregnant women with HIV-1 pol
sequences were assigned subtype B, followed by subtype C (n=3), BF1
recombinant (n=2 and F1 (n=1). Molecular data from 15 sequences from
antiretroviral (ARV) naïve pregnant women indicated transmitted drug
resistance (TDR) mutations in five patients (33.3%). Among TDR cases single
class mutation (NRTI) was detected in two patients (T215S and T69S
mutations). Dual mutations were identified in three patients: PI+NRTI
(L90M+M41L, T215C) and one woman had PI+NNRTI mutations
(A71V+V106I).
This study highlights the potential for using incidence estimates derived from a
large antenatal screening program for HIV. The rate of recent HIV-1 infection in
the early reproductive years is a public health warning to implement preventive
measures. High prevalence of syphilis, besides the association of being black
and biracial with T. pallidum infection indicates a more vulnerable group for
targeting preventive measures. The detection of TDR mutations among young
women point out to the risk of compromising the MCT preventive measures.
Keywords: HIV; Incidence; Pregnant women; Genotype; Syphilis.
1
APRESENTAÇÃO
Graduei-me em medicina pela Universidade Federal de Goiás (UFG) em
1981 e fiz residência em Ginecologia e Obstetrícia pelo Hospital Geral de
Goiânia (1982-1983). Por vinte anos atuei nessa área, especialmente em
reprodução humana assistida.
Em 2003 ingressei no Mestrado do Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP/UFG) com o projeto
intitulado “Rastreamento para a infecção pelo vírus da Hepatite C e vírus da
Imunodeficiência Humana em gestantes do estado de Goiás: programa de
proteção à gestante, 2003 a 2005” onde foram analisados os dados referentes
à triagem sorológica para as infecções pelo HIV e HCV em gestantes,
atendidas nos serviços de pré-natal, nos municípios de Goiânia, Aparecida de
Goiânia e Trindade, no período de três anos (2003-2005). O Programa de
Proteção à Gestante de Goiás (PPG-GO) foi implantando em 2003 pela
Secretaria de Estado da Saúde de Goiás (SES-GO) em parceria com as
Secretarias Municipais e com o Instituto de Diagnósticos e Prevenção da
Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (Idp/Apae) de Goiânia, capital
do Estado. O PPG-GO realiza a triagem de nove doenças infecciosas com
potencial de transmissão vertical (HIV, Hepatites B e C, Chagas,
Citomegalovírus, HTLV, Rubéola, Sífilis e Toxoplasmose) através de exames
realizados em eluato de gotas de sangue seco coletadas em papel filtro. Essa
triagem sorológica é oferecida sem ônus para toda gestante como parte da
rotina de atendimento no pré-natal das unidades de saúde. Foi realizado um
estudo de prevalência da infecção pelo HCV e HIV em 28 576 gestantes
rastreadas neste período, com avaliação de alguns possíveis fatores de risco
como idade, raça e história obstétrica. Foi estimado o NNS (Number Needed to
Screen – número necessário de rastreamento para se prevenir um caso de
transmissão vertical) para o HIV na nossa população de gestantes em Goiás.
Minha dissertação de mestrado foi defendida e aprovada e o estudo publicado
no BMC Infectious Diseases em Julho de 2009 (BMC Infectious Diseases 2009,
9:116 doi:10.1186/1471-2334-9-116).
2
Em final de 2008 obtive aprovação em concurso público para professor
efetivo do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal de Goiás (FM/UFG) e logo em seguida,
assumi a chefia do Ambulatório de pré-natal para gestantes portadoras de
HIV/AIDS e hepatites virais do Hospital das Clínicas (HC) da FM/UFG.
Firmada a parceria entre IPTSP/UFG, HC/FM/UFG com a Secretaria de
Estado da Saúde, a Secretaria Municipal de Saúde e a APAE de Goiânia,
estabelecemos um projeto de pesquisa dando continuidade ao mestrado, sob a
orientação das Profª Drª Celina Maria Turchi Martelli e Profª Drª Mariane
Martins de Araújo Stefani, o qual foi submetido e aprovado pelo Comitê de
Ética do CEPMHA/HC/UFG sob o número 174/08 e aprovado para Doutorado
em epidemiologia pelo IPTSP/UFG em 03/2009. Esse estudo conta com o
apoio logístico do Setor de Imunologia do IPTSP/UFG na realização dos testes
laboratoriais para determinação de incidência e genotipagem. O projeto foi
financiado pelo PPSUS/FAPEG sob o número 008/2009.
Portanto, esse trabalho de conclusão de Doutorado, dá continuidade a
nossa linha de pesquisa do mestrado e propõe avaliar a estimativa da
incidência da infecção pelo HIV-1 em gestantes rastreadas pelo PPG-GO bem
como caracterizar molecularmente os genótipos virais e avaliar a associação
da infecção pelo HIV-1 a possíveis fatores de risco biológicos e a algumas
DSTs, em especial a hepatite C e sífilis.
Esse trabalho compreende uma introdução e três manuscritos.
A introdução apresenta aspectos importantes da epidemiologia do
HIV/aids, as evidências de estimativa da incidência do HIV-1, através de
métodos sorológicos aplicados em estudos transversais e inclui discussão
sobre aspectos relacionados a fatores de risco e genotipagem.
O manuscrito 1 tem por objetivo estimar a incidência da infecção pelo
HIV-1 utilizando do teste BED-CEIA, que possibilita distinguir infecção recente
3
versus de longa data em estudo transversal. As estimativas de incidência
utilizaram os ajustes preconizados pelo CDC. A genotipagem viral foi realizada
em um subgrupo dessas gestantes. Na determinação da infecção recente pelo
HIV o presente estudo utilizou a estrutura de coleta de material biológico para
detecção das gestantes soropositivas, bem como o banco de dados
informatizado de mais de 54.000 gestantes atendidas no Programa de
Proteção à Gestante no Estado de Goiás (PPG-GO) no ano de 2011. Dessa
forma, os resultados obtidos refletem a maioria da população de gestantes
atendidas nos serviços públicos de saúde regionais.
O manuscrito 2, que consiste em uma carta ao editor, descreve dados
moleculares do HIV-1 e o perfil sociodemográfico de subgrupo de gestantes,
recrutadas entre 86 casos confirmados em triagem pré-natal do PPG-GO .
O manuscrito 3 refere-se à estudo de prevalência que objetiva analisar
as possíveis associações entre infecção pelo HIV-1 e a infecção pelo
T.pallidum e potenciais fatores de risco na população de gestantes atendidas
pelo PPG-GO, no ano de 2011.
4
1. INTRODUÇÃO
1.1. Contextualização da Epidemiologia do HIV/aids A pandemia causada pela infecção do vírus da imunodeficiência humana
(HIV), responsável pela síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA/aids),
tem sido considerada uma das maiores epidemias virais dos últimos dois
séculos (UNAIDS 2011). A aids, descrita em 1981 nos Estados Unidos (EUA),
passou rapidamente a ser monitorizada por um sistema de vigilância
inicialmente instituído pelo Centers for Disease Control and Prevention
(CDC/USA) e, posteriormente, por outros países (Graham 2001).
Segundo dados do Programa das Nações Unidas para HIV/aids
(UNAIDS 2011), mais de 25 milhões de pessoas morreram de aids em todo o
mundo desde o início da epidemia. Em 2010 o número de mortes associadas
ao HIV foi de 1.8 milhões (1.6 milhões – 1.9 milhões). Nesse mesmo ano
estimou-se 34 milhões (31.6 milhões – 35.2 milhões) de indivíduos vivendo
com o HIV em todo o mundo representando 17% a mais em relação ao ano de
2001 (UNAIDS 2011). Aproximadamente 70% desses indivíduos vivem na
África subsaariana (UNAIDS 2011), enquanto que a América Latina responde
por 1,7 milhões e o Brasil por cerca de 630 mil pessoas com a infecção pelo
HIV (Bastos et al. 2008a).
Mundialmente ocorreram 2.7 milhões (2.4 milhões – 2.9 milhões) de
novos infectados pelo HIV em 2010, sendo 92.000 casos na América Latina
(UNAIDS 2011). As mulheres já representam metade das pessoas vivendo com
HIV, com tendência crescente em muitos países. Os jovens entre 15 a 24 anos
correspondem a 45% das novas infecções. O crescente acesso aos serviços
para prevenção de novas infecções pelo HIV em crianças (prevenção da
transmissão vertical) permitiu uma queda de 30% do número anual de novos
infectados em crianças menores de 15 anos reduzindo de 560 mil (500 mil –
630 mil) nos anos de 2002 e 2003 para 390 mil (340 mil – 450 mil) em 2010
(UNAIDS 2011). Neste ano, aproximadamente 4.000 crianças foram infectadas
5
na América Latina. As causas da dispersão mundial e da manutenção da
pandemia têm sido imputadas à diversidade genética do vírus e aos diferentes
mecanismos de transmissão da doença (UNAIDS 2008).
O Brasil registrou taxa de incidência da infecção pelo HIV em 2009 de
20,1 casos por 100.000 habitantes e uma taxa de mortalidade de 6,2
óbitos/100.000 (Brasil Ministério da Saúde 2010a). Aproximadamente 60% dos
casos notificados estão associados a alguma forma de contato sexual
desprotegido. Nos primeiros anos da epidemia, a maior parte dos casos
concentrou-se entre homens que fazem sexo com homens decorrente de
relações sexuais desprotegidas. Em seguida disseminou-se entre os usuários
de drogas injetáveis e entre indivíduos que receberam transfusão de sangue
e/ou hemoderivados. Após meados de 1990, o vírus disseminou-se entre os
heterossexuais. Em 2003, a transmissão heterossexual já representava 41%
dos casos registrados em homens e 61% do total de casos de transmissão
sexual (Brasil Ministério da Saúde 2005b). A incidência entre mulheres
aumentou rapidamente modificando a relação de casos entre homens e
mulheres de 18,9:1 em 1984, para 1,3:1 em 2007. Nesse mesmo ano, entre
jovens de 15 a 19 anos a relação apresenta-se maior para as mulheres em
número de 0,7:1 (Brasil Ministério da Saúde 2010a). A transmissão
heterossexual constitui atualmente a categoria de exposição sexual de maior
número de notificação de casos no Brasil (Brasil Ministério da Saúde 2010a).
Apesar dessas tendências, a subpopulação de usuários de drogas injetáveis e
a de homens que fazem sexo com homens ainda são aquelas de maior
incidência da infecção pelo HIV e de maior risco de adquirir a infecção
comparada com a população heterossexual (Caiaffa et al. 2003; Fonseca &
Bastos 2007).
Em gestantes, a prevalência da infecção pelo HIV em estudos sentinela
foi de 0,4% em 16.410 mulheres testadas (Szwarcwald et al. 2004).
Aproximadamente 12000 gestantes/ano estariam infectadas se essa
prevalência fosse extrapolada para o Brasil como um todo. Em 2006, cobertura
de testagem anti-HIV em gestantes foi de 46% na Região Norte, 41% no
Nordeste, 74% na Sudeste, 86% na Sul e 70% no Centro-Oeste (Szwarcwald
6
et al. 2008). Entre 2000 e 2009, 54.218 gestantes soropositivas ao HIV foram
notificadas, sendo 40.999 (75,6%) concentrados nas regiões Sul e Sudeste
(Pereira et al. 2011). Na região Centro-Oeste, 3066 gestantes foram
registradas nesse período, sendo 1156 casos em Goiás. Em 2009, o número
de casos de infecção pelo HIV detectados no Brasil foi de 6.104 e o coeficiente
de incidência, correspondeu a 2,1 casos por mil nascidos vivos. Nesse mesmo
ano em Goiás, os 126 casos de infecção pelo HIV em gestantes resultaram em
um coeficiente de incidência de 1,4 casos/ 1000 nascidos vivos (Pereira et al.
2011).
A taxa de transmissão vertical registrada anteriormente à implementação
da profilaxia apropriada (protocolo ACTG 076) foi de 16%, em estudo realizado
em São Paulo em 1997 (Tess et al. 1998). No Brasil houve redução
progressiva das taxas de transmissão vertical para 3,7%, conforme estudo
multicêntrico realizado em 2002 (Succi 2007). No Brasil dados do Ministério da
Saúde indicam valores em torno de 3,0% de transmissão vertical em 2009
(Pereira et al. 2011) com expressivas diferenças regionais. A transmissão
vertical da infecção pelo HIV responde por 3% de todos os casos de HIV/AIDS
no Brasil (Bastos et al. 2008b). Em Goiás a taxa de transmissão vertical foi de
40,8% para o grupo sem profilaxia versus 1% para o grupo com adequadas
medidas de prevenção em estudo realizado no período de 1995 a 2001 (Turchi
et al. 2007). Outra subpopulação importante dentro do contexto epidemiológico
do HIV/AIDS compreende a faixa etária de adolescentes e adultos jovens para
os quais existem medidas de prevenção governamentais específicas (Brasil
Ministério da Saúde 2010a).
Nos últimos anos, o Ministério da Saúde tem utilizado para calcular a
estimativa da taxa de transmissão vertical o indicador de taxa de incidência de
aids em menores de 5 anos de idade, uma vez que a maioria dos casos
diagnosticados nessa faixa etária são atribuídos à transmissão materno-infantil.
Entre 1997 e junho de 2010, foram notificados 13.676 casos de aids em
menores de 5 anos de idade no Brasil (Pereira et al. 2011). De forma geral, a
taxa de incidência de aids em menores de cinco anos vem diminuindo desde o
ano 2000 (5,4 casos) para 3,0 casos/100.000 habitantes em 2009. Entretanto
7
dados regionais revelaram aumento nessas taxas no Norte e Nordeste (Pereira
et al. 2011). Em Goiás, nos 216 casos registrados de infecção pelo HIV em
menores de cinco anos nesse período, a taxa de incidência reduziu de 4,3 em
1997 para 0,2 por 100.000 habitantes em 2009 (Pereira et al. 2011).
Os desafios e as respostas do governo do Brasil frente à epidemia do
HIV/AIDS foram sumarizados no capítulo intitulado “AIDS no Brasil: o desafio e
a resposta” (Bastos et al. 2008b). Segundo os autores, essa epidemia começou
no início de 1980, teve um dos seus maiores marcos com o estabelecimento do
acesso livre e universal da terapia antirretroviral em 1996. O governo federal
tem mantido uma postura de estreita ligação e provisão de fundos para
organizações não governamentais (ONGs) representantes de trabalhadores do
sexo, usuários de drogas injetáveis e populações de gays, lésbicas, bissexuais
e transexuais no sentido de implementar ações de prevenção da transmissão
pelo HIV (Berkman et al. 2005). A grande mobilização desses grupos da
sociedade civil tem ajudado o governo a implementar serviços de saúde pública
para o tratamento e prevenção dos indivíduos portadores do HIV/AIDS.
Entretanto as disparidades socioeconômicas, o tamanho do país (quinto maior
país do mundo) e a diversidade geográfica têm complicado a resposta a essas
medidas. O Brasil apresenta-se ainda em um importante contexto de
desigualdade social com distribuição de renda bastante desigual: quase um
quarto dos brasileiros ganha menos de dois dólares por dia (Brasil Ministério da
Saúde 2005b). Enquanto o acesso à terapia antiretroviral altamente ativa
(HAART - Highly Active Antiretroviral Therapy) foi rapidamente implementado
em áreas urbanas com um sistema de saúde satisfatório, no interior do país,
em cidades menores e em áreas não urbanizadas a assistência pré-natal, a
logística de medicamentos e os sistemas de monitoramento permanecem muito
precários (Almeida et al. 2000; Brito et al. 2005; Szwarcwald et al. 2002). É
sabido que o acesso universal ao tratamento reduz o número de
hospitalizações e mortes por aids. A universalização do acesso à TARV na
rede pública de saúde reduziu em 82% o número de hospitalizações entre 1997
a 2007. De acordo com o Ministério da Saúde o coeficiente de mortalidade nos
últimos anos (1996 a 2008) permaneceu estável em cerca de seis óbitos/
8
100.000 habitantes, com variações regionais (Brasil Ministério da Saúde
2010d).
Com o intuito de reduzir a transmissão mãe-filho da infecção pelo HIV, o
Brasil tem atualmente várias frentes de atuação. Instituída desde 2004, a
Política Nacional de Atenção Integral à Saúde da Mulher em parceria com a
Secretaria de Políticas de Promoção da Igualdade Racial (SEPRIR) e a
Secretaria de Políticas para as Mulheres trabalham com a participação de
entidades de classe, sociedades científicas, gestores do SUS, e de vários
movimentos de mulheres: negras, trabalhadoras rurais e mulheres em geral.
Em 2007, visando uma atuação ainda mais ampla de promoção da saúde da
mulher do ponto de vista sexual e reprodutivo, de prevenção, diagnóstico e
tratamento das doenças sexualmente transmissíveis, tanto a nível federal
quanto estadual e municipal, passou a atuar o Plano Integrado de
Enfrentamento da Feminização da HIV/AIDS e outras DST em conjunto coma
Secretaria Especial de Políticas para as Mulheres (Pereira et al. 2011). A partir
de 2010 e também atuante até o momento, a “Rede Cegonha”, por iniciativa do
Governo Federal, através de inúmeras medidas tem o objetivo de garantir a
todas as mulheres atendidas pelo SUS, assistência pré e pós- natal até os dois
primeiros anos de vida do filho, de forma adequada e humanizada (Brasil
Ministério da Saúde 2010c).
Em recente avaliação sobre os sucessos e falhas no controle de
doenças infecciosas no Brasil, considerou-se que houve sucesso parcial no
controle da epidemia HIV/AIDS. Entre os indicadores favoráveis salienta-se a
manutenção estável da incidência de doenças relacionadas ao HIV nos últimos
cinco anos, com cerca 33 mil novos casos registrados por ano (Barreto et al.
2011). Ainda considerado como sucesso estão os esforços para a prevenção
da transmissão vertical com oferta de testagem gratuita e profilaxia nos
serviços de pré-natal, com melhora substancial na sobrevida e qualidade de
vida das crianças com HIV/AIDS (Barreto et al. 2011).
1.2. Dinâmica da infecção pelo HIV
9
Indivíduos infectados pelo HIV apresentam um período de incubação de
cinco a trinta dias até o aparecimento dos sinais e sintomas da fase aguda. A
infecção aguda do HIV pode ser definida como o tempo decorrido desde a
aquisição do HIV até a soroconversão (Cohen et al. 2010; McMichael et al.
2010; Sax & Walker 2005). As manifestações clínicas da fase aguda são
habitualmente pouco expressivas com sintomas comuns inespecíficos de
infecção viral como febre, angina, mal estar, linfadenopatia e exantema
maculopapular transitório. Em geral, essas manifestações clínicas duram em
média dez a quatorze dias e com freqüência passam despercebidas. A viremia
é alta e ocorre queda transitória de linfócitos T-CD4. Esse período de tempo,
onde os testes sorológicos de detecção de anticorpos anti-HIV estão negativos
e que finaliza com o início da soroconversão caracteriza a janela imunológica
ou período de janela de soroconversão (Cohen et al. 2010). As conseqüências
clínicas da infecção pelo HIV se devem à habilidade do vírus de infectar células
cruciais do sistema imunológico que são os linfócitos T que expressam
marcadores CD4, capazes de se ligar às proteínas do envelope viral (Shaw
2005).
Indivíduos na fase aguda da infecção são altamente contagiosos (Pilcher
et al. 2004) devido à alta carga viral e também à ausência de anticorpos. A
aquisição do HIV e, portanto, a fase aguda da doença não é incomum na
gestante, o que provavelmente aumenta o risco de transmissão vertical (Gay et
al. 2010). O diagnóstico precoce durante o estágio de infecção aguda
representa enorme oportunidade para entendimento dos eventos da
transmissão do HIV, bem como de tratamento e implementação de medidas de
prevenção (Cohen et al. 2010).
Instala-se posteriormente a fase assintomática ou de latência da
infecção, quando os indivíduos iniciam a produção de anticorpos e passam a
apresentar marcadores virais ou antivirais detectáveis e linfócitos T-CD4 em
níveis normais ou em declínio. Esse período apresenta duração que pode
variar de dois a dez anos, em média seis anos (Shaw 2005). Os testes para
detecção de anticorpos anti-HIV estão disponíveis para uso clínico desde 1985
e evidenciam que a infecção e viremia persistem por anos, antes dos
10
indivíduos apresentarem qualquer sintoma da aids(Busch & Satten 1997). O
indivíduo infectado pelo HIV pode transmiti-lo em todas as fases da infecção
cujo risco é proporcional a magnitude da viremia (Brasil Ministério da Saúde
2010e; Shaw 2005).
Com a evolução da infecção, agrava-se a disfunção do sistema
imunológico, eleva-se a carga viral e inicia-se uma fase sintomática com
processos oportunistas de menor intensidade como candidíase oral, diarréia,
etc. (Brasil Ministério da Saúde 2010d). A queda de linfócitos T-CD4 a níveis
inferiores a 200 células/mm3 e o aparecimento de infecções oportunistas
graves como a pneumonia pelo Pneumocystis carinii e o sarcoma de Kaposi,
foram os primeiros critérios para o diagnóstico da aids (Giesecke 1994).
Atualmente para fins de vigilância epidemiológica caracteriza-se como caso de
aids aquele indivíduo que apresenta sinais e sintomas de acordo com o
“Critério do CDC adaptado” em “Critérios de definição de casos em adultos e
crianças – 2004” ou de acordo com o “Critério Rio de Janeiro / Caracas e
Critério excepcional de óbito” ambos em detalhes no guia de doenças
infecciosas e parasitárias do Ministério da Saúde (Brasil Ministério da Saúde
2010e).
O entendimento da dinâmica de infecção do HIV no organismo
hospedeiro bem como a seqüência da resposta imunológica ao longo do tempo
é crucial para estabelecer as características dos marcadores biológicos de
infecção recente e de longa data. Logo após a exposição do indivíduo ao HIV
ocorre replicação local do vírus no sítio de inoculação e, durante a segunda e
terceira semana segue-se alta viremia com disseminação e fixação viral nos
tecidos susceptíveis do corpo (Busch & Satten 1997). A elevação do RNA
genômico do HIV antes que o organismo hospedeiro seja capaz de produzir
anticorpos anti-HIV representa um forte marcador de infecção recente. Poucos
dias após o início da viremia a proteina core do vírus nominada antígeno p24
(Agp24) passa a ser detectável no sangue (Busch & Satten 1997) (Figura 1).
Assim que o sistema imune inicia sua produção de imunoglobulinas os níveis
do RNA viral e do Agp24 diminuem; o antígeno p24 usualmente se torna
indetectável, porém o RNA do HIV, na maioria dos casos, permanece
11
detectável apesar de usualmente em níveis um pouco menores que aqueles
observados na fase aguda da infecção (Busch & Satten 1997). Detecção de
p24 na ausência de anticorpos anti HIV também pode ser um marcador de
infecção recente, porém sua presença ocorre usualmente por curto período de
tempo (uma a duas semanas) e, portanto, tem aplicação limitada em medir a
incidência da infecção pelo HIV (Murphy & Parry 2008). Segue-se a resposta
imune inicial com produção de imunoglobulina da classe M (IgM) por um curto
período de duas a quatro semanas (Gaines et al. 1988) (Figura 1). A produção
de imunoglobulinas da classe G (IgG) ocorre em torno de quatro a cinco
semanas após a exposição viral, caracterizando o início da soro-conversão
onde os testes padrão utilizados para diagnóstico da infecção não são capazes
de diferenciar infecção recente de infecção de longa data (Murphy & Parry
2008). Nessa fase quanto maior o tempo de infecção pelo HIV maior a
produção, a concentração e avidez de IgG específica (Figura 1).
Figura 1. Evolução típica dos principais marcadores sorológicos e virais durante as
primeiras semanas subsequentes à infecção pelo HIV-1 (diagrama esquemático).Adaptado de Murphy, G. & Parry J. V. 2008
12
1.3. Estimativas da incidência do HIV-1 para vigilância e monitoramento
Estimar a incidência da infecção pelo HIV numa população é crucial para
a análise da dinâmica e das tendências da epidemia do vírus, na avaliação de
programas de prevenção do HIV e para desenhar e avaliar ensaios de
intervenção (Hall et al. 2008; Incidence Assay Critical Path Working Group
2011; Prejean et al. 2011). A estimativa de incidência certamente possibilita
avaliar se as medidas de prevenção e o tratamento influenciam a infectividade
e a transmissão viral (Porco et al. 2004). Delineamentos de coorte, metodologia
clássica para estimar incidência, em geral, são de alto custo pela exigência do
acompanhamento de grande número de indivíduos soronegativos e por longo
tempo, além dos potenciais vieses de perda de seguimento inerente aos
estudos longitudinais (Barnighausen et al. 2010; Nelson et al. 2002; Tyndall et
al. 2001).
Devido ao fato da fase aguda da infecção pelo HIV habitualmente não
ser reconhecida e muitos anos passarem até que se faça o diagnóstico, com
freqüência a distinção entre infecção incidente (nova) e prevalente
(estabelecida) não pode ser feita. Usualmente “diagnósticos novos” são feitos
muitos anos depois da aquisição do HIV quando a contagem de linfócitos TCD4
cai, deteriora a saúde do indivíduo e leva-o à busca por assistência médica.
Claramente, o “diagnóstico novo“ de infecção pelo HIV ou de AIDS não pode
ser considerado como infecção incidente. Portanto, a notificação de casos de
infecção pelo HIV ou de casos de AIDS não seria capaz de mostrar a
incidência da infecção do HIV em um país e sim a incidência acumulada da
infecção viral de vários anos anteriores. Evidentemente, têm infecção incidente
tanto os indivíduos com infecção aguda quanto aqueles que recentemente
desenvolveram resposta imunológica ao HIV (soroconversão). Assim sendo,
infecção incidente deve ser definida como o período entre a aquisição do HIV
seguido da soroconversão e o desenvolvimento de carga viral estável (Cohen
et al. 2010).
13
Entre as inovações metodológicas para avaliação da incidência através
de casos prevalentes a aplicação de conceitos matemáticos deu origem ao
método de retrocálculo ou back-calculation (Gregson et al. 2010; Venkatesan
2006). Esse modelo possibilita avaliar a nova infecção do vírus HIV pelo tempo
de incubação (latência clínica) entre a infecção inicial e o aparecimento da
síndrome clínica, sendo possível estimar a densidade de novas infecções
ocorridas uma década antes. Outras inovações de modelagem também
procuravam distinguir os casos prevalentes dos casos incidentes tentando
distinguir o número de casos clínicos e dos casos novos. Do ponto de vista
laboratorial, indivíduos soropositivos aos testes habituais constituem uma
combinação heterogênea de indivíduos infectados recentes e de indivíduos
vivendo com a infecção a longos anos. A técnica BED de captura constitui-se
numa alternativa laboratorial atual para distinguir as infecções recentes
(incidência) a partir de marcadores biológicos (Dourado & Bastos 2011) e será
detalhada posteriormente.
Vários métodos laboratoriais têm sido identificados para detectar e
distinguir infecção recente pelo HIV-1 de infecção de longa data. Embora
alguns esforços tenham sido direcionados no sentido de detectar o antígeno
p24 ou o RNA do HIV-1 na ausência de anticorpos (fase pré soroconversão), a
maioria deles baseia-se nas diferenças qualitativas e quantitativas observadas
na evolução de produção de anticorpos anti-HIV após a soroconversão. Os
testes realizados previamente à produção de anticorpos devem ser aplicados
em indivíduos soronegativos e em um período de janela de 10 a 20 dias,
portanto, requerem amostragem muito grande para detectar positivos nesse
curto período de tempo tornando-se metodologia de alto custo e não ideal para
implementação da incidência do HIV em grande escala (Brookmeyer & Quinn
1995; More et al. 2000; Pilcher et al. 2004). Nos Estados Unidos a testagem do
RNA do HIV-1, além dos testes sorológicos, tem sido recomendada para
indivíduos com comportamento de risco e/ou com sintomatologia compatível
com infecção aguda (Branson et al. 2006; Facente et al. 2011).
A metodologia nominada STARHS (Serologic Testing Algorithm for
Recent HIV Seroconversion), descrita pela primeira vez por Janssen (Janssen
14
et al. 1998), compreende a combinação do teste diagnóstico confirmatório
positivo para anticorpos HIV, seguido pela testagem para infecção recente
(detecção de período inicial da produção de anticorpos). Nos últimos anos
vários métodos baseados em parâmetros biológicos para detectar
soroconversão recente ao HIV têm sido descritos e avaliados, conforme
recente revisão (Morgado & Bastos 2011). Esses testes medem a resposta
imunológica do indivíduo contra o vírus e, para detectar os casos de infecção
recente, podem se basear na concentração do anticorpo específico ao HIV
(Janssen et al. 1998), na proporção de IgG específica e IgG total (Parekh et al.
2002), na determinação de isótopos (Wilson et al. 2004) e na avidez da
imunoglobulina (Suligoi et al. 2002) (Figura 2).
Tempo
Res
po
sta
Figura 2. Esquema de detecção dos biomarcadores no STARHS. Adaptado de Cohen M. S. et al. 2010
O algoritmo de testagem sorológica para soroconversão recente pelo
HIV oferece inúmeras vantagens quando comparado a outros métodos para
determinar incidência do HIV-1. Diferente dos estudos de coorte que requerem
testagens repetidas de indivíduos, portanto com risco de vieses por perda de
seguimento, os testes do STAHRS podem ser realizados retrospectivamente
em amostras estocadas de inquéritos sorológicos cross-seccionais (amostras
anti HIV-1 positivas estocadas e recuperadas durante um determinado período
15
de tempo, de uma população definida, cujo tamanho é conhecido). A aplicação
do STAHRS é menos dispendiosa, mais rápida e simples. Ainda, permite a
medida da incidência em tempo real, ou seja, no momento da realização do
estudo, diferentemente da incidência obtida através de estudos longitudinais
que só pode ser estimada após coleta e testagem da amostra do follow-up.
Para estimar a incidência do HIV é necessário determinar o intervalo de
tempo em que os indivíduos permanecem classificados como “infectados
recentes” pelo teste. A determinação da duração da janela de soroconversão
recente dos testes aplicados na técnica STAHRS, usualmente denominada
período médio de janela (W, mean window period) é baseada na observação
de painéis de amostra de indivíduos cuja data de soroconversão é conhecida,
ou seja, a estimativa w requer uma calibração de estudos de coorte com
seguimento de indivíduos cujas datas de infecção são aproximadamente
conhecidas. A modelagem destes dados permite indicar um cut-off e um
período de soroconversão em dias, de acordo com a sensibilidade e
especificidade do método para classificar infecções recentes e de longa data
(Murphy & Parry 2008; Parekh et al. 2002). Usando a fórmula bem conhecida
onde prevalência é igual incidência vezes a duração da doença é então
possível estimar a incidência como a razão entre os recém infectados pelos
susceptíveis e o período médio de janela (Barnighausen et al. 2010).
A figura 3 apresenta esquematicamente os princípios que norteiam o
algoritmo para a testagem sorológica da infecção recente pelo HIV (STARHS).
O eixo da ordenada indica o aumento da concentração de anticorpos enquanto
o eixo da abscissa mostra o progresso da infecção ao longo do tempo após a
exposição ao HIV, iniciando com baixos níveis de anticorpos na infecção
recente seguidos de elevação progressiva desse marcador sorológico, O cut-off
da técnica STARHS pretende estabelecer um equilíbrio apropriado entre a
sensibilidade e especificidade o qual está associado com o período de infecção
recente pelo HIV-1 de três a seis meses. Entretanto, a variabilidade inerente ao
modelo deve ser considerada, com a inclusão da acurácia do período de janela
para infecção recente, pelo cálculo do intervalo de confiança (IC95%) e a
variabilidade individual (pessoa a pessoa), que pode responder à infecção viral
16
com progressão rápida ou lenta. Murphy (2008) em seu artigo de revisão
discute os ensaios para detecção de infecção recente e apresenta os principais
testes laboratoriais disponíveis (Murphy & Parry 2008).
Figura 3. Princípios que determinam o algoritmo de testagem sorológica para infecção recente pelo HIV-1 (STARHS). Adaptado de Murphy, G. & Parry J. V. 2008
Na metodologia descrita por Janssen através da modificação de um
teste ELISA anti-HIV 3A11 (Abott) já existente no mercado cuja diluição de
1/400 foi aumentada para 1/20000 e o tempo de incubação de 120 para 30
minutos, foi desenvolvido um teste menos sensível, também chamado teste
detuned (Less Sensitive - 3A11 LS). Indivíduos testados com níveis de
soroconversão recente, ou seja, com baixa concentração de anticorpos anti-
HIV, não eram detectados e, portanto, considerados infectados recentes. Esse
simples algoritmo utilizando dois testes (sensível e menos sensível) foi capaz
de detectar infecção recente pelo HIV pós soro-conversão (Janssen et al.
1998). No entanto, pelo processo de diluição laborioso e pela pouca
acessibilidade ao método, outro teste detuned (Vironostika HIV-1 EIA) de
17
realização mais simplificada em laboratório foi produzido pela Organon Teknika
e utilizado para determinar incidência do HIV em vários estudos (Kothe et al.
2003). Entretanto, nenhum desses testes comerciais apresentou desempenho
semelhante para os vários subtipos virais porque utilizam antígeno(s) derivado
de um único subtipo viral (Young et al. 2003).
O teste BED capture enzyme immunoassay (BED-CEIA) (Parekh et al.
2002) mede indiretamente a quantidade (proporção) de IgG anti-HIV no soro. O
teste BED, enquanto estimador de incidência, mensura a proporção do IgG HIV
específico como uma densidade óptica normalizada (OD-n), quantidade que
aumenta em função da tempo de infecção (Barnighausen et al. 2010; Dobbs et
al. 2004; Parekh et al. 2002). Esse teste tem a capacidade de capturar, tanto a
IgG anti-HIV como a IgG não específica na mesma proporção presente no
soro, em um peptídeo sintético ramificado trimérico que inclui a seqüência da
região imunodominante da glicoproteina gp41 dos subtipos B, E e D do HIV-1
(multi-subtype derived branched synthetic peptide – BED). A captura
imunoenzimática (capture EIA – CEIA) permite a diluição1/100 e devido a sua
natureza competitiva, um aumento gradual na proporção de IgG específica anti-
HIV-1 e IgG total pode ser detectado durante o período de dois anos após a
soroconversão (Parekh et al. 2002). Esse teste foi validado posteriormente em
amostras no continente africano para os subtipos A, C e D (Barnighausen,
2008). O teste BED-CEIA permite a detecção dos anticorpos com um período
médio de janela de infecção recente de 160 dias, variável de acordo com os
diferentes subtipos virais, porém com sobreposição dos intervalos de confiança
(Dobbs et al. 2004; Parekh et al. 2002).
O ensaio BED capture foi desenvolvido pelo CDC (Centers for Disease
Control and Prevention) (Dobbs et al. 2004; Parekh et al. 2002) para minimizar
algumas desvantagens dos testes sensível/menos sensível já existentes, como
a necessidade de altas diluições, a grande variabilidade dos resultados e o
desempenho dependente do subtipo viral. Em 2004, o CDC estabeleceu áreas
selecionadas nos Estados Unidos para implementar um sistema de vigilância
de incidência da infecção pelo HIV (Lee & McKenna 2007). A partir de 2005, o
teste BED passou a ser comercializado nos EUA (Dobbs et al. 2004), com a
18
facilidade de poder ser realizado em amostras líquidas ou secas de sangue,
soro, ou plasma. Em 2006, o CDC norte americano iniciou sua utilização em
vigilância epidemiológica (Hall et al. 2008). Apesar de várias publicações de
testes in house (Barin et al. 2005; Wilson et al. 2004) e de outros ensaios
modificados para detectar infecção recente (Constantine et al. 2003; Kothe et
al. 2003; Rawal et al. 2003; Suligoi et al. 2002), o ensaio BED-CEIA é o único
teste desenvolvido para detectar infecção recente pelo HIV-1 em estimativa de
incidência disponibilizado comercialmente na forma de kit (Dobbs, 2011).
Atualmente o teste sorológico BED é o mais amplamente utilizado no algoritmo
STARHS e considerado medida confiável da incidência do HIV-1.
Os marcadores da resposta imune que têm sido rastreados pelos testes
de infecção recente para o HIV, podem variar não somente com os diferentes
subtipos virais, mas também com as fases da epidemia e diminuir ou
desaparecer ao longo do curso da infecção devido à queda da competência
imunológica do indivíduo ou a tratamentos realizados (Guy et al. 2009; Hallett
et al. 2009; Hladik et al. 2007; Laeyendecker et al. 2012; Marinda et al. 2010).
Portanto, esses testes aplicados em populações com infecções de longa data
não diagnosticada ou onde o tratamento é amplamente utilizado podem
superestimar o número de infecções recentes. As soluções propostas para este
problema tem sido a aplicação de fatores de correção para ajustes desses
vieses (Hargrove et al. 2008; McDougal et al. 2006). Outro problema na
utilização de testes de incidência é a necessidade de grande tamanho amostral
para a realização de estimativa mais precisa. Em regiões como a África do Sul
considerando a taxa de falso recente de 0% do teste sorológico seria
necessário dois rastreamentos de 6000 indivíduos cada; se considerarmos o
falso recente de 5%, a amostragem deverá ser de 15000 rastreados em cada
grupo (Welte et al. 2010).
No final do ano de 2005 a UNAIDS Reference Group on Estimates,
Modeling and Projections fez recomendações para aplicação do teste BED-
CEIA em sistemas de vigilância do HIV e para estudos de prevalência. Isto
porque estudos de validação demonstraram que esse teste superestimava a
incidência da infecção pelo HIV-1 por classificar erroneamente infecção de
19
longa data como infecção recente (UNAIDS 2006). Esse erro de classificação
se apresenta particularmente acentuado em populações com alta prevalência
do HIV, podendo variar de acordo com o subtipo viral. A UNAIDS então
recomendou que o teste não devesse ser utilizado para avaliação de rotina da
vigilância do HIV-1 e estabeleceu um grupo de trabalho para avaliar essas
questões (UNAIDS 2006).
Em 2006, o grupo de trabalho denominado Surveillance and Survey and
Laboratory working groups to the Office of the Global AIDS Coordinator revisou
os resultados de novos estudos com dados apresentados por países de três
continentes (Ásia, África e América do Norte) incluindo China, Costa do Marfim,
África do Sul, Tailândia, Uganda, Zimbábue e EUA, e propuseram fatores de
ajustes para estimar a incidência do HIV-1 usando o teste BED-CEIA. Baseado
nos resultados dessas revisões foi estabelecido recomendações para sua
utilização em inquéritos de soroprevalência, estudos de intervenção e vigilância
baseada em casos de notificação (Surveillance and Survey and the Laboratory
working groups to the Office of the Global AIDS Coordinator 2006). O BED-
CEIA pode ser usado para estimar a incidência do HIV-1 se ajustes
apropriados forem feitos e orientados por consultores especialistas em
métodos utilizados para soroprevalência em estudos populacionais ou sentinela
e para avaliação de medidas de prevenção. Em sistemas de vigilância baseada
em casos notificados sua utilização poderá ser realizada somente sob
determinadas circunstâncias (Surveillance and Survey and the Laboratory
working groups to the Office of the Global AIDS Coordinator 2006).
Em estudos de soroprevalência o teste BED-CEIA pode ser usado para
estimar a incidência do HIV-1 incluindo estudos de vigilância sentinela em
clínicas de assistência pré-natal ou em outras populações e em estudos
populacionais. Entretanto, os dados devem ser ajustados devido ao risco de
superestimativa dos casos considerados infectados recentes pelo BED-CEIA
(falso recente) (Surveillance and Survey and the Laboratory working groups to
the Office of the Global AIDS Coordinator 2006). O grupo de trabalho revisou
duas fórmulas (Hargrove et al. 2008; McDougal et al. 2006) e orienta que os
dois ajustes devem ser realizados para se obter medidas de incidência
20
separadas para posterior checagem da consistência dos resultados. O método
descrito por McDougal utiliza ajustes tanto para falsos casos recentes (> 310
dias) quanto para os falsos casos de infecção tardia (≤ 310 dias) (McDougal et
al. 2006). O método Hargrove utiliza ajustes apenas para os falsos casos
recentes (> 365 dias). Ambos os ajustes têm validação apenas para os
subtipos B e C do HIV-1 e possuem aplicação otimizada em populações onde
nenhum ou poucos indivíduos com infecção pelo HIV estão sob terapia anti-
retroviral (TARV). O uso da TARV pode associar-se de forma substancial à
classificação errônea de infecção recente superestimando os resultados de
incidência. Na análise da tendência ao longo do tempo em estudos seriados de
soroprevalência (incluindo sistemas de vigilância) a classificação errada de
pessoas sob TARV pode ser particularmente relevante, considerando-se a
crescente utilização da TARV em inúmeros países (Surveillance and Survey
and the Laboratory working groups to the Office of the Global AIDS Coordinator
2006). As fórmulas dos ajustes estão incluídas no Anexo 1.
Em locais de testagem e aconselhamento voluntário ou em doadores de
sangue são requeridos ajustes adicionais para retirar os vieses causados pela
freqüência e motivação para a realização do teste, no sentido de evitar a sub
ou superestimativa da incidência do HIV através da utilização do teste BED-
CEIA. Em estudos de intervenção esse teste pode ser usado para avaliar o
impacto das medidas de prevenção sobre a incidência do HIV-1 desde que os
fatores de ajuste sejam utilizados para cada braço de comparação. Os ajustes
podem produzir vieses de estimativas, porém, desde que as intervenções não
resultem em diferentes níveis de uso de TARV, espera-se que os vieses sejam
similares uma vez que os ajustes são aplicados para cada grupo de
intervenção. Nesse caso, as diferenças de medidas devem refletir as
diferenças de incidência (Surveillance and Survey and the Laboratory working
groups to the Office of the Global AIDS Coordinator 2006).
Nos sistemas de vigilância baseados em casos notificados, o BED-CEIA
pode ser usado para estimar a incidência da infecção pelo HIV-1 sob as
seguintes condições: alta cobertura (mínimo de 85% dos casos de infecção
pelo HIV-1 sejam notificados); cobertura precisa (menos de 5% de casos
21
duplicados); notificação precoce (mais de 66% dos casos reportados dentro de
seis meses do diagnóstico); disponibilidade dos dados do estádio clínico da
infecção no momento do diagnóstico (contagem de linfócitos T CD4 e
diagnóstico de aids); uso de TARV (Karon et al. 2008; MMWR 1999). Na
ausência destas condições, o grupo adverte contra a utilização do BED-CEIA
para estimativa da incidência da infecção pelo HIV-1 em sistemas de vigilância
por casos notificados e sugere o uso de estudos de soroprevalência
(Surveillance and Survey and the Laboratory working groups to the Office of the
Global AIDS Coordinator 2006).
É importante ainda salientar algumas recomendações adicionais do
Grupo:
� O teste BED-CEIA não deve ser usado para diagnóstico de infecção
recente em um indivíduo. O método é apropriado para estudos em larga
escala e os resultados devem ser interpretados apenas quando
agregados. Os dados de incidência recuperados através do BED-CEIA
são especialmente úteis para comparar incidência entre sub-populações
e mudanças de incidência ao longo do tempo.
� Apenas amostras com infecção confirmada pelo HIV-1 devem ser
testadas com o BED-CEIA. Indivíduos com infecção confirmada pelo
HIV-2 devem ser excluídos a fim de evitar superestimação da incidência.
� Quando possível, os inquéritos de soroprevalência devem medir os
principais fatores que podem afetar a interpretação dos resultados do
BED-CEIA: uso de TARV e diagnóstico de AIDS (Surveillance and
Survey and the Laboratory working groups to the Office of the Global
AIDS Coordinator 2006).
O teste sorológico BED capture têm sido incorporado em atividades de
vigilância (Batzing-Feigenbaum et al. 2008; Hall et al. 2008) e utilizado em
estudos para determinar infecção recente em diversos grupos populacionais
22
(Braunstein et al. 2009; de Castro et al. 2010). Apesar da publicação de
inúmeros estudos de soro prevalência do HIV na maioria dos países, a
estimativa de indivíduos infectados recentes (incidência de infecção) está
restrita a poucos países (Batzing-Feigenbaum et al. 2008; Hall et al. 2008).
Estimativas de incidência do HIV nos Estados Unidos têm sido registradas em
indivíduos de idade igual ou superior a treze anos, retestados com ensaio
imunoenzimático (BED HIV-1) para classificar as infecções como recentes ou
tardias/prolongadas (Hall et al. 2008). Em 2008, a Alemanha para estimar a
incidência de infecção recente do HIV no país, complementou o sistema de
vigilância do HIV através da retestagem dos indivíduos soropositivos com teste
imunoenzimático (BED-CEIA) (Batzing-Feigenbaum et al. 2008).
Em recente revisão sistemática sobre estudos de corte transversal que
estimaram a incidência do HIV usando o teste BED-CEIA, foram identificados
estudos em cinco continentes na população geral e em grupos de risco
utilizando diferentes fórmulas para ajustes das taxas (Barnighausen et al.
2010). Entre os 39 estudos selecionados, a maioria dos estudos foi realizada
na África. No Brasil, dois estudos foram identificados na cidade do Rio de
Janeiro com incidência de infecção de 1,68% em população de Centros de
Testagem (9008) e de 9,12% em 498 homens que fazem sexo com homens
(Velasco de Castro 2006; Velasco de Castro 2007). Os autores concluem que
os inquéritos que utilizam o teste BED podem produzir estimativas válidas de
incidência, porém muitos estudos não levaram em conta as imperfeições do
teste. Recomendam ainda que avaliações futuras devessem descrever a
incidência pontual e as suas variações, usar estimadores locais para calibração
dos parâmetros e calcular os intervalos de confiança das estimativas
(Barnighausen et al. 2010).
Estudos brasileiros utilizando testes sorológicos para avaliar incidência
do HIV-1, realizados fora do período de abrangência e ou não incluídos na
revisão acima, são descritos a seguir. As estimativas de incidência foram
calculadas majoritariamente em grupos populacionais de risco para a aquisição
da infecção. Usuários de cocaína (N= 839) da cidade de São Paulo-SP
apresentaram incidência de HIV com a estratégia de teste sensível/menos
23
sensível de 0,71/100/ano (IC 95% 0,07-3,03) (Turchi et al. 2002). Estudos
posteriores utilizando a metodologia STARHS e o teste Vironostika em
populações urbanas de usuários de drogas do Rio de Janeiro (Teixeira et al.
2004) e em indivíduos procurando tratamento ou aconselhamento em Centros
de Testagem Anônima (CTA) de São Paulo-SP (Bassichetto et al. 2009),
relataram incidência da infecção pelo HIV de 0,76% e 0,53% respectivamente.
Em aproximadamente 7400 indivíduos triados em um CTA da cidade do Rio de
Janeiro (2006-2007), a prevalência global de HIV-1 foi de 7,5% e a incidência
estimada de 1,39/100 pessoas/ano (IC95% 1,19-1,59) (Mercon et al. 2009). Em
2004/2006, o rastreamento para HIV-1 com retestagem pelo BED-CEIA em três
CTAs do estado do Rio de Janeiro apresentou uma prevalência de
soropositividade de 4,8% com taxa de incidência bruta de 1,68%/ano (IC95%
1,26%-2,10%) e ajustada de 1,17%/ano (IC95% 0,88%-1,47%) considerando o
fator de correção segundo Hargrove (de Castro et al. 2010). No estado de
Goiás, a incidência ajustada da infecção pelo HIV-1 através dessa metodologia,
ainda não foi descrita.
Essa nova estratégia para detectar infecção recente, através de medidas
de incidência em estudos transversais, reduz a necessidade de estudos de
coortes e, devido ao fato de ser realizada em indivíduos soropositivos, requer
menor quantidade de exames a ser realizada viabilizando sua aplicabilidade
em estudos populacionais. Sob o ponto de vista de saúde pública, o algoritmo
de retestagem em soropositivos facilita sua utilização em sistemas de
vigilância, para estabelecer coortes de vacinação, testar microbicidas e
promover a profilaxia pré-exposição (Fiamma et al. 2010).
1.4. Aspectos da Epidemiologia Molecular do vírus HIV-1
Para entender os aspectos referentes à genotipagem, e à resistência
antirretroviral segue uma breve síntese dos aspectos virais. O HIV, retrovírus
da família Retroviridae e gênero Lentivirus (Barre-Sinoussi et al. 1983)
apresenta dois tipos distintos geneticamente. O HIV-1, responsável pela
epidemia mundial da AIDS, e o HIV-2 restrito a casos de infecções no oeste da
África. O HIV-1 compreende quatro grupos filogenéticos nominados M, O, N e
24
P (Plantier et al. 2009; Robertson et al. 2000). O grupo genético M (Major)
representa 90% dos tipos circulantes em todo o mundo (Robertson et al. 2000).
Compreende nove subtipos (A-D, F-H, J e K) e alguns sub-subtipos (F1, F2, e
A1, A2, e A3) que podem recombinar entre si e formar mosaicos os quais,
quando adquirem importância epidemiológica, se denominam formas
recombinantes circulantes (CRFs – circulating recombinant forms) (Hemelaar et
al. 2006). Os diferentes subtipos do HIV se baseiam nas diferenças de
nucleosídeos ao longo do genoma viral. Essa divergência entre os subtipos
pode chegar a 30% na região do envelope viral, e em torno de 15% nas regiões
gag e pol, levando a diferenças genotípicas nas regiões da transcriptase
reversa, protease, integrase e gp41, locais de atuação dos antirretrovirais
(ARV) disponíveis atualmente. Como conseqüência direta dessas variações
genéticas, acredita-se que elas possam ser responsáveis por diferenças
biológicas, influenciando não só a transmissão viral e a progressão de doença,
como também o diagnóstico, o desenvolvimento de vacinas, a resposta clínica
e a emergência de resistência aos ARV (Gottesman et al. 2006; Kantor et al.
2005; Kiwanuka et al. 2008; Machado & Soares 2009).
Mundialmente os subtipos mais prevalentes são o C (50%), A e A/G
(17%) e B (10%) (Hemelaar et al. 2006). O subtipo B é o mais prevalente na
Europa, Américas, Austrália e parte da Ásia. O subtipo C é o principal
responsável pela epidemia na África subsaariana. No Brasil há predominância
do subtipo B (Bongertz et al. 2000; Morgado et al. 1998; Stefani et al. 2007) e
também são encontrados os subtipos F1, C e casos isolados dos subtipos A e
D e os recombinantes B/F e B/C (Brigido et al. 2005; Cavalcanti et al. 2007;
Cerqueira et al. 2004; De Sa Filho et al. 2006; Guimaraes et al. 2008; Soares et
al. 2003). Na região Centro-Oeste o subtipo B é o mais prevalente, seguido do
subtipo F, C e recombinante B/F (Cerqueira et al. 2004; Pereira et al. 2004;
Pereira et al. 2006; Stefani et al. 2007; Stefani et al. 2000). A vigilância
temporal e geográfica dos diferentes genótipos e recombinantes do HIV
constitui ferramenta importante nas estratégias de prevenção e controle do HIV
(Hu et al. 1996; Montano et al. 2005; Tovanabutra et al. 2003).
25
O envelope viral do HIV-1 é constituído de bicamada lipídica derivada da
membrana da célula do hospedeiro e apresenta um complexo de proteínas
contendo a glicoproteína (gp) 120 (proteína de envelope viral externa) e a gp41
(proteína de envelope viral transmembrânica). Internamente ao envelope,
encontra-se a proteína matriz p17, o capsídeo viral composto pela proteína
p24, o nucleocapsídeo composto pelas proteínas p7/p9, o genoma de ácido
ribonucléico (RNA), e três enzimas virais: protease (p10), transcriptase reversa
(p51) e integrase (p32) (Barre-Sinoussi 1996). As glicoproteinas do envelope
viral gp41 e gp120 são codificadas pelo gene env, as proteínas p17, p24 e
p7/p9 são codificadas pelo gene gag e as enzimas virais pelo gene pol. O
genoma viral ainda contém dois genes reguladores (tat e rev) e quatro genes
acessórios (nef, vif, vpu e vpi). Todos eles estão envolvidos com a replicação
viral e a infectividade do virion na célula não infectada e com a liberação de
novos vírus da célula infectada.
Após a interação do vírus através da gp120 aos sítios dos receptores
CD4 e co-receptores presentes em macrófagos, células dendríticas ou em
linfócitos T do hospedeiro ocorre formação de um complexo intermediário que
desloca a gp120 e gp41. Seguem-se várias mudanças de conformação na
gp41com exposição de sua região hidrofóbica amino-terminal, rica em glicina,
conhecida como peptídeos de fusão. Os peptídeos de fusão inserem-se na
bicamada lipídicada célula hospedeira, forma-se um complexo de seis hélices
das regiões hepta repetidas da gp41 que se emparelham e se retraem
promovendo aproximação e contato entre a membrana celular e a viral, com a
formação de poros de fusão e liberação do capsídeo viral no citoplasma da
célula hospedeira (Broder & Jones-Trower 2009). Ativa-se a transcriptase
reversa (TR) que transcreve o RNA viral em DNA complementar (cDNA) o qual
é duplicado e transportado para o núcleo e, através da enzima viral integrase
(IN), é incorporado ao genoma da célula hospedeira. O DNA pró-viral, cDNA
incorporado à célula, pode permanecer em estado de latência por meses ou
anos (Graci et al. 2009). Quando a célula infectada for novamente ativada, o
cDNA servirá de molde para a formação de moléculas de RNA genômico e
mensageiro, desviando a sua atividade metabólica para a síntese de partículas
virais (Frankel & Young 1998). Na célula infectada ativada, a transcrição do
26
gene do HIV-1 é realizada através da RNA polimerase celular com produção de
proteínas e enzimas virais. A protease (PR) viral cliva a proteína codificada
pelo gene gag, levando à produção dos polipeptídeos p24, p17 e p15. Ocorre
empacotamento das proteínas e RNA viral com liberação de milhares de virions
por brotamento, capazes de infectar outras células (Barre-Sinoussi 1996; Freed
2001). A enorme diversidade genética do HIV-1 tem sido atribuída a erros na
transcrição do RNA viral em cDNA através da TR devido à ausência de
mecanismo de correção da leitura no processo de replicação viral. Essa
diversidade genética está relacionada com diferenças na ação viral, na
resposta imune do hospedeiro e com o uso de drogas anti-retrovirais (ARVs).
A terapia antirretroviral (TARV) tem por objetivo a redução da carga viral
do indivíduo infectado no sentido de prolongar a sobrevida, diminuir a
ocorrência de infecções oportunistas e reduzir o risco de transmissão do HIV
(Detels et al. 1998). A distribuição universal das drogas anti-retrovirais no Brasil
tem aumentado a sobrevida e melhorado a qualidade de vida dos pacientes
com HIV/AIDS (Brasil Ministério da Saúde 2010d). O Brasil foi o primeiro país
em 1996 a garantir acesso universal à TARV e, particularmente neste caso, o
uso em larga escala de drogas ARVs tem propiciado a ocorrência de quadros
de resistência do HIV-1 e falha terapêutica. A maioria das drogas ARVs são
inibidores da TR e PR e atuam no ciclo de replicação viral impedindo a
produção do cDNA e a maturação viral, respectivamente. As drogas mais
recentes são os inibidores de entrada (IE) e os inibidores da integrase (IN). Os
inibidores da TR podem atuar competindo com os nucleotídeos fisiológicos
formando “falsos” substratos (NRTI – Nucleotide and Nucleoside Analogs
Reverse Transcriptase Inhibitors) (Shafer 2002) ou bloqueando diretamente o
sítio ativo da enzima TR (NNRTI – Non Nucleoside Analogs Reverse
Transcriptase Inhibitors) (Esnouf et al. 1997).
A resistência do HIV-1 às drogas ARVs é definida pela presença de
mutações que reduzem a sensibilidade do vírus a essas drogas quando
comparada à ação no vírus selvagem (Shafer 2002). Para o estudo da
resistência do HIV-1 aos ARVs, a nomenclatura é baseada nas diferenças de
aminoácidos da sequência HXB2 do subtipo B (número de acesso ao Gen
27
Bank, k03455). Por exemplo, a mutação M184V significa que na posição do
códon 184 o aminoácido metionina (M) foi substituído pelo aminoácido valina
(V). As mutações podem ser primárias ou principais e secundárias ou
acessórias. As primárias alteram a ligação da droga ou inibem a atividade viral
e, portanto, promovem redução da susceptibilidade à droga. As mutações
secundárias surgem para compensar a perda da atividade da enzima, ou seja,
para aumentar a capacidade replicativa do vírus, sem alterar a susceptibilidade
à droga (Shafer 2002; Spira et al. 2003). As mutações de resistência às drogas
ARVs podem ser identificadas através de ensaios genotípicos e fenotípicos. Os
ensaios genotípicos (genotipagem) identificam as mudanças genéticas
ocorridas no genoma viral capazes de bloquear ou diminuir a resistência dos
ARVs. Os ensaios fenotípicos (fenotipagem) cultivam pseudovírus com
fragmentos do vírus do indivíduo em diferentes concentrações de drogas
ARVs. Se o vírus persiste replicando, demonstra ser resistente; se é inibido,
sugere sensibilidade viral à droga.
A resistência aos ARVs pode ocorrer por uso inadequado da medicação,
fatores farmacológicos como alteração na absorção e eliminação da droga,
penetração insuficiente dos ARVs em alguns reservatórios anatômicos do HIV-
1, interações medicamentosas e transmissão de partículas virais que carregam
genes com mutações de resistência (Ghosn et al. 2006; Pierson et al. 2000). A
resistência primária, atualmente nominada resistência transmitida,
habitualmente ocorre por transmissão de cepas resistentes do HIV no momento
da infecção, comprometendo a eficácia dos regimes terapêuticos de primeira
linha em indivíduos virgens de tratamento. Resistência secundária com
freqüência surge em indivíduos que já utilizaram vários esquemas terapêuticos
e passam a apresentar falha de resposta ao tratamento (Boden et al. 1999;
Yerly et al. 1999).
Caracterizar as mutações associadas à resistência aos ARVs a cada um
dos subtipos mais comuns do HIV tem sido essencial para confirmar se essas
drogas quando utilizadas são ativas contra os subtipos mais comuns da região
(Shafer & Schapiro 2005). No sentido de comparar com precisão as taxas de
resistência às drogas entre diferentes períodos de tempo e regiões, tem-se
28
atualmente listadas 93 mutações sendo 34 mutações de resistência aos NTRI
em 15 posições da TR, 19 mutações aos NNTRI em 10 posições da TR e 40
mutações de resistência aos IP em 18 posições da Protease (Bennett et al.
2009).
A maioria dos estudos sobre mutações de resistência aos antirretrovirais
(genotipagem) é baseada no subtipo B do HIV-1 que, apesar de mais
prevalente em países desenvolvidos, representa apenas 10% do total de todas
as infecções em todo o mundo (Buonaguro et al. 2007; Rhee et al. 2006).
Apesar da resposta clínica a esses medicamentos na maioria das vezes ter se
apresentado eficaz para diferentes subtipos, pouca evidência se tem sobre o
impacto dos diferentes subtipos não-B na susceptibilidade às variadas
medicações. Essas questões não só são importantes para definir o melhor
regime terapêutico em países em desenvolvimento com acesso restrito ao
tratamento, como também em países como o Brasil, onde se tem acesso
universal à terapia antirretroviral e onde circulam, além dos subtipos B, os C, D
e F1 (Galvao-Castro et al. 1996; Stefani et al. 2007).
Estudos moleculares e análises filogenéticas nos vírus isolados das
amostras de gestantes soropositivas para o HIV diagnosticadas em Clínicas de
Assistência Pré- natal, por serem pessoas que na maioria realizam o teste anti
HIV pela primeira vez, podem fornecer dados sobre a resistência antirretroviral
transmitida, correlacionando com os subtipos circulantes e a presença de
mutações. A determinação da prevalência da resistência primária pelo HIV-1 é
importante para avaliar o potencial de resposta a esses medicamentos, assim
como para monitorar as estratégias de tratamento, especialmente em
indivíduos recentemente infectados, que poderão ter impacto na política de
distribuição de medicamentos e na implantação de testes de resistência. No
Brasil, as regiões Sudeste e Sul englobam mais da metade dos casos HIV/aids
e representam o grande número de publicações nessa área (Barreto et al.
2009; Eyer-Silva et al. 2008; Pires et al. 2004; Rodrigues et al. 2006; Turchi et
al. 2002). Na região Centro-Oeste, a maioria dos estudos de resistência
antirretroviral foi realizada em subgrupos populacionais (Cardoso et al. 2009;
Cardoso & Stefani 2009; Cerqueira et al. 2004). Dados pioneiros sobre a
29
diversidade genotípica do HIV-1 em gestantes e sua resistência aos
antirretrovirais foram publicados em 2000 (Stefani et al. 2000). A transmissão
mãe-filho e a resistência a drogas antirretrovirais foram investigadas em uma
coorte de 142 mulheres e 149 crianças no período de 2008-2010 em programa
de pré-natal no estado de Goiás. O estudo evidenciou predominância do
subtipo B seguido do subtipo B/F1 recombinante e subtipo C. Uma gestante
sem TARV (virgem de tratamento) apresentou resistência transmitida, 10
pacientes em uso de drogas ARVs apresentaram resistência secundária. O
estudo corrobora os achados de diversidade genética na Região Centro Oeste
(Alcantara et al. 2012a).
A determinação da diversidade genética do HIV e dos fatores de risco é
importante para o melhor entendimento das tendências epidemiológicas atuais
da transmissão do vírus (Chawla et al. 2007; de Castro et al. 2010; Fiamma et
al. 2010).
1.5. Epidemiologia da Sífilis e da coinfecção HIV e sífilis
Globalmente estima-se 12 milhões de indivíduos infectados pelo
Treponema pallidum a cada ano nas duas últimas décadas apesar da
existência de medidas de prevenção e das opções de tratamento efetivas e de
baixo custo, (WHO. World Health Organization 2008). A eliminação da sífilis
congênita tem representado um desafio de saúde pública e sua estratégia está
na redução da prevalência da infecção na gestante e na prevenção da
transmissão materno fetal (Brasil Ministério da Saúde 2005a; WHO. World
Health Organization 2008). Em países industrializados a prevalência das DSTs
bacterianas (sífilis, gonorréia e cancróide), após um pico durante a segunda
guerra mundial. Nos Estados Unidos a sífilis apresentou um decréscimo na
década de cinqüenta e voltou a elevar-se na década de sessenta e início dos
anos setenta para diminuir novamente quando a prevalência da doença
primária e secundária teve seu maior declínio (2,1 casos por 100.000
indivíduos) no ano de 2000 (Department of Health and Human Service et al.
2005).
30
Após o ano 2000, a incidência de sífilis tem aumentado
significativamente nos Estados Unidos e na Europa, com um aumento maior da
infecção em homens que fazem sexo com homens (HSH), elevando a relação
masculino:feminino de 1.2 em 1996 para 5.7 em 2005 (Department of Health
and Human Service et al. 2005). Portanto, houve aumento do risco de
aquisição de sífilis em população masculina (HSH) e, simultaneamente,
detecção de elevadas frequências dessa infecção em indivíduos infectados
pelo HIV (Centers for Disease Control and Prevention 2006). Finalmente, o
ressurgimento de sífilis em populações heterossexuais veio acompanhado de
disseminação do HIV nesse grupo (Millett et al. 2005; Montgomery et al. 2003).
Entre as várias infecções que podem ser transmitidas durante o ciclo
grávido puerperal, a sífilis apresenta as maiores taxas de transmissão mãe-filho
(Brasil Ministério da Saúde 2005a). Calcula-se anualmente dois milhões de
novos casos de gestantes infectadas pelo T. pallidum; cerca de 25% destes
resultam em natimortos ou abortos espontâneos, e outros 25% em recém-
nascidos de baixo peso ou com infecção grave, ambas condições de risco para
o óbito perinatal (WHO. World Health Organization 2008). Segundo dado do
Ministério da Saúde a sífilis está entre as mais frequentes DSTs rastreadas
pelos serviços de pré-natal em todas as regiões brasileiras (Brasil Ministério da
Saúde 2005a).
As doenças sexualmente transmissíveis (DSTs) bacterianas estão entre
os conhecidos fatores de risco para a aquisição da infecção pelo HIV (Fleming
& Wasserheit 1999; Grosskurth et al. 2000). Portanto, a sífilis e úlceras genitais
são consideradas tanto marcador de comportamento de risco quanto possível
fator causal para a aquisição do HIV (Greenblatt et al. 1988; Mehta et al. 2006;
Rottingen et al. 2001; Stamm et al. 1988; Zetola et al. 2009). A interação entre
a infecção pelo HIV e a sífilis têm sido considerada complexa, apesar da
extensa experiência clínica com pacientes coinfectados nas duas últimas
décadas (Zetola et al. 2007). As manifestações clínicas da sífilis são, em geral,
similares em indivíduos HIV infectados e não infectados porém quadros
atípicos podem aparecer em um percentual pequeno de casos de coinfecção
31
(Rompalo et al. 2001; Schofer et al. 1996). Estudos sugerem que a sífilis pode
causar aumento transitório na carga viral e decréscimo na contagem de células
CD4 os quais se resolvem após o tratamento da infecção (Kofoed et al. 2006;
Palacios et al. 2007). Esse aumento transitório da carga viral poderia contribuir
para o aumento do risco de transmissão do HIV entre pacientes coinfectados.
Recomendações para tratamento da sífilis permanecem inalteradas
independente do indivíduo ser ou não portador do HIV (Workowski & Berman
2006).
Estudo ecológico baseado em dados de inquéritos nacionais de
vigilância para o HIV e sífilis em gestantes na África do Sul evidenciou variação
da infecção pelo HIV de 16% (10,3%-24,2%) e da sífilis de 3,8% (2,1%-6,5%)
no ano de 2009 (Manda et al. 2012). Esse estudo mostrou correlação negativa
da prevalência da sífilis com a prevalência do HIV, havendo divergência dos
padrões espaciais entre as duas infecções. Estudo em 3824 gestantes
atendidas em unidade hospitalar no Malawi mostrou prevalência de 30% da
infecção pelo HIV e de 5% para sífilis sendo que as características
demográficas correlacionadas às infecções foram distintas (Kwiek et al. 2008).
Inquérito sentinela em mulheres atendidas em clínicas de assistência pré-natal
na Tanzânia demonstrou prevalência da infecção pelo HIV de 6,6% para as
moradoras rurais e de 8.4% para mulheres de área urbana (p=0,279). A
prevalência de sífilis nesse estudo esteve fortemente associada com o local de
residência: 16% para gestantes de áreas rurais distantes e 7% para residentes
em áreas urbanas (Kumogola et al. 2010). Vigilância sentinela do HIV em
clínicas de atendimento pré-natal vem sendo utilizado para coleta de dados de
prevalência do HIV em países da África subsaariana (Ghys et al. 2006).
Segundo estudo sentinela parturiente a prevalência global da sífilis em
gestantes no Brasil foi de 1,6% no ano de 2004 e de 1,1% em 2006. Houve
variação de acordo com as diferentes macrorregiões: Norte (1.5%); Centro
Oeste (1,0%); Nordeste (0,8%) e as menores taxas registradas em
maternidades públicas da macrorregião Sul (0,6%). A estimativa global da
prevalência do HIV e sífilis foi de 0,4% e de 1,1% respectivamente. Esse
estudo sentinela foi realizado com base em dados secundários, mediante
32
informações coletadas rotineiramente nas maternidades do SUS (Szwarcwald
et al. 2007). Estudo em 1029 mulheres de Vitória capital (ES) no ano de 2006
estimou a prevalência da infecção pelo HIV de 0,6% (IC95% 0,1%-1,1%) e de
sífilis de 1,2% (IC95% 0,5%-1.9%) (Miranda et al. 2008).
Gestantes infectadas pelo HIV recebem tratamento profilático e
terapêutico de acordo com inúmeros guias internacionais e nacionais.
Entretanto a eficácia desses tratamentos pode estar comprometida pela
presença de coinfecção viral ou bacteriana pelo T. Pallidum. A sífilis apresenta
maior prevalência em gestantes HIV infectadas. Gestantes coinfectadas HIV e
sífilis têm maior risco de transmissão vertical do HIV-1 e o curso da sífilis pode
estar alterado durante a coinfecção (Mwapasa et al. 2006; Thorne et al. 2008).
Apesar do tratamento não diferenciar, os esquemas tanto para sífilis quanto
para o HIV são menos efetivos para gestantes coinfectadas comparados aos
tratamentos em monoinfectadas (Brasil Ministério da Saúde 2010b).
A frequência da coinfecção HIV/sífilis depende da prevalência das duas
infecções em uma determinada população considerando os fatores de risco
envolvidos (Zetola et al. 2007). Revisão de trinta estudos nos Estados Unidos
mostrou soroprevalência global do HIV em indivíduos com sífilis de 15.7%.
Evidenciou-se um risco maior de infecção pelo HIV de 8.8% para o homem e
de 3.3% para a mulher com sífilis quando comparado com indivíduos sem sífilis
(Blocker et al. 2000). Na Espanha um estudo de seguimento de 1161 pacientes
HIV positivos mostrou soroprevalência de sífilis de 13% no início do estudo e
de 4% após 38 meses de seguimento (Munoz-Perez et al. 1998). O Grupo da
Alemanha para Estudos da aids (German AIDS Study Group) registrou
prevalência de sífilis de 1,33%, 151 casos positivos em 11 368 indivíduos
testados (Schofer et al. 1996). Em estudo realizado na França, a prevalência
de sífilis em infectados pelo HIV foi de 3,8% (110 casos de sífilis em 2865
indivíduos vivendo com HIV/aids). Desses com sífilis, apenas dois casos eram
mulheres e, dentre os homens, 89% eram homens que fazem sexo com
homens. Em 11% dos casos a infecção pelo HIV foi diagnosticada no momento
do episódio de sífilis (Abraham et al. 2005).
33
No Brasil, estudo de coorte de 2262 indivíduos portadores do HIV,
realizado na região sul durante o período de 1991 a 2008, a prevalência de
sífilis foi de 20,5%, sendo 57% do sexo masculino. Nesse estudo, sexo
masculino e HSH estiveram associados de forma significativa à coinfecção HIV
e sífilis (Adolf et al. 2012). O estudo evidenciou que essa população ainda está
engajada em práticas de intercurso sexual desprotegido e sugere que medidas
de saúde pública deveriam focar esses grupos específicos que apresentam
grande potencial de manter essa coinfecção. De forma global no Brasil , entre a
população de mulheres, encontra-se alta prevalência da infecção pelo HIV em
populações consideradas de risco como usuárias de drogas e trabalhadoras do
sexo (Barbosa Junior et al. 2009). Estudos demonstram que a prevalência do
HIV é quinze vezes maior em trabalhadoras do sexo quando comparada com a
prevalência encontrada na população feminina geral (Szwarcwald et al. 2008).
Recente estudo multicêntrico em 2523 mulheres trabalhadoras do sexo de dez
cidades do Brasil distribuídas entre as cinco macrorregiões do país, utilizando o
Respondent-Driven Sampling demonstrou importante associação da infecção
pelo HIV com a sífilis (OR 2.189; IC95% 1.064-4.488) (Damacena et al. 2011).
Em 130 gestantes HIV infectadas atendidas em ambulatório universitário no
Rio Grande do Sul durante o período de 2003 a 2008 a prevalência de sífilis foi
de 3,1% (Tornatore et al. 2012).
A triagem sorológica para sífilis em gestantes para prevenção da sífilis
congênita, por meio de teste não treponêmico isoladamente, vêm sendo
contestada tanto pela possibilidade de resultados falso positivos como de
resultados falso negativos. A realização do teste FTA-Abs (Fluorescent
Treponemal Antibody Absortion) em gestantes na confirmação da triagem
sorológica positiva pelo VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) foi
capaz de reduzir em cerca de 25% os casos de falso positivos (Romaguera
2011). Adicionalmente esse estudo mostrou baixa concordância entre os testes
VDRL realizados em diferentes maternidades sugerindo baixa reprodutividade.
Além disso, resultados falsos negativos podem ocorrer em até 2% dos exames
por efeito pró-zona e, baixa sensibilidade do VDRL (37%) foi mensurada nos
extremos da doença (Lautenschlager 2006).
34
Os testes treponêmicos utilizam suportes sensibilizados com antígenos
totais de T. pallidum ou componentes antigênicos do microrganismo obtidos por
biologia molecular ou engenharia genética. Os testes treponêmicos não são
utilizados para monitorar o tratamento e têm sido pouco usados em
procedimentos de triagem, sob a alegação de terem menor sensibilidade do
que os não treponêmicos durante as primeiras semanas da infecção. Na
verdade, os testes treponêmicos imunoenzimáticos (ELISA) vem sendo
recomendados para triagem sorológica da infecção pelo T. Pallidum
(Lautenschlager 2006). Esses testes detectam anticorpos das classes IgG e
IgM utilizando como frações antigênicas proteínas recombinantes (TpN47,
TpN14 e TpN15), e apresentam elevada sensibilidade, igual ou superior à dos
testes não treponêmicos na fase inicial da infecção (12, 24, 25). Atualmente o
Programa de Proteção à Gestante do estado de Goiás (PPG-GO) utiliza o teste
de ELISA de forma rotineira na triagem da infecção pelo T. Pallidum (www.goiania.apaebrasil.org.br).
Respostas sorológicas não usuais têm sido observadas em indivíduos
coinfectados HIV-sífilis, a maioria envolvendo resultados falsos negativos,
independente do tempo de evolução primária ou secundária da sífilis (Geusau
et al. 2005). O fenômeno pró-zona pode aumentar os resultados falsos
negativos dos testes não treponêmicos, em geral na sífilis secundária, devido a
alta concentração de antígenos treponêmicos levando à formação de
complexos antígeno- anticorpo. Pacientes HIV infectados apresentam alta taxa
de falência de negativacão de anticorpos não treponêmicos após o tratamento
da sífilis (Ghanem et al. 2007; Pialoux et al. 2008). Entretanto, apesar da
possibilidade de respostas alteradas, a interpretação dos testes treponêmicos e
não treponêmicos deverá ser a mesma para pacientes infectados e não
infectados pelo HIV (Lynn & Lightman 2004).
Nessa tese discutimos as questões relativas à prevalência e estimativas
de incidência da infecção pelo HIV-1, genotipagem e resistência antiretroviral
em gestantes atendidas pelo Programa de Proteção à Gestante do estado de
Goiás.
35
As estimativas de incidência foram baseadas no método STARHS
utilizando o teste BED - CEIA e aplicados os cálculos de ajustes apropriados
conforme recomendação da UNAIDS (Surveillance and Survey and the
Laboratory working groups to the Office of the Global AIDS Coordinator 2006).
Adicionalmente avaliamos a prevalência de infecção pelo T. pallidum e fator de
risco associados e exploramos a co-infecção sífilis e infecção pelo HIV-1 nessa
população. O Programa de Proteção à Gestante compreende a assistência pré-
natal a toda gestante atendida na rede pública da região Brasil Central, com
rastreamento de doenças com potencial de transmissão vertical incluindo o HIV
e sífilis.
36
2. JUSTIFICATIVA
Globalmente, a redução da transmissão vertical das infecções pelo HIV
e sífilis tem como eixo a prevenção, diagnóstico e tratamento dessas infecções
nas mulheres em idade fértil (Pereira et al. 2011). O rastreamento universal e
precoce para gestantes e o aconselhamento integram os principais Guias de
acompanhamento pré-natal (Brasil Ministério da Saúde 2005a; Centers for
Disease Control and Prevention 2006; Chou 2011). Ainda a sífilis pode ser um
fator de risco para aquisição da infecção pelo HIV com potencial interação
biológica no curso da infecção/doença (Fleming & Wasserheit 1999; Grosskurth
et al. 2000). Ambas infecções (HIV e sífilis) compartilham a mesma rota de
transmissão. Na última década, vem sendo consideradas problema de saúde
pública crescente, particularmente entre gestantes pelo potencial de
transmissão vertical e danos ao concepto e neonatos (Millett et al. 2005;
Montgomery et al. 2003).
No Brasil, estudos sentinela da infecção pelo HIV em gestantes têm sido
conduzidos para a determinação dos níveis endêmicos da epidemia do
HIV/aids (Szwarcwald et al. 2007). A metodologia de testagem de
soroconversão recente do HIV, denominada STARHS, possibilitou que
estimativas de incidência (novas infecções) pudessem ser mensuradas por
delineamentos de prevalência, na última década. Esse delineamento para
estimar incidência vem sendo utilizado em substituição aos estudos de coorte
que, em geral, demandam mais tempo, são mais dispendiosos e podem
apresentar perda de seguimento dos participantes gerando vieses
(Barnighausen et al. 2010). A vigilância da incidência do HIV com a
metodologia STAHRS vem se consolidada, nos EUA e na Europa, como
estratégia para avaliar, de forma oportuna e rápida, a transmissão da infecção
e, portanto, a dinâmica da infecção e a tendência da epidemia na população
(Batzing-Feigenbaum et al. 2008; Prejean et al. 2011). A maioria das
publicações nacionais aborda a incidência em subgrupos de risco, existindo
lacuna no conhecimento da incidência do HIV em gestantes, particularmente na
região centro-oeste.
37
Estudos de genotipagem contribuem para o mapeamento genético
molecular do HIV-1 em grupos populacionais específicos (Alcantara et al.
2012b; Carvalho et al. 2011) e, realizados em indivíduos recém infectados
podem indicar a dinâmica da transmissão de diferentes genótipos do HIV-1 em
grupos vulneráveis como o de mulheres jovens. Os diversos subtipos podem
mostrar diferenças genotípicas nas regiões da transcriptase reversa, GP 41,
protease e integrase, que são alvo da ação dos antirretrovirais e podem,
portanto, alterar a capacidade replicativa do vírus, sua susceptibilidade e a
seleção de mutações de resistência à terapêutica medicamentosa.
No Brasil onde há acesso universal a terapia ARV há vários anos,
diversos estudos têm mostrado níveis baixos a moderados de resistência
transmitida em pacientes virgens de tratamento antirretroviral. Estudos
moleculares e análises filogenéticas nos vírus isolados das amostras de
gestantes soropositivas para o HIV diagnosticadas em clínicas de assistência
pré- natal, por serem pessoas que na maioria realizam o teste anti HIV pela
primeira vez, podem fornecer dados sobre a resistência antirretroviral
transmitida, correlacionando com os subtipos circulantes e a presença de
mutações (Cardoso et al. 2009). No contexto de uma epidemia crescente entre
mulheres jovens, a resistência transmitida entre gestantes é importante tema
de saúde pública, pois as mulheres infectadas podem transmitir o vírus para
seus parceiros e para seus filhos durante a gestação, o trabalho de parto e no
pós- parto pela amamentação. A transmissão vertical do HIV-1 é multifatorial,
entretanto a alta carga viral materna representa o maior fator de risco para
transmissão. O uso de drogas antirretrovirais na gestação e trabalho de parto,
aliado ao uso de ARV pelo neonato e substituição do aleitamento materno,
representam medidas profiláticas altamente eficazes para evitar a transmissão
vertical do HIV-1. Entretanto, a presença de mutações de resistência
transmitida em gestantes pode comprometer a eficácia destas medidas bem
como de futura terapia ARV (Alcantara et al. 2012a). Desta forma, a realização
de testes de genotipagem para resistência em gestantes infectadas pelo HIV-1
é importante para direcionar a melhor associação de drogas para prevenção da
transmissão vertical.
38
Na presente tese estamos dando continuidade à linha de pesquisa
epidemiológica das infecções sexualmente transmissíveis em gestantes. Os
manuscritos apresentados têm como objetivos: determinar a prevalência da
infecção pelo T. Pallidum e do HIV-1; estimar a incidência pelo HIV-1 e avaliar
potenciais fatores de risco associados às infecções pelo HIV e sífilis; definir
genótipos prevalentes e o perfil de resistência antirretroviral primária do HIV-1
em subgrupo de gestantes. A população de estudo foi de gestantes atendidas
na maioria dos serviços públicos de pré-natal do estado de Goiás, incluídas no
PPG-GO durante o ano de 2011. Pela ampla abrangência, cobertura dos
serviços de pré-natal pesquisada aliada a qualidade laboratorial, acreditamos
que os resultados são válidos e representativos da população atendida nos
serviços públicos, podendo fornecer informações para os programas de saúde.
No desenvolvimento dessa pesquisa, consolidamos a parceria com as
Instituições que realizam o PPG/GO. Reconhecemos a colaboração e apoio
das instituições - Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás,
Hospital de Doenças Tropicais do Estado de Goiás, fundamentais para
viabilizar a operacionalização da proposta. O projeto foi aprovado pelo Comitê
de Ética em Pesquisa Humana e Animal do Hospital das Clínicas da UFG
(CEPHA/HC/UFG) sob o número 174/08 e recebeu apoio financeiro do
PPSUS/FAPEG (008/2009).
39
3. OBJETIVOS
Geral:
Avaliar a prevalência, incidência da infecção pelo HIV-1 e dados
moleculares, bem como identificar potenciais fatores de risco associados à
infecção pelo HIV-1 e sífilis em gestantes atendidas nos serviços públicos
de saúde do estado de Goiás, no ano de 2011.
Específicos:
1. Estimar a incidência da infecção pelo HIV-1, por meio da metodologia de
algoritmo de testagem sorológica para soroconversão recente do HIV,
utilizando o teste sorológico BED-CEIA, em população de gestantes
incluídas no Programa de Proteção à Gestante do estado de Goiás, no
ano de 2011.
2. Determinar os genótipos e a resistência antirretroviral do HIV-1 em
gestantes soropositivas rastreadas pelo Programa de Proteção à
Gestante do estado de Goiás, em 2001.
3. Analisar através de estudo transversal os fatores de risco associados à
infecção pelo HIV-1 e sífilis em gestantes atendidas nos serviços
públicos de saúde pelo Programa de Proteção à Gestante do estado de
Goiás, em 2001.
40
4. ARTIGOS
Manuscrito 1: Estimated HIV-1 incidence and genotypes among pregnant
women in central Brazil.
Manuscrito 2: Transmitted resistance among pregnant young women infected
with HIV-1.
Manuscrito 3: Prevalence and risk factors for HIV and Syphilis infections among
pregnant women attending ante-natal public health clinics in
central Brazil.
41
Manuscrito 1
Estimated HIV-1 incidence and genotypes among pregnant
women in central Brazil
42
Submitted to Plos One
Estimated HIV-1 incidence and genotypes among pregnant women in
central Brazil
Short title: Estimated HIV incidence among pregnant women in Brazil
Zelma Bernardes Costa,1 Mariane Martins de Araujo Stefani,2 Yanna Andressa Ramos
de Lima,2 Wayner V Souza,3 Noemia Teixeira de Siqueira Filha,3 Marilia Dalva Turchi,4
Walter Costa Borges,1 Clidenor Gomes Filho,5 Jose Vicente Macedo Filho,6Ana Lucia
Minuzzi,6 Celina Maria Turchi Martelli,4,7*
1 Faculty of Medicine, Federal University of Goias, Goias, Brazil 2Department of Microbiology, Immunology, Parasitology and Pathology, Institute of
Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goias, Brazil 3 Oswaldo Cruz Foundation, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhaes, Pernambuco,
Brazil 4Department of Epidemiology, Institute of Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goias, Brazil 5 Health State Secretariat, Goias, Brazil 6 Associacao de Pais e Amigos dos Excepcionais de Goiania - APAE, Goias, Brazil 7Faculty of Medicine / Federal University of Pernambuco, Pernambuco, Brazil
*Correspondence to Celina Maria Turchi Martelli, Av. Beira Rio, n.666, Apt.801,
Madalena, Recife - PE, CEP: 50610-100. Brazil. Phone: 55 81 3223-1937; Fax: 55 81
2126-8527;
e-mail: [email protected].
43
ABSTRACT
Objective:to estimate the incidence of HIV-1 infection among pregnant women from
central-western Brazil.
Design: Observational, cross-sectional study.
Methods: The study included 54,139 pregnant women who received antenatal HIV
screening from a network of public healthcare centers in 2011. The incidence of
confirmed HIV-1 infection was estimated using the Serological Testing Algorithms for
Recent HIV Seroconversion (STARHS) methodology by BED-capture enzyme
immunoassay (BED-CEIA). Positive results were linked to the official HIV notification
system, treatment files and hospital files to avoid misclassification of recent infection.
The yearly incidence was calculated, and adjusted incidences of HIV infection were
estimated.
Results:Of the participants, 25% had a pregnancy before age of 20, approximately 40%
were experiencing their first pregnancy. Of the 54,139 pregnant women screened, 86
had a confirmed HIV-1 diagnosis, yielding an overall prevalence of 1.58 cases per 1000
women (95% CI 1.3–2.0). A higher prevalence was detected in older age groups,
reflecting cumulative exposure to the virus over time. Among the infected pregnant
women 20% were considered recently infected by BED-CEIA. The estimated incidence
of HIV infection was 0.61 per 1000 person-years (95% CI 0.33-0.89); after correction,
the incidence was 0.47 per 1000 person-years (95% CI 0.26-0.68). HIV-1 subtype B
was the most common, followed by subtype C, BF1 recombinant and subtype F1.
Conclusions: This study highlights the potential for using incidence estimates derived
from a large antenatal screening program for HIV. The rate of recent HIV-1 infection in
the early reproductive years is a public health warning to implement preventive
measures.
44
Keywords:HIV; Incidence; Pregnant Women; HIV Seroconversion; Genotype.
Introduction
In Brazil, approximately 600,000 people were living with HIV/AIDS at the end of the
year 2000, and since then, the number has steadily increased. Since the mid-1990s, the
incidence of AIDS has increased among young women as the result of the spread of the
HIV-1 epidemic among heterosexual individuals[1]. Among the registered cases in the
13- to 24-year-old age group, the male:female ratio decreased from 3.7:1 in 1990 to
0.9:1 in 2000[2].According to the epidemic types defined by UNAIDS[3], the country
has been categorized as having a concentrated epidemic because it has a high
prevalence of HIV (>5%) among vulnerable subpopulations, such as female sex
workers, drug users and men who have sex with men[4], and less than a 1% infection
rate among pregnant women in urban areas[5,6]. This epidemiologic pattern contrasts
with the profile of a generalized epidemic, in which high HIV prevalence is detected in
the general population, as in several countries on the African continent[7].
A comprehensive national HIV-1 control program was implemented in the late 1980s.
The program provided free drug therapy as well as HIV-1 counseling, testing and
prophylaxis in prenatal care, and it has been considered a partially successful control
strategy[8]. Universal access to antiretroviral therapy (ART) has considerably improved
the life expectancy of AIDS patients and changed the profile of the HIV/AIDS epidemic
in Brazil[9]. Since the year 2000, the prevalence of HIV infection in the Brazilian
population aged 15-49 years has been estimated using data from the Parturient Sentinel
Surveillance studies, which are conducted nationwide biannually using probabilistic
sampling. For the year 2004, the overall HIV prevalence was 0.61% for this age-group;
approximately 209 thousand women and 385 thousand men (a total of 594 thousand
45
people) were living with the infection[6,10]. Notably, parturient have been considered a
reachable and feasible sentinel group that has prevalence rates similar to the rates in the
general female population. Therefore, studying this group can be a useful approach to
monitoring HIV infection in Brazil, despite the regional disparities in access to
healthcare and HIV screening coverage[6].
Estimates of HIV-1 incidence rather than prevalence are essential to evaluate the
dynamics of the epidemic in the context of the surveillance system and to implement
timely preventive measures[11,12]. Cohort studies for assessing incidence are generally
costly because of the large samples required, the requests for long-term follow-up,
and/or and losses to follow-up[13,14]. Mathematical modeling using secondary
prevalence data has been applied to estimate newly detected cases in studies such as the
UNAIDS report[15]. Recently, Serological Testing Algorithms for Recent HIV
Seroconversion (STARHS) were validated in several populations for surveillance and
prevention purposes[12,16-20]. The commercial BED-capture enzyme immunoassay
(BED-CEIA) assay has been considered a reliable measure of HIV incidence that can be
used to evaluate recent infection among diverse population groups[18,21,22]. Estimates
of the number of recently infected individuals using STARHS have been calculated
using the surveillance system in the USA since 2006[23,24], and, more recently, in
several European countries[25-27]. In Brazil, although there have been estimates of
HIV incidence in vulnerable subpopulations using STARHS methodology [28-30], data
on recent HIV infection among pregnant women have been scarce[31].
We have previously reported that the prevalence of HIV-1 infection was approximately
0.1% among approximately 28,000 pregnant women in the state capital of Goias in
Central Brazil in 2004-2005[5]. The current study aimed to estimate the incidence of
HIV-1 infection among pregnant women screened in the large routine antenatal program
46
in Goias State in central-western Brazil in 2011. These findings will contribute to the
understanding of the dynamics of HIV-1 transmission among young women and guide
HIV control programs.
Methods
Study population and setting
This is a study to estimate the incidence of HIV-1 infection among pregnant women
who received prenatal screening at public health clinics in Goias State in central Brazil
(population ~ 4.0 million) between January and September 2011. Detailed information
about the Program for the Protection of Pregnant Women (PPPW), which was
implemented in Goias State in 2004, has been published previously[5]. Briefly, PPPW
is a comprehensive screening program that covers approximately 80% of pregnant
women who receive public health services and works in partnership with the central
laboratory (IDP/APAE). Screening is available to pregnant women regardless of past
HIV-1 diagnoses. As part of this program, data about demographic characteristics and
obstetric history are collected at enrollment, and HIV-1 screening is offered free of
charge to all pregnant women on a voluntary basis (i.e., using an “opt-in” strategy).
Screening for HIV-1 infection is performed with ELISA tests using eluates of dried
blood spots, and confirmatory tests are performed on venous blood samples[32]. All the
tests are performed in one central laboratory located in the state capital (Goiania City),
where the samples are stored for quality control and retests. In the current study, women
with second ELISA or Western Blot confirmed positives for HIV-1 were tested for
recent HIV infection using BED-CEIA[33]. In compliance with the Brazilian
Department of STD, AIDS and Viral Hepatitis, HIV-positive pregnant women are
compulsorily registered using the official notification system. ART is offered free of
47
charge as one aspect of vertical HIV-transmission control, and there is also an official
registry for drug delivery[34].
Data Collection
Demographic characteristics and obstetric data were retrieved from the electronic files
of the screening program. The collected data included date of birth, ethnicity, region of
residence, number of pregnancies and gestational age (in weeks). To exclude the
possibility of obtaining false recent HIV results, we checked all HIV-positive women
for previous HIV notification, registration in HIV/AIDS healthcare programs and use of
ART. The data on HIV/AIDS notification, CD4 count and HIV-RNA viral load were
retrieved from medical records if they were available. The laboratory results that were
temporally close to the current screening (+/- 2 months) were considered for analyses.
In addition, the participants who were identified as recently infected by serology were
contacted by one of the authors (ZBC) to determine their knowledge of their HIV status
(date of HIV infection), their specific drug regimen and/or the medical follow-up they
had received for HIV/AIDS.
Laboratory procedures
BED enzyme immunoassay - Recent infections were identified using the commercial
Calypte HIV-1 Bed Incidence EIA Test (©Calypte Biomedical Corporation, Portland,
OR, USA) according to the manufacturer’s instructions. Briefly, we retrieved dried
whole blood from a finger prick that had been placed onto dried blood spot (DBS)
collection cards and stored at the Central Laboratory bank (IDP/APAE). The elution of
the samples, controls and calibrators was performed simultaneously in a 96-microwell
plate using the same procedure. The positive controls and calibrators were tested in
48
triplicate. Three 6-mm discs were punched out from specimen and control cards and
placed in each microwell. Dilution buffer was added, and the elution plate was
incubated for 16 hours at 4ºC. Following elution, the samples, controls and calibrators
were transferred to a test plate coated with goat anti-human-IgG (1:2 dilution) and
incubated (60 minutes, 37ºC). The plate was washed, and biotinylated HIV-1 peptide
(gp41) was added (1:1001 dilution). After the washing plate was incubated (90 minutes,
37ºC) with streptavidin-peroxidase (1:1001 dilution) and TMB substrate (15 minutes),
the optical densities (OD) were recorded (450 nm wavelength, 630 nm reference
wavelength). The normalized OD (ODn) values were calculated for the controls and the
samples to minimize the inter-test variability. ODn was obtained by dividing the median
OD of a control/sample by the median OD of the calibrator. The samples with ODn≤1.2
were retested in triplicate, and specimens with ODn<0.8 were considered recent
seroconversions. We considered normalized optical density values <0.8 (which
corresponds to a mean duration of infection of 155 days) obtained with the Calypte
HIV-1 BED incidence test as recent HIV-1 infections. A recent study showed that the
reliability of this test was high across duplicate specimens and different
laboratories[35].
HIV-1 subtypes were identified and molecular data were obtained for a subset of
pregnant women [n=22] because of operational limitations. Blood EDTA samples were
collected for laboratory testing, including CD4 cell counts, viral loads and HIV-1 pol
gene sequencing. Genomic RNA was extracted from plasma (QIAamp® Viral RNA
Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany), reverse transcribed into complementary DNA
(cDNA) (Invitrogen) and used as the target for a nested polymerase chain reaction
(nested-PCR) employing HIV-1 PR, RT K1/K2 external primers and DP10/F2 internal
primers[36]. The entire PR gene (corresponding to positions 2253-2549 relative to the
49
HXB2 genome, GenBank accession nº K03455) and a 750 bp fragment of the RT gene
(corresponding to positions 2550-3299 relative to the HXB2 genome) were amplified.
After purifying the amplicons (QIAquick® PCR Purification Kit/QIAGEN, Qiagen
GmbH, Hilden, Germany), genomic sequencing was performed using a BigDye
Terminator (Applied Biosystems; USA; ABI Prism 3100 Genetic Analyzer, Applied
Biosystems, USA). All generated sequences underwent quality control analysis using
the HIV-1 Quality Analysis Pipeline Tool (http://www.sanbi.ac.za) and visual
inspection of the alignment using Bioedit software to exclude sample mix-ups and
contamination[37]. The REGA automated genotyping tool version 2.0
(http://www.bioafrica.net/rega-genotype/html/subtypinghiv.html) and phylogenetic
inference were used to define the HIV-1 genetic subtype. Phylogenetic inferences were
performed using the Neighbor-Joining (NJ) method with Kimura’s two-parameter
correction using MEGA4 software[38]. Bootstrap values (1000 replicates) above 70%
were considered significant. The isolates with discordant PR/RT subtypes were
analyzed with SIMPLOT 3.5.1 software in a 200 bp sliding window advanced in
increments of 20 bp (1000 replicates) [39]. The sequences were gap-stripped, the
transversion-to-transition ratio was set at 2.0, and distances were calculated according to
Kimura’s two-parameter model.
Data analyses
The demographic and obstetric data were checked for duplicates before analyses were
conducted. We used exploratory methods of data analysis to assess the distribution of
numeric variables, such as age, number of pregnancies and gestational age. The
prevalence of HIV-1 infection and 95% confidence intervals (CI) were calculated for
50
the entire group of pregnant women, taking into account age-group, race/ethnicity,
number of pregnancies and gestational age at the first screening test.
The annual numbers of recent and pre-existing HIV-1 infections were estimated using
the BED-CEIA results and considering the 274 days of the survey period. HIV
incidence and the 95% CI were calculated based on the estimated annual number of
recent and pre-existing HIV-1 infections using the recommended 155-day window and
the incidence formula[21,33]. Following the recommendations of Surveillance and
Survey and the Laboratory Working Groups (2006), the guide to using the BED-CEIA
to estimate incidence and conduct surveillance, the unadjusted BED-CEIA incidence
and two adjusted corrections with 95% CIs were estimated[40,41].The analyses were
conducted with SPSS 18.0 and Microsoft Excel 2008. The prevalence for each age
group was divided by the overall estimated HIV incidence to calculate the duration of
infection by age using the following formula: prevalence = incidence X duration.
Ethical considerations
The study protocol was approved by the Ethical Committee of the Federal University of
Goias, Brazil (CEPMHA/HC/UFG; number 174/08). All of the participants (or the legal
guardians of underage participants) signed an opt-in informed consent form before
receiving the screening, which was part of the routine protocol.
Results
The Program for the Protection of Pregnant Women registered 54,346 pregnant women
for HIV-1 serological screening during the study period (274 days). We excluded 207
(0.38%) records that were duplicates. Therefore, 54,139 women were eligible to be
included in the analysis. At the first serological screening, of the 54,139 women tested,
51
95 were HIV-1 seropositive and 4 had undetermined status. Of the 87 women who
returned for laboratory retesting, 86 were HIV-1 positive according to EIA and WB
techniques using venous blood samples (Figure 1). For the incidence study employing
BED-CEIA testing, 84 filter paper samples with HIV-1 positive confirmatory tests were
recovered from the reference laboratory.
The 54,139 screened pregnant women had a mean age of 24.2 years (SD=6.12) and an
age range from 12 to 52 years. Adolescents between the ages of 12 and 19 made up
26.1% of the studied population. Women 42 years old or older were considered to have
extreme values in the age distribution by exploratory data analysis. Most participants
(approximately 59%) self-reported their ethnic/racial classification as biracial or black,
and 30.4% of the population was white. Approximately 40% of the pregnant women
were experiencing their first pregnancy, 42.6% reported two or three previous
pregnancies, 12.8% reported four or more pregnancies, and 5.2% were missing obstetric
information. Most of the women (64.9%) were registered for screening at the beginning
of the gestational period (≤14 weeks); 28.4% were registered later, and approximately
8% were missing these data.
Of the 54,139 pregnant women screened, 86 had a confirmed HIV-1 diagnosis, yielding
an overall prevalence of 1.59 per 1,000 women (95% CI 1.48‰–1.70‰).
Seroprevalence increased with age; the prevalence was significantly higher among older
women (X2=7.5, df=2, p=0.006). The prevalence of HIV-1 was 1.69% (95% CI 1.55‰–
1.84‰) among self-identified biracial/black individuals, which was significantly
different than the prevalence of 1.21% (95% CI 1.05‰–1.39‰) among white women.
A significantly higher prevalence of HIV-1 infection was observed as the number of
pregnancies increased (X2=18.0; df=2; p<0.001). HIV-1 prevalence was significantly
52
lower among women who received their initial screening before 15 weeks of gestational
age compared to those who received screening later in their pregnancy (Table 1).
During the study period (9 months), of the 84 women who were seropositive for HIV-1,
18 (21.4%) had recent infections according to the BED-CEIA results, independent of
their past HIV status. Of the 18 participants with positive results, 14 women were
considered recently infected pregnant women over the 274 day study period. Four
participants were excluded because they were considered to have long-standing
infections. Three had received HIV diagnoses in 2002, 2006 and 2009 and two of these
were already receiving ARV therapy. One patient could not be located and was
excluded.
First, we estimated HIV-1 incidence considering all 18 BED serology results over the
time frame of one year, which yielded 24 cases out of 112 seropositive individuals. The
estimated incidence using the newly diagnosed cases of HIV-1 (i.e., excluding the
women with previous HIV-1/AIDS diagnoses or ARV therapy) yielded 19 cases
(17.0%) per year out of 112 seropositive individuals. The crude incidence rate was 0.61
per 1000-year (95% CI 0.33‰-0.89‰). The adjusted incidence rates of HIV-1 using the
McDougal correction[40] and the Hargrove correction[41]were 0.43 new infections per
1000 person-years (95% CI 0.24‰-0.63‰) and 0.47 per 1000 person-years (95% CI
0.26‰-0.68‰), respectively (Table 2).
Figure 2 presents the prevalence by age, taking into account the estimated duration of
the infection. There was an increase in HIV prevalence between the early reproductive
years and age 20, with a less steep increases afterwards.
Molecular data
HIV-1 pol was successfully genotyped in 18 out of 22 patients; the samples from four
patients could not be amplified by PCR. In this subsample of pregnant women
53
diagnosed while receiving prenatal care, HIV-1 subtype B prevailed (66.7%, 12/18)
followed by subtype C (16.7%, 3/18), BF1 (11.1%, 2/18) recombinants and one case of
subtype F1 (5.5%,1/18). Among the six cases considered recent seroconversions, 5
cases were subtype B, and one case was subtype C.
Discussion
In this comprehensive antenatal care program in a central-western state in Brazil, of the
54,000 pregnant women screened, the overall prevalence of HIV-1 was 1.59 per 1000
women in 2011. Similar results among those screened in the ANC were previously
reported in the state capital[5], and this figure is comparable to the prevalence among
women in some developed European and American countries[15]. The prevalence of
HIV-1 detected in central Brazil was lower than the mean prevalence of 0.4% estimated
from the Parturient Sentinel Surveillance survey conducted among 16,410 pregnant
women between 15 and 34 years old in Brazilian states in the early 2000s[6].
In our study, the probability of recent HIV-1 infection was 0.47 per 1,000 person per
year based on BED serology with adjustments. The overall HIV-1 incidence and the
prevalence among the 12 to 19 year old pregnant women who were screened were
similar. Our findings support the general assumption that the HIV prevalence among
young pregnant women is a proxy measure of the incidence in countries with
generalized epidemics[42], although Brazil has a concentrated epidemic of HIV.
In our setting, approximately 20% of the screened pregnant women who were HIV-
positive were recently infected, a rate similar to the figure previously reported using the
STARHS algorithm in the city of São Paulo, Brazil[31]. The national French
surveillance survey of recent HIV infections (2003-2006) also reported a 23.0% rate of
recent seroconversion in a low-risk population. This surveillance system was created
54
using the network of national reference laboratories[26]. Our study design was similar
to the operational strategy adopted in this French surveillance study, taking advantage
of a large network of health units and stored dried serum samples (DSS) of the new HIV
diagnoses to further re-test the samples using STARHS methodology. In the USA, the
surveillance data revealed that approximately 30% of infections were recent at the
population level (2006-2009). Estimates of HIV incidence among individuals older than
13 years using STARHS have been calculated from the USA surveillance system data
since 2004[12,23,24].Other European countries are in the process of implementing
recent HIV infection surveillance as part of their strategies to monitor
transmission[25,27].
The estimated HIV-1 incidence of 0.47 new infections per 1000 person-years among
pregnant women in our study was low compared to the results of several studies among
high-risk subpopulations in Brazil. A recent HIV-1 infection incidence of 0.71/100/year
was detected among cocaine users in the city of São Paulo in late 1990s using a less
sensitive ELISA[43]. Studies using the STARHS methodology found an incidence of
HIV-1 infection of 0.53% among drug users in the city of Rio de Janeiro[44]. In a
population receiving voluntary counseling and testing services (VCTs) in Rio de Janeiro
city, in the southeastern region of Brazil, the incidence rates estimated using BED-
CEIA in the mid-2000s were 1.17 per 100/year[22], and 1.39 per 100/year[45]. Among
the patients receiving VCTs in the city of Sao Paulo, the incidence rate was
0.35/100/year in 2001[28]. In the northeastern region of Brazil, the overall incidence
was 0.44%, and when the results were stratified, the rate was 2.2 times lower among the
pregnant women attending VCTs[30]. In Brazil, the cities located in the central-western
region (our study region) had a lower magnitude of AIDS/HIV epidemic compared to
the southeastern and southern regions[46]. In addition, there are generally lower
55
prevalence and incidence rates of HIV-1 among females than among males in Brazil.
Furthermore, deriving HIV prevalence and incidence from VTCs generally
overestimates the rates of prevalence and incidence compared to population-based
surveys.
The study participants were young, with 26% of the pregnancies occurring in women
under 20 years of age. This figure is in accordance with surveys conducted in several
Brazilian capitals, which indicated that 29.6% of the participants had their first
pregnancy during adolescence[47]. An increasing prevalence was detected among older
age groups, reflecting cumulative viral exposure over time[48]. A review from the last
decade (1995-2005) reported racial inequality with regard to health outcomes, with
poorer health indicators among black/biracial populations[5] in regions throughout
Brazil[49,50]. In the USA, HIV incidence was relatively stable between 2006-2009, but
there was an increase in incidence among MSM and black/African American
individuals[12]. Interestingly, in our study, black/biracial individuals were more prone
to infection than white individuals; however, the association between recent infection
and ethnicity could not be analyzed because of the small number of recently infected
individuals.
In our study, HIV-1 subtype B was the most common genotype, followed by subtype C,
among a subsample of seropositive women. These findings are consistent with those of
previous studies of pregnant women in our region[51-53]. The dominance of HIV-1
subtype B has also reported in studies from other populations, in other Brazilian regions
and in other South American studies[22,54].
Our results should be interpreted with caution because the sampling method was not
random. The studied population might represent women who exhibit care-seeking
behavior; it is likely that certain subgroups, such as drug addicts, sex workers and
56
homeless populations, were underrepresented. Nevertheless, the current study included
approximately 80% of all the pregnant women estimated in the state (~ 95,000 per
year), and the large sample size is one of the strengths of this study. Furthermore, a
strategy that incorporates the public ANC screening includes samples from the entire
state network, approximately 400 centers with centralized laboratory procedures and
quality assurance. For Brazil as a whole, home to approximately 3,13 million pregnant
women, approximately 1,470 new infections per 1000 person-years (95% CI 850 -
2,130) would be expected, assuming an incidence rate to that observed in our study. Our
estimate for newly infected women would correspond to approximately 24% of the
6,104 pregnant women infected with HIV and notified in 2009 in Brazil[55]. In contrast
to the low HIV-1 incidence among the pregnant women in central Brazil, in countries
with a generalized epidemic, prevalence and incidence estimates derived from ANC
surveys generally overestimate the rates compared to the results of population-based
studies[56-58].
We checked for records of the HIV-positive women in the official HIV notification
system, the ART delivery files and hospital reference files to avoid misclassifying past
HIV/AIDS cases as recent infections[20,59,60]. On an individual basis, it was also
possible to check fairly recent CD4 count values and/or ARV treatment for most
seropositive women, and the CD4 values were within the range that indicates immune
competent status. Notably, only four women were considered to have long-standing
infections, and they were excluded from the analysis. To ensure the best possible
incidence estimate in this cross-sectional study, we applied both of the recommended
adjustments for HIV-1 incidence[40,41].
This study highlights the potential for estimating HIV incidence using data from a large
ANC screening program to aid HIV surveillance efforts. In addition, an increase in the
57
number of HIV-1 infections in the early reproductive years is a public health warning to
take preventive action. Our findings strongly support the need for more widespread
testing for HIV-1 and estimating the incidence of HIV-1 using BED-CEIA to monitor
the trends in viral transmission and to evaluate the impact of preventive and educational
interventions in target populations.
Acknowledgements
We thank our colleagues at the Secretariat of Health and APAE for their support.
Martelli CMT, Souza WV, Turchi MD and Stefani MMA have received fellowship
grants (CNPq# 306489/2010-4, # 305947/2006-0, # 306928/2010-8 and #304869/2008-
2). Martelli CMT, Souza WV, Turchi MD are research members of the National
Institute of Science and Technology for Health Technology Assessment.
Competing interests: none declared.
Funding: this research was sponsored by Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de
Goias (FAPEG 008/2009) and the authors’ institutions.
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62
Figure 1.Screening strategy for HIV-1 infection among pregnant women attending
antenatal clinic, central Brazil.
Figure 2.Duration of HIV infection in years among pregnant women according to age,
central Brazil.
63
Table 1.Prevalence of HIV-1 infection in pregnant women screened in antenatal clinic
in central Brazil, 2011.
Characteristics
HIV Infection
Total
Positive
Prevalence ‰ (95% CI)
P
Overall 54,139 86 1.59 (1.48 – 1.70)
Age, years <0.006a
12-19 14,154 10 0.71 (0.58 – 0.85)
20-29 29,349 51 1.74 (1.59 – 1.83)
≥ 30 10,636 25 2.35 (1.55 – 3.42)
Ethnicityb <0.001
White 16,486 20 1.21 (1.05 – 1.39)
Biracial/Black 31,923 54 1.69 (1.55 – 1.84)
No of pregnanciesc <0.001d
First 21,625 20 0.92 (0.80 – 1.06)
2–3 23,071 42 1.82 (1.65 – 2.00)
≥ 4 6,628 22 3.32 (2.90 – 3.77)
Gestational age, weekse
<0.001f
≤14 35,167 47 1.34 (1.22 – 1.46)
>15 15,375 31 2.02 (1.80 – 2.25) aX2 for trend=7.51, df=2, P=0.006 b Missing data = 5730 c Missing data = 2815 d X2 for trend=18.05, df=2, P <0.001
e Missing data = 3597 fX2=33.0, P<0.001
64
Table 2.Estimation of HIV-1 incidence among pregnant women in central Brazil, 2011.
HIV positive n=112
Recent infection
Incidencea
‰/year (95% CI) Incidenceb
‰/year (95% CI) Incidencec
‰/year (95% CI)
Overall diagnosis 24 0.78 (0.47-1.10) 0.62 (0.37-0.87) 0.67 (0.40-0.93)
Newly diagnosed
19 0.61 (0.33-0.89) 0.43 (0.24-0.63) 0.47 (0.26-0.68)
Overall diagnosis - all positive HIV cases tested positive by BED-CEIA;
Newly diagnosed - number of positive HIV cases by BED- CEIA excluding women with previous HIV
diagnosis / AIDS or at ARV therapy; aCrude incidence rate; b Adjusted incidence rate according to McDoughal (2006); c Adjusted incidence rate according to Hargrove (2008)
65
Figure 1
66
Figure 2
67
Manuscrito 2
Transmitted resistance among pregnant young women
infected with HIV-1
68
Letter Submitted to Aids Patient Care and STDs
TRANSMITTED RESISTANCE AMONG PREGNANT YOUNG WOMEN
INFECTED WITH HIV-1
Zelma Bernades Costa1
Yanna Andressa Lima2
Celina Maria Turchi Martelli3,4
Mariane Martins de Araújo Stefani2
1Faculty of Medicine, Federal University of Goias, Goias, Brazil 2Department of Microbiology, Immunology, Parasitology and Pathology, Institute of
Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goias, Brazil 3Department of Epidemiology, Institute of Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goias, Brazil 4Faculty of Medicine / Federal University of Pernambuco, Pernambuco, Brazil
Word count: 1,200
69
Dear Editor,
Worldwide Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is considered the
main sexually transmitted infectious pathogen affecting currently approximately 34
million people and accounting for around 3 million newly infected persons per year 1.
Heterosexual HIV-1 transmission has increased significantly among young women and
in Brazil the rate of male:female infection has changed from 25:1 to 1,5:1 during the
last 2 decades 2. This shift raises concerns since infected women can disseminate HIV-1
by sexual route and by mother to child transmission (MTCT). HIV-1 MTCT is a
multifactorial event however; maternal viral load alone is considered the main risk
factor 3. In this context, prophylactic use of antiretroviral drugs (ARV) to reduce
maternal viral load has proved effective to avoid MTCT. Nevertheless, emergence of
HIV drug-resistant strains has increased with the scaling up population-based treatment
regimens based on nucleoside/non nucleoside reverse transcriptase inhibitors
(NRTI/NNRTI) and protease inhibitors (PI) and due to the widespread use of standard
first-line regimens based on low genetic barrier NNRTI 4. Transmitted HIV-drug
resistance mutations (TDR) in ARV naïve pregnant women can compromise both
MTCT preventive measures and future treatment options. In this regard, genotypic data
among pregnant women is crucial to effective MTCT prophylaxis and future ARV
regimens.
In central western Brazil a comprehensive public health antenatal program
including over 240 municipalities from Goias State (“Program for the Protection of
Pregnant Women/PPPW”) screens ~90,000 pregnant women/year for seven infectious
diseases, including HIV-1. This program has contributed to lower HIV-1 MTCT rates to
1%, the lowest in Brazil 5. In this setting, during 2004-2005 the prevalence of HIV-1
infection among 28,000 pregnant women was around 0.1% 6. More recently (2010-
2011) among 54,139 pregnant women from this setting the prevalence of HIV-1
infection was 1.58 case/1000 women and the incidence was estimated at 0.47/1000
person-years based on HIV-specific antibody affinity (Calypte Aware BED EIA HIV-1
Incidence Test), representing 20% of the recently diagnosed cases 7. In the current
study we report HIV-1 molecular data including drug resistance and genetic subtypes
and socio-demographic profiles of a sub group of these pregnant women .
Participants were interviewed using a standardized questionnaire to collect
socio-demographic data. Clinical and laboratory data including CD4+ cell counts and
70
viral loads were retrieved from the medical files at the reference public health hospital
(Hospital Anuar Auad/HDT/SUS, Goiania/GO). Molecular data was obtained as
previously described8. In brief, for analysis of pol gene, RNA was extracted from
plasma samples (QIAamp® Viral RNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany), reverse
transcribed into complementary DNA (Invitrogen) and used as target for a nested
polymerase chain reaction (nested-PCR) employing HIV-1 protease (PR) and reverse
transcriptase (RT) K1/K2 external primers and DP10/F2 internal primers. The entire PR
gene and a ~750 bp fragment of RT region were amplified, purified (QIAquick® PCR
Purification Kit/QIAGEN, Qiagen GmbH, Hilden, Germany) and sequenced (BigDye
Terminator kit, ABI Prism 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, USA).
Secondary and TDR mutations were analyzed using International AIDS Society-USA
(IAS-USA) major mutation lists and Stanford HIV Drug Resistance Database
(hivdb.stanford.edu). TDR was analyzed using the Calibrated Population Resistance
(CPR) Tool. ARV mutation susceptibility profile was analyzed by Stanford HIV Drug
Resistance Database. GenBank accession numbers of the sequences presented in this
study are KC249749-KC249766. HIV-1 subtypes were defined with REGA tool and
phylogenetic inference (Neighbor-Joining under Kimura’s 2-parameter). Isolates with
discordant subtypes in PR/RT regions were analyzed by SIMPLOT software (200bp
window, 20bp step, 1000 replicates). Sequences were gap-stripped, the transversion-to-
transition ratio was set to 2.0, and distances were calculated according to Kimura’s 2-
parameter model. Local institutional review board (Universidade Federal de Goiás:
protocol #073/05) approved this study and signed informed consents were obtained.
Frequencies and medians of main variables were calculated using Epi Info7 (CDC,
Atlanta, GA, USA).
The study group included 22 out of 86 (25.6%) pregnant women diagnosed for HIV-
1 infection during antenatal screening in 2010-2011 7. Median age was 25 years (range,
15-38), 5 were adolescents (≤19 years). Twelve participants had a stable sexual partner;
one of the participants was a prostitute. All pregnant women reported heterosexual route
for HIV-1 infection, 5/22 declared a sexual partner known to be infected with HIV-1,
however none had information about ARV use by the partner. Two participants have
had a partner who had been in prison and 3 had a bisexual partner. Sexually transmitted
disease was reported by 2 patients (HPV) and 2 patients have previously received blood
transfusion. Half of the participants had low educational level (<8 years) and none had a
71
university degree. Most patients (n=11) have had from 1-4 previous pregnancies. Most
patients (14/22, 63.3%) were from the great metropolitan area (capital Goiânia city, 1.6
million inhabitants). For 18 out of 22 patients recruited HIV-1 pol gene could be
amplified and sequenced, including 6 cases of recent seroconversion (<155 days) and
12 cases of long term seroconversion identified by BED EIA. Main characteristics of
recent and long term seroconversion cases are summarised in Table 1.
Only 2 long terms seroconverted pregnant women had been exposed once to
intravenous AZT during a previous delivery and none of them had secondary drug
resistance mutation. Molecular data from 16 ARV naïve pregnant women indicated 4
cases (25%, 4/16) of TDR (GenBank accession numbers: KC249752, KC249759,
KC249760, KC249761). Among TDR cases, single class mutation (NRTI) was detected
in two patients (PI: M46I and NRTI: T215S) and dual class (PI+NRTI) mutations were
identified in 2 patients: L90M+M41L and T215C/D mutations. Two out of 6 recently
infected patients had TDR mutations: PI (L90M) and NRTI mutations (M41L and
T215C). M46I is a major PI mutation that confers low susceptibility to nelfinavir (NFV)
but in non- subtype B, M46I is usually the consensus amino acid. T215S/C are revertant
mutations related to the emergence of T215Y, that increases the risk of virologic failure
to AZT and stavudine (d4T) 9. M41L when associated with T215Y confers high level of
resistance to these two drugs and decreases susceptibility to all nucleoside reverse
transcriptase inhibitors 10. L90M is associated with high level of resistance to NFV 9.
Regarding HIV-1 diversity despite the predominance of subtype B (12/18) subtype C
represented the second most frequent subtype, followed by BF1 recombinants and
subtype F1 (Table 1, Figure 1). Our findings corroborate the recently described
heterosexual spread of HIV-1 subtype C in central western Brazil, which contrasts with
its low prevalence in previous studies from this geographic area 11, 12
The profile of the Brazilian pregnant women infected with HIV-1 depicted in
this report raises concerns since it includes adolescents, mostly with low educational
profile, high risk behavior represented by unprotected sex with HIV-1 infected patients
and prisoners. Moreover, despite the small sample size, a high rate of TDR mutations
(25%) was observed, including dual class resistance mutations. This rate may be under
estimated since bulk sequencing detects only strains that represent >20%. Timing of
genotypic testing among long term seroconverters may also interfere as in the absence
72
of ARV drug pressure, resistance mutations may decline and become undetectable. The
high rate of TDR mutations identified in this group represents an alert since great efforts
in public health programs in central western Brazil have promoted the lowest HIV-1
MTCT in the country, which is an important achievement for an AIDS-free generation.
73
Acknowledgements
This research was sponsored by Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de Goiás
(FAPEG 008/2009) and the authors’ institutions. We thank our colleagues of Secretariat
of Health and APAE for their support. Martelli CMT and Stefani MMA are recipients of
fellowships from the CNPq/Bolsa de Produtividade em Pesquisa (grants #306489/2010-
4 and #310582/2011-3). Martelli CMT is a research member from the National Institute
of Science and Technology for Health Technology Assessment.
Ethical approval: The project was approved by the Ethical Committee of the Federal
University of Goias, Brazil (CEPMHA/HC/UFG; number 174/08). All of the
participants (or the legal guardians of underage participants) signed an opt-in informed
consent form before receiving the screening, which was part of the routine protocol.
The Study was also approved by regional APAE Ethical Committee.
Conflict of interest: none declared.
74
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75
Table 1. HIV-1 infected pregnant women with recent and long-term seroconversion
Variables Recent
Seroconversion (n=6)
Long-term
seroconversion (n=12)
Age
Median
(range)
24
(19-32)
24
(15-36)
CD4 count (cells/mm3)
Median
(range)
532
(310-666)
427
(146-1302)
Viral load (copies/mL)
Median
(range)
28,700
(14,828-55,299)
36,370
(342-219,750)
ARV status
Previously exposed
Naïve
-
06 (100%)
02 (16.7%)
10 (83.3%)
Clinical status
Asymptomatic
Symptomatic
6 (100%)
-
10 (83.3%)
02 (16.7%)
HIV-1 subtype (PR/TR)
B/B
C/C
F1/F1
B/F1 or F1/B
05 (83.3%)
01 (16.7%)
-
-
07 (58.3%)
02 (16.7%)
01 (8.3%)
02 (16.7%)
Drug resistance
PI
02 (2/6, 33.3%)
02 (L90M)
02 (2/12, 16.6%)
01 (M46I)
76
NRTI
NNRTI
02 (M41L/T215C/D)
-
01 (T215S)
-
ARV: antiretroviral; PR: protease; RT: reverse transcriptase; PI: protease inhibitor; NRTI: nucleoside reverse transcriptase inhibitor; NNRTI: non nucleoside reverse transcriptase inhibitor
77
Figure 1. Phylogenetic classification of 16 HIV-1 isolates from pregnant women in PR and TR genes. Sequences described in this work are labeled: without drug resistance mutations (●) and with TDR mutations (▲). Recombinants were excluded. Brackets indicate different monophyletic clusters. Only bootstrap values (1000 replicates) above 70% are shown. GenBank accession numbers of reference sequences are: Subtype B (AY173956, K03455, AY781126; AB287365; AY037269), Subtype F1 (AF077336; AF005494; FJ771010; JX140671) and Subtype C (U52953; AF286228; AY727524; AY703911; AB254142). The tree was rooted using the simian immunodeficiency virus sequence from chimpanzee (SIVcpz, GenBank accession number: AF103818) as an outgroup.
78
Manuscrito 3
Prevalence and risk factors for HIV and Syphilis infections
among pregnant women attending ante-natal public health
clinics in central Brazil
79
To be submitted to BMC Public Health
Prevalence and risk factors for HIV and Syphilis infections among pregnant
women attending ante-natal public health clinics in central Brazil
Zelma Bernardes Costa1, Mariane Martins de Araujo Stefani2, Ana Lucia
Minuzzi3, Clidenor Gomes Filho4, Mariana Costa Borges1, Celina Maria Turchi
Martelli,5,6*
1Faculty of Medicine, Federal University of Goias, Goias, Brazil 2Department of Microbiology, Immunology, Parasitology and Pathology, Institute
of Tropical Pathology and Public Health, Federal University of Goias, Brazil 3 Associacao de Pais e Amigos dos Excepcionais de Goiania - APAE, Goias,
Brazil 4 Health State Secretariat, Goias, Brazil 5Department of Epidemiology, Institute of Tropical Pathology and Public Health,
Federal University of Goias, Brazil 6Faculty of Medicine / Federal University of Pernambuco, Pernambuco, Brazil
Email: Zelma Bernardes Costa - [email protected]; Mariane Martins de
Araujo Stefani - [email protected]; Ana Lucia Minuzzi -
[email protected]; Clidenor Gomes Filho - [email protected];
Mariana Costa Borges – [email protected]; *Celina Maria Turchi Martelli
*Corresponding author: Av. Beira Rio, n.666, Apt.801, Madalena, Recife - PE,
CEP: 50610-100. Brazil. Phone: 55 81 3223-1937; Fax: 55 81 2126-8527; e-
mail: [email protected].
80
Abstract
Background: HIV infection and syphilis are sexually transmitted diseases that causes
substantial burden among pregnant women. Antenatal HIV and syphilis infections
screening are universally and routinely recommended in early pregnancy to prevent
vertical transmission. The objectives were to assess the prevalence risk factors
associated for HIV and syphilis among pregnant women who attended prenatal clinics.
Methods: Screening and counseling for HIV-1 infection and syphilis are offered free of
charge to pregnant women who attended public pre-natal clinic in the State of Goias (4
million inhab.), central Brazil in the year 2011. During the first prenatal visit, blood
samples are collected by digital puncture onto filter paper and confirmatory tests are
performed in venous blood samples. Syphilis cases were diagnosed by two specific anti-
treponemic antibodies (ELISA and FTA-abs) and HIV infection confirmed by ELISA
and Western-blot. Case-control analyses were build-up taking demographic and
gestational characteristics as independent variables; confirmed HIV-1 and syphilis as
outcomes and seronegative pregnant women as the control group. Univariate and
multivariate analysis were performed.
Results:Of 54,139 pregnant women screened, 1.21% had confirmed syphilis infection
and 0.16% HIV infection. Prevalence of syphilis was 7.5 times higher than HIV
infection.The frequency of syphilis among the HIV infected was 2.32% (95% CI
0.39%-7.47%). Risk factors independently associated with syphilis were: self-referred
as black or biracial ethnicity and two to three previous gestations. Women at the age
group of 20-29 years old were at higher risk for syphilis (OR= 2.81) (IC95% 2.13- 3.71)
and also for HIV infection compared to the adolescent group.
Conclusion: The seroprevalence of syphilis remains unacceptable high, and the
findings of higher risk among black and biracial women should be further explored
since it could be a surrogate marker of socio-economic condition. The rate of co-
infection for HIV-1 and syphilis infections detected corroborate with the general
recommendation of screening HIV/aids or syphilis patients for co-infection.
81
Background
Worldwide, the interaction of HIV infection and syphilis, a systematic disease caused
by Treponema pallidum, is considered an increasing public health, in subpopulation as
in men who have sex with men (MSM) but also among heterosexuals in the last
decade[1, 2]. Bacterial sexually transmitted diseases (STD), including syphilis and
genital ulcers are known risk factors for the acquisition of HIV infection and share the
same transmission routes [3, 4]. Thus syphilis may be a proxy marker of risk behavior
or may have a causal link to the acquisition of HIV [5-9]. The elimination of congenital
syphilis relies on the reduction of prevalence of Treponema pallidum infection among
pregnant women for the prevention of mother to fetal transmission [10].
In Brazil, syphilis is one of the most prevalent STD among pregnant women with the
potential of high rates of vertical transmission [10]. Globally, an estimated two million
of incident cases of T. pallidum infection occurs annually, resulting in around 25% of
stillbirth or abortions, besides of low weight neonates or severe disease, those are both
risk factors for neonatal deaths [11-13]. For co-infected pregnant women the therapeutic
schedule for both infections (HIV/aids or syphilis) are considered less effective
compared to pregnant women with a solely infection.[14]. Sentinel national surveillance
study detected prevalence of 1.1% of syphilis infection among pregnant women in the
year 2006, with diverse regional patterns ranging from highest in the North and lowest
in the South macro-regions. In the same subpopulation the global prevalence of HIV
was 0.4% with also some variation of endemicity levels [15]. Co-infected HIV and
pregnant women have higher risk to transmit HIV to neonates and the clinical evolution
of syphilis and HIV may be altered in co-infected patients.
The frequency of HIV and syphilis co-infections depend of the prevalence of both
infections and also the risk factors associated with exposure in each subpopulation [16].
Although several studies have reported the HIV prevalence and syphilis infections
among high risk population, less is known about the prevalence and risk factors among
pregnant women in our setting. In a previous paper we report the prevalence and HCV
infection among pregnant women attending pre-natal clinics in the capital city (Costa,
2009). The current study aims to assess the prevalence of HIV and syphilis among
pregnant women and explore risk factors associated with biological and gestational
period in a context of comprehensive screening program in the year of 2011 in Central
Brazil.
82
Methods
Study Design and Population
A prevalence study conducted to assess prevalence of and risk factors of HIV infection
and syphilis. Two case control studies were conducted to compare potential risk factors
for HIV-1 infection or syphilis compared to seronegative pregnant women. The study
takes advantage of the well-established ANC program with high coverage of infectious
disease screening described in previous publications [17, 18]. Briefly, Goias State is
located in central western Brazil with approximately 4.0 million inhabitants and 90,000
pregnant women per year [19, 20]. This Program of Protection of Pregnant Woman
(PPPW) is a universal STD screening strategy among others with potential of vertical
transmission. These tests are offered free of charge in public health units all over the
state covering at least 70% of the estimated number of pregnant women in this region.
The study was performed during the period from January to September 2011.
Data Collection
Data on demographic are collected at initial visit by a structured interview: date of birth,
race, last menstrual period, gestational age, mode of previous delivery, abortions and
the recruitment site and health unit. Results of syphilis screening and confirmatory tests
were obtained from the central Laboratory APAE.
Screening and Confirmatory Laboratory Tests
During the first prenatal visit, blood samples are collected by digital puncture onto filter
paper to perform laboratory screening tests. Confirmatory tests are performed in venous
blood samples according to Brazilian Ministry of Health recommendations [14].
HIV tests: HIV screening onto filter paper eluate used an UMELISA HIV 1+2
RECOMBINANT to detect antibodies anti gp 120, gp 41, p24 and gp 36 antigens
(Centro de Inmunoensayo, La Habana, Cuba). Screened pregnant women with positive
or indeterminate results are re-tested using sera from venous puncture blood samples
and at least one of this confirmatory tests were applied: Indirected Inmunofluorescence
by IFI - HIV-1 (Bio-Manguinhos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro; Imuno Blot
(IB) using a NEW LAV BLOT 1 (Bio-Rad, France) that detects antibodies against
83
gp160, gp110/120, p68, p55, p52, gp41, p40, p34, p24/25 e p18; Western Blot (WB),
for detection of HIV-1 e HIV-2 using HIV BLOT 2.2 (Genelabs ® Diagnostics Pte Ltd,
Singapore) for detect antibodies to gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p39, p31, p24,
p17 e o HIV-2.
Pregnant women are considered HIV infected if positive or indeterminate at the
screening test and positive result by any technique of confirmatory (IFI, IB, WB) tests.
HIV-1 incidence assessment - Pregnant women with confirmed diagnosis of HIV-1
infection were assessed for recent infection employing the Calypte HIV-1 Bed
Incidence EIA Test (Calypte Biomedical Corporation, Portland/ OR, USA) which was
performed according to the manufacturer’s instructions. Briefly, dried whole blood from
finger prick spotted onto dried blood spot (DBS) collecting cards stored at the Central
Laboratory bank (IDP/APAE) were retrieved. Elution of samples, controls and
calibrator was done simultaneously in a 96-microwell plate using the same procedure.
Positive controls and calibrator were tested in triplicate. Three 6 mm discs were
punched out from specimen and control cards and placed properly in each microwell.
Dilution buffer was added and the elution plate was incubated for 16 hours at 4ºC.
Following elution, samples, controls and calibrator were transferred to the test plate
coated with goat anti-human-IgG (1:2 dilution) and incubated (60 minutes, 37ºC). Plate
was washed and biotinylated HIV-1 peptide (gp41) was added (1:1001 dilution). After
washing plate was incubated (90 minutes, 37ºC) with streptavidin-peroxidade (1:1001
dilution) and TMB substrate (15 minutes) and optical densities (OD) were obtained
(450 nm wavelength, 630 nmreference wavelength). Normalized OD (ODn) was
calculated for controls and samples to minimize inter-test variability. ODn was obtained
by dividing the median OD of control/sample by the median OD of calibrator. Those
samples with ODn ≤ 1.2 were retested in triplicate and specimens with ODn< 0.8 were
considered as recent seroconversion. This test was performed at Laboratory of
Immunology/IPTSP/UFG.
Recent HIV diagnosis definition: We adopted as recent HIV-1infection values of optical
density normalized < 0.8, by the Calypte HIV-1 BED incidence test which corresponds
to a mean duration of infection of 155 days.
84
Syphilis tests: Serological screening for syphilis onto filter paper employ
IMUNOSCREEN Sífilis Total – SS (MBiologDiagnósticos Ltda., Brazil), an enzyme
immunoassay (ELISA) that detects specific qualitative antibodies (IgG and IgM)
against Treponema pallidum. Screened pregnant women with positive results are re-
tested using sera from venous puncture blood samples and performing detection of
specific anti-treponemic antibodies (Inmunofluor FTA/Abs. Interlab Distribuidora de
Produtos Científicos, São Paulo-SP-Brasil). This Kit presents sensitivity of 84% for
primary syphilis, 100% to phase secondary and 98% for tertiary syphilis, according to
manufacturer.
Pregnant women are considered positive Treponema pallidum infected with positive
results by ELISA in screening test and positive in FTA-Abs confirmatory test in venous
blood samples.
Data analysis
The original data bank is centrally kept at Idp/Apae and we have checked for
consistency before analysis. Repeated registered cases were excluded from the analysis.
Descriptive analysis of the main characteristics of the study population was performed.
We used exploratory data analysis to evaluate the distribution of the continuous
variables. Frequencies of infected individuals with the respective 95% CI were
calculated for HIV-1 and Syphilis infections. The co-infection HIV-1and Syphilis was
calculated, taking the dual positive results as numerator and the total screened
population as denominator. Chi-square test and Fischer tests were applied for
categorical variables. Values of p < 0.05 were considered statistically significant.
Possible associations between the infections and potential risk factors were assessed by
calculating the Odds Ratio (OR), (95% CI) and p-values. Variables that were associated
with the outcome with p < 0.10 were included in a multivariate regression model using
forward method. The analyses were conducted with Statistical Package for the Social
Sciences (SPSS) software for Windows version 18.0.
Ethical issues
The study protocol was approved by Ethical Committee of the Federal University of
Goias, Brazil (CEPMHA/HC/UFG) number 174//08. All participants or legal guardians
85
for underage participants included signed an opt-in informed consent before screening,
as part of the routine attendance.
Results
The routine ANC program enrolled 54,346 pregnant women, 207 (0.4%) were excluded
due to duplicated records or missing data. The eligible participants were young, mean
age of 24.2 years (SD=6.12), around 60% classified themselves as black or biracial and
30% as white. Approximately 40% were screened during the first pregnancy; around
65% had the screening tests at the first 14 weeks of the gestational period (Table 1).
Of 54,139 pregnant women, 710 (1.31%) were positive by treponemal test (EIA) at the
first screening; 660 tested positive by EIA and FTA-Abs tests yielding 1.21% of
confirmed syphilis. Prevalence of confirmed HIV infection was 0.16% (95% CI 0.15%-
0.18%). Prevalence of syphilis was 7.5 times higher than HIV infection among this
subpopulation. Two out of 86 HIV infected women also tested syphilis positive, thus the
proportion of syphilis among the HIV infected was 2.32% (95% CI 0.39%-7.47%). Of
14 recent HIV infected women one had concurrent diagnosis of syphilis.
Table 1 presents the univariate analysis of the characteristics of pregnant women
associated with HIV infection or syphilis infection. According to the State regions, the
prevalence of HIV infection ranged from 0.1% to 0.2%; while the prevalence of syphilis
varied from 0.9% to 1.6%. There was no statistical difference from the prevalence of
both infections and the regions. Prevalence of HIV and syphilis increased by age-group;
women at the age-group ≥ 30 years old had 3.3 fold higher prevalence of HIV infection
and 4.7 fold higher prevalence of syphilis compared to the adolescents (12-19 years
old). Self-reported African descendent or mestizo was associated with syphilis infection
but not with HIV infection. HIV infection or syphilis were associated with increased
number of pregnancies.
In the multivariate analysis women at the age group 20-29 years had 2.23 fold risk of
HIV infection (95% CI 1.01-4.94) compared to younger age. Risk factors
independently associated with syphilis were: self-referred as black or biracial ethnicity
and having two to three number of previous gestations compared to the first gestational
86
at the time of the serological screening. Age group of 20-29 years old was an
independent risk factor for syphilis in pregnant women, OR= 2.81 (IC95% 2.13- 3.71)
(Table 2).
Discussion
In the current study, the prevalence of syphilis was around seven fold higher than the
prevalence of HIV infection among approximately 54 thousands pregnant women
attending pre-natal public clinics in central Brazil. Highly populated settings such as the
capital city and surroundings had similar prevalence of HIV infection than less
populated regions pointing out the scatter spatial distribution of this infection and its
spread to in less urbanized within inner Brazil. Syphilis was also scattered distributed
among most regions in this central area.
The prevalence of syphilis and HIV infections in the current study were similar to the
surveillance sentinel study conducted in Brazil [15]. In this setting co-infection of
syphilis among HIV infected women was relatively low around 2%. In the south of
Brazil, a cohort of individuals living with HIV/AIDS the prevalence of syphilis was
20.5%, and this co-infection was highly association among males and MSM, suggesting
unsafe practices [21]. In a representative sample of the Brazilian female population,
higher prevalence of HIV infection have been reported among women enrolled at high
risk behavior groups such as female sex workers (FSW) or drug users [22]. In a
multicentric study among FSWs in 10 Brazilian cities, using Respondent-Driven
Sampling, syphilis was associated with HIV infection [23]. In the USA, HIV infection
among syphilis female patients showed and overall prevalence of 12.4% half of the
detected among the male group (25%). Also higher rates of co-infection were found for
gay sex and intravenous drug users according to the literature review [24]. Therefore, in
most settings higher co-infection rates were reported in men who have sex with men
(MSM) and other high risk group [25, 26]. As expected the rate of HIV and syphilis
varies greatly depending upon the frequency of both infections in the community and
the individual risk factors [27].
One of the limitations of the current study is inherent of the cross-sectional design since
both infections and risk factors were measured at the same point in time. Therefore it is
not possible to determine the time of acquisition of syphilis in relation to HIV infection,
that is, the accurate temporal relationship between both infections. We have established
87
that around 20% of the seropositive pregnant women had acquired HIV infection in the
three months preceding the screening, according to the estimates of recent infection
yielded by STHARS algorithm (BED-CEIA tests). However we were unable to
ascertain whether the women were screened or treated for syphilis before this evaluation
nor the phase of T. pallidum infection since the data corresponded to one point in time
measurement and the follow-up of the infected women was outside the scope of the
current analysis.
We also acknowledge that the investigation of risk factor was limited to few variables
such as age, race/ethnicity, and gestational history due to the large subpopulation
screened (n~52,000) in this screening official program. Nevertheless, our analysis
pointed out that participants self-referred as black or biracial were more prone to have
syphilis compared to the white group and women at young age are at increased risk of
being infected by HIV or syphilis infections compared to adolescent group.
Further studies mapping by county level HIV infection and syphilis prevalence by will
help to visualize the spatial distribution of both infection helping to target preventive
measures. The spatial pattern in the prevalence of HIV and syphilis may help explore
the ecological correlation and causes of disease-specific intersection of both infections
at municipality level as reported by other studies [28].
Approximately 28% of pregnant women had their first screening delayed (beyond 15
weeks of pregnancy), later than the first trimester recommended by the guidelines [10].
Therefore there is much room for improving the early detection and consequent
treatment and prevention of syphilis and HIV infection in this setting.
In conclusion the seroprevalence of syphilis remains unacceptable high, and the
findings of higher risk among back and biracial women should be further explored since
it could be a surrogate marker of socio-economic condition. The rate of co-infection for
HIV-1 and syphilis infections detected corroborate with the general recommendation of
searching for co-infection among HIV/aids or syphilis patients.
88
Acknowledgements
This research was sponsored by Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de Goiás
(FAPEG 008/2009) and the authors’ institutions. We thank our colleagues of Secretariat
of Health and APAE for their support. Martelli CMT and Stefani MMA receive
scholarship – Bolsa de Pesquisa-CNPq (# 306489/2010-4 and # 306928/2010-8).
Martelli CMT is a research member from the National Institute of Science and
Technology for Health Technology Assessment.
Conflict of interest: none declared.
89
Table 1. Association of demographic and gestational factors of pregnant women and HIV-1 and syphilis infections, central Brazil, 2011.
HIV Infection Syphilis
Variables N n (%) OR (95% CI) n (%) OR (95% CI)
Overall 54,139 86 (0.16) 610 (1.21)
Regions
Central-west 23,749 43 (0.1) 1 133 (1.1) 1
Northeast 11,925 16 (0.2) 0.74 (0.40-1.36) 306 (1.3) 1.16 (0.94-1.43)
Central-North 9,473 13 (0.1) 0.76 (0.39-1.40) 88 (0.9) 0.83 (0.63-1.10)
Southeast 3,989 4 (0.1) 0.55 (0.17-1.61) 51 (1.3) 1.15 (0.82- 1.61)
Southwest 5,003 10 (0.2) 0.11 (0.52-2.28) 82 (1.6) 1.48 (1.01- 1.97)
Age, years
12-19 14,154 10 (0.7) 1 79 (0.6) 1
20-29 29,349 51(1.7) 2.46 (1.21-5.16) 314 (1.1) 1.93 (1.49-2.49)
≥ 30 10,636 25 (2.3) 3.33 (1.53-7.42) 267 (2.5) 4.59 (3.54-5.95)
Ethnicitya
White 16,486 20 (1.2) 1 142 (0.9) 1
Biracial/Black 31,923 54 (1.7) 1.40 (0.81-2.41) 432 (1.3) 1.58 (1.30-1.92)
No of pregnanciesb
First 21,625 20 (0.9) 1 137 (0.7) 1
2–3 23,071 42 (1.8) 1.97 (1.13-3.47) 270 (1.2) 1.86 (1.50-2.30)
≥ 4 6,628 22 (3.3) 3.60 (1.89-6.86) 219 (3.3) 5.36 (4.30-6.69)
Gestational age, weeksc
≤14 35,167 47 (1.3) 1 408 (1.2) 1
>15 15,375 31(2.0) 1.51 (0.94-2.43) 209 (3.0) 1.17 (0.99-1.39) a Missing data = 5730 b Missing data = 2815 c Missing data = 3597
90
Table 2. Multivariate analysis of demographic and gestational characteristics of pregnant women associated with HIV-1 and syphilis infections, central Brazil, 2011
Hiv Infection
Adjusted (OR 95% CI) Syphilis
Adjusted OR (95% CI)
Age, years
12-19 1 1
20-29 2.23 (1.01-4.95) 2.81 (2.13- 3.71)
≥ 30 1.16 (0.71-1.99) 1.92 (1.62- 2.28)
Ethnicitya
White 1 1
Biracial/Black 1.80 (0.88-3.72) 1.51 (1.15-2.00)
No of pregnanciesb
First 1 1
2–3 1.30 (0.30-5.58) 1.70 (1.16-2.51)
≥ 4 2.56 (0.64-10.64) 1.15 (0.79-1.66)
Gestational age, weeksc
≤14 1 1
>15 1.29 (0.46-3.62) 1.69 (0.15-2.48)
91
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94
5. CONCLUSÕES
1. A estimativa da incidência da infecção do HIV-1 obtida pelo algoritmo de
testagem sorológica para diagnóstico de soroconversão recente em
estudos seccionais foi de 4.7 gestantes recém-infectadas por 10.000
mulheres testadas por ano no estado de Goiás. A alta proporção de
infectadas recentes (~20%) entre gestantes soropositivas indica elevada
taxa de transmissão do HIV-1 em mulheres jovens em fase reprodutiva,
servindo de alerta para os programas de prevenção e controle do
HIV/aids. Esses resultados estão em consonância com os dados de
vigilância da infecção recente nos países com epidemia concentrada do
HIV.
2. A alta taxa de mutações de resistência transmitida nas gestantes de
Goiás com detecção de mutações para uma ou duas classes de
antirretrovirais indica a importância dos testes de genotipagem na
gravidez para direcionar o melhor esquema profilático para a
transmissão vertical do HIV-1. A alta frequência do HIV-1 subtipo C
encontrada nas gestantes corrobora sua interiorização e disseminação
por transmissão heterossexual no centro-oeste brasileiro.
3. A alta prevalência de sífilis detectada (1,2%) em gestantes ressalta a
importância da triagem pré-natal dessa infecção na prevenção da
transmissão vertical e como estratégia de eliminação da sífilis congênita.
Mulheres jovens e da raça negra ou parda apresentaram as maiores
taxas de prevalência de sífilis sinalizando um grupo potencial de risco
para a aquisição da infecção, regionalmente. A magnitude da infecção
pelo T. pallidum foi seis vezes maior que a prevalência da infecção pelo
HIV (0,2%) nas gestantes do estado de Goiás. A frequência de
coinfecção pelo T. pallidum em gestantes HIV positivas foi menor que a
registrada para outros grupos populacionais considerados de maior risco
para aquisição de ambas DSTs.
95
6. RECOMENDAÇOES
1. Consolidar e manter programas de saúde pública que assegurem o
rastreamento pré-natal que permita o diagnóstico precoce de casos de
infecção pelo HIV-1 e pelo T. pallidum em mulheres assintomáticas
viabilizando a rápida implementação das medidas preventivas para
transmissão vertical e transmissão horizontal dessas infecções.
2. Rápida realização de testes de genotipagem nas gestantes recém-
diagnosticadas uma vez que o sexo desprotegido com parceiros
infectados em uso irregular de drogas antirretrovirais aumenta o risco de
resistência transmitida.
3. O estudo reforça o potencial de se incorporar a metologia STARHS em
Programas de triagem pré-natal de ampla cobertura, para estimar novas
infecções pelo HIV (incidência) de forma sistemática e estabelecer a
dinâmica de infecção pelo HIV-1, no intuito de monitorar a ocorrência de
infecções recentes em séries temporais, regionalmente.
96
7. REFERÊNCIAS
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ANEXOS
Anexo 1 – Protocolo CEPMHA/HC/UFG Nº 174/08
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Anexo 2 – Incidência pelo teste do BED-CEIA e Fórmulas de Ajuste Símbolos das variáveis: Valores calculados: I = Incidência (número de novas infecções por ano por 100 pessoas expostas) F = Fator de ajuste de acordo com sensibilidade/especificidade do teste Valores medidos no estudo transversal: T = total de pessoas na amostra P = total de indivíduos HIV positivos N = total de indivíduos HIV negativos R = total de indivíduos com infecção recente pelo teste BED-CEIA Valores definidos a partir de estudos independentes de calibração: w = janela em dias (duração máxima da soropositividade nos testes recentes) α = sensibilidade do teste BED-CEIA para detecção de infecção recente (< w) β = especificidade do teste BED-CEIA ao longo do período > w e < 2w γ = especificidade do teste BED-CEIA ao longo do período > 2w ε = taxa de falsos recentes em indivíduos com infecção de longa data (> 2w) NOTA: ε = (1 – γ) e γ = (ε – 1) Fórmula de Incidência não-ajustada (por ano): I = (365/w) R x 100 N + (365-w) (R/2) Ajuste por Sensibilidade/Especificidade (McDougal, 2006):
1. Cálculo do Fator de Correção F: F = (R/P) + γ – 1 (R/P) (α – β + 2γ – 1)
2. Multiplicar R na fórmula de incidência por F:
I = (F) (365/w) R x 100
N + (F) (365/w) (R/2)
Ajuste por Especificidade (Hargrove, 2008): I = R – εP x 100 (R/2) + N(w/365) – εN – ε(P/2) Nota: Os valores considerados para as variáveis são baseados na análise de 2532 amostras de 1192 indivíduos com data de soroconversão conhecida (aproximada). Como estabelecido em 2006, os valores são: w = 155 dias; α = 0.7682; β = 0.7231; γ = 0.9443; ε = 0.0557.
