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MiSeqを使用した研究計画のご提案
小林 孝史 (Takafumi KOBAYASHI, PhD)
イルミナ株式会社テクニカルサポート
Email:[email protected]
2
MiSeqとは？
イルミナ社のデスクトップ型の
次世代シーケンサー（NGS）
1 ng~1 µgのDNA(RNA)サンプルから調製したライブラリ
最大8Gbases(8,000,000,000bases)の塩基が解析可能！ 2012年11月時点、（予定）来年にはさらに大きなアウトプット
3
MiSeqを使用した実験
DNAサンプルの準備と、解析するDNAライブラリーの作製
Illumina Experiment Manager (IEM)を用いた
サンプルシートの作成
MiSeqによるデータ取得
MiSeq Reporterによるデータ解析
4
今回のセミナーの内容
MiSeq解析の技術的な手法について今回はご説明しません：
Sequence-By-Synthesis法（SBS）を用います。
過去のウェビナーをご参考ください。
http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn
今回のセミナーでは、Illumina Experiment Manager (IEM)の
それぞれのワークフローに沿って、
1) MiSeqによる解析でどのような実験が可能なのか？
2) 解析により得られるデータはなにか？
3) 解析の際の注意点は？
の３つについてご説明します！
5
Illumina Experiment Manager (IEM)とは？
IEM: Illuminaが開発いたしましたMiSeqを用いた実験のデザインを作成できるソフトウェア
→それぞれの実験デザインに従ってサンプルシートを作成する。
過去のウェビナーをご参考ください。
http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn
6
MiSeqで検討いただけるさまざまな実験のワークフロー
MiSeqと
Illumina Experimental Manager
とMiSeq Reporterを使えば
こんなにたくさんの実験が可能に！
7
MiSeqで可能な実験のワークフロー：
RNA
DNA
8
MiSeqで可能な実験のワークフロー Small Genome Sequencing
RNA
DNA DNA
9
多サンプル解析が可能
ゲノムサイズの大きさ
DNAのシーケンス解析の例
スモールゲノムシーケンシング
・De novo アッセンブリー
・リシーケンシング
ターゲットリシーケンシング
・TruSeq/Nextera Enrichment
・TruSeq Amplicon
・Nextera XT
10
MiSeqで可能な実験のワークフロー Assembly
RNA
DNA DNA
11
De novo アッセンブリ−とは？
– 参照配列を使用せずにデータをつなぎ合わせて配列を解析すること。
– 小さいゲノム(<10 Mb) を持つ生物種に有効
大腸菌（Esherichia coli）
ウイルス
応用例
– 微生物やウイルスの全配列を決定する
– 微生物やウイルスのエキソーム解析
– 全配列が明らかにされていない生物の配列
– BAC/YAC スクリーニング
– 相同性組み替え、挿入配列、欠失配列などの解析
スモールゲノムシーケンス – De novoアッセンブリ−
スモールゲノムシーケンシング
・De novo アッセンブリー
・リシーケンシング
12
実験から得られる生データ
– データをつなぎ合わせた微生物の全ゲノム配列のファイル
(contigのFASTAファイル)
– 同定された配列と既知の生物のゲノム配列との比較
スモールゲノムシーケンス – De novoアッセンブリ−
Protocol サンプル調製キット 必要なDNA量 解析モード
TruSeq DNA sample prep 1 µg ゲノムDNA
De novo Nextera DNA sample prep 50 ng ゲノムDNA
Nextera XT sample prep 1 ng ゲノムDNA
13
注意点
– サイズの大きい生物種に関しては検討が必要（MiSeq解析のデータ量は8Gbases)
線虫（Ceanorhabditis elegans）の全ゲノム配列の決定(100 Mbases)：大きすぎ
出芽酵母 (Saccharomyces cerevisiae)の全ゲノム配列の決定(12.1 Mbases)：やや大きい
大腸菌（Esherichia coli）の全ゲノム配列の決定（4.6 Mbases）：解析可能
– データベースなどから取得する参照配列は（基本的に）不必要
参照先に指定することも可能→長い挿入配列や欠失の解析が容易になる
– MiSeqに付設のMiSeq Reporter (MSR)でつなげあわせた配列を作成
– 他のデータ解析ツールを使用する前に大まかにデータ解析ができる
– ただし、複数のRunのデータをMSRで使用することはできない
スモールゲノムシーケンス – De novoアッセンブリ−
14
MiSeqで可能な実験のワークフロー Resequencing/Plasmids
RNA
DNA DNA
15
リシーケンシングとは？
– データベースなどの既知の配列情報をもとに解析
– 小さいゲノムサイズの生物種(≤ 250 Mbases)に最適
ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster） : ~120 Mbases
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）: ~115 Mbases
線虫（Caenorhabditis elegans）: ~100 Mbases
菌類: ~ 30 Mbases
酵母: ~ 12 Mbases
バクテリア: 0.5-10 Mbases
ウイルス: 3 kbases-1.3 Mbases
応用例
– SNP解析
– De novo アセンブリデータの確認
(contigのFASTA配列の確認)
– 網羅的な挿入・欠失配列の同定
リシーケンシング – 全ゲノム配列のシーケンシング(WGS)
スモールゲノムシーケンシング
・De novo アッセンブリー
・リシーケンシング
16
実験から得られる生データ
– bamファイルとvcfファイル
– SNPの解析と、挿入・欠失配列の解析
Protocol サンプル調製キット 必要なDNA量 解析モード
TruSeq DNA sample prep 1 µg ゲノムDNA
Resequencing Nextera DNA sample prep 50 ng ゲノムDNA
Nextera XT sample prep kit 1 ng ゲノムDNA
リシーケンシング – 全ゲノム配列のシーケンシング(WGS)
17
注意点
– 「参照する配列のデータ」が必要
– サンプルの生物種のゲノムサイズを確認する
– 同じ配列を何回読めばよいか（カバレッジ）？
– MiSeqで取得できる最大のデータ量は8 Gbases！
265Mbasesのゲノムサイズを~30xのカバレッジで解析できる
ヒトゲノムを2.4xのカバレッジで解析できる
リシーケンシング–全ゲノム配列のシーケンシング(WGS)
http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_coverage_calculation.pdf
18
MiSeqで可能な実験のワークフロー Targeted Sequencing
RNA
DNA DNA
19
ターゲットReseq – ターゲット配列の大きさとカバレッジ
多サンプル解析が可能
ゲノムサイズの大きさ
スモールゲノムシーケンシング
・De novo アッセンブリー
・リシーケンシング
ターゲットリシーケンシング
・TruSeq/Nextera Enrichment
・TruSeq Amplicon
・Nextera XT
20
ターゲットReseq – ターゲット配列の大きさとカバレッジ
TruSeq/Nextera Enrichment
TruSeq Amplicon
Nextera XT
ターゲット配列の大きさ
カバレッジ数
21
MiSeqで可能な実験のワークフロー Targeted Sequencing
RNA
DNA DNA
22
TruSeq Enrichmentに適した実験とは？
– ヒトゲノムの目的の一部の配列を解析する
– TruSeq DNA kitで作製されたライブラリを解析する (TruSeq DNA kitが必要)
– ビーズ精製により目的の領域を回収する
– プローブに結合するビーズはTruSeq Exome kit あるいはTruSeq Custom
Enrichment kitsに含まれる
応用例
– 変異解析、バリデーション、スクリーニング
– Design Studioで作成したプローブを用いる
TruSeq Exome Enrichment = Illuminaで設計済み
TruSeq Custom Enrichment = ご自身で設計
ターゲットリシーケンス–
TruSeq Exome/Custom Enrichment (数千ターゲットに適応)
23
実験から得られる生データ
– SNP情報、小さい挿入・欠失配列
– ゲノムの一部に集中した配列情報
62 Mb （exome enrichment）
700 Kb – 15 Mb （custom enrichment）
– 参照するゲノム配列が必要 (ヒトゲノム)
Protocol 使用するkit 必要なDNA量 解析モード
TruSeq DNA sample prep +
TruSeq Exome Enrichment 1µg ゲノムDNA/サンプル Enrichment
TruSeq DNA sample prep +
TruSeq Custom Enrichment
ターゲットリシーケンシング–
TruSeq Exome/Custom Enrichment (数千ターゲットに適応)
24
Nextera Exome / Custom Enrichmentに適した実験とは？
– ヒトゲノムの一部の配列を解析する
– Nextera kitで作製したライブラリを解析する
– ビーズ精製により目的の領域を回収
– Nextera Exome / Custom Enrichment kitsだけあれば解析可能！
応用例
– 変異解析、バリデーション、スクリーニング
– Design Studioで作成したプローブを使用
Nextera Exome Enrichment = Illuminaで設計済み
Nextera Custom Enrichment = ご自身で設計
ターゲットリシーケンシング–
Nextera Exome/Custom Enrichment (数千ターゲットに適応)
25
実験から得られる生データ
– SNP情報、小さい挿入・欠失配列
– ゲノム中の目的の配列情報のみ解析
62 Mb （exome enrichment）
500 Kb – 25 Mb （custom enrichment）
– 参照配列が必要 (ヒトゲノム)
Protocol 使用するkit 必要なDNA量 解析モード
Nextera Exome Enrichment 50 ng DNA/サンプル Enrichment
Nextera Custom Enrichment
ターゲットリシーケンシング–
Nextera Exome/Custom Enrichment (数千ターゲットに適応)
26
注意点
– 現在はヒトゲノム由来のサンプルにのみ対応
– カバレッジ– 何回同じ配列を解析するか？
62 Mbases をexome enrichmentで解析 = 130xカバレッジ
25 Mbases – 500 Kbases をcustom enrichmentで解析 = 320x–16,000xカバレッジ
FASTQ配列のみ得られる
– 付属のMiSeq Reporterにより配列比較が可能
参照配列かNextera用のマニフェスト配列が必要
ターゲットリシーケンシング– TruSeq/Nextera Exome or Custom Enrichment (数千ターゲットに適応)
http://www.illumina.com/documents//products/technotes/technote_optimizing_coverage
_for_targeted_resequencing.pdf
27
MiSeqで可能な実験のワークフロー TruSeq Amplicon
RNA
DNA DNA
28
TruSeq Ampliconとは？
– Extension-ligationを介して目的のターゲット領域を解析
– Design Studioを使用してプローブ領域を設計する
TruSeq Custom Amplicon (TSCA)：ご自身で設計
TruSeq Amplicon Cancer Panel (TSACP) ：Illuminaが設計
– ターゲット領域のみ配列比較が可能
（全ゲノム領域ではない）
Design Studioでマニフェストファイルを作成
応用例
– 変異解析、バリデーション、スクリーニング
– ターゲットとなる目的の小さい領域へのアプローチが可能
ターゲットリシーケンシング–
TruSeq Amplicon (数十〜百ターゲットに適応)
29
実験から得られる生データ
– SNP情報、小さい挿入・欠失配列
– ゲノム中の小領域(12 – 650 Kbases)にターゲットを絞る
(48 – 1536アンプリコン)
96サンプル中にそれぞれ48アンプリコン ~ 平均7000xカバレッジ
24サンプル中にそれぞれ1536アンプリコン~ 平均500xカバレッジ
96サンプル中にそれぞれ1536アンプリコン~ 平均130xカバレッジ
Protocol 使用するキット 必要なDNA量 解析モード
TruSeq Custom Amplicon
(TSCA) 150-250 ng DNA
/サンプル
Custom
Amplicon
TruSeq Amplicon Cancer
Panel (TSACP)
ターゲットリシーケンシング–
TruSeq Amplicon (数十〜百ターゲットに適応)
30
考察
– PCRアンプリコンのシーケンス方法とは異なる
– 現在はヒト、ラット、マウス、 ウシに対応
– ターゲット配列は150bp, 175bp, 250bp or 425bp
– Design Studioを用いたサンプル調製を想定
– 配列比較と変異解析にはMiSeq Reporter (MSR)でマニフェストファイルが必要
– データはAmplicon Viewerにてご自身のPCで参照可能
ターゲットリシーケンシング–
TruSeq Amplicon (数十〜百ターゲットに適応)
31
MiSeqで可能な実験のワークフロー PCR Amplicon
RNA
DNA DNA
32
Nextera XTとは？
– PCRアンプリコン特異的な方法
Small genomeとプラスミドに適応可能
– 超微量サンプル(1 ng)から解析可能
応用例
– 集団遺伝学解析
– 血清中のウイルスの量や種類の同定
– 高スループットの薬剤スクリーニング
– ノックアウトスクリーニング
– FFPEサンプルや凍結した癌組織の解析
– 大きな容量のサンプルからのジェノタイピング
ターゲットリシーケンシング–
Nextera XT (複数のターゲットに対応)
33
実験から得られる生データ
– SNPや小さい挿入・欠失配列の同定
– 全ゲノム配列ではなく、目的の配列のみと配列比較
マニフェストファイル –Illumina Experiment Manager (IEM)で設計
Protocol サンプル調製キット 必要なDNA量 解析モード
Nextera XT sample prep 1 ng PCR Amplicon
ターゲットリシーケンシング–
Nextera XT (複数のターゲットに対応)
34
考察
– PCRアンプリコンを使用する際には300 bp以上の長さが必要
– 最適なPCR ampliconの長さは >2000 bp
– Bulletinを参照: How to use Nextera XT with PCR Amplicons
https://icom.illumina.com/MyIllumina/Bulletin/kTtc2xXyKk6ju9Z4jcB2Rw/how-to-use-
nextera-xt-with-pcr-amplicons
– Nextera XTライブラリはReadのはじめに配列の多様性の高い塩基を含む必要
下記リンクを参照:
https://icom.illumina.com/MyIllumina/Bulletin/cC6za4-hLEmpi09-IUBi_w/how-can-i-
improve-the-data-quality-of-my-pcr-ampli
ターゲットリシーケンシング–
Nextera XT (複数のターゲットに対応)
35
MiSeqで可能な実験のワークフロー Clone Checking
RNA
DNA DNA
36
Clone Checkingとは？
– プラスミドやベクターの配列を解析する
– PCR産物やプラスミドDNAの調製が必要
応用例
– 変異解析
– プラスミドやベクターのインサート配列の解析
– 形質転換や導入効率のチェック
ターゲットリシーケンシング– Clone Checking
37
実験から得られる生データ
– 標的サンプルのFASTQ配列
– MiSeq Reporter (MSR) で参照配列との比較と変異解析
bamファイルとvcfファイル
Protocol 使用するkit 必要なDNA量 MiSeq reporterのモー
ド
Nextera XT sample prep 1 ng DNA Clone checking
(FASTQ)
ターゲットリシーケンシング– Clone Checking
38
注意点
– 配列比較や変異解析のためにはデータベースなどから参照配列（FASTAファイル）が必要
– どれほどのカバレッジが必要か？
– 多サンプル解析での解析が可能か?
ターゲットリシーケンシング– Clone Checking
39
MiSeqで可能な実験のワークフロー Metagenomics 16S rRNA
RNA
DNA DNA
40
16Sメタゲノミクスとは？
– 環境サンプルから直接DNAを回収して微生物の解析を行う
– 16S rRNA配列から多様性のプロファイルを解析
応用例
– 環境試験
– 動物の検査
– プラスミド
ターゲットリシーケンシング– 16S Metagenomics
http://www.illuminakk.co.jp/document/pdf/
publication_metagenome-j.pdf
41
実験から得られる生データ
– 解析された配列により下記の分類学的なクラスを同定できる
界（Kingdom）
門（Phylum）
綱（Class）
目（Order）
科（Family）
属（Genus）
ターゲットリシーケンシング– 16S Metagenomics
Protocol サンプル調製キット 必要なDNA量 解析モード
TruSeq DNA sample prep - 16S
Metagenomics Nextera DNA sample prep -
42
注意点
– サンプル調製の方法についてIllumina公式のプロトコールはございません
– 過去の論文データを参照ください（先ほど紹介いたしました冊子に掲載）
Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, Berg-Lyons D, Lozupone CA,et al.
(2011) Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences
per sample. Proc Natl Acad Sci USA 108:4516–4522.
Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, Berg-Lyons D, Huntley J, et al. (2012)
Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and
MiSeq platforms. The ISME Journal 1-4
– 多様性のないサンプル
データのクオリティーを上げるためにPhiX(目安として30-50%)を加えることを検討
ターゲットリシーケンシング– 16S Metagenomics
43
MiSeqで可能な実験のワークフロー
Others
RNA
DNA
44
MiSeqで可能な実験のワークフロー
ChiP Seq
RNA
DNA
45
ChiP DNAシーケンシングとは？
– クロマチン共沈法(ChiP)で回収されたDNAをシーケンスする方法
応用例
– タンパク質-DNA結合を解析する:
転写因子
ポリメラーゼ
ヒストンなどの構造タンパク質
ChIP DNA-Seq
46
実験から得られる生データ
– FASTQファイル (ほかのツールでの解析)
Protocol サンプル調製キット 必要なDNA量 解析モード
TruSeq ChIP 5 – 10ng ChIP-Seq
ChIP DNA-Seq
47
注意点
– 以前Illuminaで提供していたChIP-Seqサンプル調製プロトコールは
MiSeqでサポートされていない
– 現在提供のTruSeq ChIP-Seqサンプル調製プロトコールはMiSeqをご使用可能
– MiSeq Reporter (MSR) ChIP-SeqワークフローではFASTQファイルのみ取得
配列比較が不可能
変異体解析が不可能
– 上記の配列比較にはサードパーティーツールが必要
ChIP DNA-Seq
48
MiSeqで可能な実験のワークフロー
Library QC
RNA
DNA
49
ライブラリーQCとは？
– HiSeqなどを用いて大規模解析を行う前にライブラリーの質をチェックする
応用例
– お手持ちのライブラリの量、断片長, ミスマッチの割合、
配列の多様性のチェック
– 大規模実験に移る前にサンプル調製の効率をチェックする
（時間と材料の節約、効率化）
– クラスター形成効率をお手持ちのサンプルで確認する
Library Quality Control (QC)
50
実験から得られる生データ
– アライメントの割合（%）
– ミスマッチの割合（%）
– 重複するPCR断片(PCR duplicate)の割合
– 配列の多様性
– 断片長
– 多サンプル解析が可能なサンプルの割合（％）
– インデックスの量
Library Quality Control (QC)
Protocol サンプル調製キット 必要なDNA量 解析モード
TruSeq kit
あるいは Nextera kit 目的により異なります LibraryQC
51
MiSeqで可能な実験のワークフロー
FASTQ Only
RNA
DNA
52
たとえば
– DNAのメチル化状態を調べる
Whole‐Genome Bisulfite Sequencing [WGBS]
Methylation-sensitive enzymatic digestion experiments (e.g. Reduced
Representation Bisulfite Sequencing [RRBS])
Aza-labeled DNA
応用例
– 目的のDNAのメチル化状態について解析（経時的変化なども）
MyIllumina内の下記のリンクを参照ください
https://icom.illumina.com/download/summary/3xkQCsK7KUane-IlxkVdXg
その他のモード
– DNAメチル化解析 (バイサルファイトシーケンシング)
53
実験から得られる生データ
– FASTQファイル：サードパーティーツールで解析可能
その他のモード
– DNAメチル化解析 (バイサルファイトシーケンシング)
Protocol サンプル調製キット 必要なDNA量 解析モード
RRBS Paired‐End Sample Prep Kit * 2-5 µg DNA FASTQ only
WGBS TruSeq DNA sample prep * 5 µg DNA
* 追加のキットや試薬が必要です。
イルミナでMiSeqを用いて検証したプロトコールですが、サポートは行っておりません。ご理解の上、お試しください（先ほどご紹介いたしました資料を参照ください）。
54
注意点
– MiSeq Reporter (MSR)はバイサルファイト処理したDNAの解析に非対応
– 従って、得られたFASTQファイルをサードパーティーツールで解析
– サンプルの多様性が低い場合はPhiXのスパイクインを試す
– MiSeqにより得られる最大データ量が8Gbasesであることを考慮して
カバレッジを計算する。
その他の情報は弊社Websiteでもございます。
http://www.illuminakk.co.jp/applications/epigenetics/sequencing_based_methylation_analysis.ilmn
その他のモード
– DNAメチル化解析 (バイサルファイトシーケンシング)
55
MiSeqで可能な実験のワークフロー
RNA
RNA
DNA
56
MiSeqで可能な実験のワークフロー
RNA
RNA
DNA
57
Small RNAシーケンシングとは？
– Dicer/Droshaで修飾されたmiRNA
– サンプル調製キットに用いるTotal RNAあるいは精製したSmall RNAが必要
– 全ての哺乳動物に適応可能
応用例
– Small RNAの定量解析・同定
– 遺伝子制御
– 薬剤のスクリーニング
RNA – Small RNAシーケンシング
Drosha/Dicer diagrams from: Barbara Weber, Carlo Stresemann, Bodo
Brueckner, Frank Lyko*. Methylation of Human MicroRNA Genes in Normal
and Neoplastic Cells. Cell Cycle 6:9, 1001-1005, 1 May 2007
58
実験から得られる生データ
– FASTQファイル
– 既知のヒトmiRNAとの配列比較
– ヒット数の高い配列情報
– 分解産物のコンタミネーションの割合
(small RNA、mRNA、ゲノム配列、ミトコンドリアの配列の割合)
RNA – Small RNAシーケンシング
Protocol サンプル調製キット 必要なRNA量 解析モード
TruSeq Small RNA 10-50 ng small RNA
1 µg total RNA Small RNA
59
注意点
– 多サンプル解析が可能か？ (１サンプルにどれだけのデータが必要か？）
– サンプルがヒト由来でない場合、
FASTQファイルを解析するためのどのサードパーティーツールを使用するか？
– 哺乳動物以外のSmall RNAサンプルにも適応可能
TruSeq Small RNA kitがお手持ちのサンプルに使用可能か？
MiSeq Reporter (MSR)だけでは解析を最後まで行うことが出来ない。
しかしFASTQファイルを作成することができる→サードパーティーツールの使用
RNA – Small RNAシーケンシング
60
MiSeqで可能な実験のワークフロー
RNA
RNA
DNA
61
mRNAシーケンシングとは？
– 遺伝子の発現を解析するためmRNA配列
– アレル特異的な発現を解析する
応用例
– 遺伝子発現解析
– トランスクリプトーム解析
– バイオマーカーの特定
– 腫瘍プロファイル
– 薬剤のスクリーニング
RNA – mRNAシーケンシング
62
実験から得られる生データ
– FASTQファイル：サードパーティーツールで解析可能
RNA – mRNAシーケンシング
protocol サンプル調製キット 必要なRNA量 解析モード
TruSeq RNA sample prep 0.1 - 4 µg total RNA
10 - 400 ng mRNA
RNA-Seq TruSeq Stranded mRNA 0.1 – 4 µg total RNA
TruSeq Total RNA 0.1 – 1 µg total RNA
(FFPE / degradation)
63
注意点
– MiSeq ReporterのRNA-SeqモードではFASTQファイルのみ作成
– MiSeq Reporterではサンプルの種類を判別できない
– MiSeq Reporterでの配列比較ではexonとexonの境界配列に関しては、
解析が不可能
– FASTQファイルを解析するためにどのサードパーティーツールを使用するか？
– 実験にどれだけのデータ量・カバレッジが必要か？
MiSeqのデータだけでは、mRNAや転写物の量の小さな変化を解析することが困難
どれだけのリード長が最適か？
シングルエンド・ペアドエンドのどちらを使用するか？
RNA – mRNAシーケンシング
64
ご質問を受け付けます！
RNA
DNA
65
参考資料（後にHP上にアップします）
•MyIllumina: https://icom.illumina.com/Home/Index
•サポートトレーニング: http://www.illuminakk.co.jp/support/training.ilmn
•ウェビナー: https://my.illumina.com/Webinar/Index（英語）
https://my.illumina.com/Webinar/Archives（英語：過去のレコーディング）
http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn（日本語） 発表中に使用した資料:
•カバレッジ関連
•http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_coverage_calculation.pdf
•http://www.illumina.com/documents//products/technotes/technote_optimizing_coverage_for_ta
rgeted_resequencing.pdf
•Nextera XT for PCR Amplicons
https://icom.illumina.com/MyIllumina/Bulletin/cC6za4-hLEmpi09-IUBi_w/how-can-i-improve-
the-data-quality-of-my-pcr-ampli
•PCR Amplicon関連
https://icom.illumina.com/MyIllumina/Bulletin/cC6za4-hLEmpi09-IUBi_w/how-can-i-improve-
the-data-quality-of-my-pcr-ampli
•16S rRNAメタゲノム関連
http://www.illuminakk.co.jp/document/pdf/publication_metagenome-j.pdf
DNAメチル化関連
http://www.illuminakk.co.jp/applications/epigenetics/sequencing_based_methylation_analysis.il
mn
