MIKROTEKNIK PEMBUATAN PREPARAT SAYATAN ORGAN HEWAN (HATI MENCIT ) DENGAN METODE

PARAFIN

BY, RIA ANDARINI (F16111006)

A. PENDAHULUAN

TUJUANTUJUAN

1. UNTUK MENGETAHUI PEMBUATAN PREPARAT DENGAN METODE

PARAFIN HEWAN 2. UNTUK MENGETAHUI STRUKTUR

JARINGAN HEWAN

1. UNTUK MENGETAHUI PEMBUATAN PREPARAT DENGAN METODE

PARAFIN HEWAN 2. UNTUK MENGETAHUI STRUKTUR

JARINGAN HEWAN

METODE PARAFIN

Metode paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode paraffin. (Dasumiati , 2008).

Kelebihan-kelebihan dari metode parafin, yaitu irisan dapat jauh lebih tipis,tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron.Kelemahan dari metode parafin, yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah.

Metode paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode paraffin. (Dasumiati , 2008).

Kelebihan-kelebihan dari metode parafin, yaitu irisan dapat jauh lebih tipis,tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron.Kelemahan dari metode parafin, yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah.

TEKNIK DASAR DALAM METODE PARAFIN

Pembiusan (Nacrose)Proses pembiusan tergantung pada jenis hewan yang akan diambil jaringannya. Pembius yang biasa digunakan : Eter, Kloroform, Aseton, Prokain, Morfin dan Metana

Pengambilan Tisu (Diseksi)Dilakukan proses pembedahan bagian tubuh hewan yang akan dibuat jaringan dengan alat bedah.

Fiksasi (Fixation)Tujuan dari fiksasi adalah untuk mempertahankan morfologi sel seperti semula, untuk mencegah terjadinya otolisis, dan untuk mencegah pertumbuhan bakteri atau jamur. Fiksasi tergantung pada daya penetrasi dan ketebalan jaringan. Larutan fiksatif yang digunakan ada dua :

a.Fiksatif tunggal (formalin, alkohol, asam asetat dan asam pikrat)b.Fiksatif majemuk (Bouin, Formol, FAA,dll).

Pembiusan (Nacrose)Proses pembiusan tergantung pada jenis hewan yang akan diambil jaringannya. Pembius yang biasa digunakan : Eter, Kloroform, Aseton, Prokain, Morfin dan Metana

Pengambilan Tisu (Diseksi)Dilakukan proses pembedahan bagian tubuh hewan yang akan dibuat jaringan dengan alat bedah.

Fiksasi (Fixation)Tujuan dari fiksasi adalah untuk mempertahankan morfologi sel seperti semula, untuk mencegah terjadinya otolisis, dan untuk mencegah pertumbuhan bakteri atau jamur. Fiksasi tergantung pada daya penetrasi dan ketebalan jaringan. Larutan fiksatif yang digunakan ada dua :

a.Fiksatif tunggal (formalin, alkohol, asam asetat dan asam pikrat)b.Fiksatif majemuk (Bouin, Formol, FAA,dll).

Pencucian (Washing)Proses ini dilakukan sebelum dan sesudah fiksasi serta setelah Staining. Terdiri dari 3 bentuk pencucian, antara lain : pembilasan (Rinshing), Pencucian (Washing) dan Pencelupan (Soaking). Umumnya dilakukan dengan air mengalir atau alkohol.

Dehidrasi (Dehydration)Proses mengeluarkan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidran yang dapat digunakan : alkohol, dioksan, aniline oil atau bergamot oil.

Penjernihan (Clearing)Proses menggantikan tempat alkohol dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih. Jenis penjernih yang dapat digunakan : Minyak Anilin, Benzene, Karbon Tetraklorida, Karbon Bisulfida, kloroform, Minyak Cengkeh, dan Xylol.

Infiltrasi (Infiltration)Proses menyusupkan

media penanaman ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih. Dengan menggunakan parafin dan dilakukan dalam oven 58 0C.

Lanjutan..............

Penanaman (Embedding)Proses memasukkan

atau menanam jaringan ke dalam blok-blok parafin (cetakan) sehingga memudahkan pada proses sectioning dengan bantuan mikrotom

Penyayatan (Sectioning)Proses penyayatan

yang menghasilkan sayatan jaringan tipis dengan menggunakan mikrotom, kuas bulu kuda/bulu unta, spatula, pinset, skalpel, akuades, hot plate. Mikrotom terdiri dari 3 bentuk : putar, sorong dan beku.

Afiksing (Afixing)Proses perlekatan atau

penetapan sayatan jaringan pada

kaca preparat dengan bantuan media perekat tertentu. Perekat yang digunakan ialah albumin dan aquades.

Deparafinasi (Defaraffination)

Proses menghilangkan sisa dari parafin yang melekat baik pada jaringan maupun yang melekat pada kaca preparat. Larutan yang digunakan ialah xylol.

Pewarnaan (Staining)Proses mewarnai

jaringan dengan tujuan agar dapat mempertajam/memperjelas berbagai elemen jaringan terutama selnya sehingga dapat dibedakan melalui mikroskop. Pewarna yang umum digunakan ialah Hematoksilin-Eosin (HE).

Lanjutan......

a. Alat 1. Alat untuk

pemotongan/pengambilan organ (seperangkat alat bedah)

2. Alat untuk infiltrasi parafin (oven, bekker glass,pinset)

3. Alat untuk embedding(pinset,kotak-kotak kecil 1,5 cm x 1,5 cm)

4. Alat untuk sectioning (mikroton dan kuas )

5. Alat untuk affixing (objek glass,pipet tetes, cotton bud dan hot plate)

6. Alat untuk staining/pewarnaan (staining jar,kertas label dan tissue)

7. Alat untuk mounting (cover glass)

8. Alat untuk pengamatan (mikroskop)

b. Bahan1. Organ hewan (hati mencit)2. Kloform atau eter 3. NaCl 0,9 % fisiologis atau

Ringer4. FAA (Formalin alkohol acetid

acid) atau formalin 10 %5. Alkohol 30%, 40%, 50%,

60%, 70%, 80%, 90% dan 96%.

6. Meyer albumin (albumin dan glyserin)

7. Larutan xylol8. Parafin9. Pewarna eosin 10.Pewarna hematoxilin11.Canada balsam

ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN DALAM METODE PARAFIN

CARA KERJA METODE PARAFIN

1. Narkosis/Pembiusan : hewan dibius dengan klorofrom

atau eter, bedah dan ambil organ yang diperlukan.

(organ hati)

2. Pencucian (washing) ; organ tersebut dicuci dengan

larutan NaCl 0,9 % fisiolgis selama 30 menit.

3. Fiksasi : organ dimasukkan kedalam botol-botol film,

kemudian difiksasi dengan larutan FAA atau Formalin

10 % selama 3 jam atau sampai jaringan matang.

4. Dehidrasi : organ tersebut dimasukkan kedalam

alkohol bertingkat yakni 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,

80%, 90%, dan 96% masing-masing 60 menit.

1. Narkosis/Pembiusan : hewan dibius dengan klorofrom

atau eter, bedah dan ambil organ yang diperlukan.

(organ hati)

2. Pencucian (washing) ; organ tersebut dicuci dengan

larutan NaCl 0,9 % fisiolgis selama 30 menit.

3. Fiksasi : organ dimasukkan kedalam botol-botol film,

kemudian difiksasi dengan larutan FAA atau Formalin

10 % selama 3 jam atau sampai jaringan matang.

4. Dehidrasi : organ tersebut dimasukkan kedalam

alkohol bertingkat yakni 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,

80%, 90%, dan 96% masing-masing 60 menit.

Lanjutan.........................

5. Penjernihan (clearing) : organ dimasukan kedalam xylol selama

60 menit hingga kelihatan transparan.

6. Infiltrasi : menyusupkan media penanaman kedalam jaringan.

Media penanaman disimpan di dalam oven bersuhu 58 derajat

celsius. Langkah pada infiltrasi adalah : a. Xylol : parafin (3:1)

selama 15 menit, b. Xylol : parafin (1:1) selama 15 menit, c.

Xylol : parafin (1:3) selama 15 menit.

7. Penanaman (embedding) : disiapkan kotak-kotak kecil (1,5 cm x

1,5 cm), dimasukkan masing-masing organ kedalam kotak-kotak

kecil parafin yang telah disediakan , kemudian dimasukkan

parafin cair setelah itu disimpan kedalam kulkas hingga padat

dan siap disayat selama 15 menit.

8. Penyayatan (sectioning) : Setelah parafin mengeras (beku), dilakukan sectioning (pemotongan) dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan 4-6 m

9. Penempelan (Affixing) :- bersihkan gelas benda dengan alkhol 70% agar bebas lemak - teteskan albumin pada gelas benda , gosok rata-tetesi akuades 1 tetes- letakkan pita sayatan (coupes) diatas akuades- pindahkan gelas benda keatas hot plate dengan suhu 50 derajat celsius , atur posisi organ , biarkan sampai akuades kering.

10. staining:

- Deparafinasi : jaringan dimasukkan kedalam xylol selama 3x2

menit

-Rehidrasi dengan alkhol dari tinggi kerendah (96%, 80%, 70%,

50%, dan 30%) masing-masing sebanyak 10 celupan.

Lanjutan...

Lanjutan....

- cuci dengan air mengalir setelah itu celupkkan kedalam

akuades sebanyak 10 celupan

-warnai dengan hematoksilin dengan 3 celupan , kemudian

cuci dengan air mengalir.cek dibawah mikroskp

- Warnai lagi dengan eosin sebanyak 3 celupan , cuci lagi

dengan air mengalir. Kemudian cek dibawah mikroskop.

- Dehidrasi dengan alkhol bertingkat 70%, 80%, 90% dan

96% masing-masing sebanyak 5 celupan.

- Clearing dengan xylol selama 6 menit.

11.Mounting yaitu menutup preparat dengan canada balsam

dan gelas penutup hindari terbentuk gelembung udara.

12.Pelabelan

13.Periksa dibawah mikroskop

Gambar Litelatur Perparat Hati

Sumber :http://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/CorePages/Liver/liver.htm Sumber : Geneser, finn. 2007. Atlas berwarna histologi.

Batam:Binarupa Aksara

HASIL PENGAMATAN

Perbesaran 4x10Perbesaran 10x10

Perbandingan gambar

Gambar hasil pengamatan Gambar litelatur

Hasil Pengamatan

a

b

c

Keterangan :Perbesaran 10x10a.Vena sentralb.SINUSOIDc.HEPATOSID

Preparat hati disayat secara vertical.Jika di bandingkan dengan litelatur ternyata warna sayatan organ yang didapat dari hasil pengamatan tidak begitu terang Hal ini disebabkan mungkin dalam tahap pembuatan preparat pada waktu staining yaitu pada saat setelah diwarnai esosin perparat sempat mengalami kekeringan dikarenakan pada saat ingin melihat preparat pada mikroskop diperlukan waktu yang lama karena mengantri dan setelah kering prearat sempat direndam kembali pada xylol sehingga warna yang didapat tidak maksimal.

Dan juga mungkin pada saat melakukan penyayatan (Sectioning) sayatan yang dihasilkan terlalu tebal sehingga hasil yang dipereroleh kurang maksimal.Menurut pendapat Kurniawan (2010), bahwa terdapat sebagian organ yang gagal menjadi suatu preparat, hal ini mungkin disebabkan kurangnya ketelitian dan keterampilan pada saat mengiris block parafin saat menggunakan mikrotom, sehingga lembaran pita jaringan yang didapatkan terlalu tebal dan sulit diamati di bawah mikroskop.

PEMBAHASAN

Sekian dan terimakasih..