MMP-2, MMP-8, MMP-9 og TIMP- koncentrationer i den Cervikale Slimprop i forhold til succes ved igangsætning af fødsel.

IndledningDenne Forsknings metodologiske opgaver er lavet ud fra et forskningsår på Gyn/Obst. afd. Y på skejby sygehus: Matrix metalloproteinaser - Er gravide kvinder responderer/non-respondere ved igangsætning af fødslen med fødekapsel. Det er et projekt udgået fra et PhD udført af Cand. Med. PhD. Naja Becher, der har været en stor hjælp i hele processen. Formålet med opgaven var

• At undersøge, om man ved at teste gravide kvinders slimprop forud for igangsætning af fødslen kan udtale sig om, hvorvidt kvinden vil responderer på igangsætningsmetoden eller ej.

• At udforske slimproppens antibakterielle egenskaber, herunder sammenhængen mellem infektion og for tidlig fødsel.

Naja Becher har udviklet metoden til indsamling og ekstraktionen så den endelige fortynding var brugbart på ELISA-kittene. De intakte slimpropper (Cervical Mucus Plug, CMP) er indsamlet af hjælpsomme og opmærksomme jordmødre på fødegangene og de distale prøver er indsamlet af mig under kyndig oplæring af Professor Niels Uldbjerg. Derudover Var Lektor Carl Christian Danielsen, Bindevævsbiologisk afd., Anatomisk Institut min hovedvejleder og fulgte mig gennem analyser og forsøg i forbindelse med Toll-Like receptors (TLR). Bioanalytiker Eva Mikkelsen har udført en kæmpe indsats i forbindelse med Western Blot i forsøget på at at visualisere TLR i CMP. På Y-forskningslab. har jeg udført laboratoriearbejdet, i forbindelse med ekstraktions- og ELISA-processerne, hvor Bioanalytiker Kirsten Zeeberg med entusiasme og godt humør har assisteret og kommenteret. I forbindelse med forskningsåret, har jeg deltaget i Kursus for Stata og PhD-kursus i Biostatistik og det har stillet mig stærkt i forbindelse med at skulle udregne statistiske analyser og opstille grafer.

En STOR og dybfølt TAK til alle der har hjulpet mig eller holdt mig ved godt selskab.

_________________________________________________

Marie Normark Holmgaard

1

Baggrund Igangsætning af fødslen

På skejby sygehus er der 11% af de gravide kvinder der går over termin. Disse kvinder undergår

mekanisk eller medicinsk igangsætning af fødslen, da det er bevist at have maternelle og føtale

konsekvenser. Igangsætningen initierer den inflammatoriske proces der leder op til fødslen. [1]

På skejby sygehus bruges præparatet Cytotec®, tabletter a 50 μg Misoprostol, der er et syntetisk

prostaglandin E1-analog.

Fysiologiske og immunologiske processer ved normal fødsel

Normal fødsel indebærer 3 fysiologiske processer: cervix remodellering, fosterhindesvækkelse og

ruptur og rytmiske kontraktioner.

Cervix

Forandringerne i cervix er afhængig af og underlagt hormonel og immunologisk kontrol.

Immunologisk er det påvist at pro-inflammatoriske cytokin koncentrationer af IL-8, IL-1β, IL-6 og

TNF-α forøges, hvorved bl.a. produktionen af de zink-afhængige proteinaser Matrix

Metalloproteinaser (MMP) forøges og ekspressionen af Tissue Inhibitor of Metalloproteinase

(TIMP) nedreguleres. [2] Kollagenaserne (MMP-8) nedbryder fibrillær og non-fibrillær kollagen.

Gelatinase-A (MMP-2) og Gelatinase-B (MMP-9) nedbryder kollagen type IV, elastin,

proteoglykaner og fibronectin. [3] MMP-8 og -9 secerneres af IL-8 aktiverede neutrofile

granulocytter, der under graviditet og fødsel diffunderer ind i cervix. IL-8 stimuleres af COX2 og

PGE2, der i sig selv enten stimulerer proteinaseprod. direkte eller indirekte via leukocyt influx pga.

øget kar permeabilitet. [2] TIMP er påvist i endothelceller og glatte muskelceller. [4]

Fosterhinder

I fosterhinderne sker der en lignende pro-inflammatorisk proces, hvor cytokin koncentrationen og

dermed MMP-9 forøges. MMP-2 der nævnes som værende et ikke inducerbart enzym forbliver

uændret og TIMP reduceres. [2][5] MMP2 produceres af amnion epitheliale og chorionoidale celler

[6], cervikale fibroblaster og glatte muskelceller. [7]

2

Myometriet

I myometriet resulterer cytokin opreguleringen i COX2 og PGE2 produktion og efterfølgende uterin

kontraktion, samt forøget MMP-9 prod. [2]

MMP MMP transkriptionen påvirkes af bl.a. progesteron, østrogen, glucokortikoider, IL-1,-8, TNF-α og

NO. De opererer ved neutral pH og frigives som latente zymogen former, der aktiveres

ekstracellulært. Ved ikke gravide findes MMP i tre former, som frie molekyler eller i kompleks med

TIMP eller α2-makroglobulin, hvorved den normale balance opretholdes. Ved fødsel ændres disse,

så ECM remodellering og modning af cervix kan foregå. Samlet kollagenkoncentration i cervix er

ved fødslen reduceret til 30% af ikke-gravides. [8]

CMPDisse strukturer og processer er alle i tæt relation

til Slimproppen, en unik viskoelastisk,

fysiologisk og immunologisk struktur, der

secerneres fra de endocervikale krypter. Sekretet

udtamponerer cervix kanalen under graviditet.

Den er en effektiv sterisk og immunologisk

barriere for det intrauterine miljø og er distinkt

forskellig fra ikke-gravid cervix sekret. Den består af en

uterin, acellulær og en vaginal, cellulær del, hvor cellerne hovedsageligt består af neutrofile

granulocytter. De førnævnte inflammatoriske cytokiner er også påvist, men afviger i koncentration

og menes at bliver produceret af fibroblaster og andre immunceller underlagt kontrol af vaginal

mikroflora. MMP-2, -8 og -9 samt TIMP-1 er også påvist og korrelerer stærkt med IL-8 konc. [9,

10]

HypoteseCytotecVi ønsker at undersøge hvorvidt Cytotec behandlingen påvirker CMP i form af MMP-2, -8 -9 og

TIMP-1 og derved afspejler cervix funktionen med øget inflammation hos kvinder der får fødslen

igangsat med Cytotec i forhold til kvinder der går spontant i fødsel.

3

Fig. 1: Biokemisk kaskade involveret i fødselforløbet. [2]

intakt cmp med og uden miso

og herunder også at vurdere om der er forskel på de leukocyt deriverede komponenter (MMP-8 og

-9) og de cervix deriverede komponenter (MMP-2 og TIMP-1)[10]

CMPEn kuriositet er at kun 50% af kvinderne der møder til igangsætning reagerer på medicinsk

igangsætning med Cytotec! Derfor har vi ønsket at undersøge om det var muligt at inddele kvinder

med der kommer til igangsætning ved grav. prolong. i respondere (resp) eller non-respondere (non-

resp) .

Materialer og MetoderDistale CMP lave tabel oversigt over alder, gest.alder, cmpvægt, igangsætningsårsag. )

28 distale CMP er indsamlet i forbindelse med grav. prolong. procedure. Kvinderne havde en

gennemsnitsalder på 31 år (min-max: 26-39) 16 kvinder fik foretaget hindesprængning (HSP) og 12

fik lagt Cytotec i fornix post. Disse 28 kvinder fik inden disse tiltag foretaget GU med amnioskop,

hvorved det var muligt med anatomisk pincet at tage en prøve (mean: 0.15g (min-max 0,007g-1,8g)

fra den distale del af CMP. Prøven blev overført til Cryorør og inden for 30 minutter frosset til

-20oC.

Intakte CMP35 intakte CMP (gennemsnitsvægt: 4,8g (min-max: 0,5-14)) er indsamlet på fødeafdelingerne,

skejby sygehus. Af disse er 15 (graviditetsuge 385-413), indsamlet ved spontan vaginal fødsel, hvor

CMP er udskilt automatisk eller ved manuel eksploration. Kvinderne var raske med

gennemsnitsalder på 30 år (min-max 23-34)

20 er ligeledes indsamlet under vaginal fødsel (graviditetsuge 370-420), men hvor kvinderne har

modtaget Cytotec inducering. Kvinderne havde forskellige indikationer for igangsætning, herunder

grav. prolong, IUGR, føtus mortuus, Stort foster, GD. Der blev givet i gennemsnit 2 x 50 mg

Cytotec (min-max: 1-6) over gennemsnitlig 2 dage (min-max: 1-4) De havde en gennemsnitsalder

på 33 år (min-max 20-44). CMP blev nedfrosset til -20o C inden for 30 minutter og efterfølgende

luftforseglet og frosset til -80oC til senere ekstraktion.

Den centrale videnskabsetiske KomitéForsøget er godkendt ved Den Centrale Videnskabsetiske Komité og der blev på forhånd indsamlet

informeret samtykke fra alle deltagere.

Enzyme linked immunosorbent assay kit Kommercielle Elisa kit blev forhandlet via GE Healthcare.

4

distal cmp hsp, 1. udvælgelse udføres af jordmødrene, derfor er misogruppen den der skal undersøges på

intakt cmp med og uden miso

Ekstraktion

CMP blev for alles vedkommende pulveriseret i flydende kvælstof i en manuel morter. En

slutfortynding på 1:100 med ekstrahering over 3 døgn under fuld rotation forudgået af manuel eller

maskinel homogenisering med ekstraktionsbuffer (50 mmol/L Tris HCL, 10 mmol/L CaCl, 0,05%

Brij35 og 25 µmol/L phenylmethylsulfonyl flouride (PMSF)) . Supernatant afpipetteres og pooles.

Elisa

MMP-2,-8,-9 og TIMP-1 koncentrationmålingerne blev udført med dobbeltbestemmelser på

kommercielt forhandlede

ELISA-kits, baseret på en

“2-site sandwich format”.

Efter afpipettering i

brøndene, blev pladen

aflæst på APP navn!

Statistik

Statistik programmet Stata

11 er blevet brugt til at udføre

parametriske og non-parametriske tests og visualiserer tallene i grafer og box-plot. For at opnå

normalfordeling, blev tallene log-transformerede og efterfølgende udregnet P-værdier vha. uparret

t-test og Fischers exact test. Lineær regression blev udført i forbindelse med vurdering af Cytotec’s

effekt på MMP og TIMP koncentrationerne.

P-værdier under 0,05 anses for at være statistisk signifikante.

Værdier under detektionsgrænsen (ND) regnes med i grupperne som nedre detektionsgrænse.

ResultaterVi har undersøgt effekten af Cytotec administration ved at analyserer intakte CMP indsamlet under

fødsel med eller uden Cytotec påvirkningen. Vi undersøger om tidsintervallet der gives Cytotec,

eller mængden af Cytotec har størst betydning. Samtidig undersøger vi om der er forskel på de

leukocyt deriverede og de cervix deriverede komponenter.

Desuden har vi undersøgt om det var muligt at forudsige udfaldet af Cytotec behandlingen ved at

analysere distale CMP opsamlet inden igangsætning i form af HSP eller Cytotec adm.

5

Komponent Genkendelsesstrukturer Interval (ng/mL) Detektionsgrænse (ng/ml)(ng/mg CMP)

MMP-2

MMP-8

MMP-9

TIMP-1

Pro-MMP-2, pro-MMP-2/TIMP-2 1,5-24,0 0,37 (0,037)

pro-MMP-8, aktiv MMP-8 (både frit og inhibitorkompleksbundet)

0,25-4,0 0,032 (0,0032)

pro.MMP-9, pro-MMP-9/TIMP-1 kompleks

1,0-32 0,6 (0,006)

total TIMP-1 (frit og MMP kompleksbundet)

3,13-50,0 1,3 (0,13)

Fig. 2: Informationsoversigt over elisa-kit, der oplyser genkendelsesstrukturer,

detektionsgrænse (ng/mL)(ng/mg CMP)og måleinterval (ng/mL)

Det vil have en stor værdi for kvinder der kommer til igangsætning, at de fra starten kan få klarhed

over hvilken behandling der er bedst i deres tilfælde, i stedet for at prøve sig frem, så vi ønsker at

undersøge om disse faktorer kan være af prognostisk værdi for at vurdere om gravide kvinder over

termin vil have effekt at medicinsk igangsætning vurderet ud fra MMP-2, -8, -9 eller TIMP-1.

Det vil i klinikken være en nem undersøgelse, da CMP er en lettilgængelig struktur og en nem og

smertefri prøvetagning.

Intakte CMPDet er for intakte CMP, indsamlet under spontan eller Cytotec-induceret fødsel, muligt at påvise

stat. sign. højere koncentration af MMP-8

(p=0,027) hos de kvinder der fik sat

fødslen igang. De andre parametre var

ikke stat. sign. forskellige. (fig. 3)

Tidsinterval

I intakte CMP kan der detekteres stadigt

ændrede parametre over dage. De der har

fået Cytotec 1-2 dage har stat. sign

forøget koncentration af TIMP-1 i

forhold til de der ikke er blevet

6

Fig 3: Box plot af MMP-2, -8, -9 og TIMP-1 koncentrationerne fra intakte CMP indsamlet før og efter Cytotec behandling

Fig. 4: MMP-2 konc. målt i intakt CMP efter hhv. 0, 1-2, og ≥3 dage med gentagne Cytotecdoser.

Fig. 5: Box plot af MMP-8 konc. målt i intakt CMP efter hhv. 0, 1-2, og ≥3 dage med gentagne Cytotecdoser.

inducerede. For de der har fået

prostaglandin kan der ses stat.

sign. forøget MMP-8 (p=0,03) og

stat. sign. nedsat MMP-2 (p=0,02)

og TIMP-1 (p=0,004) efter 48

timer. MMP-8 forøgelsen ses

tydeligt mellem de der føder

spontant og de der har fået

prostaglandin i ≥ 3 dage. (p=0,007). (fig. 4-8)

Cytotec-koncentration

Ændres opmærksomheden til antallet af

kapsler lagt op ses der for MMP-2 en stat.

sign. reduktion på 0,44 ng/mg CMP pr

given kapsel (p= 0,046). For MMP-9 ses

der en stat. sign. stigning på 1,38 ng/mg

CMP pr given kapsel (p=0,037). For

MMP-8 og TIMP-1 ses der hhv. en stærk

stigende og en faldende tendens uden den

dog er stat. sign. (fig 9-13)

7

Fig. 7: Box plot af TIMP-1 konc. målt i intakt CMP efter hhv. 0, 1-2, og ≥3 dage med gentagne Cytotecdoser.

Fig. 6: Box plot af MMP-9 konc. målt i intakt CMP efter hhv. 0, 1-2, og ≥3 dage med gentagne Cytotecdoser.

Fig.8: P-værdier fra t-test udført på MMP-2, -8, -9 og TIMP-1 i forhold til effekten af cytotec administreret over dage.

T-test spontan fødsel vs. 48 timer m Cytotec.

48 timer m. Cytotec vs. 52 timer m Cytotec

spontan fødsel vs 52 timer m cytotec.

MMP-2 0,14 0,02 0,23

MMP-8 0,2 0,03 0,007

MMP-9 0,82 0,27 0,2

TIMP-1 0,07 0,004 0,2

Fig. 9: MMP-2 konc. udvikling afhængig af hvor mange kapsler der er givet før prøvetagning med bedste fitted line

Distale Nappeprøver

For de distale CMP var der for Timp-1’s vedkommende en udetekterbar mængde hos gruppen der

var klar til at få foretaget HSP.

Alle i HSP-gruppen gik i fødsel

inden for 24 timer. (Fig. 14)

I forsøget på at opdele disse

patienter i respondere (resp)/non-

respondere (non-resp),

8

Fig. 10: MMP-8 konc. udvikling afhængig af hvor mange kapsler der er givet før prøvetagning. med bedste fitted line

Fig. 11: MMP-9 konc. udvikling afhængig af hvor mange kapsler der er givet før prøvetagning med bedste fitted line

Fig. 12: TIMP-1 konc. udvikling afhængig af hvor mange kapsler der er givet før prøvetagning med bedste fitted line

Fig. 13: Lineær regression på antal kapslers indflydelse på MMP og TIMP konc.

Lineær regress.

t-værdi P-værdi β1, (slope) β 0 (intercept)

MMP-2 -2,14 0,0463 -0,4374841 2,723459

MMP-8 2,01 0,0593 1,361994 2,180967

MMP-9 2,25 0,0372 1,3759 1,294

TIMP-1 -1,51 0,1476 -0,486 4,336

Distale Nappeprøver

MMP-2 MMP-8 MMP-9 TIMP-1

HSP (n=16) 0,98 (-0,2-2,2) 25 (12-39) 19 (8,5-30) 1,9 (0,7-3,0)

Misoprostol (n=12) 0,81 (0,44-1,6) 35 (14-56) 28 (5,4-52) ND

t-test 0,73 0,71 0,82 -

Fig. 14: HSP vs. Misoprostol behandling ved grav prolong. Prøve fra distal CMP før igangsætning af fødslen.

visualiseredes Misoprostol-gruppens koncentrationer af MMP-8 og MMP-9.

Denne inddeling gjorde det synligt

at med en koncentrationsgrænse

på 23 ng/mg CMP for både

MMP-8 og -9 var det muligt at se

at de der havde koncentrationer

over 23 ng/mg CMP gik i fødsel

efter max 1 døgn og de der har

MMP koncentrationer under tog

mere end 1 dag om at gå i fødsel.

MMP-8 har to outliers, ,mens

MMP-9 følger cut-off grænsen.

(Fig. 15)

Grupperingen er testet for baggrundsvariablen Paritet: alle 6 resp var fleregangsfødende. 2 af 4 non-

resp var fleregangsfødende. Forskellen er ikke stat. sign. (p= 0,083)

Testes gestationsalder er der stat. sign. forskel på de to grupper (p=0,0013), hvor resp-gruppen har

højere gest. alder.

Resp, non-resp

grupperne er som

udgangspunkt ikke

stat. sign forskellige.

(fig. 5+7), men

ekskluderes en

prøve, der har 0 i

alle parametre ændres det til stat. sign.

forskel på MMP-2 (p=0,01), -8 (p=0,04)

og -9 (p=0,005), hvor resp har højere

konc. end non-resp. (fig 6+8)

9

Fig. 15: Inddeles MMP-8 og -9 koncentrationerne i misoprostolgruppen, distale prøver efter hvor mange dage der går før de går i fødsel, kan en

Fig. 7: MMP-2, -8, .9 og TIMP-1 koncentrationer analyseret med t-test for Cytotec-gruppen, distale CMP.

MMP-2 MMP-8 MMP-9 TIMP-1 Parity = 0 Parity ≥ 1

Responders n = 6 1,6 (0,19-3) 52 (13-91) 52 (11-93) ND 23 % 77 %

Non-responders n = 4

ND 23 (-7,2-53) 7 (-8,1-22) ND 34 % 66 %

t-test 0,04 0,8 0,32 - 0,083

MMP-2 MMP-8 MMP-9 TIMP-1

Responders n = 5

1,9 (0,38-3,4) 62 (25-99) 62 (21-103) ND

Non-responders n = 4

ND 23 (-7,2-53) 7 (-8,1-22) ND

t-test 0,010 0,036 0,0051 -

Fig 8 : MMP-2, -8, -9 og TIMP-1 koncentrationer analyseret for stat. sign. forskel mellem resp og non-resp for misoprostolgruppen, distal nappeprøve. ex pr 13.

DiskussionCMP der er blevet primet af prostaglandin har højere konc. af MMP-8 og -9 og mindre MMP-2 (kit

måler ikke aktiv MMP-2. dvs en evt omdannelse til aktiv MMP-2 vil give et lavere resultat. )

CMP er kan altså påvirkes af, ikke mindst antallet af kapsler, men også over hvor lang tid de bliver

givet over. De der kommer til igangsætning og har brug for prostaglandin E priming har alle

udetekterbar TIMP-1.

Alle der fik foretaget HSP gik i fødsel inden for 24 timer.

Ved at kigge på MMP-8 og -9 konc. i distale CMP kunne det visualiseres at det var muligt at

inddele kvinder der kommer til igangsætning i resp og non-resp. Tal der dog først blev stat. sign.

efter ekskludering af Prøve med 0 værdier i alle parametre. Der er forskel i Gestationsalderen, men

set i lyset af, at kvinderne udvælges helt korrekt af jordmødrene og der kan vises en stat. sign

forskel på kvinders MMP-2, -8 og -9 konc. afhængig af om de reagerer på prostaglandin E

behandlingen har det ikke betydning for denne problemstilling.

-

a. hovedfund: max 5 sætninger

b. styrker og svagheder

for få prøver.

c. tolkning

d. litteratur (Gunvor, evt. flere. Ikke gentagelse af baggrund)

e. klinisk implikation

2. diskussion

- Der er fysiologisk forskel på hsp og miso gruppen, men det kan ikke måles på MMP ved distale cmp.

- selvom der er forskel mht gestationsalder, så er der ingen forskel på hsp og misogruppen v t=0, så det

er ikke noget der spiller nogen rolle for min hypotese?. Der er forskel i Gestationsalderen, men set i

lyset at kvinderne udvælges helt korrekt af jordmødrene og der kan vises en stat. sign forskel

på kvinders MMP-2, -8 og -9 konc. afhængig af om de reagerer på prostaglandin E

behandlingen har det ikke betydning for denne problemstilling.-

10

- siden MMP-2 ikke stiger i hinderne, men i cervix, kan de formentlig være forhindret adgang! Ingen

stimulation? US nærmere. (mine tal viser faldende mmp-2) (Morgan R Peltier) (sterisk?????) (måler ikke

aktiv MMP-2!!!!!)

-MMP-9 stiger efter uge 37, men siger ikke noget prædiktivt om fødselsudfald. Dvs. ligesom mine prøver

er det MMP-8 der er stærkest. (Suk-Joo Choi)

- et studie viser at MMP-2 produceres hovedsagligt i stromale, cervikale fibroblaster. (dvs diffunderer,

mens MMP-9 produceres af leukocytter, der jo under IL-8 aktivering diffunderer ud i CMP [11]

- Najas 3. artikel viste ikke forøget MMP-8 og -9 men nedsat TIMP.

- Der er sandsynligvis ikke nogen proteolytisk effekt af MMP’er i CMP, men kan resulterer i præterm

fødsel. Desuden er det et udemærket billede af hvad der sker i det omkringliggende væv. [12] (gode

billeder) MMP-2,-8 og -9 og Timp1 er påvist i CMP [13]

- Der er påvist nedsat leukocytinflux i cervix hos Non-respondere. og dermed også nedsat IL-8 og

MMP-9.

- prostaglandin forøger vasopermeailitet og øger inflam celle influc som neutrofil og makrogager i cervix

under 1 trimester. Neutrofiler afgiver mmp der nedbryder vaskulær basalmembraner der øger leukocyt

akkumulation, specielt neutrofiler, monocytter og mastceller . nedbrudt vasalmembran frigiver IL-8 der

yderligerer forstærker kaskaden. [14]

- Selvom der er MMP, er det pga MMP/TIMP ratio ikke sikkert der er katalytisk aktivitet , men tallene

viser ikke desto mindre at der sandsynligvis er en prediktiv værdi af at måle MMP-8 i distal cmp.

- Dehydrering under prøvetagning og processering mulig fejlkilde. [9]

- PGE påvirker MMP direkte eller øger neut influx, derfor ses der kun MMP-8 og -9 reaktion...

Bibliografi1.! Mackenzie, I.Z., Induction of labour at the start of the new millennium.

Reproduction, 2006. 131(6): p. 989-98.2.! Peltier, M.R., Immunology of term and preterm labor. Reprod Biol Endocrinol, 2003.

1: p. 122.3.! Hulboy, D.L., L.A. Rudolph, and L.M. Matrisian, Matrix metalloproteinases as

mediators of reproductive function. Mol Hum Reprod, 1997. 3(1): p. 27-45.4.! Sennstrom, M.B., et al., Matrix metalloproteinase-8 correlates with the cervical

ripening process in humans. Acta Obstet Gynecol Scand, 2003. 82(10): p. 904-11.

11

5.! Xu, P., N. Alfaidy, and J.R. Challis, Expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in human placenta and fetal membranes in relation to preterm and term labor. J Clin Endocrinol Metab, 2002. 87(3): p. 1353-61.

6.! Fortunato, S.J., R. Menon, and S.J. Lombardi, Collagenolytic enzymes (gelatinases) and their inhibitors in human amniochorionic membrane. Am J Obstet Gynecol, 1997. 177(4): p. 731-41.

7.! Sahlin, L., et al., Impaired leukocyte influx in cervix of postterm women not responding to prostaglandin priming. Reprod Biol Endocrinol, 2008. 6: p. 36.

8.! Uldbjerg, N., U. Ulmsten, and G. Ekman, The ripening of the human uterine cervix in terms of connective tissue biochemistry. Clin Obstet Gynecol, 1983. 26(1): p. 14-26.

9.! Becher, N., et al., The cervical mucus plug: structured review of the literature. Acta Obstet Gynecol Scand, 2009. 88(5): p. 502-13.

10.! Becher, N., et al., Matrix metalloproteinases in the cervical mucus plug in relation to gestational age, plug compartment, and preterm labor. Reprod Biol Endocrinol, 2010. 8: p. 113.

11.! Stygar, D., et al., Increased level of matrix metalloproteinases 2 and 9 in the ripening process of the human cervix. Biol Reprod, 2002. 67(3): p. 889-94.

12.! Becher, N., et al., Balance between matrix metalloproteinases (MMP) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) in the cervical mucus plug estimated by determination of free non-complexed TIMP. Reprod Biol Endocrinol, 2008. 6: p. 45.

13.! Becher, N., et al., Matrix metalloproteinases and their inhibitors in the cervical mucus plug at term of pregnancy. Am J Obstet Gynecol, 2004. 191(4): p. 1232-9.

14.! Aronsson, A., et al., The effect of orally and vaginally administered misoprostol on inflammatory mediators and cervical ripening during early pregnancy. Contraception, 2005. 72(1): p. 33-9.

12