CURSO DE FARMCIARELATRIO AULA PRTICA: CINTICA MICROBIANA

Discentes: Fulano

Beltrano

CiclanoTurma: FAN01S1

Professor: MSc. Francisco NetoDisciplina: Processos BiolgicosManaus

2011

CURSO DE FARMCIARELATRIO AULA PRTICA: CINTICA MICROBIANADiscentes:

Fulano

Beltrano

Ciclano

Manaus

2015IntroduoA determinao da evoluo ao longo do tempo da concentrao de um componente celular, da concentrao de clulas ou da biomassa em suspenso em meio de crescimento lquido, permite obter experimentalmente acurva de crescimento da populao microbianae calcular ataxa especfica de crescimentoe otempo de gerao ou de duplicaodo microrganismo em questo nas condies decrescimentotestadas (De Carvalho, 2006).Segundo De Carvalho et al (2006), para acompanhar e traar a curva de crescimento de uma populao microbiana necessrio fazer a avaliao quantitativa da evoluo da concentrao de clulas ao longo do tempo. Esta pode basear-se em mtodos diretos, como contagem de clulas totais, contagem de clulas viveis e determinao da biomassa seca. Ou em mtodos indiretos, como o caso da Anlise espectrofotomtrica da Densidade ptica (D.O.) da cultura. Embora, em teoria, quando o crescimento de uma populao microbiana equilibrado, o seu acompanhamento possa basear-se na quantificao de qualquer constituinte celular, o crescimento usualmente acompanhado com base na determinao da D.Oda cultura, daconcentrao de clulasou damassa celular. A seleo do mtodo a utilizar depende do tipo de microrganismo e do problema particular em causa.Saccharomyces cerevisiae um organismoeucariotaunicelularque pertence ao Reino dosFungos. A sua utilizao combina vrias vantagens: um organismo unicelular e, ao contrrio dos organismoseucariotascomplexos, pode crescer emmeios de culturadefinidos, permitindo ao investigador o controlo dos parmetros ambientais (E-escola.com, 2011) uma levedura ascomictica gemulante tpica. Cepas desta espcie so utilizadas no processo de fermentao para a produo de bebidas alcolicas. Na presena de oxignio, as leveduras oxidam os acares a dixido de carbono que so responsveis pelas bolhas de ar no po. As leveduras de cervejaria e padaria tm sido utilizadas a milhares de anos, uma levedura de grande importncia econmica.As clulas de so elpticas, medindo cerca de 6 a 8 mm de comprimento por 5 m de largura, reproduzem-se assexuadamente por brotamento (De Carvalho, 2006).Objetivo GeralO objetivo da aula prtico foi verificar a cintica de crescimento de Saccharomyces cerevisiae.

Objetivos Especficos Determinar a concentrao de acares redutores no incio e no final do experimento (tempo zero e tempo final);

Construir a curva de crescimento da levedura a partir dos valores de densidade ptica.

Materiais e MtodoMaterial:

Fpram utilizados na aula prtica autoclave, espectrofotmetro, banho-maria, balana analtica, agitador magntico, agitador tipo vrtex, pHmetro, micropipeta, ponteiras, erlenmeyers de 125 mL, bquer de 500 mL, cubetas de 3 mL, basto de vidro, tubos eppendorf, esptulas, provetas e filtro milipore 22 m.

Reagentes:

Como reagentes utilizamos a levedura seca de panificao, HCl 0,1 M e soluo DNS.

Meio de Cultivo (pH 5,0):

Glicose (10 g/L), estrato de malte (3 g/L), extrato de levedura (3 g/L), peptona bacteriolgica (5 g/L).

Procedimento:

1. Pesar os componentes do meio de cultura em um bquer e dissolv-los em gua destilada utilizando o agitador magntico;

2. Ajustar o pH do meio de cultura com HCl utilizado o pHmetro;

3. Completar o volume utilizando uma proveta;

4. Autoclavar o meio de cultura nos erlenmeyers e as ponteiras a 121C por 20 min.;5. Deixar os frascos esfriarem e quando a temperatura for inferior a 30C, acrescentar a levedura.

Experimento:

Frascos n 1 e 2: 100 mL de meio de cultura e 1,0 g/L de levedura com agitao;

Frascos n 3 e 4: 100 mL de meio de cultura e 2,0 g/L de levedura com agitao;

Frascos n 5 e 6: 50 mL de meio de cultura e 1,0 g/L de levedura com agitao;

Frascos n 7 e 8: 50 mL de meio de cultura e 1,0 g/L de levedura sem agitao;Anlise de crescimento:

1. Retirar 1 mL de amostra a partir do tempo zero, de 2 em 2 horas;2. Ler a absorbncia em 600 nm no espectrofotmetro, realizando as diluies necessrias caso a absorbncia ultrapasse 0,0800.

Concentrao de acares redutores:

1. Adicionar a tubos de ensaio 500 L de amostra previamente filtrada e 500 L de DNS;

2. Agitar os tubos em agitador tipo vrtex e levar ao banho-maria 100C por 5 minutos;

3. Resfriar a temperatura ambiente e adicionar 5 mL de gua destilada;

4. Ler a absorbncia a 540 nm;5. A curva padro de glicose foi utilizada para determinar os valores de concentrao de acares redutores, conforme mostrado na figura 1.

Figura 1

Resultados e DiscussoAs fases de crescimento celular so mostradas na figura 2. Para os experimentos de 1 a 4, visualiza-se a fase lag nas primeiras 2 horas de experimento. Passando as primeiras 2 horas at a 6 hora percebe-se a fase de multiplicao celular, conhecida como fase exponencial. A fase de esgotamento dos nutrientes, fase estacionria, quase no percebida, pois em seguida inicia a fase de morte celular. Isso pode ser explicado pela rpida capacidade se multiplicar da levedura.

Figura 2Experimento 1 e 2:

Os experimentos 1 e 2 foram realizados com 100 mL de meio de cultura e 1,0 g/L de levedura com agitao. Os valores de concentrao de clula e substrato, tempo de duplicao, consumo de substrato e produtividade so mostrados na tabela 1. Tabela 1

tempo (h)Concentrao de Celula (g/l)Concetrao de Glicose (g/l)ln Concentrao de clula (g/l)Tempo de Duplicao (h)Consumo de Substrato (g /g)Produtividade

00,4798510,65856031-0,7342817243,0361243130,0774320640,12289375

20,7343-0,308837615

30,7301-0,314573768

40,9653-0,035316345

61,4630,380489122

81,24740,7460,221061385

A velocidade de crescimento foi de 0.2283 h-1. A figura 3 mostra uma curva de crescimento linear. Esse crescimento moderado pode ser justificado devido a grande quantidade de meio de cultura no frasco e a pouca quantidade de levedura, que apesar de estar sendo aerado, a quantidade de oxignio torna-se baixa.

Figura 3Apesar do baixo crescimento, a figura 4 mostra que houve um consumo de glicose pela S. cerevisiae, pois a concentrao de glicose est diminuindo concomitantemente com o aumento do crescimento celular. A determinao dos acares redutores totais foi realizada pelo mtodoDNS.

Figura 4Experimento 3 e 4:

Os experimento 3 e 4 foram realizados com 100 mL de meio de cultura e 2,0 g/L de levedura com agitao. Como se pode observar na figura 1 o crescimento foi maior. Isso pode ser justificado devido o aumento da quantidade de levedura no meio. Na figura 5 mostrado o crescimento exponencial, a velocidade do crescimento exponencial de 0,1831 h-1.

Figura 5O tempo de duplicao celular foi de 3, 7856 h e a produtividade foi de 0,1797 conforme mostrado na tabela 2. Esse valores so maiores que dos experimentos 1 e 2 , mostrando assim que o aumento na quantidade de levedura no meio melhora a cintica de crescimento da S. cerevisiae, pois o tempo de duplicao, consumo de substrato e produtividade aumentaram.Tabela 2

tempo (h)Concentrao de Celula (g/l)Concetrao de Glicose (g/l)ln Concentrao de clula (g/l)Tempo de Duplicao (h)Consumo de Substrato (g/g)Produtividade

00,866611,95097276-0,143177773,7856208660,0432151090,179725

21,28030,247094425

31,330,285178942

41,60020,470128621

62,30440,834820339

81,33071,2116731520,28570512

Assim como nos experimento 1 e 2, houve um baixo crescimento porm a figura 6 mostra que houve um consumo de glicose pela S. cerevisiae, pois a concentrao de glicose est diminuindo concomitantemente com o aumento do crescimento celular.

Figura 6Experimento 5 e 6:

Os experimento 5 e 6 foram realizados com 50 mL de meio de cultura e 1,0 g/L de levedura com agitao. Houve ento uma reduo de 50% na quantidade de meio de cultura. Essa reduo de nutrientes resultou em baixo crescimento da levedura. Porm conforme a figura 7, houve um consumo de glicose. A produtividade foi de 0,057 e o consumo de glicose foi de 0,042 g/g, conforme mostrado na tabela 3.

Figura 7Tabela 3

tempo (h)Concentrao de Celula (g/l)Concetrao de Glicose (g/l)ln Concentrao de clula (g/l)Tempo de Duplicao (h)Consumo de Substrato (g/g)Produtividade

00,4651511,60077821-0,7653953450,0420557950,05735625

20,756-0,279713903

30,6531-0,426025022

40,8603-0,150474113

60,6986-0,358676947

80,9240,690272374-0,079043207

Experimento 7 e 8:

Os experimento 7 e 8 foram realizados com 50 mL de meio de cultura e 1,0 g/L de levedura sem agitao. Portanto houve uma reduo de 50% de nutrientes e no houve aerao, esses parmetros resultaram em uma produtividade de 0,0263, mais baixa que a produtividade dos experimentos 6 e 7, que tinham os mesmos parmetros, porm com aerao. Porm, assim como nos experimentos 6 e 7, houve um pequeno consumo de glicose, conforme figura 8. Os resultados do crescimento esto mostrados na tabela 4.

Figura 7Tabela 4

tempo (h)Concentrao de Celula (g/l)Concetrao de Glicose (g/l)ln Concentrao de clula (g/l)Tempo de Duplicao (h)Consumo de Substrato (g/g)Produtividade

00,689859,196692607-0,3712810960,0245818490,02638125

20,64505-0,438427446

30,2996-1,205307027

40,8484-0,164403056

60,4837-0,726290399

80,90090,611089494-0,104361015

ConclusoCom a anlise dos dados obtidos pode-se concluir que o desenvolvimento da S.accharomyces cerevisiae simples, por processos assexuais e, por isso, muito rpido em condies ambientais favorveis. O crescimento influenciado por vrios fatores ambientais, destacando-se o alimento e o oxignio. Cada um destes fatores importante e pode limitar o crescimento, determinando o desenvolvimento da leveduraA elaborao de dados cinticos em forma de grficos facilitam o entendimento da cintica microbiana, fornecendo dessa maneira parmetros para que diversos micro-organismos possam ser utilizados em bioprocessos de mdio a grande porte.Referencial BibliogrficoDE CARVALHO, Giovani B. M.; BENTO, Camila V.; SILVA, Joo B. A.Elementos Biotecnolgicos Fundamentais no Processo Cervejeiro: 1 parte As Leveduras. Revista Analytica: Outubro/Novembro 2006, N25.Endereo Eletrnico: http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=235. Acessado em 29 de Setembro de 2011.Trabalho apresentado ao professor MSc. Francisco Neto, como requisito para obteno da nota na disciplina de Processos Biolgicos. Bioprocessos

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