Modelos celulares

1

Modelos Celulares Modelos Celulares parapara

Estudios de Toxicidad y Estudios de Toxicidad y Metabolismo de XenobiMetabolismo de Xenobiticosticos

XenobiticosXenobiticos

2

TOXINASTOXINASIntrIntrnsecasnsecas

Efecto en todos los individuos expuestosEfecto dosis-dependiente

Efecto predecible en animales

IdiosincrIdiosincrsicassicasEfecto solo en algunos individuos

No dosis-dependiente:hipersensibilidadDosis-dependiente: idiosincrasia metablica

Polimorfismo genticoInduccin de los CYPs

Efecto No predecible en animales

ClasificaciClasificacin mecann mecanstica stica de las TOXINASde las TOXINAS

ActivasActivasSon txicas per se y no requieren ser

biotransformadas para ejercer su efectotxico.

Efecto dosis-dependiente enlos individuos expuestos

LatentesLatentesRequieren ser biotransformadaspara ejercer su efecto txico.

3

Detoxificacin

RESPUESTAINMUNE

Metabolito reactivoMetabolito estable

Alteracin de lahomeostasis

del Ca2+

Depleccinde GSH

Estrs oxidativoGeneracin de ROS

BIOTRANSFORMACION

ELIMINACION

Peroxidacinlipdica

Unincovalente

Alteraciones metablicas

ATP

APOPTOSIS NECROSIS

Inactivacin debiomolculas

Reacciones Fase II

XENOBIOTICO Reacciones Fase I

"... "... un determinado experimento no se realizarun determinado experimento no se realizar en en animales, si existe otro manimales, si existe otro mtodo disponible que sea todo disponible que sea razonablerazonable, , realizablerealizable y y cientcientficamente satisfactorioficamente satisfactoriopara obtener los mismos resultados y que no para obtener los mismos resultados y que no requiera el uso de animales...requiera el uso de animales...

Parlamento Europeo

(Directiva 86/609/CEE)

.... se utilizar.... se utilizar el el mmnimo nnimo nmeromero de animales y de animales y aquel procedimiento que produzca aquel procedimiento que produzca el mel mnimo y menos nimo y menos prolongado dolor y sufrimientoprolongado dolor y sufrimiento......

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VentajasVentajasde los Modelo In Vitrode los Modelo In Vitro

Se evitan interferencias de la respuesta del organismoVersatilidad en el diseo experimentalAhorro de tiempo y coste econmicoPosibilidad de automatizacin, robotizacin, miniaturizacinNecesidad de poca cantidad de producto en estudioSe puede utilizar material biolgico humanoReduccin del nmero de animales

InconvenientesInconvenientesde los Modelo In Vitrode los Modelo In Vitro

Simplicidad: Informacin a veces parcialDificultad de interpretacin de los resultadosDificultad para extrapolar al hombreNo sustituyen del todo los ensayos in vivoNo se pueden detectar efectos secundariosNecesidad de validacin formalTodava no estn aceptados legalmente, ni incorporados en los protocolos oficiales para el registro de nuevos frmacos

5

35

25 x 106 clulas

1 2 3 4 5 6A

B

C

D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGH

190 1.000

2-3 g de tejido

Evaluacin del riesgo de toxicidad

Productos que se desarrollan para el uso o consumo humano (aditivos alimentarios, cosmticos, medicamentos, biomateriales, etc.)

Clasificacin y etiquetaje de productos qumicos (disolventes,detergentes, etc)

Medioambiente: Ecotoxicologa (plaguicidas, metales pesados, etc)

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XenobiticosXenobiticosEstudios de toxicidad

Medicamentos

Fase Clnica

SEGURIDAD SEGURIDAD

BalanceBalanceentreentre

RIESGORIESGOTTxicoxico

Fases en el desarrollo Fases en el desarrollo de un de un

nuevo medicamentonuevo medicamento

Fase Preclnica Fase QuFase QumicamicaFase biolFase biolgica en animalesgica en animales

Metabolismo Toxicologa Farmacocintica Actividad farmacolgicaMoleculaMolecula candidatacandidata

Fase I: VoluntariosFase I: VoluntariosFase II: Ensayo clFase II: Ensayo clniconicoFase III: Estudios Fase III: Estudios multicmulticntricosntricosFase IV: Registro y comercializaciFase IV: Registro y comercializacinn

BENEFICIOBENEFICIOTerapeTerapeticotico

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DiseDiseo experimental o experimental para evaluar la toxicidad para evaluar la toxicidad in vitroin vitro

ElecciEleccinn de un modelo biolgico adecuado

EvaluaciEvaluacinn de los parmetros adecuados para estudiar los efectos txicos

Correcta interpretaciCorrecta interpretacinn de los resultados: Valor predictivo del modelo y extrapolacin in vitro - in vivo


ElecciEleccinn de un modelo biolgico adecuado

Organismo enteroPerfusin de rganosCultivo de rganos/slicesCultivos primariosLneas celularesHomogenados de tejidosFracciones subcelularesEnzimas purificados

Complej

idad

Releva

ncia

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ElecciEleccinn de un modelo biolgico: Cultivos celulares

Cultivos PrimariosCultivos PrimariosAquellos formados por clulas derivadas directamente del tejido u rgano donante. Pueden ser proliferantes (fibroblastos, etc) o no proliferantes (hepatocitos)

Cultivos PrimariosLneas celularesLneas celulares manipuladas geneticamenteCo-cultivosCultivos organotpicos

A B

C D

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NeuronasNeuronas AstrocitosAstrocitos OligodendrocitosOligodendrocitos

CCll. de . de SchwannSchwann CCl.Cromafinesl.CromafinesMicroglMicroglaa

Cultivos de CCultivos de Clulas de Sistema Nervioso lulas de Sistema Nervioso Humano para Estudios de FHumano para Estudios de Frmacormaco--ToxicologToxicologaa

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CaracterCaractersticas:sticas:Clulas inmortalesTransformadas mediante virus, etc o de origen tumoralHeteroploidesEstabilidad fenotpica

Ventajas:Ventajas:Manejo fcilComercializadas en las colecciones de clulas (ECACC, ATCC)

Inconvenientes:Inconvenientes:Prdida de funciones diferenciadas

LLneas Celulares neas Celulares ContContnuasnuas

CClulas manipuladas genlulas manipuladas genticamenteticamenteExpresiExpresin de un gen de intern de un gen de interss

IntegraciIntegracin en el genoma n en el genoma de un gen de interde un gen de inters mediante retroviruss mediante retrovirus

Inmortalizacin de los hepatocitosExpresin de isoenzimas del citocromo P450 (CYP)Expresin de otros genes de inters

ExpresiExpresin transitoria n transitoria de un gen de interde un gen de inters mediante adenoviruss mediante adenovirus

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EvaluaciEvaluacinn de los parmetros adecuados para estudiar los efectos txicos

Estudios de citotoxicidad generalEstudios de citotoxicidad general:Efectos sobre funciones vitales de la clulas.

Toxicidad Toxicidad rganorgano--especespecficafica: Efectos sobre funciones diferenciadas de las clulas del rgano diana.

Mecanismos molecularesMecanismos moleculares de toxicidad

HEPATOCITOSEN CULTIVO

VIABILIDAD

FUNCIONES BIOQUMICAS

24-72 h

FrmacosXenobiticos

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Estudios de citotoxicidad generalEstudios de citotoxicidad general:

Alteraciones de las funciones vitales de la clulas.

CriteriosCriterios: Ensayos de viabilidad celular (MTT, RN, LDH, GOT, GPT, ATP, etc)

ModelosModelos: Lineas celulares y cultivos primarios

ObjetivoObjetivo: Determinar la mxima concentracin no txica (MCNT), y las IC10 e IC50

logit(Concentration) (M)-4 -3 -2 -1

-log(

Viab

ility

) (%

of c

ontr

ol)

-6

-4

-2

0

2

4

6

Concentration (M)250 500100 1000

Viab

ility

(% o

f con

trol

)

0

25

50

75

100

IC10 IC50 IC10IC50

A B

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Los ICs, parmetros de comparacin relativa

Concentracin

% d

el C

ontr

ol

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

IC10 IC50

100 % viable< 5 % viable

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log (Rat Hepatocytes IC50)

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1

log(

Hum

an le

thal

con

cent

ratio

n)

-9-8-7-6-5-4-3-2-101

o. origen=.3060pendiente=.9320r =.7434

log (HepG2 IC50)

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1lo

g(H

uman

leth

al c

once

ntra

tion)

-9-8-7-6-5-4-3-2-101

o. origen=.4523pendiente=.8848r =.7745

Relacin entre la toxicidad in vitro y la in vivo


Estudios de toxicidad Estudios de toxicidad rganorgano--especespecficafica:

Alteraciones de funciones diferenciadas del rgano diana a concentraciones que no comprometen la viabilidad celular.

CriteriosCriterios: Evaluacin de funciones diferenciadas a concentraciones sub-citotxicas (MCNT o IC10)

ModelosModelos: Cultivos primarios

ObjetivoObjetivo: Determinar efecto txico y mecanismo de toxicidad

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Cultivo de cCultivo de clulas de diferentes tejidoslulas de diferentes tejidoshumanas y de especies animales humanas y de especies animales

HgadoSistema nerviosoMusculo liso y estriadoClulas de la pielRinPncreasPulmnClulas ocularesClulas vascularesClulas seasClulas sanguneasIntestinoOtros tejidos

Biotransformacin.

Efectos beneficiosos o txicos a nivel celular o molecular sobre funciones celulares especficas.

Biocompatibilidad.

Irritacin/corrosividad.

Accin farmacolgica.

Carcinognesis/mutagnesis.

Tipos celulares Estudios sobre lostejidos/rganos diana

Los modelos celulares de origen humanoestn llamados a desempear un papelpuente entre los ensayos preclnicos en

animales y los ensayos clnicos en el ser humano

Modelos celulares de origen humano Modelos celulares de origen humano Estudios In Vitro Estudios In Vitro predictivopredictivo para el para el hombrehombre

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Experimentacin Animal

In vivoIn vivo

Cultivo de Clulas Humanas

In VitroIn Vitro

Ensayos Clnicos

In vivoIn vivo

Ayuda para la seleccin de la especie animal ms adecuada paralos estudios pre-clnicos

Permite obtener resultados a nivel bioqumico, metablico y funcional muy predictivos

para el hombre.

Estudios pre-clnicos a nivel fisiolgico que requieren el organismo entero.


Correcta interpretaciCorrecta interpretacin de los resultados:n de los resultados:Valor Valor predictivopredictivo del modelodel modelo--Riesgo de toxicidadRiesgo de toxicidad

RelevanciaRelevancia del efecto observadoReversibilidadReversibilidad del efecto txico observadoDiferencia de sensibilidadDiferencia de sensibilidad interespeciesAspectos Aspectos farmacocinfarmacocinticosticos del compuestoDiferencias en el metabolismoDiferencias en el metabolismo interespecies

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RT =Concentracin Plasmtica /IC50

RIESGO DE TOXICIDADRIESGO DE TOXICIDAD

Pico en plasma tras administracin teraputica

0.7-1.7 x 10-5

---3 x 10-4

6 x 10-2---

3 x 10-3

2 x 10-3

5 x 10-2

1 x 10-4

4 x 10-3

0.7-1.7 x 10-4

---6.6 x 10-5

1.3 x 10-2---

9.7 x 10-4

5.1 x 10-4

1.3 x 10-2

1.5 x 10-4

6.2 x 10-3

3.3-8.1 x 10-3

---3.9 x 10-4

7.8 x 10-2---

3.1 x 10-3

6.5 x 10-3

1.6 x 10-1

1.8 x 10-2

7.1 x 10-1

0.1

4.5

3.1

3.9

0.65

Buprenorfina

Morfina

Herona

Meperidina

Metadona

2.1 x 10-2

7.7 x 10-1

9.6 x 10-1

3.1 x 10-1

5.6 x 10-3

Conc.Plasmtica

(mM)LDH

(IC50)Snt. Albmina

(IC50)RT RT

Viabilidad Funcionalidad

RIESGO DE TOXICIDADRIESGO DE TOXICIDADRT =Con. Plasmtica/IC50

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ESTUDIOS DE REVERSIBILIDAD ESTUDIOS DE REVERSIBILIDAD IN VITROIN VITRO

Relevancia de la funcin metablica alteradaReversibilidad del efectoMecanismos de toxicidad implicadosInteraccin con otros frmacosIdentificacin de los CYPs implicados en el metabolismoInduccion/inhibicion del CYPParticipan en el metabolismo CYPS con polimorfismo genetico? Evaluacin del riesgo de hepatotoxicidad

3) Extrapolacin In vitro-In vivo / Evaluacion del riesgo

Estudio de la Estudio de la hepatotoxicidadhepatotoxicidad in vitroin vitro

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Aplicaciones de los Modelo In VitroAplicaciones de los Modelo In Vitro

Clasificacin y etiquetado de sustancias qumicas Biocompatibilidad de materiales Carcinognesis y mutagnesis Test de irritacin ocular y cutnea Fototoxicidad Toxicologa del desarrollo Toxicidad rgano-especfica Toxicidad a nivel sistmico Mecanismos moleculares de toxicidad Metabolismo y toxicidad de frmacos Evaluacin de interacciones entre frmacos

Ecotoxicologa

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