Upload
phamcong
View
219
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Moderní mikroskopieElektronová mikroskopie (TEM, SEM)
Mikroskopie skenující sondou
Doc.RNDr. Roman Kubínek, CSc.Katedra experimentální fyzikyPřírodovědecké fakulty, Univerzita Palackého v Olomouci
Elektronová mikroskopie
� Transmisní elektronová mikroskopie (TEM a HRTEM)
� Skenovací elektronová mikroskopie (SEM)
Transmisní elektronová mikroskopie
TransmisníElektronovýMikroskop
TransmisníElektronovýMikroskop
Urychlené elektrony jako vlna ve vakuu
h
Ef =
Pohybující se elektron o energii E a hybnosti p má podle Lui de Brogliehoteorie vlnovou povahu; tedy chová se jako vlna o:
frekvenci a vlnové délce , kde h je Planckova konstanta vm
h
e.=λ
Pro vlnovou délku elektronu odvodíme vztah
V praxi pro výpočet λ při známé hodnotě U [V]
Příklad:
U= 10 kV → λ = 0,01226 nmU= 100 kV → λ = 0,0037 nm
eUm
h
cm
eUeUm
h
0
20
0
2
212
≅
+
=λ
[ ]nm226,1
U=λ
Atomy stejného druhu v různě orientované krystalické mříži(v případě levého obrázku, prochází elektrony snadněji)
Kontrast v obraze závisí mimo jiné na:• orientaci krystalů v látce,• na průměrném protonovém čísle atomů preparátu, • na hustotě látky (počtu atomů v krystalické mříži).
Pro transmitované elektrony: v případě obrázku vlevo bude obraz sv ětlejší než v p řípadě obrázku vpravo
Elektrony procházejícípreparátem
� přeměnou kinetické energie elektronů na světlo – pozorování, záznam
� dopadem elektronů na fotografickou emulzi – záznam
Přeměna energie elektronů na světloPodobně jako v klasické TV obrazovce, elektrony bombardujístínítko opatřené luminoforem (fosfor, ZnS atd.)
V komoře TEM, v její spodní části je oválné luminiscenčnístínítko (fosfor – zelená fosforescence), na němž vzniká celkový obraz
Snímání obrazu speciální CCD kamerou - registrujeme změny intenzity jako ČB (šedotónový) obraz.
Zviditeln ění obrazu vytvo řeného elektrony v TEM
Morada (11 MPixelů)
MegaView III
(6 MPixelů)
Parametry:• Rozlišení obrazu - 11 megapixel ů
• Velikost pixelu - 9.0 x 9.0 µm • Kmito čet pixelu - až 25 MHz• Dynamický rozsah - 14 bit ů
• Instalace kamery - p říruba na širokoúhlém portu • Připojení PC - technologie FireWireTM(IEEE 1394) • Spřažení kamery - s optickými čočkami
Vnit řní přenosový čip s elektronickým p řerušova čem umožňuje extrémn ě krátké i extrémn ě dlouhé expozi čníčasy - 1 ms až 60 s. Morada dosahuje až 10 snímk ů za sekundu a frekvenci pixelu 24 MHz.
CCD čip je chlazený Peltierovým zp ůsobem a vzduchem a je stabilizovaný p ři 15°C, poskytuje velmi vysoký pom ěr signál/šum.
Morada používá nové speciáln ě vyvinuté scintilátory, optimalizované pro 100 a 200 keV.
Kamera má video výstup 640 x 408 pixel ů (50 Hz PAL, 60 Hz NTSC).
Digitální kamery pro elektronovou mikroskopii pro instalaci na 35 mm port
Černobílá CCD kamera s vysokým rozlišením instalovaná ve spodní části projekční komory mikroskopu v ose elektronového
svazku. • Uspo řádání CCD čipu a ú činného fosforového scintilátoru na principu optického vlákna. CCD typ: rychlost: 10 nebo 20 Mega Pixel/s, dynamickáplocha: 4096 odstín ů šedi (12 bit), rozlišení: 1280 x 1024), • Expozi ční čas: 100 µs - 160 s. Chlazení kamery Peltierem na teplotu 10 oC, chlazení je sou částí dodávky. • Obrazová data jsou odesílána p řes FireWireTM (IEEE1394), což eliminuje použití p řídavného framegrabberu. • Použití pro biologické aplikace a pro materiálový výzk um s požadavkem na vysoké rozlišení. • Instalace: b ěžné transmisní mikroskopy FEI (Philips), LEO, Jeol
Digitální kamery pro elektronovou mikroskopiiPro instalaci pod projek ční komoru Keen View
Čtyři základní stavební a funkční prvky elektronového mikroskopu:� zdroj elektronů (elektronové dělo),� elektromagnetické čočky,� preparátový stolek (držák, goniometr),� vakuový systém.
Elektronové dělo
Preparátovákomůrka
Systém elektromagnetických čoček a clon
Luminiscenční stínítko
Konstrukce TEM
zdroj elektronů:termoemisní zdroj přímo (nepřímo)žhavená katoda (2700 oC – Wolframové vlákno – vydržíměsíc)
katoda LaB6(2100 oC – hexaborid lanthanu – vydržírok)
autoemisní (studený) zdroj (FEG) –vydrží několik let
� Wehneltův válec (obklopuje katodu) – potenciál -100 V� Křižiště (zdroj elektronů, podobně jako vlákno žárovky) s průměrem cca 50 µm� Urychlovací napětí 100 až 300 kV (obvyklá hodnota TEM)
Konstrukce TEM – elektronovédělo
elektromagnetická čočka průběh magnetického pole (aberace)(solenoid)
Pro ohniskovou vzdálenost elektromagnetické čočky přibližně platí:
Bz0 – magnetická indukce v místě z na oseVýhoda:možnost měnit ohniskovou vzdálenost elmag. čočky změnou proudu ve vinutí cívky (solenoidu).Nevýhoda:Magnetické pole v dutině cívky (čočky) se mění (podle obrázku) a to vede k vadám zobrazení (sférická vada, chromatická vada)
∫=2
1
).(..8
1 2z
z
zo dzzBUm
e
f
Konstrukce TEM –elektromagnetické čočky
kondenzor• fokusuje elektronové paprsky na preparát• promítá křižiště elektronové trysky na preparát • zajišťuje jeho homogenní a intenzivníozáření)objektiv• je určen k tvorbě obrazu (faktor zvětšení50 –100x)projektiv• je tvořen dalšími čočkami, které určujívýsledné zvětšení TEM a „promítají“ obraz na stínítko
Součástí elektronoptického systému v tubusu jsou clony: • Clona kondenzoru odcloní mimoosové elektronové svazky• Aperturní clona (sou část objektivu) ur čuje aperturu elektronového svazku „paprsk ů“
Konstrukce TEM – tubus TEM
Držák vzorku
1. Přesný a jemný posun (krok nm)2. Posun v osách x, y, z,3. Rychlá výměna preparátu
Konstrukce TEM – preparátovákomůrka
EM potřebuje vakuum:• ve vzduchu je elektron absorbován, (dosah elektronového svazku EM ve vzduchu je max. 1 m)• elektronové dělo musí být izolováno vakuem (vzduch nenídobrý izolant),• vzduch obsahuje molekuly O2, N2, CO2 a hydrokarbonáty, které způsobují kontaminaci tubusu a vzorku.
Vakuový systém EM je tvo řen řadouventil ů spojených s výv ěvami
Běžné hodnoty tlaku atmosférický tlak ≈ 0,1 MPa (105 Pa)tlak v kosmickém prostoru ≈ 10-7 Pa
�Vakuum v preparátové komůrce≈ 10-5 Pa� Vakuum v prostoru katody ≈ 10-5 Pa (pro LaB6), 10-7 Pa (FEG)� Vakuum v prostoru stínítka ≈10-3 Pa (je zde film pro záznam obrazu)
Konstrukce TEM – vakuový systém
Schema vakuového systému moderního TEM
3 oddělené vakuované komory1. prostor katody2. prostor preparátu3. projekční komoraTypy vývěv:• rotační vývěva (předvakuum)• difúzní olejová vývěva• iontová (Ti – sublimační, 100 litrů/s)• turbomolekulárníMěření vakua: měrkami Piraniho typuCyklus vzduchem uzavíratelných ventilů
(čerpání rotačními vývěvami cca 30 s.)Čerpání preparátové komory s výměnou
vzorku trvá několik minut.Pro kryoaplikace (biologické vzorky) je nutné
odstranit usazování ledu na povrchu vzorku (kryostat s LN2)
Konstrukce TEM – vakuový systém
Světlé a temné pole
Difrakce
TEM vysokého rozlišení
TEM Tomografie
Rentgenová mikroanalýza
Světlé a temné pole
Difrakce
TEM vysokého rozlišení
TEM Tomografie
Rentgenová mikroanalýza
Základní pracovní režimy TEM
Světlé pole - standardní režim zobrazenírovina preparátuNa tvorbě obrazu se podílí paprsky přímo procházejícípreparátem, boční difrakční maxima jsou zachycena aperturníclonou.aperturní clona (v obrazové ohniskové roviněobjektivu)(obvykle 4 – 8 průměrů AC)
Obraz světlého pole krystalu MnO(krystaly leží na tenké C vrstvě na měděné síťce)
Temné polevysunutím AC excentricky mimo osu, necháme procházet preparátem pouze paprsky 1. difrakčního maxima.Použití pro zvýšení kontrastu krystalických materiál ů
Metoda sv ětlého a tmavého pole
Příklad: dva typy elementárních buněkdvě roviny (vzdálenost rovin 1/2 délky elementární bu ňky) čtyři roviny (1/4 el.buňky)
Pro horizontální směr:
Pro dvě roviny – reciproká vzdálenost = 2 (dva body ve dvojnásobné vzdálenosti od středu), Pro čtyři roviny – reciproká vzdálenost = 4 (čtyřnásobná vzdálenost od středu) Při započítání ostatních směrů dostaneme 3D síť mřížových bodů
1. pro identifikaci krystalů,2. pro stanovení orientace krystalu.Difrakční obrazec vzniká v obrazové ohniskové rovině objektivu
(podobnost se SM) – projektiv je pro sledování obrazu zaostřen na rovinu obrazu vytvořeného objektivem. Pro studium difraktogramů je nutné přeostřit Pr na OOR.
Difraktogram Si difraktogram Si 3(hexagonální symetrie)
TEM jako difraktograf
Splnění několika podmínek:1. náklon vzorku tak, aby umožnil pr ůchod elektronového svazku podél
uspo řádaných atom ů (viz. obrázek atom ů v m řížce),2. použití apertury s velmi malým pr ůměrem pro dosažení úzkého
elektronového paprsku,3. zpravidla se používá vyšší urychlovací nap ětí (nad 300 kV).
TEM obraz atom ů Si s vysokým rozlišenímvzdálenost mezi atomy (bližšími) 0,14 nmskutečná struktura (vlevo nahoře)
Azbestová vlákna na síťce struktura azbestu s vysokým rozlišením
HRTEM - elektronová mikroskopie s vysokým rozlišením
HRTEM (High Resolution Transmission Electron Microscopy)
TEM tomografieCo je třeba k získání 3D informace?
Každý obrázek je 2D projekcí z 3D objektu
Jak získat 3D informaci v TEM?
� Stereo zobrazování (TEM)� Dva stejné obrázky získané při různých náklonech dávají stereo
obraz� Nevýhoda je omezená hloubka ostrosti
� Série řezů (TEM)� Sestavení 3D obrazu ze série řezů jejich složením� Nevýhoda: značná doba pořízení dílčích řezů a jejich analýza.
Dochází ke ztrátě obrazových dat
� Tomografie (TEM)� Získání série obrazových dat z náklonu vzorku a jejich 3D
softwarová rekonstrukce� Výhoda: + rychlost (limitovaná rychlostí zpracování dat v PC
+ obraz s vysokým rozlišením (5 nm)
Automatizovaný Automatizovaný sbsběěr datr dat
ObjemovObjemováárekonstrukce rekonstrukce
obrazuobrazu
Vizualizace Vizualizace
‘3D
TEM Tomografie - princip
� Pořízení obraz ů při náklonu
� Seřazení projekcí
� Rekonstrukce
� Vizualizace a analýza
TEM Tomografie - princip
� Pořízení obrazů při náklonu
� Seřazení projekcí
� Rekonstrukce
� Vizualizace a analýza obrazu
TEM Tomografie - princip
� Pořízení obrazů při náklonu
� Seřazení projekcí
� Rekonstrukce
� Vizualizace a analýza obrazu
TEM Tomografie - princip
� Plně automatizovaný sběr dat
30 – 60 min.� Rekonstrukce 10 min.� Objemové rozpoznání
90 min.
BaBakkteriteriee(Movie 9 sec.)
Courtesy: Dr. Kobayashi, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Osaka, Japan
TEM Tomografie - princip
Hlavní cíl:Získat morfologickou informaci (reprodukovatelným z působem) se snahou potla čit jakékoliv artefakty preparátu.Tenká transparentní fólie – pro zachycení ultratenkých řezů tkání nebo suspenze částic�uhlíková fólie – 20 až 50 nm, �plastická fólie (Formvar ředěný v etylendichloridu <<<<0,5%) – 20 nmPodmínka : stabilita p ři proza řování elektrony, nízká zrnitost, kontrast porovnatelný se vzorkem.Příprava plastické fólie je snadn ější než čisté C vrstvy (pro HRTEM je vhodn ější C fólie)
Síťka pro TEM
– pevná podpora pro fólie (řezy) vyrobená z Cu
(antiferomagnetikum)
Označení MESHMesh 100 (100 čar/palec) Mesh 400
Příprava preparátů pro TEM
Postup nanesení fólie na sí ťkua – sklíčko ponořit do roztoku s Formvaremb – vysušení v bezprašném prostředíc – fólie splavená na hladinu vodyd – síťka na proužku papíru pod fólii
Příprava uhlíkové fólie
Příprava preparátů pro TEM
Vrstvou o tloušťce 100 nm (biologický preparát o ρ = 1 g.cm-3) prochází 50 % elektronů při UN = 50 kV →není možné pozorovat celé buňky.
Obvyklá tlouš ťka tenkého řezu 50 nm .
Pro řezání musí být tkáň speciálně připravena:� odběr tkáně (krájení v kapce fixáže na polyetylénu) nebo buněk (přímo do fixativa)� fixace� odvodn ění� kontrastování� zalití do blo čků� krájení
Příprava preparátů pro TEMUltratenké řezy
Vlastnosti ideální zalévací hmoty (Durcupan, Vestopal ,…):� rozpustnost v etanolu nebo acetonu před polymerizací,� neovlivňuje chemicky vzorek,� nezpůsobuje pnutí ve vzorku,� homogenně tuhá, ale dostatečně plastická,� stabilní při ozařování elektronovým paprskem.Bloček tkáně je párátkem přenesen na dno želatinové kapsle a zalit zalévacíhmotou.
Ořezání bločku do tvaru komolého jehlanu
Ploška by měla mít velikost 0,5 mm
Zalévání vzorku do bločkuUltratenké řezy
UltramikrotomieUltratenké řezy
Zvýraznění povrchové topografie odpařováním kovu ze strany
latexové kuličky (0,3 µm)
stínovanéa) Au b) Au–Pd
Kovy používané na stínování:� vysoká hustota,� inertnost vzhledem k chemickým vlivům a teplotě,� Au, Pd, Cr, Ni, Ge, Pt, U.� Cr pod 5 nm vykazuje granularitu.� Slitina Pt-Pd (3:1) je vhodnější než čistá platina. Slitina dává tloušťku 0,3–1,5 nm.
Stínování těžkými kovy
Vzorky silnější než 0,1 µm nemohou být studovány v TEM (rozptyl, absorpce).
Metoda povrchových replik spočívá v otisku povrchu do tenkého filmu transparentního pro elektrony (C, Formvar atd.).
Tloušťka repliky je cca 20 nm. Z důvodu malého kontrastu je dodatečně stínována.
Způsob vytvá ření replik:a - rozpuštěním vzorkub - odtržením z povrchu a odstraněním pásky
Negativní replika
Nanesení plastického (nebo C) filmu, sloupnutí (obtížné), stínování
Pozitivní replika
postup přípravy pozitivní repliky
Repliky
Freeze dryingzmražení v LN2sublimace ledu ve vakuuporovnání sušení na vzduchu a
metodou Freeze–Drying(zabrání se agregaci částic)
Při mrazovém sušení buněk může být jako mezistupeňzařazeno nanesení uhlíkového filmu pro dosažení lepšího kontrastu
Metody mrazového sušení, lomu a odpařování(Freeze Drying/ Fracturing/ Etching)
Metody umož ňují zkoumání objekt ů ve zmraženém stavu. Odpadá fixace chemickými činidly (a tedy možných chemických reakcí se vzorkem) . Rozlišení je dáno zrnitostí nanášeného kovu, z n ěhož je vyrobena replika.
Freezing Kousek tkán ě (buněčné suspenze) je rychle zmražen (LN 2) a přenesen do vakuovaného prostoru s nízkou teplotou.
Fracturing Zmrzlá tká ň je zchlazeným nožem obnažena (zlomena) a dochází k su blimaci ledu z povrchu (-90 oC) do hloubky 10 – 30 nm.Vytvo ří se reliéf povrchu. Povrchová topografie kopíruje bun ěčné membrány a organely. Povrch se bezprost ředně stínuje kovem a nanáší se C film pro vytvo ření repliky.
Postup:a. izolace tkán ěb. zmraženíc. mrazový lomd. sublimace ledue. stínování a
příprava replikyf. čišt ění repliky
Freeze fracturing (etching)
Transmisní elektronová mikroskopie (TEM)
JEM 2010 (JEOL) Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) je zobrazovací technikou využívající průchodu urychlených elektronů vzorkem a jeho zobrazenína fluorescenčním stínítku nebo záznamu na film nebo speciální CCD kameru. Podle zvoleného urychlovacího napětí je možné měřit velikosti nanočástic do 0,1 nm.
Aplikace: stanovení velikosti a distribuce částic, morfologie nanočástic, chemického složení, krystalickéstruktury.
Rozlišovací mez 0.194 nm
Urychlovací nap ětí: 80–200 kV
Zvětšení: 50–1,500 000×