36
Modul Mikroorganismen Abb.: Bakterien auf einem Filter ( 0,45 μm). Balken: 3 μm Seite Allgemeines und Sicherheitsvorschriften 4 Protokollführung 5 Themen: 1. Wachstum und ubiquitäre Verbreitung von Mikroorganismen 6 2. Wasseranalytik 13 3. Mikrobielle Gärungsvorgänge; Milchsäuregärung 19 4. Mikrobielle Gärungsvorgänge; alkoholische Gärung 24 Deuteromyceten, Exoenzyme 5. Methoden der mikrobiellen Diversitätsanalyse 29 6. Einfache Methoden der Datenbankanalyse und Bioinformatik 33 Anhang 34

Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

Modul Mikroorganismen

Abb.: Bakterien auf einem Filter ( 0,45 µm). Balken: 3 µm Seite

Allgemeines und Sicherheitsvorschriften 4 Protokollführung 5 Themen:

1. Wachstum und ubiquitäre Verbreitung von Mikroorganismen 6

2. Wasseranalytik 13

3. Mikrobielle Gärungsvorgänge; Milchsäuregärung 19

4. Mikrobielle Gärungsvorgänge; alkoholische Gärung 24 Deuteromyceten, Exoenzyme 5. Methoden der mikrobiellen Diversitätsanalyse 29

6. Einfache Methoden der Datenbankanalyse und Bioinformatik 33

Anhang 34

Page 2: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

Vorläufer (ca. 3 Milliarden J. )

Tiere Pilze Grüne S-

Bakterien

Thermotoga Aquifex

Pflanzen

Grüne Nicht-S Bakterien

Gram-positive Bakterien

Spirochaeten

Proteobakterien (Purpurbakterien) (æ Mitochondrien)

Eukarya Bacteria

Crenarchaeota

Euryarchaeota

Archaea

Cyanobakterien (æ Chloroplasten)

Beachte: Die Darstellung basiert auf Sequenzvergleichen der 16 S rRNA (Bacteria und Archaea) bzw. 18 S rRNA (Eukarya)

19.4.2012; 4h

26.4.2012; 4h

03.5.2012; 2h

10.5.2012; 4h

24.5.2012; 4h

31.5.2012; 2h

14.6.2012; 2h

21.6.2012; 2h

31.7.2012

Page 3: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

Allgemeines

Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen und ihren Aktivitäten vertraut zu werden. Von jedem Teilnehmer ist ein Protokoll anzufertigen. Das Protokollheft ist bereits im Praktikum zu führen und ist ggf. den Kursbetreuern oder dem Praktikumsleiter vorzulegen.

Zu Beginn eines jeden Kurstags werden zwei Fragen über den Inhalt des Kurses gestellt, die schriftlich zu beantworten sind. Eine Mindestanzahl von Punkten ist Voraussetzung für die erfolgreiche Teilnahme am Kurs. Eine Abschlussklausur erfolgt am Ende des Semesters.

Sicherheitsvorschriften

Zu Beginn des Praktikums werden Sie über die relevanten Vorschriften der Gefahrenstoffverordnung und Sicherheitsvorschriften (S1) belehrt.

1 Schutzkittelpflicht 2 Geschlossenes Schuhwerk 3 Essen, Trinken, Rauchen sind untersagt 4 Zum Pipettieren stets Pipettierhilfen verwenden (nie mit dem Mund pipettieren) 5 Mikroorganismen so handhaben, daß sie sich nur in abgeschlossenen Gefäßen befinden 6 Impfösen, Impfnadeln und Drigalskispatel nach Berührung mit Standortmaterial oder Anreicherungskulturen abflammen 7 gebrauchte Pipetten in die Behälter auf den Tisch stellen 8 Verunreinigungen des Arbeitsbereichs, sofort mit einem Flächen-Desinfektionsmittel (z. B. Fermacidal) aufwischen. 9 Nach dem Arbeiten die Tischflächen ebenfalls mit Flächen-Desinfektionsmittel behandeln und die Hände, besonders zwischen Fingern, mit einer Hände-Desinfektionslösung (z. B. Sterillium) desinfizieren (Einwirkungsdauer mindestens 30 sec).

Arbeitsvorgaben

Alle verarbeiteten Kulturgefäße und sonstige Ansätze werden von den Teilnehmern mit Versuchsnummer, Gr.-Nummer und anderen Kurzbezeichnungen beschriftet (Edding 3000 (schwarz), wasserfest auch beim Autoklavieren).

Mikroskope, Wasserbäder und andere Geräte sowie Glasgeräte müssen sorgfältig behandelt werden.

Für Abfälle stehen Behälter zur Verfügung. Gebrauchte Petrischalen mit Kulturen werden in Metalleimern mit Plastiksäcken gesammelt. Gebrauchte Glasgefäße werden entschriftet und am Waschbecken oder auf den Metallwagen gesammelt. In die auf dem Fußboden stehenden Plastikeimer werden benutzte Zellstofftücher und Papier gegeben. Glasabfälle kommen in den dafür vorgesehenen Behälter.

Am Ende des Praktikums hinterlassen Sie bitte Ihren Arbeitsplatz aufgeräumt und mit Desinfektionsmittel gereinigt. Die Bunsenbrenner werden gelöscht und die Gashähne geschlossen. Die Mikroskope werden ausgeschaltet, Objektträger entfernt und Objektiv und Objekttisch sorgfältig mit einem Linsentuch gereinigt, am Objektivrevolver wird das kleine Objektiv eingerastet. Die Phasenkontrastschieber der Mikroskope neueren Typs aus den Mikroskopen herausnehmen. Das Elektrokabel wird um ein Okular gewunden.

Page 4: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 4 -

? Protokollführung

� Gebundenes Heft � Handschriftlich führen

� Sofort im Kurs protokollieren � Ersten 2 Seiten für Inhaltsverzeichnis freilassen

� Eintragen auf jede Seite: Seiten-Nr., Datum des Versuchs, Überschrift des Versuchs, kurz das Versuchsziel (max. 1-2 Sätze)

� Genug Platz für Versuchsauswertung lassen, vorher Platzbedarf planen, ggf. ½ bis 2 Seiten)

� Ergebnisse (möglichst in Tabellen- oder Abbildungsform), mit Kommentaren ! � Tabellen: bevorzugt Querformat, halb- oder ganzseitig

Überschrift (was dargestellt wird), auch ggf. nötige Erklärungen in den Titel (z.B. Abkürzungen, Proben-Vorbehandlung etc.) Alle Parameter der Messung und Auswertung aufführen

1 (große) Spalte für „Sonstiges” (Beobachtungen, Kommentare) freilassen � Kurven bevorzugt Hochformat halbseitig (z.B. ½ Seite Millimeterpapier einkleben)

Achsen beschriften, Einheiten angeben Symbole groß eintragen (Reihenfolge: m à o à n….), keine „x”

Immer mit Legende: was dargestellt ist, nötige Erklärungen z. Versuch, Abkürzungen � Berechnungen: Überschrift. Nachvollziehbar. Rechenweg exemplarisch an einem Beispiel

Page 5: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 5 -

1. Kurs: Wachstum von Mikroorganismen, Medienherstellung

Werden physiologisch aktive Bakterienzellen mit geeigneten Substraten versorgt, so erfolgt eine Umsetzung dieser Substrate von den Organismen in zelleigene makromolekulare Bausteine. Die Biomasse der Zellen - und damit die Biomasse der Kultur - nimmt dabei zu. Zellwachstum erfolgt bis zu einer kritischen Zellgröße; die darüber hinausgehende Zunahme der Biomasse einzelner Zellen ist nur nach Zellteilung möglich: die Zellen vermehren sich. Das Wachstum einer Bakterienkultur lässt sich somit anhand der Zunahme der Zellzahl oder der Biomasse beschreiben.

1. Wachstumskurve einer geschlossenen Kultur, OD-Messung

Zur Anzucht von Bakterien wird vorwiegend das geschlossene Kultursystem genutzt, in dem ein geeignetes steriles Kulturgefäß (z.B. ein Erlenmeyerkolben) mit Nährmedium versehen und mit Bakterien beimpft wird. Anschließend wird die Kultur bebrütet. Dabei werden die Komponenten des Nährmediums verbraucht und das Bakterienwachstum klingt aus (bei einem offenen Kultursystem wird durch laufende Zufuhr frischen Nährmediums die Kultur in der Phase aktiven Wachstums gehalten).

Im geschlossenem System durchlaufen die Kulturen aufgrund der sich ständig ändernden Bedingungen verschiedene Phasen. Nach dem Beimpfen können die Organismen im Prinzip gleich mit der maximalen Rate wachsen (exponentielle = logarithmische Phase). Voraussetzung hierfür ist, dass sie in ihrem Stoffwechsel auf eine optimale Verwertung der Nährstoffe eingestellt sind. Sie wachsen mit dieser maximalen Rate solange, bis die Konzentration einer begrenzt vorhandenen Komponente des Mediums (dies wird in erster Linie das Substrat sein) auf limitierende Werte absinkt, so dass das Wachstum der Kultur abnimmt. Verbunden damit wird zunächst die Wachstumsrate µ geringer (Verzögerungsphase) bis das Wachstum letztlich ganz zum Stillstand kommt (stationäre Phase). Auch die Bildung von Stoffwechsel-Endprodukten kann über eine Hemmung zum Stillstand des Wachstums führen (z.B. Änderung des pH-Wertes bei der Produktion von Säuren).

Werden Zellen aus suboptimalen Wachstumsverhältnissen als Impfmaterial in frisches Medium übertragen, so sind sie zunächst nicht auf die günstigeren Bedingungen eingestellt. Die Adaptation an das frische oder ggf. geändertes Medium erfolgt in einer ersten Phase ("lag"-Phase), in der die Wachstumsrate bis zu ihrem maximalen Wert (exponentielle Phase, s.o.) gesteigert wird. Wachstumsprozesse gehorchen Exponentialfunktionen. Deren graphische Darstellung wird in halblogarithmischem Maßstab überschaubar.

Zum einen wird in dieser Auftragung der Übergang zwischen verschiedenen Wachstumsphasen deutlicher und zum anderen lässt sich die maximale Wachstumsrate (µmax) aus der Steigung des Geradenbereichs ablesen.

Im Versuch beschränken wir uns auf die Ermittlung von Parametern, die eine Quantifizierung des Wachstums auf der Grundlage der Biomasse ermöglichen. Die Geschwindigkeit des Wachstums der Biomasse folgt der Gleichung (X) = ΔX/Δt = µ•X. Die Konstante µ hat die Dimension [h-1] und wird als Wachstumsratenkonstante oder in der Literatur kurz als

Page 6: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 6 -

Wachstumsrate bezeichnet. Zur Bestimmung von µ lösen wir die Gleichung nach Umformung durch Integration: ΔX = µ •Δt X X log (X/X0) ln = = µ•t loge = 0,43429] X0 loge log Xt - log X0 ln Xt - ln X0 µ = = [h-1] d. h. X = X0 • eµ•

t

0,43429 (t - t0) t - t0 Anschaulicher als die Wachstumsrate (µ) einer Kultur ist die Verdopplungszeit td. ln 2 X0 – ln •X0 ln 2 td = = [min] ln 2 = 0,69 µ µ

Zur Quantifizierung der Biomasse einer Kultur steht eine Reihe von Methoden zur Verfügung. Direkte Methoden sind z.B. die Ermittlung von Trockengewicht, Zellprotein oder des Gesamtstickstoffs. Als indirekte Methode zur routinemäßigen Bestimmung der Biomasse hat sich die Messung der Trübung durch Lichtstreuung an den Zellen einer Zellpopulation bewährt und wird als „scheinbare optische Dichte (OD)“-Messung ausgedrückt. Wie die echte Absorption durch Pigmente folgt auch die scheinbare optische Dichte (OD)-Messung dem Lambert-Beerschen Gesetz, d. h. die Extinktion (Auslöschung, ohne Einheit) als Messgröße der OD ist linear proportional der Zell- bzw. Schichtdichte.

Φex = Φin • e-sn • c

• d

Φex / in = Strahlungsfluß des austretenden / eintretenden Lichts e = 2,71828 (Basis des natürlichen Logarithmus) sn= natürlicher Streukoeffizient (Proportionalitätsfaktor) c = Zelldichte (Partikelkonzentration) d = Schichtdicke (cm)

(A) Messung des nicht gestreuten Lichtanteils („Turbidimetrie“) (B) Messung des gestreuten Lichtanteils („Nephelometrie“)

Zu beachten: � Zur Vermeidung der Verfälschung durch Absorption durch Pigmente wird bei der OD-Messung in einem Wellenlängenbereich des Spektrums (ca. 560-600 nm) gemessen, in dem keine Pigmente der Zellen absorbieren. � Man misst nur im Bereich von OD < 0,8. In diesem Fall ist die OD der Zelltrockenmasse/ml rel. gut proportional. Bei höheren Werten ist die gemessene OD geringer als nach Lambert-Beer zu erwarten, d.h. die tatsächliche Zelltrockenmasse/ml höher.

Page 7: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 7 -

Versuch 1.1: Bestimmen Sie mit Kulturen von Escherichia coli durch Messung der OD

a) die Wachstumsrate (µ) b) die Verdopplungszeit (td)

c) ggf. die Zeit vom Animpfen bis zum Erreichen der exponentiellen Phase

Material: Schüttelwasserbad mit passenden Einsätzen; Photometer, 2 Stationen zum Animpfen der Kulturen (mit je 1 Übernacht-Kultur und sterilen 10 ml Pipetten). Pro Gr.: 1 x 300 ml E.-Kolben mit 100 ml LB-Medium, 1 ml Pipette plus Spitzen, 1x1 cm Halbmikro-Einmal-Küvetten, Gefäß für gebrauchte Pipetten, Desinfektionslösung (Sterillium), 3 Eisbäder, 5 Reagenzgläser (RG), halblog-Papier, Taschenrechner (mitzubringen).

Vorsicht: Escherichia coli ist nicht typischerweise pathogen. Dies bedeutet jedoch nicht, dass mit diesem Bakterium sorglos umgegangen werden kann. Ein Auftreten in größeren Mengen kann, z.B. über Hautverletzungen zur Infektion führen. Es gilt das grundsätzliche Gebot des sauberen bzw. sterilen Arbeitens in der Mikrobiologie.

Durchführung: Jede Gr. beimpft eine Kultur von Escherichia coli, die in LB-Medium (siehe Versuch 1.2.) als Schüttelkultur (= gute Belüftung) entweder bei 37°C (optimale Wachstumstemperatur; gerade Gr.-Nr.) oder bei 30°C (suboptimale Wachstumstemperatur; ungerade Gr.-Nr.) bebrütet wird (Anzucht in 300 ml Erlenmeyerkolben, Kulturvolumen 100 ml). Um gutes Wachstum zu erhalten, sollten die Kulturen mit einer OD600 von 0.1 (Messung in Halbmikro-Küvetten; 1,0 cm Strahlengang) angeimpft werden. Probennahme mit sterilen Glaspipetten oder 1 ml Pipette, in Abständen von ca. 30 min (Zeiten genau protokollieren!)

Ist die Messung nicht sofort nach der Probenahme möglich, Proben im Eisbad rasch abkühlen und dort bis zur Messung aufbewahren. Vor der Messung die Proben kurz aufschütteln, dabei Schaum- oder Bläschenbildung vermeiden! Ab OD = 0,5 muss die Probe vor der Messung mit Medium verdünnt werden, damit die Messung weiterhin im linearen Bereich erfolgen kann.

? Tragen Sie die Messwerte in halblogarithmischem Maßstab gegen die jeweilige Kulturdauer auf und berechnen Sie die Wachstumsrate (µ) und die Verdopplungszeit (td).

2. Luftkeimplatten

Die Luft enthält feine Wassertröpfchen und kleine Partikeln als Schwebestoffe, an die Bakterien oder Pilzsporen angeheftet sein können. Die Zusammensetzung solcher in der Luft enthaltenen Populationen wird durch den Grad der Luftfeuchtigkeit, die Temperatur, Art und Intensität der Strahlung oder auch durch spezifische Keimquellen (z.B. Antibiotika-resistente Bakterien in Krankenhäusern) bestimmt. Bei niedrigem Feuchtigkeitsgehalt der Luft und intensiver Sonnenstrahlung bleiben nur wenige Organismen vermehrungsfähig. Viele dieser Bakterien sind daher pigmentiert, bilden Sporen oder haben einen hohen GC-Gehalt der DNA. Auf Luftplatten findet man häufig Vertreter der Gattungen Micrococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia und Streptomyces, sowie Hefen der Gattung Rhodutorula.

Versuch 2: Anreicherung von Keimen aus der Luft.

Material: Jede Gr. erhält je 1 LB-Agar-Platte und 1 Malz-Agar-Platte (siehe Anhang).

Durchführung: An einem vom Kursleiter angegebenen Standort werden die Petrischalen für 30 min mit abgehobenem Deckels exponiert. Die beschrifteten Platten [Gr.-Nr., Standort] werden anschließend bei 30°C bebrütet. Auswertung im 2. Kurs.

Page 8: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 8 -

3. Mikroskopische Betrachtung einer Mischkultur

Über einige Kurstage hinweg werden Sie Experimente mit einer vorgegebenen Mischkultur durchführen. Das Ziel ist es die Mikroben aus der Mischung zu vereinzeln. Dies soll durch Auswahl geeigneter Medien oder durch Zugabe bestimmter Substanzen zu den Medien erfolgen. Die Strategie der Anreicherung ist begründet auf physiologischen Eigenschaften der Organismen. Versuchen Sie diese Eigenschaften zu verstehen, damit Ihre Experimente gelingen können. Wenn Ihre Isolierung erfolgreich verläuft, dann haben Sie nicht nur viele Basistechniken in der Mikrobiologie erlernt, sondern sind auch in der Lage einfache Anaerobier zu isolieren.

Die vorgegebene Mikrobenmischung enthält:

1. Einen Hefestamm

2. Ein Purpurbakterium

3. Einen fakultativen Denitrifizierer

4. Einen aeroben Sporenbildner

In den letzten Kurstagen werden wir Ihre Isolate phylogenetisch über 16S rRNA-Gen Analyse untersuchen. Wir kennen die Ausgangsstämme und können somit überprüfen, ob Sie Kontaminationen angereichert oder steril gearbeitet haben.

In der Mikrobiologie ist man auf die Phasenkontrastmikroskopie angewiesen. Diese bringt zwar keine Verbesserung der Auflösung mit sich, jedoch eine bessere Sichtbarmachung von Bakterienzellen durch Erhöhung des Kontrasts. Meist ist man jedoch zur Differenzierung auf weitere Eigenschaften angewiesen.

Versuch 3: Betrachtung verschiedener Bakterienformen und ihrer evtl. Beweglichkeit aus einer definierten Mischkultur bei hoher Auflösung (100er Objektiv) im Phasenkontrast.

Material: Flüssig-Mischkultur. Phasenkontrastmikroskop

Durchführung: Entnehmen Sie mit einer abgeflammten Impföse einen Tropfen aus der vorgegebenen Mischkultur, geben Sie diesen auf einen Objektträger und bedecken Sie ihn mit dem Deckgläschen. Objektträger und Deckgläschen nur an den Rändern anfassen! Am Objektivrevolver wird zunächst das 10er Objektiv (10/0,25) eingestellt und geköhlert. Erst danach wird für das Phasenkontrastverfahren justiert. Die Betrachtung der Zellen erfolgt mit dem 100er Phasenkontrast-Objektiv (100/1,25 Oil, Ph 3). Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas unterhalb des Objektives und drehen Sie das 100er Objektiv direkt in das Öl (Objektträger-Tisch nicht erneut bewegen!). Bewegen Sie dann den Objekttisch unter mikroskopischer Kontrolle mit dem Feintrieb langsam nach oben bis die Zellen im Bild erscheinen.

? Skizzieren Sie die Zellformen in der Mischkultur und protokollieren Sie die beobachteten Formen, evtl. Beweglichkeit (aktive Bewegung nicht mit passiver Brown'scher Molekularbewegung oder Strömung verwechseln).

Page 9: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 9 -

4. Ansetzen von Nähragar

Alle in diesem Versuch hergestellten Medien sind komplexe Vollmedien, die die Nährstoffansprüche einer Vielzahl an Bakterien erfüllen. Die Zugabe von Nitrat, Äpfelsäure, oder Kanamycin gibt aber Denitrifizierern, Purpurbakterien, bzw. Eukaryoten einen Wachstumsvorteil, den wir im Kurs ausnutzen wollen.

Versuche 4: Ansetzen von Denitrifizierer-, RÄH-, LB- und YPD/Amp-Nähragar. Gießen von Agarplatten.

Material: Autoklav, pH-Meter bzw. pH-Papier, Komponenten der Medien (Anhang), E.-Kolben, Plastikbecher, Rührstab, Waage

Durchführung:

Die Gruppen 1-4 setzen den Denitrifizierer-Nähragar an.

Die Gruppen 5-8 setzen RÄH-Nähragar an.

Die Gruppen 9-12 setzen LB-Nähragar an.

Die Gruppen 13-15 setzen YPD/Amp-Nähragar an.

Jede Gruppe wiegt zunächst alle Komponenten bis auf den Agar für 300 ml Nährmedium in einem Plastikbecher ein. Danach werden ca. 200 ml Wasser zugegeben und es wird der pH-Wert eingestellt. Erst danach wird mit Wasser auf 300 ml aufgefüllt (Messzylinder!). 6 g Agar werden in eine leere 500 ml Schottflasche gegeben und das Medium wird in die Flasche eingefüllt.

Zunächst: â 6 g Agar Dann erst â 300 ml Medium in 500 ml Schottflasche

Anschließend werden die Kolben 20 min im Autoklaven sterilisiert.

Gießen von Nähragar-Platten: Da das Autoklavieren mehrere Stunden dauert, werden autoklavierte Kolben mit Agar in 60°C Wasserbädern von den Kursassistenten bereitgestellt. Jeder Kursteilnehmer soll mindestens 2 Platten nach Vorgabe der Kursleitung unter Einhaltung steriler Bedingungen an den vorbereiteten Gießstationen gießen. „Strichcode“ an den Plattenrändern.

? Protokollieren Sie die Ansätze sowie den Strichcode

Page 10: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 10 -

5. Anreicherung von Purpurbakterien und Denitrifizierern

a. Purpurbakterien

Die schwefelfreien Purpurbakterien können zwar photolithoautotroph (Licht als Energiequelle, anorganischer Elektronendonor, CO2 als C-Quelle) leben, bevorzugen aber photoorganoheterotrophe Bedingungen (organische C-Quelle). In Gegenwart von Sauerstoff können viele phototrophe Bakterien auch chemotroph wachsen (Energiegewinn über die Atmungskette). Selektive Bedingungen für ihre Anreicherung sind (a) Organische C-Quelle wie z.B. Malat, (b) Ausschluss von Sauerstoff und (c) Beleuchtung im roten Spektralbereich von Glühlampenlicht (ab 700 nm).

Versuch. 5.1: Anreicherung anoxygener schwefelfreier Purpurbakterien.

Material: Mischkultur, 25 ml Schraubdeckelflasche, Schottflasche mit RÄH Nährmedium (siehe Anhang), Glaspipetten.

Durchführung: Das Impfmaterial (1 ml) wird in die Schraubdeckel-Flaschen überführt. Anschließend werden diese luftblasenfrei mit RÄH-Medium aufgefüllt, verschlossen und zum Verbrauch des gelösten Sauerstoffs zunächst für 1-2 h im Dunkeln bei 30°C bebrütet. Dann werden die Flaschen im Lichtbrutraum mit Glühbirnen bestrahlt (ca. 3.000 Lux).

b. Denitrifizierer

Viele Prokaryoten sind nicht auf Sauerstoff angewiesen um zu atmen. Die Natur stellt eine Vielzahl potentieller anderer Elektronenakzeptoren für Sauerstoff-unabhängige Atmungsvorgänge zur Verfügung. Dazu gehört zum Beispiel Nitrat im Boden, oder Sulfat im Meerwasser. Generell erlauben Atmungsvorgänge im Vergleich zu Gärungswegen eine höhere Energieausbeute pro umgesetzter Kohlenstoff- und Elektronenquelle (warum?). Aber auch Atmung per se erlaubt nicht immer einen äquivalenten Energiegewinn. Vielmehr ist dieser abhängig vom Redoxpotential des verfügbaren Elektronenakzeptors. Je höher das Potential des Elektronenakzeptors, desto mehr Energie kann erhalten werden, da mehr Protonen-pumpende Schritte an der Membran durchgeführt werden können. In diesem Versuch starten wir die Isolierung des Denitrifizierers der Mischkultur mit einem Komplexmedium, das Nitrat als Elektronenakzeptor enthält.

Versuch 5.2: Anreicherung von Denitrifizierern

Material: Mischkultur, 25 ml Schraubdeckelflasche, Erlenmeyer-Kolben mit Denitrifizierer-Nährmedium (siehe Anhang), Glaspipetten.

Durchführung: Das Impfmaterial (1 ml) wird in die Schraubdeckel-Flaschen überführt. Anschließend werden diese luftblasenfrei mit Denitrifizierer-Medium aufgefüllt, verschlossen und im Dunkeln bei 30°C bebrüte

Page 11: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 11 -

6. Aufbau einer Winogradsky-Säule

Sergej Winogradsky war ein russischer Mikrobiologe. In den nach ihm benannten Säulen wird ein vollständiges aquatisches Ökosystem nachgestellt. Wir möchten diesen Versuch mit Ihnen durchführen, damit Sie ein Gefühl für die weitreichenden physiologischen Möglichkeiten von Mikroben bekommen und sehen auf welch kleinem Raum sich ökologische Nischen bilden können. Dabei sind die Vorgänge, die in einer Winogradsky Säule ablaufen, sehr komplex. Wir wollen versuchen die unterschiedlichen Abläufe Stück für Stück über mehrere Kurstage verteilt zu beleuchten.

Winogradsky-Säulen verursachen ein wenig Gestank. Daher sollen bitte jeweils 4 Studenten eine Säule aufbauen und beobachten. Wir geben Ihnen zwei mögliche Aufbauten zur Wahl.

Aufbau 6 A): Cellulose als Kohlenstoffquelle für eine Winogradsky-Säule

Material: Eine Mischung aus 0,5 g CaCO3, 5 g Heu, 10 g CaSO4 mit 200 g Schlamm; Schlamm; Teichwasser; PET-Flasche

Durchführung: Schneiden Sie die PET-Flasche auf, so dass Sie einen oben offenen Zylinder erhalten. Füllen Sie den Boden mit 5-7 cm der Schlamm-Mischung. Packen Sie den Schlamm mit einer Glaspipette und entfernen Sie dabei größere Luftblasen. Füllen sie weitere 2,5 cm mit dem nicht behandelten Schlamm auf. Füllen Sie die Flasche mit Teichwasser und verschließen Sie sie mit Aluminiumfolie. Stellen Sie die Flasche an einen beleuchteten Ort. Eine Gruppe wird eine Kontrollsäule erstellen, die wir vollständig mit Alufolie einpacken.

ALTERNATIV Aufbau 6B): Hackfleisch als Kohlenstoffquelle für eine Winogradsky Säule

Material: Hackfleisch, 1:1 Mischung aus CaSO4 und Schlamm, Sand; PET-Flasche; Teichwasser

Durchführung: Schneiden Sie die PET-Flasche auf, so dass Sie einen oben offenen Zylinder erhalten. Füllen Sie den Boden mit 1 cm Hackfleich. Packen Sie die Schlamm-CaSO4 Mischung 4 cm hoch darauf. Setzen Sie eine dünne Sandschicht auf den Schlamm. Füllen Sie die Flasche mit Teichwasser und verschließen Sie sie mit Aluminiumfolie. Stellen Sie die Flasche an einen beleuchteten Ort. Eine Gruppe wird eine Kontrollsäule erstellen, die wir vollständig mit Alufolie einpacken.

Page 12: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 12 -

2. Kurs Bakteriologische Wasseruntersuchung

Für eine Prüfung der mikrobiologischen Qualität von Wasserproben (z.B. Fluss-, Teich- und Abwasser) bestimmen wir zunächst die Lebendkeimzahl/ml (koloniebildende Einheiten/ml) auf GPH-Medium. Sie gibt einen ersten Anhaltspunkt für den Verschmutzungsgrad des Wassers (hohe Keimzahlen lassen ggf. auch Pathogene vermuten). Wir prüfen dann qualitativ und quantitativ auf Enterobakterien bzw. auf Coliforme (Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella), indem auf selektiven Nähragarplatten ausplattiert wird. Im Fall keimarmer Wasserproben kann man das Membranfilterverfahren anwenden. Wir führen in dem Kurs auch eine Titerbestimmung Coliformer durch. Die endgültige Identifizierung von Escherichia coli als Indikator-Bakterium für Verschmutzung durch Fäkalien erreicht man z. B. durch die Verwendung von Enterotubes. Eine vollständige bakteriologische Wasseruntersuchung schließt auch die Prüfung auf Enterokokken, Clostridien und Pseudomonaden ein, ist aber aus Zeitgründen im Kurs nicht durchführbar. Die Prüfung auf pathogene Bakterien wie z.B. Salmonellen ist Aufgabe von Speziallaboratorien). Zur Prüfung von Wasser (z.B. Leitungs- oder Flusswasser) auf Trinkwasserqualität erfassen wir im Kurs die mikrobiologische Besiedelung semiquantitativ: in 100 ml Trinkwasser darf keine E. coli (oder andere Coliforme) Zelle enthalten sein. Keimzahl/ml Eignung als Trinkwasser Eignung als Badewasser

< 100 + + 100-300 bedingt + > 300 nur nach Abkochen bei Nachweis von E. coli nur bedingt Coliforme/ml < 0,01 + + 0,01 - bedingt 1 - bedingt 10 - - 1. Mikrobiologische Qualität von Fluss-, Teich- und Abwasser 1.1. Lebend-Keimzahlbestimmung (auf GPH-Platten)

Versuchsziel: Bestimmung der Lebend-Keimzahl/ml in verschiedenen Wasserproben (vermehrungsfähige Keime unter aeroben Bedingungen auf Vollmedium).

Vorsicht: bei den Abwasserproben (ggf. Pathogene) besondere Sorgfalt beim mikrobiologischen Arbeiten: Schutzhandschuhe, Platten mit Parafilm verschließen und zur Auswertung nicht öffnen.

Material: Verschiedene, zu prüfende Wasserproben, 5 sterile Reagenzgläser, Reagenzglasständer, 1 ml und 5 ml Pipetten, sterile physiol. NaCl, Bunsenbrenner, Vortex, 5 GPH-Nähragar Platten (gut getrocknet), Drigalski-Spatel, Schale mit Ethanol, Filzstift oder Zählgerät mit Punkter. è Auswertung nächster Kurs.

Page 13: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 13 -

Durchführung: Gr 1-2 Trinkwasser aus Kursraum (Hahn vor Probennahme mit Alkohol desinfizieren + Wasser ca. 3 min laufen lassen), Gr. 3-4 stilles Mineralwasser, Gr 5-7 Flusswasser (Rhein), Gr 8-10 Teich am Schloss, Gr 11-12 Knielinger See, Gr 13-15 Abwasser (Kläranlage), Schutzhandschuhe! Zur Bestimmung müssen Sie von der Wasserprobe zunächst eine dezimal abgestufte Verdünnungsreihe herstellen. Beachte: � exaktes quantitatives und steriles Arbeiten � vor jeder Probenentnahme gut mischen und für jede Verdünnungsstufe getrennte Pipette benutzen. Kontrolle: unbeimpfte GPH-Platte (durch Kursassistenz).

Rö Verdünnungsverhältnis (-faktor) Ansetzen

1 unv. (100) 15 ml Probensuspension (unverdünnt) 2 1:10 (10-1) 0,5 ml v. Rö 1 + 4,5 ml sterile physiol. NaCl 3 1:100 (10-2) 0,5 ml v. Rö 2 + 4,5 ml “ 4 1:1.000 (10-3) 0,5 ml v. Rö 3 + 4,5 ml “ 5 1:10.000 (10-4) 0,5 ml v. Rö 4 + 4,5 ml “

Dann pipettieren Sie von jeder Verdünnungsstufe exakt 0,1 ml auf die Oberfläche von vorbereiteten GPH-Platten (beginnend mit Rö 5, ohne Pipettenwechsel). Streichen Sie dann sofort bei jeder einzelnen Platte (ansonsten lokales festsetzen) mit dem Drigalski-Spatel bei schräg und nur leicht geöffnetem Deckel gleichmäßig und vollständig flächendeckend aus. Bebrütung bei 37oC (48 h) .

? Auszählung makroskopisch oder mit der Lupe (ggf. Zählgerät), mit Filzstift auf Plattenunterseite “punkten”. Gut auszuzählen sind 30-300 Kolonien/Platte. Errechnen Sie die Lebendkeimzahl/ml. è Auswertung nächster Kurs

1.2. Keimzahlbestimmung von Coliformen Enterobakterien (auf MacConkey-Platten)

Versuchsziel: Nachweis des selektiven Wachstums von Enterobakterien auf MacConkey-Platten. MacConkey-Platten enthalten Gallensalze und Kristallviolett, die beide Wachstum von Enterobakterien erlauben und zugleich andere Bakterien unterdrücken. MacConkey-Platten enthalten Lactose und einen pH-Indikator zum Nachweis von Lactoseverwertung und damit der wahrscheinlichen Anwesenheit von Coliformen.

Material: wie V 1.1; 5 MacConkey-Agarplatten

Durchführung: wie bei Versuch 1.1: Plattieren Sie je 0,1 ml von den Rö 5 bis 1 (von Versuch 1.1.) mit dem Drigalski-Spatel auf vorgegebenen MacConkey-Platten aus.

Kontrolle: verschiedene Enterobacteriaceae-Arten auf MacConkey-Platten (durch Kursassistenz). Bebrütung bei 37 °C (24 h).

? Wie bei Versuch 1.1. Die Eigenschaften der Kolonien erlauben zu differenzieren: farblos, transparent (Salmonella, Shigella), rot, groß, trüber Hof (Escherichia coli), rosa, groß, schleimig (Enterobacter, Klebsiella), sehr klein, vereinzelt, opak (Enterococcen, Staphylococcen u. a) è Auswertung nächster Kurs

Page 14: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 14 -

1.3 Keimzahlbestimmung coliformer Bakterien mit dem Membranfilterverfahren Versuchsziel: Anwendung des Membranfilterverfahrens zur Konzentrierung von Keimen in keimärmerem Wasser. Wenn man quantitativ arbeitet und nach der Filtration die Filter auf ENDO-Platten bebrütet, erhält man die Keimzahl Coliformer/ml. Material: Verschiedene Wasserproben, sterilisiertes Membranfiltergerät, Membranfilter (0,2 µm), Pinzette, Schale mit Ethanol, Bunsenbrenner, Wasserstrahlpumpe, ENDO-Nähragarplatten.

Durchführung: [DEMO] Es werden jeweils 25 ml von Leitungs-, Rhein-, stilles Mineral-, oder Teichwasser durch einen bakteriendichten Membranfilter (0,2 µm) filtriert. Auf das vorsterilisierte Gerät wird mit einer sterilen Pinzette ein Membranfilter gelegt. Nach Aufsetzen des Trichteraufsatzes, Verriegelung, Zugabe des Probenvolumens und Öffnung des Hahns des Filtertisches wird das Wasser mittels einer Wasserstrahlpumpe durch den Filter gesaugt. Nach weiteren 5-10 sec Absaugen zur Entfernung von Restwasser wird die Membran mit der sterilen Pinzette mit der Oberseite nach oben auf ENDO-Agarplatten gelegt (es diffundiert genügend Nährmedium durch den Filter). Bebrütung bei 37 °C (24 h).

? Wie bei Versuch 1.1.und 1.2. Coliforme wachsen auf ENDO-Platten als rote, feuchte Kolonien. è nächster Kurs

1.4. Titerbestimmung Coliformer

Versuchsziel: Quantitative Erfassung Coliformer in Teich-, Fluss-, bzw. Abwasser durch Titerbestimmung.

Der “Titer” einer Bakterienart ist das kleinste Volumen [ in ml ausgedrückt] einer Wasserprobe, das in Lactose-Bouillon gerade noch Wachstum dieser Bakterien zeigt. Coliforme erkennt man durch Lactosevergärung bei 37 °C unter Säure- (Bromkresolpurpur als pH-Indikator) und Gasbildung (Durham-Rö).

Material: Wasserproben und Verdünnungen aus Versuch 1, 1 großes, steriles Rö (Test-Rö a) gefüllt mit 10 ml doppelt konz. DEV-Lactose-Bouillon, 5 sterile Rö (Test-Rö b-f) gefüllt mit je 5 ml DEV-Lactose-Bouillon, 1 ml und 5 ml Pipetten, sterile physiol. NaCl, Lactose-Bouillon, Durham-Röhrchen, Bunsenbrenner.

Durchführung:[Gr-Aufteilung wie bei Versuch 1.1.] Wir haben zwei Vorgaben: � für die Titerbestimmung verwenden wir die unter (Versuch 1.1.) hergestellte dezimale Verdünnungsreihe (“ml von Rö-Nr” aus Versuch 1.1). �für den Nachweis von Wachstum unter Säurebildung bzw. Gasbildung in DEV-Lactose-Bouillon sind bereits Röhrchen mit DEV-Lactose-Bouillon und Bromkresolpurpur als pH-Indikator sowie Durham-Röhrchen vorgerichtet (Test-Rö. a-f der Titerbestimmung, Test-Rö a ist größer als die übrigen Test-Rö und enthält 10 ml doppelt konzentriert angesetzte DEV-Lactose-Bouillon). Pipettierschema siehe unten!!

Gehen Sie von der Verdünnungsreihe von (1.1.) aus: von der unverdünnten Wasserprobe (von 1.1.) geben Sie 10 ml in das Test-Rö a der Titerbestimmung, von den einzelnen Verdünnungsstufen 1 bis 5 (von 1.1.) geben sie je 1 ml in die Test-Rö b bis f der Titerbestimmung. Bebrütung bei 37 °C (48 h) im Brutschrank èNächster Kurs

Page 15: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 15 -

ml von Rö Nr aus 1.1 Test-Rö der Titerbestimmung Entspr. Volumen (ml),

10 ml der unverdünnten Probe a 10 1 ml von Rö 1 b 1 1 ml von Rö 2 c 0,1 1 ml von Rö 3 d 0,01 1 ml von Rö 4 e 0,001 1 ml von Rö 5 f 0,0001

? Ablesen des Titers (Wachstum? Farbumschlag von purpur à gelb? Gasbildung? è Auswertung nächster Kurs

2. 1 Verdünnungsausstrich

Mit Hilfe des Verdünnungsausstrichs mit der Impföse können Bakterien bzw. Hefezellen isoliert und Reinkulturen gewonnen werden, indem die gewünschten Zellen durch Vereinzelung auf einer verfestigten Agaroberfläche von den übrigen Zellen getrennt werden. Aus diesen Einzelzellen entwickeln sich bei Bebrütung Kolonien und nach Wiederholung ggf. Klonkulturen. Form, Farbe, Rand und Oberfläche der Kolonie können charakteristische Eigenschaften einer Bakterienkultur sein.

Die zum Ausstreichen verwendeten Impfösen bestehen aus einem ca. 6 cm langen Platin-Iridium-Draht. Das eine Ende des Drahtes ist kreisförmig zu einer Öse gebogen, das andere Ende

im Spannfutter des Kollehalters fixiert. Impfösen werden stets mit dem Halter in einem Ständer stehend aufbewahrt. Die Öse soll nie in Berührung mit anderen Gegenständen oder der Tischplatte kommen. Grundsätzlich werden Impfösen vor und nach jedem Gebrauch durch Ausglühen in der Bunsenbrennerflamme sterilisiert, und zwar im Außenkegel der prasselnden, entleuchteten Flamme. Zum Vermeiden des Verspritzens von Bakterien an der Öse wird diese zunächst im kühleren Innenkegel der Flamme getrocknet und dann im Außenkegel ausgeglüht.

Wir möchten mit dieser Technik aus unseren Flüssig-Anreicherungskulturen vom ersten Kurstag Reinkulturen gewinnen. Deswegen streichen wir etwas Material aus den Anreicherungskulturen auf entsprechende Medienplatten aus. Da wir die Zellen anaerob anziehen wollen müssen wir die Platten ohne Luftsauerstoff inkubieren. Dazu benutzt man Anaerobentöpfe und Gaspaks. Anaerobentöpfe sind gasdichte Behältnisse.

enspricht dem Titer (ml) falls Wachstum

Page 16: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 16 -

Viele Gaspaks funktionieren dabei nach folgendem Prinzip:

H2-Entwicklung/O2-Bindung

NaBH4 + 4 H2O à NaB(OH)4 + 4 H2

2H2 + O2 à 2 H2O

CO2-Entwicklung

Citronensäure + H2O + Na2CO3 à Natriumcitrat + CO2 + NaOH

Versuch 2.1: Isolierung von Einzelkolonien durch den 3-Ösenausstrich.

Material: Im 1. Kurs hergestellte Denitrifizierer- und RÄH-Agarplatten (4 pro Gr.), Anreichrungskulturen vom 1. Kurstag

Durchführung: Durch Eintauchen der ausgeglühten und wieder abgekühlten Impföse in die Anreicherungskultur werden der Suspension Bakterien entnommen und auf dem Nähragar in der Petrischale ausgestrichen. Dabei wird der Deckel der Petrischale mit den mittleren Fingern schützend über die Petrischale gehalten, während die beiden äußeren Finger die Petrischale festhalten.

Impfstriche 1 - 3 werden direkt aus der Anreicherungskultur ausgestrichen. Dann wird die Öse ausgeglüht. Nach dem Abkühlen werden die Impfstriche 4 -6 durch 1 -3 gezogen. Der gleiche Vorgang wird für 7- 9 und 10 - 13 wiederholt. Ein "Pflügen" des Agars wird vermieden, indem man die Impföse flach und ohne Druck über die Agaroberfläche gleiten läßt.

Zwei Platten/Gr:

- je eine Platte wird bei 30°C aerob inkubiert - je eine Platte wird im Anaerobentopf (Abb.) durch die Kursassistenz anaerob mit oder ohne Licht inkubiert.

Auswertung: im 3. Kurs.

2.2 Anreicherung von Sporenbildnern und Eukaryoten

a) Sporenbildende Organismen Einige Mikroorganismen sind in der Lage Überdauerungsformen zu bilden. Oftmals haben diese erstaunliche Eigenschaften. Endosporen z.B. sind stark hitzeresistent, strahlungsresistent und können in getrockneter Form über Jahrhunderte überdauern.

Daher müssen Flüssigkeiten im Labor autoklaviert werden, um tatsächlich keimfreie Medien zu erhalten. In einem Autoklaven werden die Flüssigkeiten auf 121°C erhitzt.

Deckel

Katalysator

Gaspack Platten (umgedreht, untersten beiden leer)

O2-Indikator-Streifen

Page 17: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 17 -

Diese Temperatur ist nötig, da die Endosporen bei 100°C nicht abgetötet werden. Ein Autoklav ist ein Druckbehälter, bei dem man unter gesättigtem gespanntem Dampf (2 atm = 202,65 kPa) die gewünschten 121°C erreicht.

Wir möchten die Thermoresistenz der Endossporen nutzen, um aus unserer Mischkultur den Endosporen bildenden Organismus zu isolieren.

Material: Vorgegebene Mischkultur von Nicht-Endosporen-bildenden und Endosporen-bildenden Organismen, LB-Medium, 4 RG

Durchführung: Von der vorgegebenen Mischkultur wird ein Tropfen in ein RG mit 15 ml Redcap gegeben. Nach gutem Mischen durch Schütteln werden je 5 ml in 3 leere RG gegeben. Die RG werden mit Kappen verschlossen und beschriftet. Je ein RG wird anschließend

• bei 30°C inkubiert (Kontrolle, RG Nr. 1) • 10 Min bei 80°C erhitzt (RG Nr. 2), und anschließend bei 30°C inkubiert • 20 Min im Autoklaven bei 121°C (2 atm) gehalten (RG Nr. 3) und bei 30°C inkubiert.

Auswertung: im 3. Kurs

b) Eukaryoten In der Theorie ist es ein Leichtes Eukaryoten aus einem Gemisch aus Prokaryoten zu isolieren. So wie es eigentlich auch ein Leichtes ist bakterielle Infektionen zu heilen. Das Mittel der Wahl sind dafür Antibiotika. Substanzen also die gezielt Prokaryoten hemmen (bakteriostatische Antibiotika) oder abtöten (bakterizide Antibiotika). Wir wollen dafür im Kurs Ampicillin benutzen. Ampicillin ist ein β-Lactam Antibiotikum, das dementsprechend mit dem Penicillin nah verwandt ist.

Material: Vorgegebene Mischkultur, YPD-Medium, Amp (100 mg/ml), 2 RG

Durchführung: Von der vorgegebenen Mischkultur wird ein Tropfen in je ein RG mit 5 ml YPD-Medium gegeben. Zu einem der Reagenzgläser wird von der Ampicillin Stammlösung zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 100 µg/ml erreicht wird. Beide Reagenzgläser werden bei 30 °C inkubiert.

Auswertung: im 3. Kurs

Auswertung von Kurstag 2

A) Bestimmen Sie die Nitrat und Nitrit Konzentration im unbeimpften Denitrifizierermedium und in der eine Woche alten Anreicherungskultur.

B) Mikroskopieren sie verschiedene Klone der Luftkeimplatte. Protokollieren Sie die Ergebnisse.

Page 18: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 18 -

3. Kurstag Mikrobiologie der Milch/mikrobielle Gärung

Sie werden in diesem Kurs mit den wichtigsten Bakterien, die Milch und Milchprodukte besiedeln, vertraut gemacht. Hierzu gehören insbesondere die Lactose (Milchzucker)-verwertenden Lactobacillus- und Streptococcus-Arten. Hauptprodukt der Milchsäurebakterien ist die für sie namensgebende Milchsäure. Milch verändert sich bei Lagerung zunehmend (Milch ist ein hervorragendes Substrat für Bakterien). Die an diesem Vorgang beteiligten Mikroorganismen reichern sich je nach Vorbehandlung und Lagertemperatur an und bringen charakteristische Veränderungen der Milch mit sich. Eine laufende mikrobiologische Kontrolle von Milch und Milchprodukten ist daher aus hygienischer und ernährungsphysiologischer Sicht von Bedeutung. Für die Herstellung der meisten Milchprodukte wird die Milch zunächst pasteurisiert, anschließend werden definierte Starterkulturen als "Säurewecker" zugegeben. Wir verwenden nichtpasteurisierte Milch, um die natürliche, ungestörte mikrobiologische Besiedelung zu erfassen.

1) Säuregrad (SH-Wert) und pH der Milch 2) Reduktase-Probe, Keimzahlbestimmung 3) Mikroskopische Untersuchung von Milchkeimen

1. Säuregrad (SH-Wert) und pH der Milch Versuchziel: Messung der pH und SH-Werte von 100 ml Milch unterschiedlichen Alters.

Der Gehalt an Milchsäure und anderen Säuren in der Milch wird von Praktikern als “Säuregrad” (SH, von Soxhlet-Henkel) bezeichnet. Der SH-Wert ist die ml-Anzahl an 0,25 M NaOH, die bis zum Farbumschlag der Phenolphthaleinlösung für 100 ml Milch benötigt werden. Obwohl frisch gemolkene Milch noch keine Milchsäure enthält, beträgt der pH-Wert 6,6 und der SH-Wert 7 [ml]. Der leichte Säuregehalt ist durch Phosphate, CO2 und 0,2% Zitronensäure bedingt. Die bei Lagerung von Milch durch Milchsäurebakterien einsetzende Säuerung beginnt bei SH 8,5 deutlich wahrnehmbar zu werden, bei SH 25-30 (entspricht pH 4,6-5,0) tritt Selbstgerinnung ein.

Material: Verschiedene Milchproben, Phenolphthaleinlösung (1%ig, in 70%igem Ethanol), 0,25 M NaOH, Bürette, Stativ mit Klammern, 300 ml E.-Kolben, Magnetrührer, Magnetstab, Messzylinder (100 ml), Magnetstabentferner, pH-Indikator „Spezial-Indikator 4,0 - 7,0“ (Merck Artikel-Nr. 9542)

Durchführung: [alle Gr] Messen Sie zunächst mit pH-Papier den pH-Wert ihrer Milchprobe. Für die Bestimmung des SH-Werts wird die Milch (100 ml) mit 5 Tropfen Phenolphthaleinlösung versetzt und unter Rühren mit 0,25 M NaOH (Schutzbrille) bis zum Eintreten von Rotfärbung titriert (Farbumschlag von farblos nach lachsfarben: pH 8,2-9,2):

Frischmilch 3 Tage alt 7 Tage alt

4 °C Gr. 1 Gr. 5, 6 Gr. 11, 12 22 °C Gr. 2 Gr. 7, 8 Gr. 12, 13 37 °C Gr. 3, 4 Gr. 9, 10 Gr. 14, 15

? Feststellung und Diskussion der pH- und SH-Werte. Berechnen Sie aus dem SH-Wert die Säurekonzentration (mM) in Ihrer Milchprobe

Page 19: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 19 -

2. Reduktase-Probe, Keimzahlbestimmung 2.1 Reduktase-Probe

Versuchsziel: Messung der Reduktase-Aktivität in Milch unterschiedlichen Alters und Lagertemperatur.

Einen ersten Hinweis auf die mikrobiologische Güte von Milch erhält man durch Messung der sog. “Reduktase-Aktivität” (sie gibt ein grobes Maß für die Zunahme an Bakterien). Die Bildung reduzierender Stoffe erfolgt überwiegend durch Gärungsfermente (hier zusammengefaßt als "Reduktasen" bezeichnet) von in der Milch wachsenden Bakterien. Bei der zur Messung der Reduktase-Aktivität (und damit Bakterienzahl) durchgeführten “Resazurin”-Probe wird der Farbwechsel des Redoxindikators Resazurin vom oxidierten blauen über rosa) bis hin zum reduzierten (farblosen) Zustand nach 60 min Inkubation bei 37°C beobachtet.

Material: Verschiedene Milchproben, Resazurin-Lösung, 2 Reagenzgläser, Reagenzglasständer, 1 ml und 10 ml Pipetten, Wasserbad (37°C)

Durchführung:[Gr-Aufteilung wie bei 1.] Geben Sie in zwei Reagenz-Röhrchen je 1 ml Resazurin-Lösung und danach 10 ml Milch, dann gut mischen und 60 min (37 °C) bebrüten.

? Farbton ablesen: Ungefährer Keimgehalt/ml Milchklasse pastellblau < 0,5 x 10

6 (I) gut

blauviolett 0,5-4 x 106

(II) mäßig rotviolett 4-20 x 10

6 (III) schlecht

rosarot bis farblos > 20 x 106

(IV) sehr schlecht

2.2. Keimzahlbestimmung von Milchproben

Versuchsziel: Keimzahlbestimmung von Milch durch Ausplattieren auf Chinablau-Lactose-Agar (Koch´sches Plattengussverfahren).

Heute gebräuchlicher als die Reduktase-Probe ist die Keimzahlbestimmung von Milch durch Ausplattieren auf Chinablau-Lactose-Agar (Koch’sches Plattengussverfahren). Die wichtigsten Arten, welche die geringe Haltbarkeit bei > 10 °C gehaltener Milch bedingen und die auch den Hauptanteil an der Gesamtkeimzahl darstellen, sind Streptococcus lactis und Lactobacillus lactis. Bei frischer Milch überwiegen Streptococcen (“Stecknadelkopf”-Kolonien), bei älterer Milch, d. h. ab pH < 4,5 Lactobacillen (größere, glänzende Kolonien). Auf Malzextrakt-Agarplatten lassen sich große, flauschige Kolonien von Hefen (z.B. Candida), sowie verschiedene Pilzkolonien nachweisen.

Material: Versch. Milchproben (4-6), Chinablau-Lactose-Agar, Malzextrakt-Agar; Petrischalen, 6 Reagenzgläser, Kappen, Reagenzglasständer, steriles physiol. NaCl, sterile 1 ml und 5 ml Pipetten, Schalen mit Ethanol, Wasserbad

Durchführung: [Gr 2, 4, 6] Frischmilch (4 °C), [Gr 8, 10, 12] Frischmilch (22 °C), [Gr 1, 3] 3 Tage alte Milch (4 °C), [Gr 5, 7] 3 Tage alte Milch (22 °C). [Gr 9, 11] 7 Tage alte Milch, (22 oC), [Gr 13, 14, 15] 7 Tage alte Milch 4°C . Von den verschiedenen Milchproben ist – unter sterilen Bedingungen - eine dezimale Verdünnungsreihe herzustellen, wobei für jede Verdünnungsstufe eine getrennte Pipette zu verwenden ist.

Page 20: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 20 -

Rö Verdünnungsverhältnis Ansetzen (* physiol. NaCl) 1 unverdünnt 5,0 ml Probensuspension 2 1:10 0,5 ml v. Rö 1 + 4,5 ml* 3 1:100 0,5 ml v. Rö 2 + 4,5 ml* 4 1:1.000 0,5 ml v. Rö 3 + 4,5 ml* 5 1:10.000 0,5 ml v. Rö 4 + 4,5 ml* 6 1:100 000 0,5 ml v. Rö 5 + 4,5 ml*

Vor dem Beschicken der Petrischalen mit den Proben und dem Agar bereiten Sie 12 Petrischalen vor, indem Sie 6 Petrischalen mit C1-C6 (C=Chinablau-Lactose-Agarplatten; 1-6=entsprechende Verdünnungsstufe) und weitere 6 Petrischalen mit M1-M6 (M-Malzextrakt-Agarplatten; 1-6=entsprechende Verdünnungsstufe) beschriften.

Für das Koch’sche Plattengußverfahren pipettieren Sie von den Rö 1 bis Rö 6 jeweils exakt 0,1 ml in die entsprechende Petrischale, wobei Sie mit der höchsten Verdünnungsstufe beginnen (mit gleicher 0,1 ml Pipette fortlaufend zu den geringeren Verdünnungsstufen). Gießen Sie anschließend jeweils ca. 20-30 ml vorsterilisierten, auf 46°C vortemperierten Agar (Chinablau-Lactose-Agar) in C1-C6 bzw. Malzextrakt-Agar in M1-M6) zu und verteilen Sie sofort das Impfmaterial gleichmäßig im flüssigen Agar durch kreisförmige Bewegung der Petrischale auf der Tischplatte (Deckel dabei leicht öffnen, um Benetzen des Deckels zu vermeiden). Beachte: � auf exaktes quantitatives Arbeiten achten � vor jeder Probenentnahme gut mischen � Bei jeder Platte jeweils sofort verteilen � steril und rasch arbeiten.

Platten nicht umdrehen, nach Erstarren im Kursraum bei 30 °C (48 h) bebrüten. Parallelansätze sind durch die Nachbargruppen gewährleistet. Milchsäurebakterien bilden auf dem bei pH > 7 graublauen Nährboden hell- oder dunkelblaue Kolonien unter Blaufärbung des Nährbodens, Nichtsäurebildner bilden weiße/graue Kolonien.

? Bestimmen Sie die Lebendkeimzahl/ml sowie die Anzahl an Milchsäurebakterien/ml auf den Chinablau-Lactose-Agarplatten (Auszählung makroskopisch oder mit der Lupe, evtl. mit Zählgerät, 30-300 Kolonien/Platte sind am besten auszuzählen, dabei Kolonien mit Filzstift auf Plattenunterseite punkten). Auf den Malzextrakt-Agarplatten bestimmen Sie ebenfalls die Lebendkeimzahl sowie die Anzahl der Milchschimmelsporen und Hefezellen in der ursprünglichen Milchprobe. Kontrollieren Sie lichtmikroskopisch die Zellformen è Auswertung nächster Kurs

Page 21: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 21 -

4. Weinherstellung durch Hefe. Messung des Gärungsverlaufes durch quantitative Bestimmung der Zucker- und Alkoholkonzentration

Messung des Gärungsverlaufes in einem Gäransatz mit Traubensaft und Hefe. Messung der Gewichtsabnahme des Gäransatzes aufgrund der Kohlendioxid-Freisetzung bei der alkoholischen Gärung durch Hefe. Die Gewichtsabnahme dokumentiert - nach einer langsamen Angärphase - die starke Produktion von Kohlendioxid in der stürmischen Gärphase. Unter aneroben Bedingungen gärt Hefe intensiv, wächst aber kaum. Bei Belüftung geht die Gärung zugunsten der Atmung zurück und lässt sich bei einigen Hefen dadurch fast völlig unterdrücken (Pasteureffekt).

Material: je Ansatz: 0,4 g gefriergetrocknete Hefe, 1 l weißer Traubensaft, 1 l Erlenmeyer-Weithalskolben, Gärröhrchen, durchbohrter Gummistopfen, Waage

Durchführung:[acht Ansätze pro Kurs] In einem Gärkolben (1000 ml Erlenmeyerkolben) werden 980 ml Traubenmost gefüllt, dem 0,4 g gefriergetrocknete Hefe (in sterilem Wasser bei 30 oC zuvor gelöst) zugesetzt wird. Nach der Befüllung des Kolbens wird kurz durchgeschüttelt, und der Gärkolben mit einem Gärverschluss versehen. Der Gärverschluss besteht aus einem durchbohrten Gummistopfen und dem darin eingesetzten Gärröhrchen. Im Gärröhrchen ist Wasser als Sperrflüssigkeit eingefüllt. Der gesamte Gärkolben wird genau gewogen und anschließend bei Raumtemperatur inkubiert.

Probenentnahmen: � Gleich zu Beginn des Ansatzes � am 4. Tag und � am 7. Tag (nächster Kurstag) werden mit einer sterilen 10 ml-Pipette jeweils 10 ml steril entnommen und in ein steriles 10 ml Plastik-Rö gegeben und tiefgefroren. In den tiefgefrorenen Proben wird am nächsten Kurstag der Zucker- und Alkohol-Gehalt quantitativ bestimmt. Gewichtskontrolle : jeden Tag!

Messung der Massenabnahme: Der Kolben wird � gleich nach Ansetzen, � am 4. Tag und � am 7. Tag genau gewogen (auch täglich ein- bis zweimal vorsichtig geschüttelt). Organisieren Sie das Ablesen und die Probenentnahme!! Gewichtsabnahme protokollieren (beachte: die Probenentnahme gewichtsmäßig berücksichtigen!).

? Geruchs- und Geschmacksprobe. Quantitative Bestimmung von Glucose und Ethanol in den Proben durch enzymatische Bestimmung (siehe nächster Kurs). Messung des Gewichtsverlustes, Berechnung des Gehaltes an Glucose und Alkohol sowie des Kohlendioxid-Verlustes.

5. Isolierung von Einzelkolonien der sporenbildenden Aerobier und Eukaryoten. Wie bereits im 2. Kurstag beschrieben sollen Verdünnungsausstriche der Anreicherungskulturen durchgeführt werden. Eine Mikroskopische Kontrolle wäre zu diesem Zeitpunkt sehr sinnvoll, um den Prozess der Isolierung von Reinkulturen zu verfolgen. Material: Im 1. Kurs hergestellte LB- und YPD/Amp-Agarplatten (4 pro Gr.); Anreicherungskulturen Durchführung: Wie im 2. Kurstag bereits beschrieben. Bitte die richtigen Platten verwenden. Inkubation aerob bei 30°C .

Page 22: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 22 -

Auswertung und Weiterführung der Kurstage 1 und 2:

1) Führen Sie bitte einen weiteren Verdünnungsausstrich der angereicherten Anaerobier durch.

2) Untersuchen Sie die Winogradsky Säule. Wenn Sie Interesse haben können Sie auch hier Anreicherungen auf Platten beginnen.

3) Werten Sie die Versuche zur Wasserqualität aus.

Vorbereitung Kurstag 4: Bitte bringen Sie Proben verschimmelter Lebensmittel mit (KEIN FLEISCH! KEINE WURST!).

Page 23: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 23 -

4. Kurstag Alkoholische Gärung

In diesem Kurs werden die Stoffwechselprodukte einer mikrobiellen Gärung quantitativ bestimmt, um aus den erhaltenen Daten auf die physiologischen Vorgänge bei der Gärung rückzuschließen. Es werden verschiedene Methoden angewandt, um Substrate und Metabolite der alkoholischen Gärung zu bestimmen. Die Bestimmung gasförmiger Produkte ist durch einfaches Wiegen des Gäransatzes und Bestimmung des Massenverlusts möglich, gelöste Substrate und Produkte werden durch spezifische physikalische, chemische oder enzymatische Verfahren nachgewiesen. Als Beispiele führen wir die Bestimmung des Brechungsindex als Maß für die Zucker-Konzentration einer Lösung durch, sowie ein enzymatisches Nachweisverfahren für Ethanol. Der enzymatische Nachweis von Metaboliten beruht auf der hohen Substratspezifität von Enzymen, die auch bei komplexen Mischungen meist nur mit einer bestimmten Verbindung reagieren. In vielen Fällen kann die primäre Enzymreaktion nicht direkt gemessen werden. Um dennoch die Bestimmung durchzuführen, ist dann die Kopplung der Nachweisreaktion mit einer oder mehreren weiteren Enzymreaktionen nötig, bis ein (meist photometrisch) detektierbares Produkt gebildet wird. Wir führen hier einen direkten (Alkohol-Dehydrogenase (ADH): gemessen wird das gebildete NADH) Enzymtest durch.

Reihenfolge der Vers.: 1. → 3. → 4; bei. 2. nach Gr-Nr durchrotieren Probenvorbereitung für Versuch 3. und 4. (bitte beachten)!

1. Auswertung der CO2-Entwicklung während der Gärung

Versuchsziel: Quantitative Untersuchung des Gärungsverlaufes durch Bestimmung der Massenabnahme (durch Freisetzung von Kohlendioxid). Graphische Darstellung des Gärungsverlaufes.

Material: Gäransätze, mm-Papier, Waage

Durchführung: [je Tischeinheit] Zur Bestimmung der Massenabnahme (durch Freisetzung von Kohlendioxid) wird der Gäransatz gewogen. Die letzte Messung wird zu Anfang des Kurses gemacht. Ergebnisse aller drei Ansätze an die Tafel schreiben!

? Tabelle mit Auftragung der Gewichtsabnahme gegen die Zeit (Tage), Umrechnung der Gewichtsverluste in Mol CO2. Graphische Auftragung der Gesamt-CO2-Produktion gegen die Zeit

Page 24: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 24 -

2. Bestimmung der Glucose-Konzentration durch Messung mit dem Refraktometer

Versuchsziel: Refraktometrische Zuckerbestimmung

Einige Tropfen unvergorener Traubensaft und verschieden konzentrierte Glucose-Standard-Lösungen werden im Abbé-Refraktometer gemessen. Jede Gruppe macht je eine Messung mit Wasser, mit Traubensaft, mit 10%iger und 20%iger Glucose sowie mit den Gäransatzproben ihrer Tischeinheit. Die erhaltenen Werte werden gemeinsam ausgewertet.

Material: Gäransatzproben, Pasteurpipetten mit Gummihütchen,, Traubensaft, 10% und 20% Glucose, Abbé-Refraktometer, Linsenpapier zum Reinigen des Refraktometers, Spritzflasche mit A. dest.

Durchführung: [alle Gr nacheinander]

Vorgehen: Prismen auseinanderklappen und säubern. Einige Tropfen Lösung auftragen und Apparatur wieder zusammenklappen. Mit dem oberen Einstellrad Grenzlinie scharf einstellen, dann mit dem unteren Einstellrad solange drehen, bis die Hell/Dunkel-Grenzlinie in der Mitte des Sichtfensters liegt (Einstellkreuz). Brechungszahl an der Skala im Sichtfenster ablesen.

? Tragen Sie die gemessenen Brechungszahlen gegen die Zuckerkonzentration auf. Interpolieren Sie die Zuckerkonzentration im Traubensaft.

3. Vorbereitung der Proben für die enzymatische Alkohol-Bestimmung

Material: Pipetten, Pasteurpipetten, Reagenzröhrchen, Tischzentrifuge

Durchführung: [je Tischeinheit] Die jeweiligen Proben , t0 , t1 und t2 [nach Gewichts-Bestimmung (!) ] werden in der Tischzentrifuge für 10 min bei 5.000 Upm zentrifugiert. Vom zellfreien, klaren Überstand werden 1 ml der jeweiligen Probe in ein Eppendorf-Gefäß pipettiert. Ausgehend von diesen Röhrchen erfolgt eine Aufteilung in Röhrchen mit verschiedenen Verdünnungsstufen für die Bestimmung des Alkoholgehalts (Versuch 4).

4. Ethanol-Bestimmung

Versuchsziel: Die Feststellung des Alkoholgehaltes durch enzymatische Bestimmung mit Alkohol-Dehydrogenase (ADH) und Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD).

Ethanol wird durch ADH und NAD unter Bildung von NADH zu Acetaldehyd oxidiert.

Ethanol + NAD+ Alkohol-Dehydrogenase ⇒ Acetaldehyd + NADH + H+

Die (molare Menge) des gebildeten NADH, die durch Extinktionszunahme bei 365 nm gemessen wird, ist genauso groß wie die anfangs enthaltene molare Ethanolmenge im Test.

Material: Photometer, Einmalküvetten, 20 und 200 µl – Gilson-Pipetten, Pipettenspitzen, 1, 5 und 10 ml-Pipetten, Pasteurpipetten, Reagenzröhrchen, mm-Papier, Reagenzien für die Alkoholbestimmung, Eppendorf-Hütchen und -Ständer, Eisbäder, ddH2O zum Verdünnen

Durchführung: [alle Gr] Zur Messung der Alkohol-Konzentration müssen zunächst die Proben wie folgt vorbereitet werden: Pro TE: Verwendung von 1 ml Überstand aus Versuch 3 Probe t0 1:100 verdünnen (Überlegung: erst 1:10, dann 1:10) Probe t1 und t2 1:500 verdünnen (Überlegung: erst 1:10, dann 1:10, dann 1:5)

Page 25: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 25 -

Puffer: 75 mM Na-Pyrophosphat, 75 mM Semicarbazid, 44 mM Glycin, pH 8,7 Alkohol-Standard: 0,02 % wässriges Ethanol Alle Proben werden gegen einen Leerwert im Photometer abgeglichen. Der Leerwert (LW) ist zu behandeln wie ein Probenansatz, wobei anstelle der Probelösung A. dest eingesetzt wird!!! t0 t1 t2 LW Standard Doppelbest.: a b a b a b a b

NAD-Lösg. (µ l) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 (15 mM)

Probe (µ l) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 verd. mit. t0(1:100 verd.) t1(1:500 verd.) t2(1:500 verd.) H20 EtOH-Stand.

A. dest.

Puffer (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Messen der

Extinktion E1 ........ .... .... ....... ....... ....... ....... ....... ....... (bei 365 nm)

Probe zurück ins Eppi gießen!!!

Zugabe von Alkoholde- hydrogenase 10 10 10 10 10 10 10 10 10 (µl) (5.000 U/ml)

Inkubation mindest. 30 min bei 37 °C Brutschrank

Messen ........ ....... ... .... ....... ...... ....... ........ ......... der Extinktion E2 (bei 365 nm) Δ E = E2 – E1 ........ ....... ......... .......... ......... ......... ........ .......

Formel für die Ermittlung der Alkoholkonzentration (Lambert-Beersche-Gesetz):

A=c x d x ε

Δ E x Testvolumen V Δ c (NADH) = ------------------------------------- x Verdünnungsfaktor F εNADH x d x Probenvolumen v

Page 26: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 26 -

εNADH : 3,44 mM-1 cm-1

Bedingung: [NADH] = [EtOH]

? Tabelle mit den gemessenen Werten, Umrechnung in Konzentrationen der Ausgangsproben, Eintragen der gemessenen Werte in die Graphik des Gärverlaufs (Versuch 1).

Rechnen Sie anhand der ermittelten Werte die Stöchiometrien der gemessenen Verbindungen aus und geben Sie die Gärbilanz an: Wie viel verbrauchte Glc ergibt wie viel CO2 und wie viel Alkohol? Wie viel Elektronen sind aus den Substraten in die Produkte transferiert worden?). Entspricht die Bilanz der Erwartung? 5. Pilzkontaminationen auf Lebensmitteln Das Verderben von Lebensmitteln verläuft in einem komplexen Prozess, der durch verschiedene Mikroorganismen wie Schimmelpilze, aber auch Hefen und Bakterien verursacht wird. Das Wachstum der Organismen ist von drei Bedingungen abhängig: 1.) Innenfaktoren: Wasseraktivität, pH-Wert, chemische Zusammensetzung und Konsistenz des Substrats 2.) Außenfaktoren: Lagertemperatur und Zusammensetzung der umgebenden Atmosphäre 3.) Verarbeitung des Lebensmittels: physikalische (Erhitzen, Bestrahlung) und chemische (Konservierungsstoffe) Prozesse Sind die Bedingungen für alle Gruppen der Mikroorganismen günstig, wachsen die Bakterien im Allgemeinen schneller als die Hefen, und diese wiederrum schneller als die Schimmelpilze. Damit können sich Schimmelpilze nur durchsetzen, wenn für sie die Lebensbedingungen auf einem Substrat besser geeignet sind als für Mitglieder der anderen Gruppen. Da Pilzsporen praktisch überall vorkommen, können sie entweder bereits bei der Herstellung oder später während der Lagerung auf die Lebensmittel gelangen. Schimmelpilze produzierten und sekretieren meist eine Vielzahl von Enzymen, die es ihnen ermöglicht verschiedenste Lebensmittel zu besiedeln. Bedingt durch einen hohen Fruchtsäuregehalt (pH-Wert 3-4) werden Früchte nur von Schimmelpilzen befallen, während beispielsweise Bakterien nicht auf verdorbenem Obst und Gemüse gefunden werden. Bekannte Vertreter kommen aus den Gattungen Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Mucor, Penicillium und Rhizopus. Getreide und Backwaren werden zumeist von Vertreten der Gattungen Aspergillus, Botrytis, Mucor, Penicillium und Rhizopus befallen. Auf Käse- und Joghurtprodukten findet man hauptsächlich Aspergillus- und Penicillium-Vertreter, da diese über eine hohe Kältetoleranz verfügen. Aufgrund der chemischen Zusammensetzung von Fleisch- und Fischprodukten werden diese zumeist von Bakterien besiedelt. Bei langer Lagerung findet man aber auch kältetolerante Penicillium-Spezies.

Page 27: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 27 -

Versuchsziel: In diesem Versuch sollen Pilze von verschiedenen, verschimmelten Lebensmitteln isoliert werden, um sie anschließend durch einige physiologische Tests zu charakterisieren. Getestet wird dabei die Produktion von Amylasen und Proteasen anhand des Abbaus entsprechender Substanzen in speziellen Nährmedien. Material: Je zwei TM88 Platten; Impfösen; kontaminierte Lebensmittel. Durchführung: Führen Sie einen Verdünnungsausstrich der Pilzproben auf den TM88 Platten durch. Die Platten werden anschließend bis zum nächsten Kurstag bei Raumtemperatur inkubiert. Auswertung und Weiterführung der Kurstage 1 und 2:

1) Werten Sie die Versuche des letzten Kurstags aus. 2) Führen Sie bitte einen weiteren Verdünnungsausstrich der

angereicherten Anaerobier und Aerobier durch. 3) Untersuchen Sie die Winogradsky Säule. Führen Sie Ihre

Anreicherungen auf Platten weiter.

Page 28: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 28 -

5. Kurstag Methoden der mikrobiellen Diversitätsanalyse/

Exoenzyme 1. Exoenzyme Zur Verwertung von Lebensmittel produzieren und sekretieren Schimmelpilze eine Vielzahl von Enzymen, so dass viele komplexe Verbindungen, wie Proteine, Kohlenhydrate oder Fette und Öl abgebaut werden können. So spielen sekretierte Proteasen eine wichtige Rolle bei der Verwertung von Proteinen. Desweiteren werden häufig Amylasen und andere Glucohydrolasen produziert, die den Abbau von komplexen Kohlenhydraten zu kürzerkettigen Oligosacchariden, Disacchariden und Monosacchariden ermöglichen. Als weiteres Beispiel sei die Ausscheidung von Pektinase und Polygalacturonasen genannt. Mit deren Hilfe erfolgt die Spaltung des Pektins in pflanzlichen Zellwänden, auf Grund dessen eine sogenannte Weichfäule bei Obst und Gemüse entsteht. Nach der Anzucht auf TM88 + Ampicillin werden die Pilzkontaminationen auf die unterschiedlichen Testmedien überimpft. Jeder Student erhält jeweils zwei Indikatorplatten mit Stärke- bzw. Milch-Medium (siehe Anhang). Die Auswertung erfolgt am nächsten Kurstag. Material: Je zwei Stärke- und Milchplatten; Impfösen; beimpfte TM88 Platten. Durchführung: Führen Sie einen Verdünnungsausstrich verschiedener Kolonien von den TM88 Platten auf die Stärke- und Milchplatten durch. Die Platten werden anschließend bis zum nächsten Kurstag bei Raumtemperatur inkubiert. 2. Phylogenetische Zuordnung über 16S rRNA-Gen Analyse Am heutigen Kurstag wollen wir untersuchen, ob die Isolierung von Reinkulturen aus einer vorgegebenen Mischkultur erfolgreich verlief. Wir benutzen dafür die isolierten Denitrifizierer, Purpurbakterien und sporenbildenden Organismen. Die Einteilung von Bakterien in abgegrenzte Arten ist nicht trivial. Dies liegt daran, dass eine für Eukaryoten typische Artdefinition nach „Eine Art ist eine vermehrungsfähige Gemeinschaft von Populationen, die eine spezifische Nische einnimmt“ nicht möglich ist. Ein häufig benutztes taxonomisches Merkmal in der Mikrobiologie ist deshalb die Sequenz des Gens für die 16S ribosomale Untereinheit (Abb. 1). Dieses Gen ist aufgrund seiner Wichtigkeit hochkonserviert und kommt in allen Bacteria vor. Man gruppiert 2 Individuen in eine Art ein, wenn ihre 16S rRNA-Gensequenz mehr als 97% identisch ist. Wir wollen in diesem Kursversuch das 16S rRNA Gen der Isolate über die Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifizieren und daran anschließend sequenzieren lassen. Im letzten Kurstag werden wir die erhaltenen Sequenzen mit Sequenzen einer Datenbank vergleichen und somit evaluieren, ob die gewünschten Organismen isoliert wurden. Das Reaktionsprinzip der PCR entspricht der Replikation (Verdopplung) der DNA in der Zelle: Eine DNA-Polymerase synthetisiert neue DNA an einer vorhandenen Nukleinsäure-Matrize. In der Zelle braucht das Enzym dazu einen (RNA)-Primer, ein Nukleinsäuremolekül, das mit dem Matrizenstrang hybridisiert und von der Polymerase als Starter benutzt wird. Im Reagenzglas werden künstlich synthetisierte Oligonucleotidprimer verwendet. Diese Startmoleküle sind aus den flankierenden Bereichen der Matrize abgeleitet, weshalb das zu

Page 29: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 29 -

amplifizierende Fragment zwischen ihnen liegt. Für die Reaktion werden also eine Matrize, eine DNA-Polymerase, Desoxynukleotide, zwei Oligonukleotide als Primer und ein geeignetes Puffersystem benötigt. Die gesamte Reaktion basiert auf drei Teilschritten, die ca. 30mal wiederholt werden.

16S-rRNA-AnalyseBakterielles Ribosom

Ribosom

50 S

30 S

16 S

Proteine: 21

RNA:

Proteine: ~50

RNA23 S

5 S

Abb. 1: Das bakterielle Ribosom. Denaturierung. Durch Erhitzung auf ca. 95°C wird die DNA in Einzelstränge aufgeschmolzen. Primer-Bindung an die DNA-Matritze (‘Annealing’). Beim Herabkühlen auf ca 50°C hybridisieren die Oligonukleotid-Primer mit den beiden DNA-Matrizensträngen (die ‘Annealing’-Temperatur ist abhängig von der Summe des (G/C- und A/T-Gehaltes der Primer). Polymerisation. Die hitzestabile DNA-Polymerase beginnt an diesem kurzen Stück doppelsträngiger DNA mit der Polymerisation des Gegenstranges (bei ca. 70°C).

Abb. 2: Die Polymerase-Kettenreaktion: Übersicht über die Reaktionsschritte der PCR.

Denaturierung 95°C

5’3’ 5’

3’

3’ 5’

5’ 3’

Primer Annealing 40°C5’

5’

3’ 5’5’

5’ 3’5’

dTTPAmplifizieren durchTaq-Polymerase (72°C)dGTPdATP

dCTP

3’ 5’5’ 3’

3’

5’5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’5’5’3’

Doppelsträngige DNA

Einzelsträngige DNA

Page 30: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 30 -

Amplifizierung der Gene durch PCR. Grundvoraussetzung für die Anwendung der PCR ist eine partielle Sequenzinformation über die Sequenz der gesuchten DNA. Im Falle des 16S Gens ist dies gegeben, da einige Bereiche des Gens in vielen Bacteria sehr ähnlich sind. Somit kann ein „universelles Primerpaar“ benutzt werden. Wir führen im Kurs eine Kolonie-PCR durch. Als Nucleinsäure-Matrize wird deswegen eine Kolonie von den Platten benutzt auf denen die Organismen isoliert wurden. Der Einfachheit halber benutzen wir einen sogenannten Premix. Dieser enthält bis auf die Primer alle notwendigen Komponenten. Versuchsziel: Amplifizierung des Gens für die 16S ribosomale Untereinheit. Material: 2fach konzentrierter PCR-Premix („Mango-Mix“) (enthält Polymerase, Puffer, dNTPs und Ladepuffer), Primer forward 2 pmol/µl, Primer revers 2 pmol/µl, Platten mit isolierten Organismen. Durchführung: Jede Gruppe führt 4 Reaktionen durch. Pipettieren Sie dazu in 4 Reaktionsgefäße: 25 µl Premix 12,5 µl Primer forward 12,5 µl Primer revers Geben Sie in Reaktionsgefäß 1 eine Kolonie der Denitrifizierer Anreicherung, in Reaktionsgefäß 2 eine Kolonie der Purpurbakterien Anreicherung und in Reaktionsgefäß 3 eine Kolonie der Anreicherung von Sporenbildnern. Das 4. Gefäß ist die Negativkontrolle und wird mit keiner Nucleinsäure-Matrize versehen. Der Ansatz wird in den Thermo-Cycler gestellt und das Programm (siehe unten) gestartet.

95°C 5 min

95°C 30 sec

55°C 30 sec

72°C 1:30 min

72°C 5 min

6°C halten Nachweis der amplifizierten DNA. Zum Nachweis der amplifizierten DNA wird 1/10 (10 µl) jeder PCR-Reaktion auf einer Agarose-Gelelektrophorese geladen.

30x

Page 31: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 31 -

Vorsicht! Beim Arbeiten mit Ethidiumbromid (EtBr)-gefärbten Gelen stets Handschuhe tragen und den direkten Kontakt mit dem Gel vermeiden.

– Gießen des Agarosegeles 1% (w/v): Agarose in 1x TAE-Puffer + 1 µl/10 ml 1% EtBr-Lösung. Das Ethidiumbromid lagert sich zwischen die Doppelstrang-DNA und macht diese indirekt durch seine Fluoreszenz im UV-Licht "sichtbar". – Überschichten des Gels mit Laufpuffer 1x TAE. – Auftragen der Proben + 2 Spuren Standard. – Gelelektrophorese bei 120 Volt, bis die Farbstoffbande etwa 2/3 des Gels durchwandert hat (ca. 30 min). – Photographie des Gels unter UV-Licht (302 nm). Vorsicht! Sonnenbrandgefahr

Stammlösungen: 1x TAE: 40 mM Tris-Acetat pH 8.0 1 mM EDTA Ethidiumbromid 1 % Stammlösung

Eines der erhaltenen Amplifikate wird von der Kursassistenz für die Sequenzierung aufbereitet und anschließend sequenziert werden.

Page 32: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 32 -

6. Kurstag Methoden der mikrobiellen Diversitätsanalyse/

Exoenzyme Auswertung des 5. Kurstages Exoenzyme: 1.) Amylaseproduktion: Falls Amylasen produziert wurden, bildet sich nach der Anzucht auf dem Stärke-Medium um das Impfstück ein stärkefreier Hof. Dies soll durch Anfärbung der Wuchsfront mit Lugolscher-Lösung verdeutlicht werden. Dazu werden mit einer Pasteurpipette einige Tropfen dieser Lösung auf die Testplatte gegeben. 2.) Proteasen Nach der 2 tägigen Anzucht auf Milchprotein-haltigem Medium können Protease Produzenten direkt durch klare „Höfe“ um die Myzelien im ansonsten trüben Nährmedium identifiziert werden.

Page 33: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 33 -

Nährböden für Anreicherungskulturen

LB-Nährmedium (Vollmedium) LB-Agar

Bacto-Trypton 3,0 g Nachdem das Medium fertig ist, 6,0 g Hefeextrakt 1,5 g Agar pro 300 ml zusetzen (direkt i.d. NaCl 1,5 g Flasche; löst sich nicht) Aqua dest. ad 300 ml pH 6,9

Nährmedium bzw. –agar für phototrophe Bakterien (RÄH) D,L-Malat 1 g Hefeextrakt 0,6 g (NH4)Cl 0,36 g Mg(SO)4 0,06 g CaCl2 0,02g

Aqua dest 293,4 ml à pH 7 einstellen

Spurenelemente-Lösung** 0,6 ml (getrennt ansetzen, nach Autoklavieren zugeben)

Vitamine*** 3 ml (getrennt ansetzen, steril filtrieren, nach Autoklavieren zugeben)

Phosphat-Puffer**** 3 ml (getrennt ansetzen, nach Autoklavieren zugeben)

pH-Wert überprüfen

Für RÄH-Agar Nachdem das Medium fertig ist, 6,0 g Agar pro 300 ml zusetzen (direkt i.d. Flasche; löst sich nicht)

** Spurenelemente: ***Vitamine:

H3BO3 10 mg Nicotinsäure 26,6 mg MnSO4 x H2O 20 mg Thiamin-HCL 53,3 mg (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O 20 mg (+)-Biotin 1 mg ZnSO4 x 7H2O 10 mg Nicotinsäureamid 26,6 mg CuSO4 x 5 H2O 10 mg ad 100 ml Aqua dest. ad 1000 ml Aqua dest. ****Phosphatpuffer pH 7

KH2PO4 0,8 g ad 100 ml Aqua dest.

Allgemein: Phosphatpuffer werden im Allgemeinen getrennt gelöst und autoklaviert (ansonsten

Ausfallen von Ca- und Mg-Phosphat in der Hitze). Nach dem Autoklavieren wird es dem Nährboden unter sterilen Bedingungen zugegeben. Danach wird der pH Wert kontrolliert.

Auch Zuckerlösungen sollen getrennt gelöst und erst nach dem Autoklavieren dem Nährboden zugegeben werden.

Page 34: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 34 -

Nährmedium für Denitrifizierer KNO3 1,5 g NaCl 1,5 g Pepton 1,5 g Hefeextrakt 0,6 g Fleischextrakt 0,6 g Aqua dest. ad 300 ml pH 7,4 Für Denitrifizierer -Agar Nachdem das Medium fertig ist, 6,0 g Agar pro 300 ml zusetzen (direkt i.d. Flasche; löst sich nicht)

Chinablau-Lactose-Agar (Fertigprodukt, nach Angabe auf Verpackung einzuwiegen)

Fleischextrakt 3,0 g Lactose 10,0 g Pepton aus Casein 5,0 g Chinablau 0,375 g NaCl 5,0 g pH 7,0 A. dest. ad 1.000ml Agar 12,0 g

Malz-Pepton-Agar (für Pilze)

Malzextrakt 3,0 g Casein-Pepton 0,5 g Agar 18,0 g Aqua dest. ad. 1.000 ml pH 5,9 Nach Autoklavieren: 2 ml Chloramphenicol /l Medium (Stammlsg: 50 mg/ml EtOH) zugeben

GPH-Nährmedium Glucose 1,0 g Pepton 5,0 g Hefeextrakt 2,0 g Aqua dest. ad 1.000 ml GPH-Nähragar: GPH-Medium siehe oben Agar 18 g/l Im Kurs: Vor Autoklavieren 9 g Agar/500 ml (in 1 l E-Kolben einwiegen)

Page 35: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 35 -

Mac Conkey-Agar (Fertig-Agar) Pepton aus Casein 17,0 g Pepton aus Fleisch 3,0 g NaCl 5,0 g D-Lactose 10,0 g Gallensalzmischung 1,5 g Neutralrot 0,03 g Kristallviolett 0,001 g pH 7.1 A. dest. ad 1.000 ml Agar-Agar 18,0 g

TM88 + Ampicillin: 20 g Malzextrakt 4 g Hefeextrakt lösen und pH 5,7 einstellen (NaOH) + A.dest. ad 1 l 100 µg/ml Ampicillin (nach dem Autoklavieren zugeben)

Lactose-Bouillon (Fertigmedium) Pepton aus Fleisch 10,0 g Fleischextrakt 3,0 g D-Lactose* 10,0 g NaCl 5,0 g Bromkresolpurpur 0,02 g pH 7,2 Aqua dest. ad 1.000 ml • Durch Filtration sterilisiert (im Kurs: vorgegeben) • ** Umschlag von purpur nach gelb bei pH 6,8-5,2

Page 36: Modul Mikroorganismen - iab.kit.edu · Allgemeines Ziel dieses Praktikums ist es, mit den grundlegenden Arbeitstechniken der Mikrobiologie sowie einigen ausgewählten Gr. von Mikroorganismen

- 36 -

Stärke-Medium 5 g Hefeextrakt 2 g Casamino Acids 50 ml 20 x Salze (s.u.) 1 ml Spurenelemente-Lsg. lösen und pH 6,0 einstellen (mit KOH) + 1000 ml A.dest. + 20 g Agar + 10 g lösliche Stärke 20 x Salze: 120 g NaNO3 10,4 g KCl 10,4 g MgSO4 x 7 H2O 30,4 g KH2PO4 + A. dest. ad 1 l Milch-Medium: 12 ml H-Milch 2 g K2HPO4 lösen und pH 6,5 einstellen + A.dest. ad 1000 ml + 20 g Agar Jod-Kaliumjodid- (Lugolsche) Lösung: 1 g Jod 2 g Kaliumjodid in 20 ml A.dest. lösen, 1 : 100 verdünnen YPD-Medium 3 g Hefeextrakt 6 g Pepton 6 g Glucose + A. dest ad 300 l

Für YPD -Agar Nachdem das Medium fertig ist, 6,0 g Agar pro 300 ml zusetzen (direkt i.d. Flasche; löst sich nicht)