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Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen WS 09/10 Praktikum Bioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie 15.-19.02.10. Abbildungen zur SDS-PAGE und zum Western Blot. Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen Praktikum - PowerPoint PPT Presentation
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Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen
WS 09/10Praktikum
Bioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie15.-19.02.10
Abbildungen zur
SDS-PAGE und zum
Western Blot
Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen
PraktikumBioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie
Verwendete Proteinmärker
Gel # 1Proteinfärbung nach dem SDS-
PAGE:Proteinkontrolle zum Nachweis von
PAL und CHS nach Blotting
Fotos Western Blot: Gruppen 1 und 5
SDS-PAGE
Gel # 5Proteinfärbung nach dem SDS-
PAGE:Proteinkontrolle zum Nachweis von
RubisCO nach Blotting
Probenauftrag Gele 1-4 (L R):
Marker (s.o.) RE Kontrollzellen RE Zellen mit 1 nM Pep13 RE Zellen mit 10 nM Pep13 RE Zellen mit 100 nM Pep13 RE Zellen mit 1 µM Pep13 RE Zellen mit 50 µM AgNO3
Marker
Probenauftrag Gele 5-6 (L R):
Marker (s.o.) RE Spinatblatt (1) RE Spinatblatt (2) RE Gartenkresse-Blatt RE Maisblatt RE Kontrolle Kulturzellen Re Zellen mit 1µM Pep13 Marker
Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen
PraktikumBioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie
Fotos Western Blot: Gel # 2
Zum Nachweis von PAL
Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot
Peroxidase-Enzymreaktion nach Inkubierung mit Anti-PAL-
Primärantikörpern
Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting
Fazit:
Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen
Ein starker immunchemischer Signal bei einem Protein knapp > 70 kD und ein schwächerer bei ca. 50 kD. Beide Signale unspezifisch, da gute Reaktion überall vorhanden, unabhängig von Pep13-Behandlung
Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen
PraktikumBioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie
Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot
Fotos Western Blot: Gel # 3
Zum Nachweis von CHS und von PAL nach Immunoabsortion
Peroxidase-Enzymreaktion nach Inkubierung mit CHS-Primärantikörpern
und mit Anti-PAL-Primärantikörpern nach versuchten Immunoabsorption von
unspezifischem 70 kD-Protein
Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting
Fazit:
Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen
Immunchemische Signale wie für Gel #2, wenn auch etwas schwächer. D.h. keine sichtbare Reaktion auf CHS; versuchte Immunoabsorption von Antikörpern gegen unspezifischem 70 kD-Protein im Anti-PAL-Serum (s. Gel # 4) nicht geglückt!
Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen
PraktikumBioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie
Fotos Western Blot: Gruppe 4
Bereitstellung von 70 kD-Protein zur Immunoabsorption von unspezifischen Proteinen, die mit Anti-PAL-Antiserum
reagieren
Ausschnitt des 70 kD_Proteins aus dem Membran nach dem Blot zur Immunoabsorption mit
dem PAL-Antiserum
Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot
Das ausgeschnittene Membranstuck entsprechend Protein von ca. 70 kD, das unspezifisch mit unseren Anti-PAL-Serum reagiert, wurde mit TBS-Milchpulver blockiert und dann für eine Stunde mit Anti-PAL-Serum (1:1000 Verdünnung in TBS-Milchpulver) inkubiert
Diese versucht Immunoabsorption der unspezifischen Antikörper war aber nach dem Enzym-Nachweis mit dem Membran von Gel # 3 (s.o.) aber nicht erfolgreich!
Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting
(Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen)
Modul Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen
PraktikumBioenergetik, Stoffwechsel und pflanzliche Molekularbiologie
Fotos Western Blot: Gel # 6
Zum Nachweis von RubisCO
Peroxidase-Enzymreaktion nach Inkubierung mit Anti-RubisCO-
Primärantikörpern
Protein-Färbung des SDS-PAGE-Gels nach dem Blotting
Membranfärbung nach dem Blot mit Ponceau-Rot
Fazit:
Protein gut aus dem Gel auf die Membran übertragen
Ein starker immunchemischer Signal bei einem Protein von ca. 50 kD (≈ große Untereinheit von RubisCO) in den Blattproben, aber nicht bzw. Kaum in den Kulturzellproben
Signal spezifisch für RubisCO, auch wenn einige weitere Reaktionen ersichtlich sind