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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
MÁRCIA LEITE DOS SANTOS
MODULAÇÃO DO ESTRESSE AGUDO E CRÔNICO
SOBRE OS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DA NOS NO
HIPOCAMPO DE RATOS WISTAR.
SÃO CRISTÓVÃO
2014
2
MÁRCIA LEITE DOS SANTOS
MODULAÇÃO DO ESTRESSE AGUDO E CRÔNICO
SOBRE OS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DA NOS NO
HIPOCAMPO DE RATOS WISTAR.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal de Sergipe como
requisito para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Fisiológicas.
Orientador : Prof. Dr. Murilo Marchioro
Co-orientador: Profª Drª Sandra Lauton dos Santos
SÃO CRISTÓVÃO
2014
iv
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA
CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
Santos, Márcia Leite dos S237m Modulação do estresse agudo e crônico sobre os níveis de
expressão da nos no hipocampo de ratos Wistar / Márcia Leite dos Santos ; orientador Murilo Marchioro – São Cristóvão, 2014. 42 f. : il. Dissertação (mestrado em Ciências Fisiológicas) –Universidade Federal de Sergipe, 2014.
O 1. Hipocampo. 2. Estresse por contenção. 3. Óxido
nítrico. I. Marchioro, Murilo, orient. II. Título. CDU: 612.821.2
v
MÁRCIA LEITE DOS SANTOS
MODULAÇÃO DO ESTRESSE AGUDO E CRÔNICO
SOBRE OS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DA NOS NO
HIPOCAMPO DE RATOS WISTAR.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal de Sergipe como
requisito para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Fisiológicas.
Orientador: Prof. Dr. Murilo Marchioro
Co-Orientador: Profª Drª Sandra Lautondos Santos
______________________________________________________
1º Examinador: Prof. Dr. Murilo Marchioro
______________________________________________________
2º Examinador: Prof. Dr. José Ronaldo dos Santos
______________________________________________________
3º Examinador: Prof. Dr. Waldecy de Lucca Junior
vi
Dedico aos meus pais.
vii
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a força suprema que rege todo o Universo. Se eu não
acreditasse no poder dessa força, não teria de modo algum, chegado até aqui.
Agradeço a minha avó Dona Nina (in memoriam), por como matriarca da família ter
sido sempre um exemplo de superação, de garra e persistência.
Aos meus pais José Bispo e Magna por nunca deixarem de ser meu porto seguro. Por
sempre acreditarem em mim, mesmo sem me entender. Pelo esforço e por uma vida
totalmente dedicada ao bem estar e ao crescimento de seus filhos.
Aos meus irmãos Márcio e Marcelo por ser sempre meu encontro com a alegria, por me
ensinarem a ver a vida cada um a seu modo.
Aos meus sobrinhos Raphael, Lorena, Caio e Heitor por ser minha fonte da juventude.
Minhas horas com vocês são o “elixir” da vida eterna e trazem a paz para a minha alma.
Agradeço também, ao professor Dr. Murilo Marchioro pela paciência, pelos
ensinamentos e pela oportunidade. Nunca esquecerei que foi com o senhor que dei meus
primeiros passos nas ciências. Obrigada por tudo.
Agradeço ao Dr. José Ronaldo dos Santos por me ajudar em muitas das fases mais
difíceis do mundo acadêmico. Obrigada por me apresentar o mundo das neurociências.
Agradeço a Professora Dr.ª Sandra Lauton, por acreditar no meu projeto e pelo suporte
experimental sem o qual eu não conseguiria terminar o presente trabalho. Obrigada por
acreditar na realização de um bom trabalho.
Ao amigo, companheiro de trabalho e de reflexão sobre a vida, Thassio Ricardo Ribeiro
Mesquita, sem o qual eu não teria concluído varias etapas do presente trabalho. Muito
obrigada por ser o homem maduro e determinado, pela competência de trabalho, e pela
forma como reage diante aos desafios, com superação, altivez e excelência no que faz.
Agradeço a amiga, Msc. Lívia Lins que compartilhou comigo grandes e difíceis
momentos durante esses dois anos. Crescemos muito durante o mestrado e sei que você
vai, sem duvida alguma, chegar onde quer na vida. Você é um exemplo de conduta e de
persistência. Será para sempre lembrada como uma grande aliada. Obrigada por toda
ajuda e disponibilidade em todas as fases desse trabalho e a cima de tudo pela amizade.
Ao aluno do curso de Biologia, Ariel da Graça, como o nome já diz, um anjo enviado
pelos céus para me ajudar. Obrigada por ser meu braço direito nessa jornada. Por nunca
me faltar e por como aluno de iniciação cientifica, cumprir com todas as obrigações e as
viii
não obrigações de trabalho. Por ser um exemplo de parceria e de caráter. E pelo amigo
que se mostrou.
A todos os amigos da primeira turma do PROCFIS, em especial a Rangel Bonfim,
Valeria Alves Fernandes, Elis Cristina, Larissa Rezende e Ana Roseli. Pela amizade,
pelas conversas e debates em meio aos corredores do Departamento de Fisiologia da
UFS, sobre as incertezas e certezas da vida. Tenho certeza que serão grandes
pesquisadores.
Agradeço a CAPES/FAPITEC pelo apoio financeiro.
E por fim, mas não menos importantes agradeço a todos os professores do PROCFIS,
grandes mestres, grandes naquilo que fazem.
Meu muito... OBRIGADA.
ix
“O período de maior ganho em conhecimento
e experiência é o período mais difícil da vida
de alguém.”
(Dalai Lama)
x
RESUMO
Modulação do estresse agudo e crônico sobre os níveis de expressão da NOS no
hipocampo de ratos Wistar. Márcia Leite dos Santos, São Cristovão-2014.
A reação cerebral ao estresse desenvolve-se ativando o eixo hipotalâmico-pituitário-
adrenal. O hipocampo está associado ao aprendizado espacial, memória contextual e
atua regulando a atividade desse eixo. De modo que o óxido nítrico, considerado um
neurotransmissor atípico, participa do processo de consolidação da memória e
aprendizagem, porém tem intima relação com o processo de neurotoxicidade
responsável pelo desencadeamento de cascatas de morte neuronal. O presente trabalho
buscou investigar os efeitos do estresse a curto e longo prazo sobre os níveis de NO no
hipocampo, utilizando o modelo experimental de contenção em ratos Wistar. Foi
verificado que determinadas áreas hipocampais foram mais suscetíveis a lesões pela
produção de NO, sendo elas a CA2 e o Giro Denteado. A região dorsal dessas áreas é
mais expressiva junto a marcações diaforásicas e possivelmente também sofrem mais
com os efeitos do estresse em longo prazo. Percebe-se que o estresse agudo não é capaz
de produzir efeitos significativos sobre a produção do NO, no tocante a promover danos
a homeostasia hipocampal. Provavelmente o NO produzido no estresse crônico seja
mantido pela via da isoforma i-NOS. Sendo que o estresse em longo prazo é
determinante para as taxas de produção de NO, deletérias ao sistema hipocampal.
PALAVRAS CHAVES: hipocampo, estresse por contenção, óxido nítrico.
xi
ABSTRACT
Modulation of acute and chronic stress on NOS expression levels in the rat
hippocampus. Márcia Leite dos Santos, São Cristovão-2014.
Cerebral response to stress involves the activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal
axis. The hippocampus is associated with spatial learning, contextual memory and
regulates this axis activation. Nitric oxide (NO) is considered an atypical
neurotransmitter and participates in the process of memory consolidation and learning,
although it is also associated with the neurotoxicity responsible for the activation of the
neuronal death cascades. The aim of the present study was to evaluate the short- and
long-term effects of stress on NO levels in the rat hippocampus, inducing stress by
restraint. We verified that the hippocampal areas CA2 and dentate gyrus seem to be
more susceptible to lesions by NO production. The dorsal region of these areas is the
most expressive of NO, and possibly the one more damaged by long-term stress. We
could observe that acute stress does not significantly alter the production of NO. It is
likely that NO produced in the chronic stress protocol is maintained by the induced NO-
synthase. Long-term stress is a determinant factor in NO production, which can be
harmful to the hippocampus.
KEYWORDS: hippocampus, restraint stress, nitric oxide.
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Diagrama esquemático do eixo Hipotálamico-Pituitário-Adrenal (HPA),
descrevendo a regulação e o feedback negativo(-) do cortisol por via dos receptores de
glicocorticoides (RGs).......................................................................................................3
Figura 2. Fotomicrografia da formação hipocampal corada com Nissl. Secção coronal
que mostra o giro denteado (DG), áreas CA1, CA2, CA3 do Hipocampo. Hemisfério
esquerdo de rato.................................................................................................................5
Figura 3. Aparelho de contenção para rato. Adaptado de Gamaro et.al. (1998) e
Gameiro et.al. (2006). a. Aparelho de contenção aberto. Vista do alto. b. Aparelho de
contenção com orifício de abertura do tubo ocluído pelo mecanismo de fechamento.
Vista frontal....................................... .............................................................................11
Figura 4. Cortes corados com a técnica NADPH diaforase e montados em lâmina
permanente.......................................................................................................................13
Figura 5. a. Isolamento de hipocampo por dissecação de hemisférios cerebrais; b.
Hipocampo direito e esquerdo isolados...........................................................................14
Figura 6. Neurônios do tipo I no hipocampo de animal do grupo teste estresse
crônico...................................................................................................................... .......18
Figura 7. Neurônio Tipo I em destaque no Hipocampo de animal do grupo teste
estresse crônico................................................................................................................18
Figura 8. Hipocampo de animal grupo controle estresse crônico. Em destaque, pode-se
observar o neurônio do tipo II marcado com NADPH-diaforase....................................19
Figura 9. Relação dos neurônios Tipo I no hipocampo de ratos Wistar, submetidos ao
protocolo de estresse agudo e crônico por contenção......................................................20
xiii
Figura 10. Relação dos neurônios Tipo II no hipocampo de ratos Wistar submetidos ao
protocolo de estresse agudo e crônico por contenção......................................................21
Figura 11: Relação dos neurônios Tipo II no hipocampo de ratos Wistar nas diferentes
áreas hipocampais. a. CA1. b. CA2. c. CA3. d. GD (giro denteado), submetidos ao
protocolo de estresse agudo e crônico por contenção......................................................23
Figura 12. Relação dos neurônios Tipo I e II no hipocampo de ratos Wistar submetidos
ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção. Análise de cortes da região
septal do hipocampo. a. Relação para neurônios tipo I. b. Relação para neurônios tipo
II.......................................................................................................................................25
Figura 13: Relação dos neurônios Tipo I e II no hipocampo de ratos Wistar submetidos
ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção. Análise de cortes da região
dorsal do hipocampo. a. Relação para neurônios tipo I. b. Relação para neurônios tipo
II.......................................................................................................................................26
Figura 14: Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase
Neuronal (nNOS) em hipocampo de ratos submetidos à estresse de
contenção.........................................................................................................................28
Figura 15: Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase
Neuronal Fosforilada (p-nNOSser852
) em hipocampo de ratos submetidos à estresse de
contenção.........................................................................................................................30
Figura 16: Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase
Induzida (i-NOS) em hipocampo de ratos submetidos à estresse de contenção.............32
xiv
LISTA DEABREVIATURAS
ACTH – Adrenocorticotropina
ANOVA- Análise de Variância
CA - Corno de Ammon
CEPA- Comitê de Ética, Pesquisa e Experimentação Animal
COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
DMF –N, N-dimetilformamida
EDTA – Ácido Étilenodiamino Tetra-Acético
EPM – Erro Padrão da Média
HPA – Hipotalâmico Pituitário Adrenal
NADPH-d – Nicotinamida Adenina Dinucleotideo Fosfato – diaforase
NBT – Nitroblue Tetrazolium
NO – Óxido Nítrico
NOS- Óxido Nítrico Sintase
PB – Tampão Fosfato
PBS - Tampão Fosfato Salino
pH – Potencial Hidrogeniônico
PMSF – Fluoreto de Fenilmetanossulfonil
RGs – Receptores Glicocorticoides
RMs – Receptores Mineralocorticoides
SDS – Disulfeto de Sódio
SNC – Sistema Nervoso Central
TBS – Tris Base Salina
xv
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1
2 REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 2
2.1 ANATOMIA E FISIOLOGIA DO ESTRESSE ...................................................... 2
2.2 FORMAÇÃO HIPOCAMPAL E ESTRESSE ........................................................ 4
2.3 ESTRESSE E ÓXIDO NÍTRICO ........................................................................... 6
2.4 NEURÔNIOS DIAFORASE POSITIVOS (NITRÉRGICOS) ................................ 7
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 9
3.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 9
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 9
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................10
4.1 ANIMAIS .............................................................................................................10
4.2 ESTRESSE POR IMOBILIZAÇÃO......................................................................10
4.3 PERFUSÕES DOS ANIMAIS E PREPARO DAS AMOSTRAS PARA TÉCNICA
HISTOQUÍMICA NADPH DIAFORASE ..................................................................12
4.4 HISTOQUÍMICA PARA NADPH DIAFORASE .................................................12
4.4.1 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS ......................................................................12
4.4.2 ANÁLISE DE DADOS PARA CONTAGEM NEURONAL EM CORTES
CORADOS COM A TÉCNICA NADPH DIAFORASE .............................................13
4.5 PREPARAÇÃO DO TECIDO PARA QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO
E EXPRESSÃO PROTEICA ......................................................................................14
xvi
4.6 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE HIPOCAMPO PARA WESTERN
BLOT...............................................................................................................................14
4.6.1 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO TOTAL DE PROTEÍNAS ........... 15
4.6.2 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA POR WESTERN BLOT .... 15
4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICA .................................................................................. 16
4.7.1 ANÁLISE ESTATÍSTICA PARA HISTOQUÍMICA NADPH DIAFORASE
................................................................................................................................... 16
4.7.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA PARA WESTERN BLOT........................................ 17
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 17
5.1 MORFOLOGIA DOS NEURÔNIOS NADPH DIAFORASE ............................... 17
5.2 DISTRIBUIÇÕES DOS NEURÔNIOS NADPH DIAFORASE ............................ 19
5.2.1 NÚMERO TOTAL DE NEURÔNIOS TIPO I E TIPO II ................................... 19
5.2.2 DISTRIBUIÇÃO DE NEURÔNIOS TIPO II NAS ÁREAS HIPOCAMPAIS
................................................................................................................................... 22
5.2.3 RELAÇÃO ENTRE O NÚMERO DE NEURÔNIOS TIPO I E TIPO II ENTRE A
REGIÃO ANATÔMICA SEPTAL E TEMPORAL DO HIPOCAMPO ...................... 24
5.3 QUANTIFICAÇÕES DA NOS POR WESTERN BLOT NO HIPOCAMPO ........ 27
5.3.1 EXPRESSÃO DA ISOFORMA nNOS ............................................................... 27
5.3.2 EXPRESSÃO DA ISOFORMA p-nNOSser852
..................................................... 29
5.3.3 EXPRESSÃO DA ISOFORMA i-NOS .............................................................. 31
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 33
REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 34
APÊNDICE A - PLANILHA PARA PLOTAGEM DAS MÉDIAS DE NEURÔNIOS
ENCONTRADOS NAS ÁREAS HIPOCAMPAIS ESTUDADAS...............................40
ANEXO A – DECLARAÇÃO DO CEPA/UFS.............................................................41
1
1 INTRODUÇÃO
O cérebro é alvo de diferentes estressores devido a sua sensibilidade e condições
degenerativas induzidas pelo estresse (PAJOVIC et al., 2006). A resposta fisiológica a
um estressor, seja ele físico ou psicológico, é um mecanismo protetor e adaptativo para
manter o equilíbrio homeostático do organismo. O estresse desencadeia uma série de
processos neurológicos e hormonais dentro do cérebro e dos sistemas orgânicos
(BEKRIS et al., 2005).
Uma das reações cerebrais ao estresse se dá pela ativação do eixo hipotalâmico-
pituitário-adrenal (HPA). O hipotálamo secreta o fator liberador de corticotropina, o
qual estimula a síntese e liberação de adrenocorticotropina (ACTH) pela hipófise
anterior, que por sua vez, estimula a síntese e liberação de cortisol em humanos e
corticosterona em roedores. Estes glicocorticoides afetam o comportamento agindo nos
receptores glicocorticóides e minerolocorticóides de diferentes regiões cerebrais, entre
elas o hipocampo (JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES 2007).
O hipocampo tem sido associado ao aprendizado espacial e memória contextual.
Também atua sobre o estresse a nível cerebral, regulando a atividade do eixo
hipotálamo-pituitário-adrenal (HERNAN et al., 2005). Existem indícios que o
hipocampo exerce um efeito protetor no cérebro quando o indivíduo está sobre estresse
repetitivo (JOELS, 2001).
No entanto, a exposição à estressores induz remodelamento dendrítico em
células piramidais hipocampais e diminuição da neurogênese no giro denteado do
hipocampo. Tais alterações morfológicas parecem ser mediadas pelo aumento de
corticosteroides que acompanha os eventos de estresse, já que a remoção das adrenais
previne a inibição da neurogênese induzida pelo estresse (BAIN; DWYER; RUSAK,
2004).
Em relação aos neurotransmissores, sabe-se que algumas substâncias, tais como
o óxido nítrico (NO), podem apresentar neurotoxicidade em situação de estresse. O NO
atua na regulação de importantes vias do Sistema Nervoso Central (SNC). Segundo
Schuman e Madison (1991), o NO participa do aprendizado e da formação de memória,
além de mediar respostas excitatórias a certos aminoácidos.
2
Sendo assim, mostra-se de grande interesse a investigação dos efeitos do estresse
a curto e longo prazo sobre os níveis de NO no hipocampo utilizando o modelo de
contenção em ratos Wistar.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ANATOMIA E FISIOLOGIA DO ESTRESSE
O estresse pode ser definido como “desgaste por uso prolongado”, que pode ser
provocado por diversos fatores estressores, tais como o frio ou calor intenso, a fome, o
sono e a contensão (CARRASCO; VAN DE KAR, 2003).
A resposta fisiológica a um estressor, seja ele físico ou psicológico, é um
mecanismo protetor e adaptativo para manter o equilíbrio homeostático do organismo.
O estresse desencadeia uma série de processos neurológicos e hormonais no cérebro e
nos sistemas orgânicos. A duração e a intensidade do estresse podem provocar efeitos
de curto e longo prazo. Um estressor pode romper a homeostasia até o ponto em que a
adaptação a ele fracassa, resultando em um processo patológico (BEKRIS et al., 2005).
Em 1936, Hans Selye descreveu uma teoria de adaptação na qual “o organismo
responde inespecificamente a qualquer demanda a ele imposta”, essa teoria ficou
conhecida como “síndrome à adaptação geral”. Selye delimitou três fases: a primeira é a
de alarme, resposta aguda a agressão, durante essa fase há a ativação de resposta de
“fuga ou luta”, na qual ocorre liberação de catecolaminas e o início da resposta do
hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). A segunda fase é a de resistência na qual o
organismo se adapta ao estressor nocivo e a atividade do cortisol ainda está aumentada.
Persistindo a exposição ao agressor, ocorre o terceiro estágio que é a exaustão. Durante
esse estágio a atividade do glicocorticóide aumenta e provoca alterações nos sistemas
orgânicos, levando-o à morte (JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES, 2007).
As respostas fisiológicas ao estresse são mediadas pelo cérebro através de uma
complexa rede de mensagens eletroquímicas. Seley, em seus estudos, delineou o papel
da glândula hipófise na estimulação do córtex adrenal, via hormônio ACTH, abrindo
desta forma, o caminho para o conceito de eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (HPA)
como eixo hormonal do estresse. A amígdala e o hipocampo, envolvidas pela
elaboração das emoções, são estruturas límbicas consideradas moduladoras do eixo
3
HPA, dessa forma esse eixo pode ser considerado límbico-hipotalamo-pituitaria-adrenal
(BAIN; DWYER; RUSAK, 2004; JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES, 2007).
O cérebro reage ao estresse ativando o eixo HPA. Os neurônios dos núcleos
paraventriculares do hipotálamo secreta fator liberador de corticotropina, o qual
estimula a síntese e liberação de adrenocorticotropina (ACTH) pela hipófise anterior,
esta por sua vez, estimula a síntese e liberação de cortisol em humanos e corticosterona
em roedores. Estes glicocorticoides exercem efeito no metabolismo e afetam o
comportamento agindo nos receptores glicocorticóides e mineralocorticóides de
diferentes regiões cerebrais (JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES, 2007).
A cortisona (em roedores) pode também exercer um feedback negativo no eixo
HPA, atuando sobre receptores de glicocorticóide situados no hipocampo, onde sua
concentração é muito alta, bem como no hipotálamo e na hipófise, inibindo assim, a
secreção de ACTH (JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES, 2007).
Embora os glicocorticoides regulem a função de quase todos os tecidos do
corpo, o efeito fisiológico mais conhecido desses hormônios é a regulação do
metabolismo energético, como mostrado na figura 1 (JURUENA; CLEARE;
PARIANTE, 2004).
Figura 1. Diagrama esquemático do eixo Hipotálamico-Pituitário-Adrenal (HPA), descrevendo a
regulação e o feedback negativo (-) do cortisol por via dos receptores de glicocorticoides (RGs).
(adaptado de JURUENA; CLEARE; PARIANTE, 2004).
4
2.2 FORMAÇÃO HIPOCAMPAL E ESTRESSE
O hipocampo é uma estrutura cerebral que tem sido associado ao aprendizado
espacial, memória contextual e resposta cerebral ao estresse, devido à regulação da
atividade do eixo hipotálamo-pituitário-adrenal (HERNAN et al., 2005). Existem
indícios que o hipocampo exerce um efeito protetor no cérebro quando o indivíduo está
sobre efeito do estimulo estressor (JOELS, 2001).
Ele é ativado por diferentes estressores e participa do processamento de
informações sobre eventos ameaçadores. Há uma grande densidade de receptores para
glicocorticóides no hipocampo que, quando ativados inibem a atividade do eixo HPA,
limitando a resposta ao estimulo estressor. Além disso, essa estrutura cerebral quando
exposta de forma repetitiva a níveis elevados de glicocorticóides pode ter efeito
deletério à sua estrutura e função (JOCA; FERREIRA; GUIMARÃES, 2007).
Exposição a estressores sejam eles físicos ou psicológicos, como novidade ou
problemas sociais, induz remodelamento dendrítico em células piramidais hipocampais
e diminuição da neurogênese no giro denteado do hipocampo. Tais alterações
morfológicas parecem ser mediadas pelo aumento de corticosteróides que acompanha os
eventos de estresse, já que a remoção das adrenais previne a inibição da neurogênese
induzida pelo estresse (AXELSON et al., 1992).
Joca et al. (2007) afirmam que eventos estressantes teriam um efeito neurotóxico
sobre o hipocampo, provavelmente mediados pelo aumento de GCs, predispondo ao
desenvolvimento da depressão.
Desde meados do século XX, os cientistas que estudam a memória e o cérebro
têm se concentrado no hipocampo como a estrutura fundamental para a memória recente
para fatos e eventos (GIL et al., 2009).
Nas últimas duas décadas, tornou-se evidente que as áreas que formam a região
hipocampal também desempenham um papel crítico na memória. Sendo caracteristico a
cada área uma determinada função na circuitaria do sistema (BURWELL; AGSTER,
2008). A figura 2, mostra a visão geral da anatomia funcional das estruturas que
suportam a memória episódica do cérebro de mamíferos.
5
Figura 2. Fotomicrografia da formação hipocampal corada com a técnica de Nissl. Secção coronal
que mostra o giro denteado (DG), áreas Corno de Ammon 1 (CA1), Corno de Ammon 2 (CA2),
Corno de Ammon 3 (CA3) do Hipocampo e suas sete camadas: camada granular (gcl), camada
molecular (ml), estrato lacunoso molecular (slm), estrato oriens (so) estrato piramidal (sp), estrato
radiato (sr), camada de células de Purkinje (pcl) (PAXINOS, 2004). Hemisfério esquerdo de rato.
(BURWELL; AGSTER, 2008).
O hipocampo estende-se ao longo do assoalho do corno temporal dos ventrículos
laterais, dividindo-se em áreas chamadas CA1, CA2 e CA3. As iniciais “C” e “A”
maiúsculas referem-se á abreviatura de Corno de Ammon (LORENTE DE NÓ, 1934).
Além disso, pode-se dividir o hipocampo em sete camadas: camada granular (gcl),
camada molecular (ml), estrato lacunoso molecular (slm), estrato oriens (so) estrato
piramidal não estratificado (sp), estrato radiato (sr), camada de células de Purkinje (pcl)
(PAXINOS, 2004). Como mostra a figura a figura 2.
O hipocampo juntamente com o giro denteado e os córtices transicionais
associativos (córtex entorrinal e subicular), constitui a formação hipocampal. Assim
chamada, pois essa unidade morfofuncional tem todas as suas estruturas acima citadas
como parte do sistema límbico e estão conectadas por um sistema de conexões
predominantemente excitatórias chamadas conjuntamente de “via trissináptica”
(LORENTE DE NÓ, 1934).
6
2.3 ÓXIDO NÍTRICO E ESTRESSE
O óxido nítrico (NO) é um gás tóxico, instável, e constitui uma das menores e
mais simples moléculas biossintetizadas. É um radical livre, gasoso, inorgânico e
incolor (WEAVER et al., 2005). Vem sendo considerado em estudos recentes como um
neurotransmissor atípico. Alguns estudos apontam o envolvimento desse gás em várias
patologias como, depressão e transtornos obsessivos (HAMID et al.,1993; BAGASRA
et al., 1995; BUTTERY et al., 1996; VODOVOTZ et al., 1996).
No cérebro o NO participa do aprendizado e da memória, além de poder mediar
respostas excitatórias a certos aminoácidos (SCHUMAN; MADISON, 1991). Estudos
prévios apontam que o NO tem efeito modulador em diferentes processos de memória e
aprendizagem.
Vodovotz et al. (1996) demonstraram que o bloqueio da síntese de NO causa
prejuízo a memória, tanto no processo de aquisição quanto no de recuperação. Zhou et
al. (2007), relataram que a inibição da síntese de NO causa diminuição da memória e
diminuição do nível de hormônio cortical liberado. O NO tem importante participação
no controle do HPA (STARKMAN et al., 1992).
A síntese do NO resulta da oxidação de um dos dois nitrogênios guanidino da L-
arginina, que é convertida em L-citrulina. Esta reação é catalisada pela enzima NO
sintase (NOS) (MARLLETA,1993; MONCADA, 1991). Estudos de análise da
sequencia de aminoácidos revelaram que as isoformas da NOS representam uma família
e são produtos de três genes distintos. Assim, as isoformas da NOS são agrupadas em
duas categorias, a NOS constitutiva (c-NOS), dependente de íons cálcio (Ca++
) e de
calmodulina, que está envolvida na sinalização celular, e a NOS induzível (i-NOS),
produzida por macrófagos e outras células ativadas por citocinas (MARLLETA, 1994;
MONCADA, 1991).
A c-NOS e a i-NOS diferem quanto ao peso molecular, à forma de ativação e à
capacidade de síntese de NO (MARLLETA, 1994). A isoforma constitutiva compreende
a NOS neuronal (n-NOS, tipo I), presente normalmente nos neurônios (BREDT;
SNYDER, 1989; KNOWLES, 1989), e a NOS endotelial (e-NOS, tipo III), presente
normalmente nas células endoteliais vasculares (MONCADA, 1991) e nas plaquetas
(RADOMSKI, 1990). A c-NOS produz pequenas quantidades de NO, da ordem de nano
ou picomols, e sua ativação depende da interação com a calmodulina, que, por sua vez,
é controlada pelos níveis de Ca++
(MARLLETA, 1994; MONCADA, 1991).
7
A i-NOS não é expressa sob condições normais, é induzida por citocinas e
endotoxinas em uma variedade de células (MONCADA, 1991). Esta isoforma requer
algumas horas para ser expressa, mas, uma vez sintetizada, libera quantidades maiores
de NO que a c-NOS e a produção deste continua indefinidamente até que a L-arginina
ou os co-fatores necessários para sua síntese sejam totalmente consumidos ou ocorra a
morte celular (DUSTING; MACDONALD, 1995).
Estudos com neurônios que contêm a forma constitutiva de NOS, demonstraram
que em situações de estresse é desencadeada uma ação neurotóxica. Essa
neurotoxicidade é promovida pela formação de peroxinitrito e liberação de íons ferro,
causando aumento de lesões no DNA e inibição da síntese desta biomolécula
(WEAVER, 2005).
2.4 NEURÔNIOS DIAFORASE POSITIVOS (NITRÉRGICOS)
Como já anunciado, a produção de NO em células de mamíferos, pode ocorrer
pela conversão da L-arginina em L-citrulina pela ação da enzima óxido nítrico sintase
(NOS). Como a NOS requer nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato (NADPH) e O2
para a produção de NO, células nitrérgicas (que produzem NO), podem ser identificadas
através da reação histoquímica da NADPH-diaforase (NADPH-d), indicadora da
atividade catalítica da NOS (GONZALEZ-HERNANDEZ et al., 1996; GABBOT;
BACON, 1996).
Corroborando com esse fato, foi demonstraram a perda completa da coloração
característica da marcação histoquímica por NADPH-d em células do sistema nervoso
de ratos transgênicos “knockdown” para um gene funcional responsável pela produção
de NOS neuronal, fornecendo apoio para a co-localização da NOS e junto a NADPH-d
(HUANG et al., 1993). Foi também verificado por Hilbig et al. (2001), que diferentes
isoformas da NOS podem expressar atividade para NADPH-d.
Tem sido relatado para o córtex cerebral de macaco Cebus apella e em outros
mamiferos que neurônios NADPH-d-positivos podem ser divididos em dois tipos
distintos. Sendo eles classificados como neuronios do Tipo I e neurônios do Tipo II
(YAN et al, 1996.; FRANCA et al, 1997; BARONE; KENNEDY, 2000).
Os do Tipo I têm um soma relativamente grande, preenchido por uma marcação
diaforase intensa que delimita bem o soma e seus prolongamentos. Esses neurônios
8
possuem uma marcação parecida com as demonstradas com a técnica de Golgi que
utiliza impregnação com prata para marcação morfologica de neurônios. Estes
neurônios estão distribuídos ao longo do córtex, mas principalmente na substância
branca subcortical e nas camadas corticais supragranulares (GABBOTT; BACON,
1996; CRUZ-RIZZOLO et al., 2006)
Neurônios do tipo II são mais numerosos, menores, com fraca atividade
NADPH-d, possuem tamanhos variantes entre médios e pequenos, com coloração pouco
forte e possuem pouca quantidade de prolongamentos dendríticos. Estão distribuídos em
maior parte nas camadas corticais do macaco Cebus apella (CRUZ-RIZZOLO et al.,
2006).
Estas células também foram encontrados na formação hipocampal de primatas
(SOBREVIELA; MUFSON, 1995) e na amígdala (BRADY et al, 1992), indicando a
ampla natureza desses neurônios no telencéfalo.
9
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos do estresse agudo e crônico pelo modelo de contenção sobre o sistema
nitrérgico no hipocampo de ratos Wistar adultos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Quantificar o número de neurônios diaforase positivos no hipocampo de ratos controle
e estressados.
- Quantificar a expressão da nNOS, iNOS, p-nNOS no hipocampo de ratos controle e
estressados.
-Comparar os modelos de estresse agudo e crônico por contenção, sobre os níveis de
modulação da NOS no hipocampo de ratos Wistar adultos.
10
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Os experimentos foram realizados com 48 ratos Wistar, divididos em quatro
grupos (Controle Agudo, Estresse agudo; Controle Crônico, Estresse Crônico), com
peso de 200-350g, com idade em torno das dezesseis semanas.
Os animais foram fornecidos pelo biotério central da UFS e mantidos em grupos
de quatro ratos em caixas plásticas padrão no biotério setorial do Departamento de
Fisiologia, até serem utilizados para os experimentos no Laboratório de Neurofisiologia.
Durante sua estadia no biotério setorial, os ratos tiveram livre acesso à água e
ração própria para roedores. A temperatura foi mantida a 240C com ciclo claro-escuro
natural. Depois de utilizados, os corpos dos animais foram acondicionados em sacos
plásticos vedados e depositados no freezer do biotério setorial do Departamento de
Fisiologia, até serem recolhidos pelo serviço de coleta da instituição.
Os animais utilizados foram tratados de acordo com as normas éticas para a
pesquisa animal, desenvolvidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa e Experimentação
Animal da Universidade Federal de Sergipe (CEPA-UFS), sob o protocolo CEPA
#76/2010 (ANEXO A).
4.2 ESTRESSE POR IMOBILIZAÇÃO
Neste trabalho foi utilizado o modelo de estresse por imobilização adaptado de
Gamaro et al. (1998) e Gameiro et al. (2006). De acordo com este protocolo, os ratos
foram confinados em tubos de PVC, de aproximadamente 24 cm de comprimento por 6
cm de diâmetro, cujo comprimento e diâmetro é ajustado para o tamanho de cada rato
por um dispositivo que oclui o orifício de abertura do tubo, de modo que os mesmos
foram impedidos de se movimentar (Figura 3). Os animais passaram por um período de
uma semana de ambientação de 30min manipulados diariamente pelo pesquisador.
Foram utilizados regimes de confinamento: estresse crônico (6 horas por dia,
durante 15 dias) e estresse agudo (1 hora, sessão única). Segundo Magarinõs et.al
(1997) as taxas dos hormônios ACTH e corticosterona dos animais mantidos em
contenção são significativamente mais elevadas quando comparadas com aquelas dos
11
animais controle, mantidos em suas gaiolas padrão. Estabelecendo assim um bom
protocolo para indução de estresse crônico e agudo.
Figura 3. Aparelho de contenção para rato. Adaptado de Gamaro et al. (1998) e Gameiro et al.
(2006). a. Aparelho de contenção aberto. Vista do alto. b. Aparelho de contenção com orifício de
abertura do tubo ocluído pelo mecanismo de fechamento. Vista Frontal.
Após 20 minutos do fim da exposição ao aparelho de contenção, ao fim do 15ª dia
de regime de confinamento para o estresse crônico e da sessão única de 1hora para o
estresse agudo, os animais seguiram então, para os procedimentos metodológicos
específicos a cada técnica aplicada.
a.
b.
12
4.3 PERFUSÕES DOS ANIMAIS E PREPARO DAS AMOSTRAS PARA
TÉCNICA HISTOQUÍMICA NADPH DIAFORASE
Vinte minutos após passarem pelos procedimentos de estresse por imobilização,
de acordo com o grupo experimental a qual se enquadravam, os animais foram
anestesiados com uma injeção intraperitoneal (1 mL/100g de peso corporal) de
ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), e em seguida perfundidos transcardialmente
com solução de tampão fosfato salino (PBS) (0,1 M, pH= 7,2-7,4) durante 5 minutos
para que os seus vasos sanguíneos fossem lavados. Depois se introduziu o fluxo de
paraformoldeído (0,1 M) a 4% em tampão fosfato (PB) durante 20 minutos. Os cérebros
dos animais foram então extraídos das caixas cranianas e reservados em PB (0,1 M).
4.4 HISTOQUÍMICA PARA NADPH DIAFORASE
Logo após a perfusão os cérebros foram fatiados no vibrátomo na espessura de
70µm, sempre banhados em tampão fosfato (PB) 0,1M. Seguiu-se com as lavagens das
fatias com Tris-HCl a 0,1M em pH 8,0 (3 lavagens de 5 minutos), em seguida lavou-se
as fatias com Triton X-100 a 0,5% (3 lavagens de 5 minutos).
eApós as devidas lavagens as fatias foram incubadas em 2 mL de meio, que
constitui-se de 1966µL de Triton X-100 0,5% em pH 8,7µL de nitroblue tetrazolium
(NBT) à 0,25 mg/ml em DMF e 17µL de β-NADPH a 0,83 mg/ml em H2O. As fatias
foram incubadas em estufa comum, durante 80 minutos, a 37°C, sendo que a cada 30
minutos eram observados se a marcação das amostras apresentava-se satisfatória. Com
obtenção das amostras na coloração roxa, a reação foi interrompida com a lavagem dos
cortes com tampão fosfato PB 0,1M (3 vezes por 5 minutos).
4.4.1 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS
Os cortes foram montados em lâminas gelatinizadas, e permaneceram durante um
intervalo de trinta minutos à uma hora em câmera úmida para que se fixassem na
lâmina. Passada esta etapa os cortes foram desidratados, com níveis crescentes de álcool
(70%, 80%, 90% e 100%) por cinco minutos cada, descorados parcialmente com um
banho de xilol (cinco minutos) e montados com meio permanente Eukitt® (SIGMA)
entre lâmina e lamínula, como mostra a figura 4.
13
Figura 4: Cortes corados com a técnica NADPH diaforase
e montados em lâmina permanente.
4.4.2 CONTAGEM CÉLULAS NEURONAIS EM CORTES CORADOS COM A
TÉCNICA NADPH DIAFORASE
Os dados foram analisados utilizando o microscópio óptico Olympus modelo
CX21FS, com câmera digital para microscopia (CMOS chip DCM130E) acoplada à
objetiva com auxílio do software de aquisição ScopePhoto® 3.1 (ScopeTek).
Foi analisado também, da mesma forma digital, as características qualitativas dos
neurônios do Tipo I e II no córtex do hipocampo dos animais testes e controle. Cada
animal forneceu seis fatias ao longo do seu eixo septo-temporal, que foram avaliadas
quanto à marcação para NADPH diaforase no hipocampo.
Das seis fatias obtidas foram utilizadas três da região septal hipocampal e três da
região temporal hipocampal. Em cada fatia o hipocampo foi identificado e classificado
em áreas CA1, CA2, CA3 e Giro Denteado de acordo com Paxinos (2004). Para cada
área hipocampal foi contabilizado o número de neuronios Tipo I e Tipo II.
Esse procedimento foi efetuado com a amostra de todos os animais utilizados nesse
estudo. As áreas hipocampais foram totalmente vizualizadas e tiveram os números
neuronais contabilizados em toda sua extensão. Para análise inicial, as médias da soma
dos números de neuronios das três fatias de cada região septo-temporal, marcadas pela
técnica diaforase, foi plotada em uma planilha feita no programa Excel
2007®
(APÊNDICE A), para posterior análise estátistica e comparação entre os grupos.
14
4.5 PREPARAÇÕES DO TECIDO PARA QUANTIFICAÇÃO DA
CONCENTRAÇÃO E EXPRESSÃO PROTEICA
Após a eutanasia dos animais por decapitação (n=32), os cérebros dos mesmos
foram extraídos da caixa craniana. Sendo os dois hemisférios cerebrais dissecados para
extração do hipocampo isolado (Figura 5).
Figura 5: a. Isolamento de hipocampo por dissecação de hemisférios cerebrais; b.
Hipocampo direito e esquerdo isolados. Escala figura b.: (5 cm).
Desse modo, o hipocampo do hemisfério cerebral direito seguiu para a
preparação do homogeneizado conforme se procede para a técnica de Western Blot. E o
hipocampo do hemisfério cerebral esquerdo foi reservado à -80Cº, para posterior
utilização.
4.6 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE HIPOCAMPO PARA WESTERN
BLOT
Os hipocampos retirados do hemisfério cerebral direito dos grupos tratados
segundo o protocolo de estresse agudo e crônico, foram rapidamente removidos e
imersos em uma solução salina tamponada com Tris-Base (TBS) contendo (mM): 50
Tris-Base; 150 NaCl, pH 7,4. Posteriormente, em banho de gelo, os tecidos foram
homogeneizados (Dremel 300®) na presença de tampão de lise contendo (mM): 150
NaCl; 50 Tris 50; 5 EDTA; 2Na; 1 MgCl2, pH 8,0 acrescido de 100 mM Dithiothreitol,
1% Nonidet P40, 0,3% de Triton X-100, 0,5% de SDS, cocktail de inibidores de
a. b.
5 cm
15
proteases (SigmaFast®, Sigma), 100 mM PMSF e de inibidores de fosfatases, 10 mM
Na4P2O7, 10 mM Na3VO4 e 100 mM NaF.
Os tecidos foram homogeneizados a uma proporção de 100 mg/mL de tampão
de lise. Após o processamento, as amostras foram centrifugadas a 15.000 rpm (Neofuge
15R, HEAL FORCE®, China) por 15 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi aliquotado e
congelado a -80ºC para posterior utilização.
4.6.1 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO TOTAL DE PROTEÍNAS
A concentração total de proteínas foi determinada pelo método de Lowry et al.
(1951). Resumidamente, as amostras foram diluídas 10 vezes e adicionadas NaOH 0,5
M. Após 15 minutos de incubação, adicionou-se em cada amostra, uma solução
composta por: 2% Na2CO3, 1% CuSO4 e 2% KNaC4H4O6•4H2O, na proporção de
100:1:1. Ao final foi adicionado o reagente de Folin diluído 2 vezes. Após incubação
por 30 minutos, foi realizada a leitura no comprimento de onda de 630nm em leitora
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (ELx800, BIOTEK Instruments®,
EUA). Para confecção da curva de proteína padrão, utilizou-se albumina bovina
(Sigma-Aldrich®) em várias concentrações.
4.6.2 DETERMINAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA POR WESTERN BLOT
As amostras foram diluídas em tampão da amostra (Tris HCl/SDS pH=6.8, 3%
Glycerol, 1% SDS, 0.6% β-mercaptoetanol, Azul de Bromofenol) e aquecidas à 98°C
por 5 minutos. Para separação, foram aplicados 60 µg de proteína em gel de SDS-PAGE
(do inglês sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) a 10%.
Após serem separadas em gel de poliacrilamida, as proteínas foram transferidas
para uma membrana de nitrocelulose (Millipore®, EUA) com poros de 0,44 μm. A
qualidade da transferência foi monitorada através da coloração da membrana com
solução de Ponceau 0,3%. A membrana foi então lavada em solução salina tamponada
com Tris-Base acrescido com 0.05% de Tween 20% (TBS-T) e colocada por 1 à 2 horas
em solução de bloqueio (4% de albumina em TBS-T). Após o bloqueio, a membrana foi
incubada em temperatura de 6-8ºC, com o anticorpo primário específico diluído em 1%
de albumina em TBS-T, overnight.
16
Os seguintes anticorpos primários foram utilizados: anti-nNOS / anti-iNOS
(1:1000; policlonal feito em coelho; Santa Cruz Biotechnology Inc - Santa Cruz, CA,
EUA) e anti-pnNOSSer852
/ anti-GAPDH (1:1000; policlonal feito em cabra; Santa Cruz
Biotechnology Inc. - Santa Cruz, CA, EUA).
Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com TBS-T durante 5 minutos e
incubada por 2 horas com o anticorpo secundário conjugado a peroxidase (HRP)
(1:5000, anti-goat IgG-HRP ou anti-rabbit IgG-HRP, Sigma, St. Louis, MO) diluído em
1% de albumina em TBS-T. Após o período de incubação, a membrana foi novamente
lavada por mais três vezes em TBS-T, durante 5 minutos. As bandas proteicas foram
detectadas por uma reação de quimioluminescência (Luminata strong™ - Western HRP
substrate, Merck-Millipore, Darmstad, Germany) e a intensidade das mesmas foi
avaliada por análise densitométrica, através do software ImageJ 1.38x (NIH).
Para os experimentos acima citados, foram utilizados o sistema Mini Protean III-
Tetracell e Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (BIORAD®, CA, EUA).
4.7 ANÁLISES ESTATÍSTICA
4.7.1 ANÁLISE ESTATÍSTICA PARA HISTOQUÍMICA NADPH DIAFORASE
A contagem foi feita manualmente, de modo a contabilizar neurônios do Tipo I e II
nas determinadas áreas do hipocampo. Com os dados coletados, observados pela
quantidade de neurônios Tipo I e II, procurou-se comparar os dados entre os animais
teste e seus respectivos controles, e entre o grupo teste agudo e teste crônico. Os
resultados foram expressos a partir da média ± o Erro Padrão da Média (EPM) e a
diferença entre os valores dos grupos experimentais e grupos controle, foi avaliada pela
ANOVA one-way, seguidas do post-hoc de Tukey para comparação entre os grupos.
Valores de p<0,05 e p<0,01 foram considerados como significativos. Foi utilizado o
programa SPSS 18.0 para as devidas análises.
17
4.7.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA PARA WESTERN BLOT
Os cálculos e análises dos resultados obtidos foram analisados pelo software
Prism 5.1 (GraphPad, San Diego, CA, EUA). Os resultados de expressão proteica
obtida, através do western blot foram normalizados pelo resultado do GAPDH de cada
amostra sendo expressos em média ± EPM e adotado o teste de ANOVA one-way,
seguido por post-hoc de Bonferroni para comparação entres os grupos. Para efeito
estatístico foram considerados significativos os valores que apresentavam p<0,05.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 MORFOLOGIA DOS NEURÔNIOS NADPH DIAFORASE
As NOS estão distribuídas no SNC de uma variedade de espécies, e, sua
localização pode estar relacionada a varias funções (BLOTTNER; GROZDANOVIC;
GOSSRAU, 1995). Como já dito no presente trabalho, os neurônios que expressam as
NOS podem ser marcados com a técnica de NADPH diaforase. Constatamos a
diferenciação morfologica entre os neurônios do Tipo I e do Tipo II no hipocampo de
ratos estressados agudamente e cronicamente, assim como já verificado por Sobreviela e
Mufson (1995).
Pode-se notar que no hipocampo dos animais estudados que os neurônios Tipo I,
possuem visualmente uma maior arborização dendrítica e uma impregnação diaforásica
maior, tanto nos animais controle quanto nos teste dos dois protocolos de estresse, em
relação aos neurônios do Tipo II dos mesmos animais, como pode ser visto na figura 6,
7 e 8.
18
Figura 6. Neurônios do tipo I no hipocampo de animal do grupo teste estresse crônico.
Em destaque (seta: ), pode-se observar os neurônio do tipo I marcado com NADPH-
diaforase. Objetiva: 40X.
Figura 7. Neurônio Tipo I em destaque no hipocampo de
animal do grupo teste estresse crônico. Objetiva 100x.
Os neurônios do Tipo II apresentam aparentemente uma coloração menos
intensa, menor tamanho, e feixes de arborizações dendriticas menos expressivas (Figura
8). Visualmente também se apresentam em maior número no hipocampo.
(50µm)
m)
µµµm)
(15µm)
19
Figura 8. Hipocampo de animal grupo controle estresse crônico. Em destaque (seta: ),
pode-se observar o neurônio do tipo II marcado com NADPH-diaforase. Objetiva: 40X.
Após visualização e caracterização dos neurônios no hipocampo, seguiu-se a
contagem dos neurônios marcados com a técnica e sua relação de expressão entre os
animais que passaram pelo protocolo do estresse agudo e estresse crônico.
5.2 DISTRIBUIÇÕES DOS NEURÔNIOS NADPH DIAFORASE
5.2.1 NÚMERO TOTAL DE NEURÔNIOS TIPO I E TIPO II
Neurônios do Tipo I observados no hipocampo
Como pode ser visto na figura 9, não houve diferença significativa no número total
de neurônios Tipo I no hipocampo dos animais submetidos a estresse agudo e crônico e
seus respectivos controles. Isso pode indicar que os neurônios NOS positivos, talvez
necessitem de um tempo maior de submissão ao estresse para que possam desencadear
essa expressão.
(60µm)
20
Figura 9. Gráfico da relação dos neurônios Tipo I no hipocampo de ratos Wistar,
submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção, marcados pela
técnica de NADPH-d. n=4.
Neurônios do Tipo II observados no hipocampo
A análise da contagem de neurônios do Tipo II possibilitou verificar uma diferença
significativa (p<0,05) existente na quantidade desses neurônios no hipocampo entre
animais estressados cronicamente, seu respectivo controle e entre o grupo submetido ao
protocolo de estresse agudo. Essa diferença pode ser observada na figura 10.
As células em questão possuem um menor grau de expressão diaforásica (Figura 8)
e, portanto o protocolo de estresse crônico aos quais os animais foram submetidos já
possibilitaria uma maior marcação desse tipo neuronal. Esse fato nos remete a vertente
que o estresse crônico atuaria aumentando a expressão da NOS e possivelmente a
expressão elevada de NO em consequência do prolongamento do estado de estresse do
modelo estudado. O que pode estar diretamente envolvido com a condição fisiológica
de desordem a qual superprodução de NO está intimamente ligada.
Relação de neurônios Tipo I marcados pela técnica de
NADPH-DIAFORASE.
21
Figura 10. Gráfico da relação dos neurônios Tipo II no hipocampo de ratos Wistar
submetidos ao protocolo de estresse agudo e crônico por contenção, marcados pela
técnica de NADPH-d. *p<0,05 quando comparado com todos os grupos. n=4.
Como observado não houve diferenças significativas em relação aos neurônios
diaforásicos do Tipo I no hipocampo, fato este que nos permite uma maior atenção
sobre a avaliação dos neurônios do Tipo II nas determinadas áreas hipocampais
estudadas.
Tem sido relatado que o padrão de expressão de NOS no hipocampo, usando a
histoquímica NADPH diaforase para células piramidais e células da camada granular,
apresentam índices elevados em estágios iniciais de desenvolvimento e que esta
coloração diminui em neurônios maduros que passam a exibir uma coloração mais fraca
para NOS (BREDT; SNYDER, 1994; YAN; RIBACK, 1997). Esse fato corrobora com
o achado de diferenças significativas apenas para neurônios do Tipo II no hipocampo
dos animais estudados, que como já ditas são células altamente marcadas pela coloração
diaforasica, que aparecem em fases mais tardias da vida do animal mesmo sob o
protocolo de estresse crônico por contenção.
Relação de neurônios Tipo II marcados pela técnica de
NADPH-DIAFORASE.
22
5.2.2 DISTRIBUIÇÃO DE NEURÔNIOS TIPO II NAS ÁREAS HIPOCAMPAIS
O hipocampo está criticamente envolvido na formação da memória, podendo
operar como uma unidade integrada ou como partes isoladas, sendo responsável
também por diferentes funções dentro da consolidação da memória (MAY-BRITT;
MOSER, 1998).
Como anteriormente exposto não houve diferenças significativas entre a
expressão dos neurônios Tipo I e o estado agudo e crônico do estresse fisiológico
(Figura 9), a investigação proposta passou então a verificar se existem diferenças na
expressão de neurônios diaforásicos do Tipo II nas áreas hipocampais CA1, CA2, CA3
e giro denteado.
A figura 11 (a, c) apresenta os gráficos que nos mostram que na área CA1 e CA3
não encontramos diferenças significativas entre o número de neurônios diaforásicos do
Tipo II nos grupos tratados sob o protocolo de estresse agudo e crônico e seus
respectivos controles, bem como entre os estressados agudamente e cronicamente
(Figura 11 a, 11 c). O número de neurônios do Tipo II nessas áreas demonstrou valores
muito próximos. Mostrando que para essas determinadas áreas os diferentes tratamentos
não tiveram impacto sobre a expressão da NOS.
23
Figura 11. Gráficos da relação dos neurônios Tipo II no hipocampo de ratos Wistar nas diferentes
áreas hipocampais. a. CA1. b. CA2. c. CA3. d. GD (giro denteado), submetidos ao protocolo de
estresse agudo e crônico por contenção. *p<0,05 quando comparado com todos os grupos. #p<0,05
quando comparado com o controle do grupo crônico. n=4.
No entanto, tem sido relatado que a marcação de neurônios positivos para NOS
ou seu marcador, NADPH diaforase, são escassos na camada piramidal de CA1 e CA2
em situações basais (VALTSCHANOFF et al., 1993; YAN; RIBACK, 1997),
mostrando que o aumento de produção de células diaforase positivas em CA2 são
eventos próprios do estresse a longo prazo.
a. b.
c. d.
Relação de neurônios Tipo II marcados pela técnica de NADPH-
DIAFORASE nas diferentes áreas cerebrais.
24
Nossos resultados demonstraram que na área CA2 houve um aumento
significativo na expressão de neurônios tipo II em animais estressados cronicamente
quando comparados aos seus controles, o que nos sugere que existe uma diferença na
expressão de NOS entre as áreas hipocampais, uma vez que não foi observada diferença
significativa em CA1 e CA3.
No entanto, não houve diferença significativa na expressão destes neurônios
entre os animais submetidos ao estresse agudo e ao estresse crônico. Desta forma, é
necessário o desenvolvimento de estudos que busquem identificar os mecanismos
responsáveis por estas diferenças, uma vez que não existem dados na literatura acerca
disto, e que nos permita determinar a relação entre o aumento da expressão destes
neurônios com uma determinada modulação fisiológica.
Na região do Giro Denteado do hipocampo verificou-se uma diferença
significativa entre neurônios Tipo II nos animais tratados cronicamente quando
comparados com todos os grupos. Demonstrando que essa área de importante
participação na consolidação da memória estaria sofrendo grandes efeitos sob a
condição de estresse crônico.
5.2.3 RELAÇÃO ENTRE O NÚMERO DE NEURÔNIOS TIPO I E TIPO II
ENTRE A REGIÃO ANATÔMICA SEPTAL E TEMPORAL DO HIPOCAMPO
Evidências recentes sugerem que o hipocampo é funcionalmente diferenciado ao
longo do seu eixo septo temporal ou dorsoventral. As conexões corticais e subcorticais
do hipocampo dorsal e ventral são diferentes, com informação proveniente dos córtices
sensoriais que entram principalmente vias da região dorsal de dois terços ou três quartos
do giro denteado (MAY-BRITT; MOSER,1998).
Ratos podem adquirir memoria espacial se pequenos blocos de tecido dentro do
giro denteado são poupados em grandes lesões, porém se grandes blocos de tecido
forem removidos no final da região ventral, eles não são capazes de sustentar a
aprendizagem espacial (GABBOTT; BACON, 1996).
Nos primatas, o hipocampo posterior (correspondente ao hipocampo dorsal de
roedores), parece ser mais importante do que a região anterior para a codificação da
memória espacial e certas formas de memória não espacial (GABBOTT; BACON,
1996; MAY-BRITT; MOSER, 1998).
25
A formação hipocampal ventral (ou anterior), em certo ponto deconectada do
resto da estrutura, tanto em termos de ligações intra-hipocampal e extra-hipocampal,
pode executar funções que são qualitativamente diferentes e independentes aos da
formação hipocampal dorsal (MAY-BRITT; MOSER, 1998).
Avaliando esses aspectos morfológicos do hipocampo foi verificado que na
região mais anterior do hipocampo, chamada anatomicamente de região septal do
hipocampo, existem diferenças entre a expressão de Neurônios Tipo I e Tipo II como
mostra a figura 12.
Sendo que mais uma vez a expressão de neurônios Tipo I não foi significativa
em nenhum dos grupos na região septal do hipocampo (Figura 12 a.). Por outro lado a
taxa dos neurônios do Tipo II em animais estressados cronicamente quando comparados
tanto com seu respectivo controle, quanto com o grupo de animais estressados
agudamente, mostrou-se bem maior (Figura 12 b.).
Figura 12. Número de neurônios Tipo I e II no hipocampo de ratos Wistar submetidos ao protocolo
de estresse agudo e crônico por contenção. Análise de cortes da região septal do hipocampo. a.
Relação para neurônios tipo I. b. Relação para neurônios tipo II. p**<0,01 quando comparado com
todos os grupos. n=4.
a. b.
Número de neurônios Tipo I e II da região septal do hipocampo marcados pela
técnica de NADPH-DIAFORASE.
26
Seguindo a mesma linha de pensamento foi feita a avaliação da expressão de
neurônios Tipo I e Tipo II para a região dorsal do hipocampo (Figura 13), de modo que,
novamente, a avaliação dos neurônios do Tipo I (Figura 13 a.) não apresentou diferenças
significativas entre o grupo teste estresse crônico, grupo teste estresse agudo e seus
respectivos controles. Mostrando mais uma vez que os neurônios que mais expressam a
NOS de acordo com a técnica da NADPH diaforase, não mostram diferenças
quantitativas em relação ao aumento do número de células nos diferentes tratamentos e
nas diferentes regiões anatômicas do hipocampo.
Figura 13. Número dos neurônios Tipo I e II no hipocampo de ratos Wistar submetidos ao
protocolo de estresse agudo e crônico por contenção. Análise de cortes da região dorsal do
hipocampo. a. Relação para neurônios tipo I. b. Relação para neurônios tipo II. p*<0,05 quando
comparado com todos os grupos. n=4.
Já na avaliação do número de neurônios Tipo II na região dorsal (Figura 12 b.)
do hipocampo, verificamos um aumento significativo (p<0,01) para o grupo de animais
estressados cronicamente quando comparados ao grupo de animais estressados
agudamente e os respectivos grupos controle. O número de células encontrado na
porção dorsal do hipocampo foi numericamente menor do que nas fatias analisadas do
a. b.
Número de neurônios Tipo I e II da região dorsal do hipocampo marcados pela
técnica de NADPH-DIAFORASE.
27
hipocampo septal. Porém a diferença de expressão entre os grupos foi
significativamente maior, mostrando mais uma vez que o tratamento crônico dos
animais parece estimular uma maior expressão de células com potencialidade de
produzir NO.
Como se pode perceber a partir das análises feitas, o tratamento crônico
demonstra um aumento de forma significativa com relação à expressão de neurônios
diaforásicos do Tipo II, neurônios que em sua constituição são considerados nitrérgicos.
O estresse a longo prazo parece, de forma fisiológica, está envolvido na maior
expressão de NOS, fato esse, explorado através da técnica de Western Blot.
5.3 QUANTIFICAÇÕES DA NOS POR WESTERN BLOT NO HIPOCAMPO
A técnica possibilita a determinação da quantidade proteica, mensurada em
valores quantitativos. Dessa forma conseguimos deduzir se ocorre aumento ou
diminuição das NOS, presentes no hipocampo após o protocolo de estresse agudo e
crônico utilizado.
Os resultados das análises dos níveis de expressão das três isoformas estudadas
das NOS confirmaram a presença da nNOS, p-nNOS e i-NOS no hipocampo de ratos
(Figuras 14, 15 e 16).
5.3.1 EXPRESSÃO ISOFORMA nNOS
A nNOS é expressa constitutivamente no cérebro, portanto nossa avaliação dos
níveis dessa NOS consistiu em verificar os níveis de expressão desta enzima de acordo
com os tratamentos dos protocolos de estresse agudo e crônico.
Como visualizado na figura 14, o grupo de animais estresse crônico mostrou um
aumento significativo na expressão da nNOS quando comparado com seu respectivo
grupo controle (p<0,05) e também mostrou aumento significativo quando comparado ao
grupo estresse agudo (p<0,01). Este fato corrobora os dados obtidos nos estudos de
histoquímica para diaforase, os quais mostraram um relativo aumento de neurônios
nitrérgicos em áreas determinadas do hipocampo. De fato, já é sabido, que o estresse
crônico aumenta as expressões de NOS, mas no presente estudo percebemos que o
28
estresse agudo parece ainda não exercer efeito significativo sobre essa expressão
nitrérgica.
Figura 14. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase Neuronal
(nNOS) em hipocampo de ratos submetidos à estresse de contenção. Os valores apresentados
foram expressos em unidades arbitrarias (u.a.) e estão representados em média ± e.p.m. Grupo
controle agudo (Ctr. Agu. – n=7), Grupo estresse agudo (Str. Agu. – n=7), Grupo controle crônico
(Ctr. Crôn. – n=5), Grupo estresse crônico (Str. Crôn. – n=6). *p<0,05, **P<0,01.
29
5.3.2 EXPRESSÃO DA ISOFORMA p-nNOSser852
A medição da expressão de p-nNOSser852
nos indica o estado de ativação ou
inativação da nNos no tecido. A isoforma p-nNOSser852
é a forma da NOS fosforilada
que se da pela medida do sítio Serina 852, que constitui o sítio de inativação da
proteína. Ou seja, em níveis mais elevados da p-nNOSser852
estamos na verdade
mensurando a inativação da nNOS.
Na figura 15 está representada a determinação da expressão da nNOS fosforilada
no resíduo de Serina na posição 852 (p-nNOSSer852
), conhecido, quando fosforilado,
causar inativação desta enzima. Nas medidas realizadas foram detectadas reduções
significativas (p<0,05) na expressão da p-nNOSSer852
nos hipocampos isolados dos
animais estressados agudo e cronicamente quando comparados aos seus respectivos
controles.
Não observamos variação de ativação relacionando o grupo estresse agudo com
o grupo estresse crônico. Este fato indica que nos dois tratamentos ocorre ativação da
nNOS, e que a via de produção de oxido nítrico endógena está continuamente ativada.
Contudo, o aumento de NO no estresse crônico pode ser modulado através da ativação
de outra isoforma de NOS, já que o aumento da expressão da forma ativada da nNOS
não muda, tanto para o grupo estresse crônico, quanto para o grupo estresse agudo. A
alteração entre os estados de ativação ocorre apenas entre os grupos teste e seus
respectivos controles (Figura 15).
30
Figura 15. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase
Neuronal Fosforilada (p-nNOS ser852
) em hipocampo de ratos submetidos à estresse
de contenção. Os valores apresentados foram expressos em unidades arbitrarias
(u.a.) e estão representados em média ± e.p.m. Grupo controle agudo (Ctr. Agu. –
n=4), Grupo estresse agudo (Str. Agu. – n=5), Grupo controle crônico (Ctr. Crôn. –
n=6), Grupo estresse crônico (Str. Crôn. – n=5). *p<0,05.
31
5.3.3 EXPRESSÃO DA ISOFORMA i-NOS
A isoforma i-NOS é conhecida por ser uma isoforma expressa naturalmente em
neurônios, e sua atividade traz uma contribuição expressiva para a quantidade de NO
produzida nestas células. Deste modo, identificar a expressão de i-NOS em animais
submetidos ao estresse por contenção mostra-se de grande importância para tentarmos
correlacionar à ativação dos neurônios nitrérgicos com a isoforma de NOS que contribui
para a produção desta molécula, bem como, correlacionar a expressão desta isoforma de
acordo com a duração do estado de estresse por contenção.
Como pode ser observado na figura 16, houve aumento significativo da
expressão da isoforma i-NOS entre o grupo estresse crônico e seu respectivo controle,
este fato demonstra que, no estresse crônico, possivelmente, há uma produção
aumentada de NO por esta via de produção.
Nesta figura, podemos ainda verificar que o grupo crônico quando comparado ao
grupo estressado agudamente, apresenta, também o nível de expressão da isoforma i-
NOS aumentada. O que nos indica que, provavelmente, o estresse a longo prazo tem
uma relação íntima com altos níveis de NO. A literatura mostra que a produção de NO
pela i-NOS é maior quando comparado com a produção pelas demais isoformas de NOS
conhecidas. Segundo Dusting e Macdonald (1995) essa isoforma requer algumas horas
para ser expressa, mas, uma vez sintetizada, sintetiza quantidades de NO, em
concentrações molares maiores que as isoformas c-NOS.
Os efeitos deletérios o NO são desencadeados através de uma ação tóxica devido
à reação do NO com o ânion superóxido (O2-) resultam na formação de peroxinitrito
(ONOO-), um poderoso oxidante de proteínas. O ONOO
- aumentando efetivamente a
ação tóxica do NO e do O2– (BECKMAN; KOPPENOL,1996).
Os efeitos deletérios do estresse crônico assim se relacionam com os efeitos
deletérios da maior produção de NO pela via da i-NOS. Efeitos estes que ainda não são
desencadeados em curto prazo no estresse agudo.
32
Figura 16. Determinação da expressão proteica da enzima Óxido Nítrico Sintase Induzida (i-NOS)
em hipocampo de ratos submetidos à estresse de contenção. Os valores apresentados foram
expressos em unidades arbitrarias (u.a.) e estão representados em média ± e.p.m. Grupo controle
agudo (Ctr. Agu. – n=5), Grupo estresse agudo (Str. Agu. – n=7), Grupo controle crônico (Ctr.
Crôn. – n=5), Grupo estresse crônico (Str. Crôn. – n=6). *p<0,05.
33
6 CONCLUSÃO
- A produção de NO se dá por outra via que não a da p-nNOSser852
.
- O desfavorecimento à homeostasia da circuitaria hipocampal pelo aumento da
produção de NO, provavelmente, se dá através da via de produção da i-NOS.
- O estresse agudo não é capaz de produzir efeitos significativos sobre a produção do
NO, no tocante a promover danos a homeostasia hipocampal.
34
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41
APÊNDICE A
PLANILHA PARA PLOTAGEM DAS MÉDIAS DE NEURÔNIOS ENCONTRADOS
NAS ÁREAS HIPOCAMPAIS ESTUDADAS.
*rato crônico#
Neurônios
Tipo I
Estresse
Crônico Hipocampo Septal Hipocampo Ventral
Animal Grupo CA1 CA2 CA3 GD CA1 CA2 CA3 GD
*RC1 TESTE
*RC2 CONTROLE
*RC3 TESTE
*RC4 CONTROLE
*RC5 TESTE
*RC6 CONTROLE
*RC7 TESTE
*RC8 CONTROLE Neurônios
Tipo II
Estresse
Crônico Hipocampo Septal Hipocampo Ventral
Animal Grupo CA1 CA2 CA3 GD CA1 CA2 CA3 GD
*RC1 TESTE
*RC2 CONTROLE
*RC3 TESTE
*RC4 CONTROLE
*RC5 TESTE
*RC6 CONTROLE
*RC7 TESTE
*RC8 CONTROLE
42
ANEXO A
DECLARAÇÃO DO CEPA/UFS
