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Module 3 Reprogrammation cellulaire: remettre la pendule des cellules à zéro Le développement cellulaire est-il à sens unique? Depuis des siècles, les biologistes se demandent comment il est possible qu’un seul ovule fécondé puisse donner naissance à un être humain, c’est-à-dire à un organisme incroyablement complexe comportant des centaines de types cellulaires différents. Jusqu’à la fin du XIXe siècle, les biologistes étaient convaincus que le développement de l’embryon en un organisme adulte était un processus unidirectionnel et irréversible, une voie à sens unique. Ils étaient sûrs que le développement cellulaire au cours duquel la cellule souche se transforme en cellule spécialisée, cellule de la peau par exemple, processus appelé la différenciation, était un mécanisme irréversible. À la fin du XIXe siècle, deux hypothèses sur le développement cellulaire se confrontaient. La première hypothèse était que les cellules se différencient par perte sélective de matériel génétique. Si nous comparons l’information renfermée par l’ADN avec un livre de cuisine, on pourrait décrire cette hypothèse de la manière suivante: si une cellule souche se transforme en cellule cutanée, certaines pages du livre de cuisine sont arrachées. La cellule cutanée ne dispose plus que des recettes dont elle a besoin en tant que cellule cutanée. Les autres recettes sont absentes. La deuxième hypothèse était que lors de la différenciation cellulaire, seul le modèle d’expression de l’ADN se modifie, sans perte de matériel génétique. Cela voudrait dire que la cellule cutanée dispose toujours du livre de cuisine complet, mais que certaines pages sont dissimulées, de sorte que la cellule ne peut plus en lire les recettes ou les cuisiner. Elle lit et transcrit uniquementles gènes lui donnant son identité de cellule cutanée.

Vérification des hypothèses par transfert nucléaire Quelle est l’hypothèse exacte? Un moyen de le vérifier est le transfert nucléaire: cette expérience consiste à énucléer une cellule différenciée (cellule cutanée par exemple), c’est-à-dire prélever son noyau à l’aide d’aiguilles microscopiques et de l’injecter dans un ovocyte également énucléé au préalable. Le noyau cellulaire d’une cellule cutanée se trouve donc dans le cytoplasme d’un ovocyte (fig. 1). Si cet ovocyte manipulé se développe alors pour donner un embryon, cela signifierait que la deuxième hypothèse est correcte. En effet, si du matériel génétique avait été perdu dans la cellule cutanée différenciée (livre de cuisine auquel des pages ont été arrachées), cette cellule manipulée ne pourrait plus engendrer de nouvel organisme puisque les recettes nécessaires manqueraient. Les organismes issus du transfert d’un noyau cellulaire sont dits «clonés». Les organismes clonés ne sont pas nés de la reproduction sexuée (fusion d’un ovocyte et d’un spermatozoïde), ils sont génétiquement identiques à l’organisme donneur.

Stammzellen und regenerative Medizin

Nationales Forschungsprogramm NFP 63

Cellules souches et médecine régénérative Programme national de recherche PNR 63

Stem Cells and Regenerative Medicine National Research Programme NRP 63

Figure 1: Transfert nucléaire chez la souris. Représentation schématique du transfert nucléaire. Le blastocyste cloné peut engendrer soit des cellules souches embryonnaires, soit une souris vivante clonée (Source: Epigenetics, 2006, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

En 1952, Robert Briggs et Thomas J. King réussissent pour la première fois à effectuer un transfert nucléaire sur des cellules de grenouille léopard (Rana pipiens). Les deux chercheurs prélèvent plusieurs noyaux d’embryon de grenouille (à un stade de développement précoce où les cellules sont encore pluripotentes) et implantent ces noyaux dans le cytoplasme d’ovocytes. Ces ovocytes donnent naissance à des têtards clonés. Cependant, lorsqu’ils prélèvent les noyaux cellulaires sur des cellules plus différenciées, par exemple des cellules de l’intestin, et qu’ils les implantent dans des ovocytes, ceux-ci n’engendrent pas de têtards. Briggs et King en concluent que du matériel génétique est perdu au cours de la différenciation cellulaire, des pages du livre de cuisine arrachées et donc que la première hypothèse est la bonne. Quelques années plus tard, un jeune chercheur en biologie du développement, le Britannique John B. Gurdon, répète l’expérience. Mais au lieu de Rana pipiens, il étudie le xénope lisse (Xenopus laevis) comme modèle. En 1962, Gurdon utilise les noyaux cellulaires de cellules de l’intestin de têtards (donc des noyaux de cellules différenciées) et les implante dans des ovocytes. Et effectivement, ces ovocytes manipulés donnent naissance à des grenouilles adultes (fig. 2). Gurdon peut ainsi montrer qu’au cours de la différenciation cellulaire, il n’y a pas de perte d’information génétique, mais que seul le modèle d’expression des gènes est différent dans les cellules différenciées par rapport aux cellules souches pluripotentes. Gurdon réfute donc ainsi la première hypothèse. 50 ans plus tard, il sera récompensé pour cette découverte par le prix Nobel de médecine. De nombreuses autres expériences viendront confirmer cette théorie (à quelques exceptions près). Cependant, plus le noyau cellulaire est spécialisé, plus le taux de succès du clonage de grenouilles ou d’autres animaux diminue (fig. 3).

Isolement decellules cutanées

Injection dunouveau noyau

cellulaire

Cellules souchesembryonnaires

Blastocyste

Sourisclonée

Prélèvement dunoyau cellulaire Ovocyte énucléé

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Figure 2: Premier vertébré cloné créé par transfert nucléaire. Cette grenouille xénope est née de la transplantation du noyau cellulaire d’un précurseur de cellule nerveuse dans un ovocyte (Gurdon et al., 1958).

Figure 3: Taux de survie des xénopes après transfert nucléaire. La figure montre que seul un certain nombre d’embryons de grenouilles clonés ont évolué pour donner des têtards. Plus les noyaux cellulaires utilisés sont différenciés, plus le taux de succès est faible. Abréviations: (B) Blastula, (G) Gastrula, (N) Neurula, (TB) Tail bud, (HB) heart beat, (ST) swimming tadpole, (FT) feeding tadpole. (Source: Epigenetics, 2006, Cold Spring Harbor Laboratory Press.) Il faudra attendre plus de 30 ans avant que l’expérience de Gurdon puisse être reproduite avec succès sur des mammifères. Une des raisons majeures est que les ovocytes de mammifères sont beaucoup plus petits que les ovocytes de grenouilles, ce qui rend l’expérience techniquement beaucoup plus difficile. De plus, les ovocytes se trouvent dans le

Nombre total de transferts nucléaires atteignant le stade de têtard

Nombre d’heures après fécondation

B G N TB HB ST FT

9 12 20 26 40 66 144

40

30

20

10

0

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corps de la mère et non à l’extérieur comme chez la grenouille et sont donc plus difficilement accessibles. Mais en 1996, deux chercheurs britanniques, Keith Campbell et Ian Wilmut, parviennent à cloner une brebis par la même technique. Ils l’appelleront Dolly. Leur méthode consiste à transférer le noyau cellulaire de cellules de glande mammaire d’une brebis (cellules différenciées) dans l’ovocyte énucléé d’une autre brebis. Mais l’expérience ne fonctionne pas du premier coup: sur 227 ovocytes manipulés, seul un se développe jusqu’à devenir une brebis vivante (fig. 4).

Figure 4: Taux de survie de mammifères clonés. Le nombre d’embryons clonés aboutissant à une naissance vivante est très faible comparé au nombre de transferts nucléaires réalisés. Ce graphique montre que le transfert nucléaire est très inefficace, mais on ne sait pas l’expliquer entièrement. L’une des raisons est que le noyau cellulaire ne dispose que de très peu de temps pour apprendre à «cuisiner les nouvelles recettes» de son nouvel environnement. Une autre est la difficulté technique que représente le transfert nucléaire. (Source: Epigenetics, 2006, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

D’après les résultats de ces expériences effectuées sur la grenouille puis la brebis, les scientifiques conclurent que plus une cellule est spécialisée et âgée, moins elle est capable de cuisiner toutes les recettes du livre de cuisine. En vieillissant, elle ne peut que cuisiner des recettes spécifiques. Exemple: si une cellule souche se transforme en cellule cutanée, celle-ci présente le modèle d’expression génétique spécifique à une cellule cutanée. Mais comme le montrent les expériences de clonage, cette expression des gènes différenciée est réversible. Cela signifie que la cellule cutanée peut, dans certaines conditions, être «reprogrammée» afin qu’elle puisse à nouveau cuisiner toutes les recettes. Ce processus est appelé reprogrammation. La pendule des cellules est remise à zéro.

Taux de survie

Âge des clonesImplantation Naissance

SurvivantsMorts

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Comment est-ce possible? C’est l’environnement du noyau cellulaire qui en est responsable: le noyau de la cellule cutanée introduit dans le cytoplasme de l’ovocyte est modifié par certaines protéines (par exemple des facteurs de transcription) se trouvant dans ce cytoplasme, de telle sorte qu’il reprend le modèle d’expression des gènes d’un ovocyte totipotent fécondé. En parallèle aux expériences de transfert nucléaire, qui ont montré que la pendule des cellules peut être remise à zéro, deux autres expériences ont eu une grande importance: 1.) Les gènes maîtres contrôlent le destin des cellules En 1987, le Professeur Walter Gehring du Biozentrum de Bâle découvre un facteur de transcription (FT, protéine) de la drosophile (mouche du vinaigre) Drosophila melanogaster. Ce FT nouvellement découvert a une fonction bien particulière: il active et surveille le développement des pattes de l’insecte. Si on introduit ce FT dans les antennes de l’insecte par des méthodes de génie génétique, celles-ci se transforment en pattes. C’est à cause de cette propriété que l’on appelle ce FT «Antennapedia» (fig. 5). La même année, des chercheurs réalisent une expérience similaire avec le FT MyoD, qui se trouve essentiellement dans les cellules musculaires. Grâce à des méthodes de génie génétique, ils introduisent MyoD dans des cellules de tissus conjonctifs et étudient ensuite les effets. De fait, en raison de la présence de MyoD, les cellules de tissus conjonctifs se transforment en cellules musculaires. Cela permit aux chercheurs de montrer que l’expression du FT MyoD, naturellementprésent dans les cellules musculaires, dans le tissu conjonctif transforme ce dernier en tissu musculaire (voir Module 1-2, page 5). Les résultats de ces deux expériences ont donné naissance au concept de «régulateurs maîtres». Il s’agit de protéines capables de déterminer le destin de différenciation d’une cellule. Elles décident si une cellule souche va générer une cellule cutanée ou une cellule hépatique. Elles décident quelles recettes la cellule pourra continuer à cuisiner ou non.

Figure 5: Tête d’une drosophile normale (à gauche) comparée à la tête d’une drosophile à mutation antennapedia (à droite). On voit nettement que la drosophile de droite porte sur la tête des pattes au lieu des antennes. (Source : http://www.gehring.biozentrum.unibas.ch/index.html)

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2.) Maintenir les cellules souches en vie en dehors du corps La plupart des cellules d’un organisme ne sont pas des cellules souches. Lorsqu’un chercheur veut travailler sur des cellules souches en laboratoire, la première difficulté est d’accéder à ces cellules et de s’assurer de leur identité. La deuxième difficulté est de les maintenir en vie dans une boîte de Petri sans qu’elles se différencient. Il a fallu des dizaines d’années de travail pour développer et améliorer de telles cultures, de sorte que l’on puisse aujourd’hui réaliser des expériences sur des cellules souches en dehors du corps (fig. 6). C’est ainsi que le scientifique James Thomson est parvenu pour la première fois en 1998 à cultiver des cellules souches humaines en dehors du corps humain.

Figure 6: Colonie de cellules souches humaines cultivées dans une étuve à 37° Celsius à l’extérieur de l’organisme, sur du tissu conjonctif de souris. On distingue la forme ronde de la colonie de cellules souches (cette forme est caractéristique des colonies de cellules souches). Une telle colonie se compose de plusieurs milliers de cellules souches. À l’origine, la colonie ne comportait qu’une seule cellule souche. Celle-ci s’est divisée de nombreuses fois, la colonie a grandi. Les cellules qui entourent la colonie de cellules souches présentent une toute autre structure. Elles ont une forme allongée, il s’agit de cellules de tissu conjonctif. Il a fallu de nombreuses expériences pour s’apercevoir que les cultures de cellules souches fonctionnent mieux sur des cellules de tissu conjonctif que dans un autre milieu. (Source http://en.wikipedia.org/wiki/Stem_cell) Utiliser les connaissances pour soigner des maladies Aujourd’hui, il s’agit d’utiliser toutes ces connaissances dans un but curatif. L’idée de départ était de prélever le noyau cellulaire d’une cellule cutanée sur une personne malade (p. ex. une personne atteinte d’une maladie cardiaque) et de transférer ce noyau dans un ovocyte humain. Le blastocyste obtenu aurait permis d’obtenir des cellules souches embryonnaires susceptibles d’engendrer de nouvelles cellules cardiaques saines que l’on aurait pu greffer au patient pour soigner la maladie cardiaque. Il s’agirait d’un traitement par cellules souches personnalisé (voir fig. 1). Mais cette approche est techniquement très complexe et très controversée du point de vue éthique. En effet, pour obtenir les cellules souches embryonnaires, on a besoin d’ovocytes et d’embryons humains clonés. Les chercheurs se sont donc mis à la recherche d’alternatives.

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Les cellules iPS (cellules souches pluripotentes induites) sont-elles la solution espérée? En 2006, le chercheur japonais Shinya Yamanaka révolutionne la recherche sur les cellules souches. Inspiré par les expériences de clonage de Gurdon et par le concept de régulateur maître de Gehring, Yamanaka étudie des cellules différenciées et compare leur modèle d’expression génétique avec celui de cellules souches (il compare les différentes prestations culinaires du livre de cuisine). Ce faisant, il trouve 24 protéines qui sont essentiellement produites par les cellules souches. Yamanaka développe des cellules de tissu conjonctif dans lesquelles il induit l’expression de ces 24 protéines. À l’aide de ce «cocktail de protéines», il parvient à produire une cellule souche pluripotente à partir d’une cellule de tissu conjonctif. C’est-à-dire que Yamanaka a découvert des gènes maîtres produisant des facteurs de transcription capables de reprogrammer des cellules différenciées en cellules souches. Une cellule différenciée peut donc être ramenée à un stade de cellule souche identique à celui d’une cellule souche embryonnaire, et ce sans transfert nucléaire! Mais à cet effet, il faut que les bonnes protéines se trouvent dans l’environnement de la cellule. Yamanaka s’est alors efforcé de découvrir de quelles protéines il s’agit. Il parvint à réduire le nombre de protéines de 24 à quatre absolument indispensables: Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc (fig. 7, 8). Il appela cette nouvelle espèce de cellules souches «cellules souches pluripotentes induites» (en anglais: induced pluripotent stem cells, iPS).

Figure 7: Il est possible d’obtenir des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) en introduisant quatre gènes, les facteurs de transcription Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc, dans des fibroblastes (cellules de tissu conjonctif). Une telle cellule de tissu conjonctif est représentée à gauche. L’introduction des quatre facteurs reprogramme la cellule de tissu conjonctif en cellule iPS (Source: S. Yamanaka, 2009, Nature). Il n’est pas surprenant que, parmi ces quatre protéines, on trouve Oct4 et Sox2, car on sait que ces protéines sont nécessaires au maintien de l’identité de la cellule souche. Les deux autres facteurs sont en revanche surprenants car il s’agit de ce que l’on appelle des oncogènes, c’est-à-dire des gènes dont les protéines sont présentes en surconcentration dans différents types de cancer et qui pourraient donc être responsables du cancer. Cependant, il

Fibroblaste Cellule iPS

Rétrovirus

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est finalement apparu que la surexpression de ces deux oncogènes n’est pas directement requise pour la reprogrammation. Ceux-ci aident plutôt à réaliser la reprogrammation plus efficacement.

Figure 8: Colonie de cellules iPS produite à partir de tissu conjonctif cutané humain en introduisant les quatre gènes facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc). Comme une autre colonie de cellules souches (voir figure 6), les cellules iPS forment une colonie ronde (la couleur est due au microscope). Cette colonie ne comportait au départ qu’une seule cellule iPS. Elle a grandi suite à d’innombrables divisions cellulaires. De même que les cellules souches, les cellules iPS prolifèrent au mieux sur des cellules de tissu conjonctif (Source: S. Yamanaka, 2009, Nature). Peut-on utiliser les cellules iPS en médecine? Les possibilités d’utilisation médicale des cellules iPS sont multiples et suscitent beaucoup d’espoir. Grâce à la reprogrammation de cellules différenciées en cellules iPS, il n’est plus nécessaire de générer des embryons par transfert nucléaire. Si la méthode iPS fonctionne pour le traitement de maladies, il sera possible de prélever des cellules différenciées (p. ex. cellules cutanées) d’une personne atteinte d’une maladie cardiaque et de les transformer en cellules iPS. À partir de ces cellules iPS, on pourra alors générer de nouvelles cellules cardiaques pour remplacer les cellules malades du patient (fig. 9). L’avantage de la méthode iPS est qu’elle n’a pas besoin d’ovocytes humains et qu’il n’est donc plus nécessaire de détruire des embryons humains clonés.

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Figure 9: Schéma d’un traitement personnalisé par cellules souches iPS. Les cellules prélevées sur le patient (en haut à gauche), de préférence des cellules cutanées (fibroblastes) sont reprogrammées en cellules iPS à l’aide des quatre facteurs. On obtient ainsi des cellules iPS spécifiques au patient que l’on cultive dans une boîte de Petri. On peut ensuite modifier génétiquement ces cellules (par exemple pour le traitement de maladies génétiques telles que la phénylcétonurie où un gène est défaillant). On différencie les cellules génétiquement modifiées en types cellulaires souhaités (ou on différencie directement les cellules iPS) et on les utilise pour le traitement. On peut aussi utiliser les cellules différenciées pour tester de nouveaux médicaments. Mais on ne sait pas encore si les cellules iPS peuvent être utilisées avec succès à des fins thérapeutiques. Un problème se pose par exemple pour l’utilisation des oncogènes Klf4 et c-Myc. On peut en effet se demander si les cellules iPS risquent éventuellement de générer un cancer chez les patients du fait de l’utilisation de ces oncogènes. Comme on ne peut pas encore répondre à cette question, plusieurs groupes de chercheurs se sont efforcés ces derniers temps de remplacer les deux oncogènes dans la mesure où ils ne sont pas indispensables à la reprogrammation. Effectivement, on peut aujourd’hui produire des cellules iPS sans utiliser les oncogènes. Un premier obstacle est donc franchi et les prochaines années montreront s’il est possible de franchir les autres. L’expérience montre, en tout cas, que des dizaines d’années peuvent encore s’écouler avant que l’on aboutisse à une utilisation médicale à grande échelle des cellules iPS.

Cellules adultes(p. ex. fibroblastes)

Approchede thérapie génique

Transplantation des cellules(retour au patient)

Facteurs derepro-

grammation

Cellules iPS

Prélèvement

Les cellulesdeviennent

pluripotentes

Auto-renouvellement

Cellules utilisées pourla recherche de substances actives

Différenciationen cellules

spécialisées

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