Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZITET U BEOGRADU
Ljiljana M. Kostić-Kravljanac
MODULIRANJE RIZOSFERNIH PROCESA I PRILAGOĐAVANJE PŠENICE RAZLIČITIM MERAMA
POPRAVKE ZEMLJIŠTA OŠTEĆENIH RUDNIČKOM JALOVINOM
doktorska disertacija
Beograd, 2015.
УНИВЕРЗИТЕТ У БЕОГРАДУ
Љиљана М. Костић-Крављанац
МОДУЛИРАЊЕ РИЗОСФЕРНИХ ПРОЦЕСА И ПРИЛАГОЂАВАЊЕ
ПШЕНИЦЕ РАЗЛИЧИТИМ МЕРАМА ПОПРАВКЕ ЗЕМЉИШТА ОШТЕЋЕНИХ
РУДНИЧКОМ ЈАЛОВИНОМ
докторска дисертација
Београд, 2015.
UNIVERSITY OF BELGRADE
Ljiljana M. Kostić-Kravljanac
MODULATION OF THE PROCESSES IN WHEAT RHIZOSPHERE IN RESPONSE
TO THE AMENDMENTS OF SOILS DEGRADED BY MINING WASTE
Doctoral Dissertation
Belgrade, 2015
UNIVERZITET U BEOGRADU
MENTORI: dr Miroslav Nikolić, naučni savetik Institut za multidisciplinarna istraživanja, Univerzitet u Beogradu dr Aleksandar Đorđević, redovni profesor Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Beogradu ČLANOVI KOMISIJE: dr Vladica Cvetković, redovni profesor Rudarsko-geološki fakultet, Univerzitet u Beogradu dr Nina Nikolić, naučni saradnik Institut za multidisciplinarna istraživanja, Univerzitet u Beogradu dr Jelena Samardžić, naučni saradnik Institut za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo, Univerzitet u Beogradu Datum odbrane: _____________
ZAHVALNICA
Ova doktorska disertacija urađena je u okviru projekta osnovnih istraživanja
Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije (OI-173028).
Zahvaljujem svima koji su na bilo koji način učestovali u izradi ove disertacije:
mom mentoru dr Miroslavu Nikoliću, bez čijeg vođstva, stručnosti, znanja i
nesebične podrške ne bih došla do tačke gde se sada nalazim. Zahvalnost mu dugujem
na nesebičnom prenošenju veština i znanja koje prati istraživački proces, i što mi na
ličnom primeru neprekidno ukazuje na kvalitete koji čine ne samo vrhunskog
istraživača nego i Čoveka, a posebnu zahvalnost mu dugujem zbog beskonačnog
strpljenja u prekoračenju skoro svih mogućih rokova;
dr Nini Nikolić na dragocenoj stručnoj pomoći pri planiranju i izvođenju
eksperimenata, obradi i tumačenju rezultata, kao i na pomoći pri pisanju prve verzije
rukopisa;
dr Jeleni Samardžić i njenim saradnicima, dr Miri Milisavljević i Dragani
Nikolić, iz Instituta za molekularnu genetiku i genetičko inžinjerstvo na izvođenju
molekularnih analiza, kao i na pomoći pri obradi rezultata;
dr Vuku Maksimoviću iz Instituta za multidisciplinarna istraživanja na izvođenju
HPLC analiza;
kolegama iz grupe za ishranu biljaka, Instituta za multidisciplinarna
istraživanja, Jeleni Pavlović na pružanju svake vrste pomoći, od tehničke pomoći u
laboratorijskom radu do ohrabrivanja onda kada mi je to bilo najpotrebnije.
drugom mentoru dr Aleksandru Đorđeviću, i članovima komisije, dr Vladici
Cvetkoviću i dr Jeleni Samardžić, na poverenju u moj rad, kao i na čitanju rukopisa i
korisnim sugestijama koje su uobličile krajnju verziju ove doktorske disertacije;
prijateljima i porodici, a posebno Mami i Sestri na svim skuvanim kafama,
buđenjima, pripremljenim ručkovima, bezrezervnoj podršći i ljubavi, kao i Zetu koji je
uvek znao da me nasmeje.
U sećanje na mog Oca i baka Jelicu
Moduliranje rizosfernih procesa i prilagođavanje pšenice različitim
merama popravke zemljišta oštećenih rudničkom jalovinom
Rezime: Zemljišta oštećena rudarskim aktivnostima zauzimaju oko 1 % ukupne
zemljine površine. Rudarsko-topioničarski basen Bor predstavlja jedan od najvećih
ekoloških problema u Srbiji. Izlivanjem otpadnih flotacijskih voda sa piritskom
jalovinom uništene su velike površine poljoprivrednih zemljišta na kojima je biljna
proizvodnja ograničena delovanjem multiplog abiotskog stresa. Glavni organičavajući
faktori za rastenje useva na ovim kiselim zemljištima, izrazito siromašnim u
pristupačnom fosforu, menjaju se od visokih koncentracija bakra do visokih
koncentracija izmenjivog aluminijuma.
Glavni cilj ovih istraživanja bio je proučavanje mehanizama prilagođavanja
pšenice (Triticum aestivum. L cv Pobeda) na mere popravke zemljišta, sa posebnim
osvrtom na procese u rizosferi. Eksperimenti su sprovedeni u rizotronima na dva
zemljišta različitog stepena oštećenja. Mere za popravku zemljišta uključile su
konvencionalne mere popravke kiselih marginalnih zemljišta, kao što je unošenje kreča,
organskih i mineralnih đubriva, kao i združenu primenu ovih mera. Pored toga,
istraživanja su uključila i primenu đubriva na bazi silicijuma, kao inovativnu i do sada
nedovoljno proučenu meru za popravku zemljišta. Osim analize mineralnog sastava
zemljišta i nadzemnog dela biljke i sekvencijalne analize neorganskih frakcija fosfora u
zemljištu, urađene su analize eksudata korena, kao i ekspresija odgovarajućih gena
uključenih u procese mobilizacije i usvajanja fosfora (TaMATE1, TaALMT1, TaPEPC1,
TaPHT1.1 i TaPHT1.2).
Sve primenjene mere popravke uticale su pozitivno na rastenje pšenice i
povećanje sadržaja fosfora u biljci. Međutim, najefikasnije su bile one mere koje su
istovremeno korigovale pH i povećale dostupnost fosfora u rizosferi (kombinacija
kalcizacije sa unošenjem fosfora). Efekat primenjenih mera na frakcije fosfora u
zemljištu je bio dodatno modifikovan metabolitima korena u rizosferi. U rizosferi
pšenice uspostavljen je jasan gradijent koncentracije teško rastvorljivih oblika fosfora u
odnosu na okolno zemljište, što ukazuje da pšenica moduliranjem procesa u rizosferi
može da iskoristi takve oblike fosfora. Stvaranje gradijenta pristupačnog fosfora je bilo
izraženo u tretmanima koji nisu povećali dostupnost P, ali jesu eliminisali druge faktore
stresa (pH, toksičnost Al), kao što je na primer kalcizacija, a razlog njegovog nastanka
leži u pojačanom efluksu karboksilata i ekspresiji odgovarajućih gena uključenih u
akviziciju fosfora, što ukazuje na važnu ulogu ponovnog uspostavljanja ovih procesa u
korenu pšenice. Pojačano trošenje frakcije fosfora vezane za kalcijum u svim
tretmanima popravke zemljišta bilo je, međutim, nezavisno od stepena eksudacije
organskih kiselina. Osnovne adaptacije korena pšenice na uslove multiplog stresa na
zemljištima oštećenim rudničkom jalovinom ogledaju se u pojačanom efluksu citrata i
malata, što je praćeno i pojačanom ekspresijom komplementarnih gena koji kodiraju
anjonske transportere TaMATE1 i TaALMT1. Ova istraživanja su prvi put pokazala da
na procese eksudacije korena pšenice, osim viška alumijuma što je opšte prihvaćeno, u
velikoj meri utiče i nedostatak fosfora.
Primene odgovarajućih mera popravke zemljišta modifikovale su adaptivni
odgovor pšenice na deficit fosfora u rizosferi. Tako je kalcizacija zemljišta (standardna
mera popravke kiselih zemljišta) koja je korigovala pH vrednost zemljišta pojačala
ekspresiju TaMATE1 transportera i eksudaciju citrata, kao i usvajanje fosfora zajedno
sa ekspresijom TaPHT1.2. Sa druge strane, primena silicijuma (inovativna mera
popravke koja predstavlja važan doprinos za praksu) pojačala je odgovor korena na
deficit fosfora uključujući povećan efluks citrata i malata, kao i jaču ekspresiju gena
uključenih u procese eksudacije i usvajanja fosfora.
Ključne reči: rudnička jalovina, rizosfera, eksudati korena, Pi transporteri, fosfor,
silicijum, TaALMT, TaMATE, TaPEPC
Naučna oblast: Multidisciplinarne nauke
Uža naučna oblast: Nauke o životnoj sredini, nauka o zemljištu, biljne nauke
UDK broj: 631.416:633.11(043.3)
Modulation of the Processes in Wheat Rhizosphere in Response to the
Amendments of Soils Degraded by Mining Waste
Abstract: Mining activities have despoiled about 1% of the Earth’s surface. In
Serbia, the industrial complex of the Bor copper mines has been a major environmental
hotspot which has degraded large areas of agricultural alluvial land by fluvial deposition
of pyritic copper tailings over arable land. Plant production on these polluted soils is
severely constrained by multiple mineral stress factors: primarily low phosphorus
availability and low pH, as well as high availability of copper and aluminium.
The objective of this study was to elucidate the adaptation mechanisms of wheat
(Triticum aestivum. L cv. Pobeda) on mining-degraded soil to different soil
amendments, with special focus on the processes in the rhizosphere. The experiments
were conducted in rhizoboxes with two types of polluted soil. The treatments included
common amendments for acid, low P soils (liming, manure and mineral P fertilization,
as well as their combination). Furthermore, an inovative application of silicon fertilizers
was investigated. Mineral analysis of soil and plant samples, sequential analysis of
inorganic phosphorus fractions in soils, as well as the analysis of wheat root exudates
and the expression of the genes involved in the processes of phosphorus sequestration
and mobilization (TaMATE1, TaALMT1, TaPEPC1, TaPHT1.1 i TaPHT1.2) were
performed.
All the applied soil amendments showed a positive effect of wheat growth and
shoot phosphorus accumulation. The combined measures which both corrected low soil
pH (liming) and low phosphorus availability (P fertilization) were the most efficient soil
amendment. The effect of soil amendments on the inorganic phosphorus fractions was
additionally modified by the activity of root metabolites in the rhizosphere. A clear
concentration gradient of sparingly available phosphorus between bulk and rhizosphere
soil compartments indicated that the modifications of rhizosphere processes increased
phosphorus acquisition potential of wheat. This concentration gradient was particularly
prominent in the treatments with lime, which did not increase phosphorus amount in
soils per se, but did eliminate the other rhizotoxic factors (low pH and high
exchangeable aluminium); the underlying reason was re-establishment of the
phosphorus acquisition machinery in wheat roots, what was reflected in enhanced
carboxylate efflux and enhanced expression of the related genes. The enhanced
utilization of the calcium-bound phosphorus fraction, however, was independent of the
exudation rate of organic acids. At the rhizosphere level, the major adaptation of wheat
to the conditions of multiple abiotic stress on the soils polluted by mining waste was the
increased efflux of citrate and malate, what was accompanied by the enhanced
expression of the related genes encoding the anion transporters TaMATE1 i TaALMT1.
This study for the first time demonstrated that, beside the well-known effect of
aluminium, phosphorus deficiency also strongly increased the anion efflux by wheat
roots when aluminium was not present.
The application of different soil amendments has modified the adaptive response
to phosphorus deficiency in the wheat rhizosphere. Liming (common amendment for
acid soils) has corrected low pH and enhanced the expression of the TaMATE1
transporter and citrate exudation, and increased phosphorus uptake and the expression
of TaPHT1.2. On the other hand, the application of silicon fertilizers (innovative
amendment with important potential for practical application) also increased the root
response to phosphorus deficiency by increasing the efflux of citrate and malate along
with the expression of genes involved in phosphorus acquisition.
Key words: pyrite tailings, rhizosphere, root exudation, Pi transporters, phosphorus,
silicon, TaALMT1, TaMATE1, TaPEPC1
Scientific field: Multidisciplinary Science
Specified scientific field: Environmental science, soil science, plant science
UDC classification: 631.416:633.11(043.3)
SADRŽAJ:
1. UVOD ................................................................................................................ 1 1.1. Degradacija zemljišta.................................................................................. 1 1.2. Rudarska aktivnost u borskom području i njene posledice po životnu sredinu ................................................................................................................ 3 1.3. Ograničavajući faktori mineralne ishrane biljaka na antropogeno zakišeljenim zemljištima .................................................................................... 7 1.3.1. Dinamika fosfora u zemljištu...................................................................... 9 1.3.2. Dinamika bakra i aluminijuma u zemljištu i fitotoksičnost........................ 11 1.3.3. Mere popravke kiselih zemljišta ............................................................... 14 1.4. Rizosferni procesi i adaptacije korena biljaka na kiselim zemljištima ... 17 1.4.1. Eksudacija organskih kiselina................................................................... 17 1.4.2. Mobilizacija, usvajanje i translokacija fosfora .......................................... 21
2. CILJEVI RADA .............................................................................................. 26 3. MATERIJAL I METODE .............................................................................. 27
3.1. Biljni materijal i uslovi gajenja ................................................................ 27 3.2. Eksperiment 1: Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta oštećenih kiselom rudničkom jalovinom na procese u rizosferi pšenice ........ 27 3.2.1. Zemljište .................................................................................................. 27 3.2.2. Dizajn eksperimenta ................................................................................. 28 3.3. Eksperiment 2: Uticaj silicijuma na procese u rizosferi pšenice na zemljištu oštećenom kiselom rudničkom jalovinom ....................................... 29 3.3.1. Testiranje različitih silikatnih đubriva ...................................................... 29 3.3.2. Mehanizam delovanja silicijuma .............................................................. 30 3.3.2.1. Zemljište ............................................................................................... 30 3.3.2.2. Hranljivi rastvor (hidroponi) .................................................................. 31 3.4. Analiza biljnog materijala ........................................................................ 32 3.4.1. Analiza mineralnog sastava ...................................................................... 32 3.4.2. Sakupljanje eksudata korena .................................................................... 32 3.4.3. Određivanje organskih kiselina ................................................................ 33 3.4.4. Molekularne analize ................................................................................. 33 3.4.4.1. Izolovanje ukupne RNK i sinteza cDNK ............................................... 33 3.4.4.2. Analiza ekspresije izabranih gena .......................................................... 34 3.5. Analiza zemljišta ....................................................................................... 36 3.5.1. Određivanje pH vrednosti zemljišta .......................................................... 36 3.5.2. Određivanje sadržaja dostupnog fosfora ................................................... 36 3.5.3. Frakciona analiza neorganskog fosfora .................................................... 36 3.5.4. Određivanje sadržaja dostupnih mineralnih elemenata .............................. 37 3.5.5. Određivanje sadržaja izmenjivog aluminijuma ......................................... 37 3.5.6. Određivanje sadržaja dostupnog silicijuma ............................................... 37 3.5.7. Određivanje ukupnog sadržaja mineralnih elemenata ............................... 37 3.6. Statistička obrada podataka ..................................................................... 37
4. REZULTATI ................................................................................................... 38 4.1. Ograničavajući faktori za rastenje pšenice na zemljištima oštećenim kiselom rudničkom jalovinom ......................................................................... 38 4.2. Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta oštećenih kiselom rudničkom jalovinom na procese u rizosferi pšenice .................................... 39
4.2.1. Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta na rastenje pšenice ........... 40 4.2.2. Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta na mineralni sastav pšenice............................................................................................................... 42 4.2.2.1. Makroelementi ...................................................................................... 42 4.2.2.2. Mikroelementi ....................................................................................... 45 4.2.2.3. Potencijalno štetni elementi ................................................................... 50 4.2.3. Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta na fiziološke adaptacije korena pšenice ................................................................................................... 53 4.2.3.1. Efluks organskih anjona ........................................................................ 53 4.2.3.2. Ekspresija TaMATE1 i TaALMT1 .......................................................... 58 4.2.3.3. Ekspresija TaPEPC1 ............................................................................ 60 4.2.3.4. Ekspresija fosfatnih transportera i usvajanje fosfora .............................. 60 4.2.4. Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta na osobine rizosfernog zemljišta ........................................................................................................... 62 4.2.4.1. pH vrednost ........................................................................................... 62 4.2.4.2. Dostupnost mikroelemenata .................................................................. 64 4.2.4.3. Dostupnost fosfora ................................................................................ 67 4.2.4.4. Frakcije neorganskog fosfora................................................................. 69 4.2.4.5. Izmenjivi aluminijum ............................................................................ 76 4.2.4.5. Organska materija i CaCO3 ................................................................... 76 4.3. Uticaj silicijuma na procese u rizosferi pšenice na zemljištu oštećenom kiselom rudničkom jalovinom ......................................................................... 77 4.3.1. Testiranje različitih silikatnih đubriva ...................................................... 77 4.3.1.1. Efekat na rastenje pšenice i status fosfora u biljci .................................. 77 4.3.1.2. Efekat na glavne organičavajuće faktore i dostupnost silicijuma u rizosferi ............................................................................................................. 79 4.3.2. Mehanizam delovanja silicijuma .............................................................. 80 4.3.2.1. Rastenje pšenice i status fosfora ............................................................ 80 4.3.2.2. Promene glavnih faktora mineralnog stresa u rizosfernom zemljištu ...... 82 4.3.2.3. Frakcije neorganskog fosfora u rizosferi ................................................ 83 4.3.2.4. Mobilizacija fosfora u rizosferi pšenice ................................................ 85 4.3.2.4.1. Dinamika efluksa organskih anjona .................................................... 85 4.3.2.4.2. Ekspresija PEP-karboksilaze i anjonskih transportera karboksilata ..... 92 4.3.2.4.3. Ekspresija Pi transportera ................................................................... 93 4.3.2.5. Model eksperiment u hranljivim rastvorima bez aluminijuma ............... 94 4.3.2.5.1. Rastenje pšenice i usvajanje fosfora .................................................... 94 4.3.2.5.2. Efluks citrata i malata ......................................................................... 97
5. DISKUSIJA ..................................................................................................... 98 5.1. Uticaj primene mera za popravku zemljišta na rastenje pšenice ............ 98 5.2. Uticaj primene mera za popravku zemljišta na mobilizaciju fosfora u rizosferi pšenice ............................................................................................. 102 5.2.1. Mobilnost fosfora u rizosferi .................................................................. 102 5.2.2. Eksudacija P-mobilizirajućih jedinjenja. ................................................. 106 5.2.3. Usvajanje fosfora i ekspresija Pi transportera u korenu pšenice. ............. 110 5.3. Fiziološka uloga silicijuma u prevazilaženju deficita fosfora kod pšenice ............................................................................................................ 112
6. ZAKLJUČCI ................................................................................................. 115 7. LITERATURA .............................................................................................. 116
Biografija autora ........................................................................................... 141 Izjava o autorstvu ......................................................................................... 142 Izjava o istovetnosti štampane i elektronske verzije doktorskog rada........ 143 Izjava o korišćenju ........................................................................................ 144
1
1. UVOD
1.1. Degradacija zemljišta
Zemljište je značajan deo biogeosfere koji obezbeđuje niz funkcija neophodnih
za održavanje života na Zemlji. Korišćenje zemljišta za proizvodnju hrane u direktnoj je
vezi sa nastankom i razvojem ljudske civilizacije. Prema nekim procenama ljudska
populacija se udvostručila u poslednjih 40 godina (World Soil Resources Institute
1992), a prema procenama Ujedinjenih Nacija (UN 2013) svetska populacija će do
2050. godine dostići 9.6 milijardi ljudi. Da bi ovakav porast bio održiv, proizvodnja
hrane mora da poraste za 70-100 % (Food and Agriculture Organization, FAO 2009).
Međutim, poseban problem predstavlja činjenica da trenutno oko 12 % svetske
populacije (870 miliona ljudi) pati od neke vrste pothranjenosti (World Health
Organization,WHO 2013). Ako se uzme u obzir da formiranje sloja zemljišta debljine
2.5 cm traje od 300 do 1000 godina, jasno je zašto se zemljište smatra neobnovljivim
resursom (White 1999). Godišnje se u svetu preko 55.000 km2 zemljišta izgubi usled
degradacije (United Nations Environment Programme, UNEP 2007), a samo u
poslednjih 20 godina izgubljena je potencijalna poljoprivredna površina veličine
Sjedinjenih Država (UNEP 2007). Prema trenutnoj stopi trošenja resursa 2050. godine
svetskoj populaciji će biti potrebno 2.9 planeta da zadovolji svoje potrebe (World
Wildlife Fund, WWF 2012). Do 2050. godine degradacija zemljišta, širenje urbanih
površina i konverzija poljoprivrednog zemljišta u nepoljoprivredne svrhe će dodatno
smanjiti površinu zemljišta pogodnih za poljoprivrednu proizvodnju za 8-20 %
(Nellemann et al. 2009). Upravo je zato degradacija zemljišta prepoznata kao ključna
prepreka ka postizanju ciljeva održivog razvoja (Agenda 21 UN). Ključni koraci koji se
moraju preduzeti kako bi se sprečila degradacija zemljišta su održivo korišćenje
zemljišta i očuvanje organske materije.
Prepoznajući značaj zemljišta Evropska Unija je još u septembru 2006. godine
usvojila dokument pod nazivom „Soil Thematic Strategy“. Ovaj dokument ima za cilj
zaštitu zemljišta na održiv način, sprečavanje dalje degradacije, očuvanje funkcije
zemljišta ali i obaveznu popravku oštećenih zemljišta (Communication from the
2
Commission to the Council, the European parliament, the European Economic and
Social Committee and the Committee of the Regions: Thematic strategy for soil
protection; COM 231, 2006). Glavni vidovi degradacije zemljišta su: hemijsko
zagađenje, erozija, zaslanjivanje, sabijanje, klizišta i poplave, smanjivanje površine
zemljišta izgradnjom građevinskih objekata bilo koje namene (“soil sealing“),
osiromašavanje organske materije i gubitak biodiverziteta. Broj potencijalno zagađenih
lokacija u zemljama Evropske Unije iznosi oko 2.500.000, pri čemu je na više od
342.000 lokacija neophodno preduzimanje remedijacionih mera (European
Environment Agency, EEA 2010). Kada se zemljište zagadi dolazi do poremećaja
njegovih funkcija što ostavlja negativne posledice na ceo ekosistem. Često se za
zemljište koristi termin “hemijska vremenska bomba“ da označi sled događaja koji
nastaju iznenadnom mobilizacijom štetnih materija iz zemljišta (Stigliani et al. 1991).
Zagađujuće materije se prenose iz zemljišta u površinske i podzemne vode, ulaze u
lance ishrane i nepovoljno deluju na biodiverzitet. Jednom degradirano zemljište postaje
osetljivije na delovanje drugih faktora degradacije. Na primer, gubitak organske
materije dovodi do smanjenja vegetacijskog pokrivača, što dodatno povećava rizik od
erozije. Šteta nastala zagađenjem zemljišta zavisi od tipa zagađivača, zahvaćene
površine, prirodnih karakteristika zagađenog lokaliteta ali i socio-ekonomskog aspekta
okruženja. Preko 30% poljoprivrednih zemljišta u svetu je antropogeno degradirano, a
deficit hraniva i toksičnost mineralnih elemenata koji se na njima javlja, predstavlja
pojedinačno najznačajniji faktor koji ograničava prinose strateški važnih useva u svetu
(Oldeman et al. 1990). Na ovakvim zemljištima usled znatno manjih prinosa,
poljoprivredni proizvođači u zemljište unose veće količine đubriva i pesticida, što
značajno poskupljuje proizvodnju, i predstavlja dodatno zagađenje ekosistema. U
socijalnom smislu, degradacija dovodi do toga da poljoprivredni proizvođači zbog
niskih prihoda napuštaju takva zemljišta, sele se u gradove, što menja demografsku
sliku zemlje, i povećava uticaj urbanizacije na životnu sredinu.
Najveći izvor zagađenja na globalnom nivou je spaljivanje fosilnih goriva,
rudarstvo, industrija, saobraćaj i neadekvatna poljoprivredna praksa. Rudarskim
aktivnostima je trajno oštećeno oko 1 % od ukupne povšine Zemlje (Walker 1999), od
3
čega značajan deo čini poljoprivredno zemljište, koje je nepovratno izgubljeno za
proizvodnju useva.
Održivo upravljanje zemljištem je jedino moguće rešenje za borbu protiv
degradacije, smanjenje procenta siromaštva i postizanje ciljeva globalnog održivog
razvoja. Zato je popravka degradiranih zemljišta neophodna da bi se, pre svega, ublažile
negativne posledice degradacije zemljišta, ali i kako bi se održala proizvodnja useva
uzimajući u obzir socio-ekonomski značaj.
Ne postoji jedinstveno rešenje za borbu protiv degradacije i za postizanje ciljeva
održivog razvoja. Zato je važno razumeti ekološke, socijalne i ekonomske uzroke, koji
stoje uz degradaciju, važno je analizirati koje mere u određenim uslovima mogu dati
najbolje rezultate, i kako se mogu adaptirati da bi bile primenjive na lokalnom nivou.
Tehnologije i mere koje se koriste moraju da budu fleksibilne i da odgovaraju
promenama kompleksnih ekoloških i socio-ekonomskih uslova.
1.2. Rudarska aktivnost u borskom području i njene posledice po
životnu sredinu Bakar se u većini slučajeva eksploatiše sa površinskih kopova, što stvara veće
količine otpada i drenažnih voda u odnosu na eksploataciju bilo kog drugog metala
(Dudka et Adriano 1997). Od 1990. godine svetska proizvodnja Cu raste stopom od 3 %
godišnje (npr. 16 miliona tona u 2011. godini; International Copper Study Group, ICSG
2014). Eksploatacija i proizvodnja Cu ostavlja posledice na skoro sve delove
ekosistema. Otvaranje rudnika i izgradnja prateće infrastrukture, jalovišta, deponija i
flotacionih jezera dovode do fizičke promene celog ekosistema. Ispuštanje kiselih
rudničkih voda, sa velikom količinom teških metala ili drugih opasnih materija, dovodi
do zagađenja zemljišta i površinskih i podzemnih voda. Pored toga, povremene
katastrofe, kao što je oštećenje brana koje zadržavaju jalovinu, rezultiraju pojavom
velikih površina upropašćenog zemljišta, sa velikim ekonomskim i socijalnim
posledicama (Dudka et Adriano 1997; Lottermoser 2003; Wolkersdorfer et Bowel 2004,
2005). Na osnovu nivoa zagađenja i rizika koje predstavlja po životnu sredinu, područje
Bora je svrstano u jednu od četiri vruće tačke u Srbiji a prekogranično zagađenje se
oseća i u Bugarskoj i Rumuniji (UNEP et United Nations Centre for Human Settlements
4
UNCHS, 1999). Procenjuje se da je preko 25.000 ha poljoprivrednog zemljišta u
Borskoj opštini degradirano.
Borska metalogenetska zona predstavlja koridor u okviru Timočkog masiva (50
km dugačak i 5 km širok), koji se pruža od Bora do Majdanpeka. Ova zona se nalazi u
Timočkom magmatskom kompleksu (TMK) koji pripada geološkoj jedinici Karpato-
balkalnida istočne Srbije (npr. Karamata et al. 1997). Drovenik (1962) prvi je prikazao
detaljnu geološku građu TMK-a, prema kojoj su svi magmatski produkti razdvojeni u tri
faze (Slika 1). Ova podela predstavlja osnov za savremenija raščlanjavanja (npr.
Banješević 2010), prema kojima se TMK sastoji iz nekoliko stenskih formacija: andeziti
Timoka (I faza), epiklastiti Metovnice, andezitbazalti Osnića i andeziti Ježevice (II
faza), plutoniti Valja Strž i latiti Boljevca (III faza).
Slika 1. Geološka skica Borske metalogenetske zone (Izvor: Drovenik et al. 1962, preuzeto sa http://rtb.rs/rtb-bor-doo/geologija-i-resursi)
5
Ležišta bakra Borske metalogenetske zone pripadaju klasi hidrotermalnih
mineralnih ležišta. U podzemnom rudniku Jama Cu se nalazi u vidu masivno- sulfidnog
ležišta, a glavni minerali su: pirit (FeS2), halkopirit (CuFeS2), enargit (Cu3AsS4), bornit
(Cu5FeS4), halkozin (Cu2S) i kovelin (CuS). Veliki Krivelj je ležište porfirskog tipa a
smešteno je u andezitima, vulkanoklastitima i okolnim sedimentnim stenama. Osnovni
minerali ovog ležišta jesu halkopirit, pirit, magnetit (Fe3O4), ređe i molibdenit (MoS2)
sa tragovima enargita, galenita (PbS) i sfalerita [(Zn,Fe)S]. Kompleks Cerovo se sastoji
od porfirskog ležišta bakra, koje je smešteno u izmenjenim andezitima. Osnovni
minerali su pirit i halkopirit, a u manjoj meri su prisutni i halkozin, kovelin i azurit
[Cu3(CO)3(OH)2].
Arheološki dokazi ukazuju da je u Borskoj metalogenetskoj zoni Cu vađen još u
doba ranog neolita (oko 5000 godina p.n.e.). Kop Rudna glava (u kompleksu
Majdanpeka) smatra se jednim od najstarijih rudnika bakra u Evropi (Jovanović 1985).
Savremena rudarska aktivnost na ovom području započela je 1903. godine otvaranjem
rudnika Jama. Kasnije su otvorena još 3 površinska kopa: Bor, Veliki Krivelj i Cerovo.
Površinski kop Bor otvoren je 1912. godine a eksploatisan je sve do 1986. godine.
Veliki Krivelj je otvoren 1979. godine i aktivan je i danas. Kop Cerevo je otvoren 1990.
godine, međutim, usled nepovoljih ekonomskih uslova, ovaj površinski kop nije bio
eksploatisan u periodu od 2002. do 2011. godine. Danas, industrijski kompleks Bor
uključuje vađenje i preradu bakra, preradu plemenitih metala i proizvodnju sumporne
kiseline.
Otvorene deponije rudničke raskrivke i jalovine nalaze se kod Bora, Velikog
Krivelja i Cerova, a deponije flotacijske jalovine su smeštene u Boru i Velikom
Krivelju. Ukupno je na teritoriji opštine Bor deponovano oko 450 x 106 t raskrivke,
207 x 106 t flotacijske jalovine i oko 23 x 106 t topioničke šljake (Bogdanović et al.
2011). Nakon otkopavanja i odlaganja raskrivke i jalovine ova masa biva izložena
vazduhu što dovodi do procesa hemijske i biohemijske oksidacije sulfidnih minerala i
pojave kiselih rudničkih voda. Danas se smatra da rešavanje problema kiselih rudničkih
voda, poreklom kako iz aktivnih tako i iz neaktivnih kopova, predstavlja najveći
pojedinačni izazov u rudarskom sektoru (Wolkersdorfer et Bowel 2004).
6
Oksidacija pirita i sulfidnih minerala bakra u vodenoj sredini generiše stvaranje
vodonikovih jona (H+) koji zakišeljavaju medijum u kome se reakcije dešavaju.
Oksidacija pirita se može opisati reakcijom (Banks et al. 1997):
2FeS2 + 7O2 + 2H2O→ 2Fe2+ + 4SO42- + 4H+ (1)
Dalje se dešava delimična oksidacija koja će potrošiti neke protone:
4Fe2+ + O2 + 4H+ → Fe 3+ + 2H2O (2)
Nastali Fe3+ može da deluje kao akceptor elektrona za dalju oksidaciju pirita, ili
dolazi do hidrolize:
Fe3+ + 3H2O →Fe(OH)3 + 3H+ (3)
FeS2+ 14Fe3+ + 8H2O →15Fe2+ + 2SO4 2- + 16H+ (4)
Brzina oksidacije minerala i stvaranje H+ jona zavisi od koncentracije kiseonika,
temperature, veličine čestica, vrsta sulfidnih minerala, pH rastvora, Eh rastvora,
sadržaja metala u sulfidima, prisustva izvesnih bakterija i drugih faktora (Bogdanović et
al. 2013). Pored pirita i drugi sulfidni minerali, kao što su halkopirit, kovelin, enargit,
sfalerit, galenit, pirotin i drugi doprinose nastanku kiseline i zakišeljavanju rudničkih
voda. Reakcije halkopirita i drugih minerala su prikazane sledećim jednačinama
(Antonijević et al. 2008; Valente et al. 2009):
Halkopirit :
CuFeS2 +2Fe2(SO4)3 →CuSO4 +2S◦ + 5FeSO4 (5) Kovelin:
CuS + Fe2(SO4)3→ CuSO4 +S◦ + 2FeSO4 (6) Enargit:
2Cu3AsS4 +11Fe2(SO4)3 +8H2O → 6CuSO4 +2H2AsO4 +5H2SO4 +8S◦ +22FeSO4 (7)
Halkozin: Cu2S + 2Fe2(SO4)3 → 2CuSO4 +S◦ + 4FeSO4 (8)
Stvaranje kisele sredine oksidacijom sulfidnih minerala koji su prisutni u
rudničkom otpadu dovodi do mobilizacije rezidualnih elemenata iz otpada kao što su:
arsen (As), bakar (Cu), mangan (Mn), cink (Zn), kadmijum (Cd), olovo (Pb), i nikl (Ni),
i tako se povećava rizik njihovog daljeg ulaska u lance ishrane (Banks et al. 1997;
7
Clemente et al. 2003; Stjernman Forsberg et Ledin 2006, 2008; Hinojosa et al. 2010;
Sarmiento et al. 2011).
Procenjuje se da se iz Borskih rudnika godišnje oslobađa oko 22 miliona tona
tečnog otpada direktno u lokalne vodotokove (Wolkersdorfer et Bowel 2005). Ti
efluenti se karakterišu niskom pH vrednošću (najčešće u intervalu od 3 do 4) i visokom
koncentracijom sulfata i teških metala (Cu, Fe, Mn, Zn, Co, Pb, Ni i Cd; Bogdanović et
al. 2007). Zagađeni lokalni vodotokovi (posebno Borska i Kriveljska reka) ulivaju se u
Timok i dugotrajno i značajno povećavaju koncentraciju teških metala u njemu
(Brankov et al. 2012). Pošto je u donjem toku Timok delom i međugranična reka koja
se uliva u Dunav, problem zagađenja ove reke ima međunarodni karakter, jer su, osim u
Srbiji, oštećena krajrečna zemljišta i u Bugarskoj i Rumuniji.
Problem sa zagađenjem životne sredine zbog neadekvatnog odlaganja flotacijske
jalovine intenziviran je sredinom pedesetih godina prošlog veka kada je došlo do
oštećenja nasipa oko flotacionog jalovišta Bor i izlivanja jalovine, što je dovelo do
potpunog uništavanja najplodnijeg aluvijalnog zemljišta Timočkog sliva (Antonijević et
al. 2008; Nikolić et Nikolić 2012). Ta poljoprivredna zemljišta su tradicionalno bila pod
uticajem neregulisanog plavljenja Timoka (dva puta godišnje, posle jesenjih kiša i
prolećnog topljenja snegova), i lokalni ratari su se značajno oslanjali na unos biljnih
hraniva nanošenjem plodnog mulja putem poplava, kao na jednu vrstu prirodnog
đubrenja (Nikolić et al. 2011, Nikolić et Nikolić 2012). Dugotrajan proces oksidativnog
raspadanja naslaga jalovine drastično je promenio nekadašnje krečno zemljište (pH >
7.5) i pretvorio ga u kiselo zemljište sa toksičnim koncentracijama Cu i aluminijuma i
izrazitim deficitom hranljivih elemenata (Antonović 1974, Nikolić et al. 2011; Nikolić
et Nikolić 2012). I pored toga što ovakvo zagađenje traje više od pola veka postoje
samo retke relevatne naučne studije o stepenu i posledicama ovakvog zagađenja
(Nikolić et al. 2011; Nikolić et Nikolić 2012; Nikolić 2013).
1.3. Ograničavajući faktori mineralne ishrane biljaka na
antropogeno zakišeljenim zemljištima Smatra se da kisela zemljišta čine čak polovnu obradivih površina na svetu
(Granados et al. 1993). Jedan od glavnih faktora antropogenog zakišeljavanja zemljišta
8
čine rudarske aktivnosti, naročito onda kada dolazi do oštećenja brana koje zadržavaju
rudarski otpad. U procesima sekundarne oksidacije ovakvog materijala dolazi do
stvaranja H+ jona, pa kao posledica izlivanja otpada, osim zagađenja dolazi i do
zakišeljavanja zemljišta. Kao glavni faktori koji ograničavaju rastenje useva na kiselim
zemljištima izdvojeni su nedostatak fosfora (P), toksične koncentracije izmenjivog Al
(Al3+) i niska pH vrednost (Kochian et al. 2004). Pored toga, rastvorljivost većine
mineralnih elemenata raste sa porastom kiselosti zemljišta, tako da često na ovakvim
zemljištima postoje i fitotoksične koncentracije Cu, Zn, Mn, As i drugih. S obzirom na
to da u kiselim zemljištima istovremeno dolazi do pojave visokih koncentracija
nekoliko elemenata i imobilizacije hraniva veoma je teško razlučiti koji faktor
dominantno ograničava rast poljoprivrednih kultura. Iako sa velikim posledicama po
životnu sredinu, zemljišta oštećena rudničkom jalovinom poreklom iz Borskog rudnika
predstavljaju izuzetan model-lokalitet za proučavanje rasta useva u uslovima
višestrukog abiotskog stresa (Nikolić et al. 2011; Nikolić et Nikolić 2012; Nikolić
2013). U poslednjih pedesetak godina slojevi piritske jalovine (bogate sulfidima i Cu)
su se nataložili preko plodnog aluvijalnog zemljišta čime je došlo do antropogenog
zakišeljavanja nekada krečnog zemljišta Timočkog sliva (Antonović 1974; Antonijević
et al. 2008). Poznato je da oksidativno raspadanje ovakvog rudarskog otpada, sa
visokim sadržajem sulfidnih primesa, osim direktnog efekta smanjene pH vrednosti na
oslobađanje metala i povećanje njihove mobilnosti (Banks et al. 1997; Clemente et al.
2003; Stjernman Forsberg et Ledin 2006, 2008), utiče i na smanjenu pristupačnost
hranljivih elemenata, posebno P (Golez et Kyuma 1997; Domínguez et al. 2010).
Međutim, na ispitivanom području Timočkog sliva debljina piritskih naslaga i stepen
oksidacije su zavisili od udaljenosti od vodotka i načina korišćenja zemljišta u prošlosti.
Usled ovakvih lokalnih specifičnosti došlo je do stvaranja gradijenta oštećenja
zemljišta, uslovljenog pre svega različitom pH, koncentracijom dostupnog Cu i P i
izmenjivog Al (Nikolić et al.2011). Ovakav gradijent zemljišta doveo je i do stvaranja
jasno uočljivog prostornog gradijenta oštećenja i rasta pšenice (Triticum aestivum)
(udaljenosti svega nekoliko metara) (Nikolić et al. 2011). Zbog ovakvog prostornog
rasporeda oštećenja zemljišta i pšenice bilo je moguće utvrditi koji faktor dominantno
utiče na rast ove kulture (Nikolić et al. 2011). Rezultati Nikolić et al. (2011) su pokazali
9
da su vizuelni znaci poremećenog rasta i prinos pšenice u najvećoj meri uslovljeni
koncentracijom dostupnog P u zemljištu i sadržajem P u biljci. Iako visok, sadržaj Cu u
listu pšenice nije značajnije varirao duž gradijenta tako da je jasno pokazano da
poremećen rast pšenice nije mogao biti uslovljen samo visokim sadržajem Cu.
Istovremeno je i statističkom metodom multiple varijacione analize pokazano da je
fosfor glavni prediktor rasta pšenice na zemljištima oštećenim kiselom piritskom
jalovinom (Nikolić et al. 2011).
1.3.1. Dinamika fosfora u zemljištu
Bez obzira na visoke koncentracije ukupnog P u zemljištu, samo mali deo je
dostupan biljkama. Procenjeno je da je prinos useva na preko 30% poljoprivrednog
zemljišta (5.7 miliona ha) smanjen usled nedovoljne količine dostupnog P (Runge-
Metzger 1995; von Uexküll et Mutert 1995; Batjes 1997).
U zemljištu P postoji u organskom i neorganskom obliku. Organski P čini 30-65%
od ukupnog P u zemljištu (Harrison 1987) a najveći deo organskog fosfora (oko 60%)
se nalazi u obliku inozitol-fosfata. Znatno manji deo (5-10%) se nalazi u obliku
nukleinskih kiselina, u vidu produkata raspadanja, dok se samo 1% nalazi u obliku
fosfolipida (Halstead et al. 1975). Najstabilniji deo organskog P zemljišta su inozitol-
fosfati, dok se fosfolipidi i nukleinske kiseline brzo raspadaju pod dejstvom zemljišnih
mikroorganizama (Anderson 1967; Ko et Hora 1970). Organska frakcija P može postati
dostupna za biljke posredstvom enzima fosfataza poreklom iz korena biljaka ili
rizosfernih mikroorganizama (Alexander 1977; Cosgrove 1977). Ovi procesi u velikoj
meri zavise od vodnog režima zemljišta, temperature, površinskih fizičko-hemijskih
osobina, kao i od pH i Eh zemljišta. Fosfor oslobođen mineralizacijom može da bude
usvojen od strane biljke, mikroorganizama, može da se fiksira u nerastvorljivu
neorgansku frakciju ili da bude ispran iz zemljišta.
Opšte je prihvaćeno mišljenje da su za ishranu biljaka važnije neorganske
frakcije P. Više od 90% mineralnog P se nalazi u obliku koji biljke ne mogu da iskoriste
kao što su: primarni minerali, deo P u vezanog za humusnu materiju, nerastvorljivi Ca,
Fe i Al fosfati, kao i P fiksiran u Al/Fe hidroksidima i silikatnim mineralima (minerali
gline). Uprkos tome što P spada u grupu elemenata koji je intezivno proučavan, o
10
hemijskim oblicima (specijaciji), biohemijskom ponašanju, i mobilnosti P u zemljištu, a
naročito u rizosferi, još uvek se vrlo malo zna. Specijacija fosfora u zemljištu je u
velikoj meri uslovljena pH vrednošću. U neutralnim i alkalnim zemljištima, fosfatni
anjoni će se taložiti u obliku Ca-fosfata, kao di- (CaHPO4 x 2H2O) ili okta-kalcijum
fosfat [Ca8(HPO4)2(PO4)4 x 5H2O], hidroksiapatit [Ca5(PO4)3 x OH] i apatit [Ca5(PO4)3]
(Lindsay et al.1989). Ova jedinjenja se razlikuju po stepenu rastvorljivosti, pri čemu su
baznija jedinjenja kao što su hidroksiapatit i apatit manje rastvorljiva. Analogno Ca, Mg
sa fosfatima takođe gradi soli [Mg(H2PO4)2 x 2H2O], (MgHPO4 x 7H2O) i [Mg3(PO4)2 x
8H2O] ali sa većim sadržajem kristalizovane vode i stoga veće rastvorljivosti. Međutim,
čiste forme minerala se retko sreću, uglavnom imaju primese koje utiču na njihovu
rastvorljivost. Tako se, na primer, apatit često nalazi u obliku fluroapatita [Ca5(PO4)3F].
Nasuprot tome, u kiselim uslovima fosfatni anjon će se taložiti sa Fe i Al jonima, u
obliku strengita (FePO4 x 2H2O), vivijanita [Fe3(PO4)2 x 8H2O], varsicita (AlPO4 x
2H2O) ili drugih minerala (Norrish et Rosser 1983; Lindsay et al. 1989). Pošto se
fosfatni anjoni ponašaju kao jaki neorganski ligandi sa jakim afinitetom prema
katjonima metala (Ca2+, Mg2+, Fe3+ Mn2+, Al3+) u zemljištu, specijacija P zapravo je
kontrolisana i količinom ovih katjona (Lindsay 1979).
Frakcije neorganskog P se razlikuju po stepenu dostupnosti za biljke i mogu se
podeliti na:
1. dostupan P u rastvoru zemljišta
2. lako dostupan (labilan)
3. nedostupan (nelabilan)
Fosfatni anjon iz rastvora zemljišta je direktno dostupan biljkama i čini daleko
najmanji deo P u zemljištu. Labilna frakcija P je sastavljena od rastvorljivih Ca-fosfata
(primarnih) i slabo adsorbovanih fosfata. Nelabilna frakcija može da uključi rezistentan
P, to jest P koji je jako adsorbovan na minerale gline i teško rastvorljive minerale. Kako
biljke primarno usvajaju P u obliku fosfatnih anjona iz zemljišnog rastvora, a P iz
rastvora se nalazi u stalnoj ravnoteži sa labilnom frakcijom, P anjon se prvo
nadomeštava labilnom frakcijom, koja se opet, ali mnogo sporije zamenjuje nelabilnom
frakcijom. U poređenju sa adsorbovanim fosfatima, količina fosfora u rastvoru je veoma
mala, čak i do 1000 puta manja. Međutim, biljke su razvile adaptacije koje im
11
omogućavaju da iskoriste i teško rastvorljive oblike. Hemijske i biološke promene
uzrokovane korenovim sistemom imaju ključnu ulogu u povećanju dostupnosti P u
rizosferi (Hinsinger 2001). Ove promene uglavnom uključuju promene rizosferne pH
(povećana aktivnost protonske ATP-aze na plazma membrani ćelija korena), eksudaciju
karboksilata i sekreciju enzima fosfataza ili fitaza koji omogućavaju rastvaranje inače
teško rastvorljivih oblika P (Neumann et Romheld 2002; Zhang et al. 2010). Tako je, na
primer, pokazano da Cajanus cajan može da iskoristi Ca-P (Ae et al. 1990), pšenica Al-
P (Pearse et al. 2007), a uljana repica (Brassica napus) Fe-P (Hoffland 1992). Promene
pH vrednosti rizosfernog zemljišta mogu da u velikoj meri utiču na dostupnost P u
rizosferi. Rizosferna pH može se za celu jedinicu razlikovati od pH okolnog zemljišta
(Nye et Tinker 1977). Razlika između pH vrednosti rizosfere i okolnog zemljišta
uglavnom nastaje usled disbalansa usvajanja anjona i katjona. U rizosferi biljaka koje su
đubrene nitratnim (NO3-) oblikom azota (N) dolazi do trošenja protona (H+) usled
simportnog transporta anjona kroz plazma membranu, kao i do oslobađanja OH- ili
HCO3-, usled čega se rizosfera alkalizuje. U zemljištima gde dominira adsorbovani P,
povećanje rizosferne pH može da dovede do desorpcije fosfata i povećane dostupnosti P
u rizosferi. Sa druge strane, koren biljaka koje se hrane amonijačnim (NH4+) N oslobađa
povećanu količinu H+ što dovodi do acidifikacije rizosfere i boljeg rastvaranja Ca-P.
Osim toga, organski ligandi (helatori metala) mogu da se izmenjuju sa fosfatom, te na
taj način povećaju dostupnost fosfata.
1.3.2. Dinamika bakra i aluminijuma u zemljištu i fitotoksičnost
Bakar spada u grupu teških metala čije poreklo u zemljištu može biti geološko ili
antropogeno. Pored toga, jedan je od najvažnijih esencijalnih elemenata u ishrani biljaka
i životinja. Prosečan sadržaj Cu u nezagađenom zemljištu varira od 20-30 mg kg-1
(Alloway 1999). Glavni minerali bakra su malahit [Cu2(OH)2CO3], azurit
[Cu3(OH)2(CO3)2], kuprit (Cu2O), tenoriti (CuO), halkocit (Cu2S), kovelin (CuS),
halkopirit (CuFeS2), bornit (Cu5FeS4) (Mengel et Rehm 2002). Halkopirit je mineral
koji se najviše eksploatiše i čini oko 50 % od ukupnih ležišta bakra na svetu.
12
Bakar se u zemljištu nalazi u jonskom (Cu2+/CuOH+) obliku u zemljišnom
rastvoru, u obliku kompleksa sa različitim ligandima (prvenstveno organskom
materijom), kao izmenjivi katjon odnosno specifično adsorbovani jon u adsorptivnom
kompleksu zemljišta, ili je okludovan u oksidima ili mineralima. Dostupnost Cu za
biljke u najvećoj meri zavisi od pH vrednosti i sadržaja organske materije. Dostupnost
Cu opada za 99% sa svakim povećanjem pH-jedinice (Mengel et Rehm 2002).
Organska materija ima snažan afinitet za Cu, čak i na niskim pH, a zbog velike
stabilnosti kompleksa Cu sa organskim ligandima organičena mu je dostupnost za biljke
(Alloway 1999). Usled slabije adsorbcije na kiselim zemljištima dolazi do povećane
rastvorljivosti Cu (Sauvé et al. 1997). Međutim, u rizosferi zahvaljujući aktivnosti
korena i/ili mikroorganizmima može doći do promena u specijaciji i mobilnosti
različitih elemenata kao posledica promena hemijskih osobina zemljišta, kao što su pH
vrednost ili koncentracija rastvorenog organskog ugljenika (C) (Hinsinger et
Courchesne 2008). U slučaju biljaka iz familije Poaceae pojačana eksudacija
takozvanih fitosiderofora (amino kiseline, derivati metionina, koje ne ulaze u sastav
biljnih proteina i poseduju jaka helirajuća svojstva prema metalima), može da poveća
usvajanje Cu iz krečnih zemljišta. U uslovima ekstremno visokih koncentracija Cu u
zemljištu, kod biljaka dolazi do pojave hloroze i nekroze listova, nekroze korena,
smanjenje rasta korena i nadzemnog dela biljke. Na ćelijskom nivou, dolazi do
vezivanja Cu za sulfhidrilne grupe u proteinima što ometa njihovu funkciju. Takođe,
visoke koncentracije Cu mogu da dovedu do deficita drugih esencijalnih elemenata,
naročito Fe, a može da prouzrokuje i oksidativni stres. Koncentracija bakra u biljnim
tkivima varira od 1 do 50 mg kg-1 suve mase (Marschner 1995), a prosečna vrednost u
listovima je 10 mg kg-1 suve mase (Baker et Senef 1995). Za pšenicu je donja kritična
granica 8 mg kg-1, a optimalni opseg je 8-19 mg kg-1 (Reuther et Labanauseks 1966).
Više od 15% zemljine kore je sačinjeno od aluminijum oksida (Al2O3).
Aluminijum je u zemljištu sastavni deo primarnih i sekundarnih minerala, naročito
alumosilikata, kao što su feldspati, mikas, kaolinit, smecit i vermikulit (Allen et Hajek
1989). Osim alumosilikata i Al-oksihidroksida, Al može da formira i slabo rastvorljiva
jedinjenja sa anjonima kao što su fosfati ili sulfati.
13
U neutralnim i alkalnim zemljištima, rastvorljivost Al je previše mala da bi
negativno uticala na rast biljaka. Da bi bio dostupan, Al mora da bude prisutan kao
katjon u zemljišnom rastvoru (Adams et al. 1984). Postoji nekoliko procesa u zemljištu
koji utiču na rastvorljivost Al, to su pre svega procesi razmene jona, reakcije taloženja i
rastvaranja, kao i reakcije adsorpcije i desorpcije sa organskih jedinjenja (Menzies et al.
1994). Čvrsta organska materija može da zadrži adsorbovani ili kompleksirani Al.
Interakcija Al sa organskom materijom je ključna u eksponencijalnom opadanju
koncentracije rastvorljivog Al na pH < 5 (Bloom et al. 1979).
Rastvaranje hidroksilnih Al komponenti u zemljištima u velikoj meri zavisi od
pH. Niska pH može da dovede do visokih koncentracija rastvorljivog Al koji je toksičan
za biljke. Najtoksičniji je Al3+, odnosno Al(H2O)63+ koji dominira na pH 4.5 (Pavan et
al. 1982; Tanaka et al. 1987; Parker et al. 1988). Sa druge strane, kompleksi Al sa
fluoridima, sulfatima ili fosfatima nisu toksični za biljke (Alva et al. 1986; Cameron et
al. 1986; Kinraide et Parker 1987).
2 3 4 5 6 7 8 9 100
0,5
1,0Al3+
Al(OH)2+
Al(OH)4-
Al(OH)3
Al(OH) 2+
pH
Mol
skiu
deo
Slika 2. Specijacija Al u zavisnosti od pH vrednosti zemljišta (prema: Martin 1999)
Koncentracija Al3+ čini samo mali deo od ukupnog rastvorljivog Al u zemljištu
(Wolt 1981). Aluminijum je toksičan za biljke i životinje, ometa strukturu i funkciju
citoskeleta, remeti homeostazu Ca, fosfatni metabolizam i dovodi do oksidativnog
stresa. Prvi vidljivi efekat Al na biljke je ograničenje u rastu korena (Clarskon et
Sanderson 1969). Vrhovi korena i lateralni korenovi postaju tanji i dobijaju braon boju
(Foy et al. 1978). Aluminijum smanjuje translokaciju fosfora u nadzemni deo biljke,
14
zato su oštećenja nastala toksičnim delovanjem Al veoma slična deficitu P: tamna
obojenost lista i smanjen rast (Foy et al. 1974). Pored toga dolazi i do smanjenog
usvajanja K, Ca i Mg (Foy 1988; Raynal et al. 1990).
1.3.3. Mere popravke kiselih zemljišta
Na globalnom nivou kisela zemljišta su glavni ograničavajući faktor za rast
biljaka. Popravka kiselih zemljišta često podrazumeva upotrebu velikih količina
mineralnih fosfatnih đubriva, dok je upotreba kreča (CaCO3), ređe dolomita (MgCO3)
najčešće primenjivana mera za ublažavanje toksičnog delovanja Al (Haynes 1982). U
svetu se svake godine iskoristi oko 30 miliona tona P đubriva (Wang et al. 2013).
Međutim, preko 90% primenjenih P đubriva se veoma brzo transformiše u oblike koje
biljka ne može da iskoristi. Pored toga, procenjeno je da će svetske rezerve fosfatnih
đubriva biti potpuno potrošene u sledećih 30-80 godina (Richardson 2009). Unošenje
velikih količina P đubriva koje biljka ne može da iskoristi svakako nije bez posledica po
životnu sredinu. Iako slabo pokretan u zemljištu, višak P se ispira u dublje slojeve
zemljišta i dospeva do podzemnih voda ili se erozijom P direktno spira u površinske
vode dovodeći do pojave eutrofikacije. Čak 33% površinskih voda u kojima se meri
stepen eutrofikacije definisano je kao eutrofno ili hipertrofno (European Commission,
EC 2010). Lindsay et al. 1962 su identifikovali čak 32 forme fosfatnih jedinjenja koja
nastaju nakon unošenja fosfornih đubriva u zemljište. Priroda nastalih jedinjenja zavisi
od prisutnog katjona, pH, količine i tipa fosfatnog đubriva i hemijskih osobina zemljišta
(Lindsay et al. 1962). Vodno rastvorljiva fosfatna đubriva, kao što su superfosfati lako
se rastvaraju u zemljištu. Međutim, u blago kiselim i kiselim zemljištima H2PO42- se
brzo adsorbuje na seskviokside i/ili minerale gline, a može da bude adsorbovan i na
kalcijum-karbonatu (Larsen 1967). Primena monokalcijum-fosfata (MCF) značajno
utiče na fizičko-hemijske osobine zemljišta. Posle unosa u zemljište MCF prolazi kroz
niz transformacija i dolazi do formiranja lokalnih zona bogatih fosfatima (Benbi et
Gilkes 1987). U ovim lokalizovanim zonama dešavaju se tri grupe reakcija: direktna
reakcija, reakcije taloženja i reakcije adsorbcije. U zoni direktne reakcije pH je veoma
niska od 1.0 do 1.6 što dovodi do mobilizacije jona metala u zemljištu. Ovako
15
mobilisani joni mogu da dodatno reaguju sa P i da dovedu do njegovog taloženja. U
krečnim zemljištima, kisela đubriva rastvaraju kalcijum, dovodeći prvo do formiranja
dikalcijum fosfata dihidrata, a zatim i dikalcijum fosfata (Terman et al.1958; Lindsay et
Stephenson 1959). S obzirom da su ovi kompleksi umereno stabilni, dolazi do njihove
konverzije u oktakalcijum fosfat, trikalcijum fosfat, apatit, ili hidroksiapatit (HAP).
Oktakalcijum fosfat, apatit i HAP su manje dostupni za ishranu biljaka (Arai et Sparks
2007), a HAP može činiti više od 50 % od ukupnog P u krečnim zemljištima (Shen et
al. 2011).
Zbog toga se popravka takvih zemljišta mora veoma pažljivo sprovoditi uz izbor
održivih i po životnu sredinu bezopasnih metoda. Neophodna je balansirana primena
mineralnih đubriva na osnovu konkretnih potreba useva uzimajući u obzir i rizosferne
procese. Ovakav način popravke zemljišta može da obezbedi postizanje željenih prinosa
uz istovremeno smanjivanje količine primenjenih fosfatnih đubriva. Jedna od
inovativnih metoda mogla bi biti upotreba đubriva na bazi silicijuma (Si), za koji
postoje rastući interes u svetu, kao jedinog poznatog mineralnog elementa koji efikasno
deluje na ublažavanje različitih vrsta abiotskog stresa kod biljaka (Liang et al. 2007).
I ako je Si drugi element po zastupljenosti u Zemljinoj kori, još uvek nema
dokaza da spada u grupu neophodnih hraniva za većinu biljnih vrsta. Većina Si u
zemljištu se nalazi u obliku alumosilikata, koje biljka ne može da usvoji (Richmond et
Sussman 2003), dok se samo manji deo Si nalazi u obliku monosilikatne kiseline koja je
dostupna biljkama. Prosečna koncentracija monosilikatne kiseline u zemljištu iznosi 0.1
do 0.6 mM (Epstein 1994). Do sada je pokazano da usvajanje Si može biti pasivan ili
aktivan proces, a postoje i biljke eksluderi Si. Pasivno usvajanje Si se dešava ili prostom
difuzujom ili u procesu olakšane difuzije posredstvom proteinskih kanala koji postoje
kod svih biljaka (Raven 2003). Aktivno usvajanje Si prisutno je kod nekoliko biljnih
vrsta kao što su pirinač (Oryza sativa) (Takahashi et al. 1990; Tamai et al. 2003),
pšenica (Triticum aestivum) (Jarvis 1987; Rains et al. 2006), ječam (Hordeum vulgare)
(Nikolić et al. 2007). Aktivno usvajanje Si iz hranljivog medijuma je posredovano
grupom Ls1 transportera, koji su prvi put ustanovljeni kod pirinča (Ma et al. 2006).
Kasnije je prisustvo ovih transportera potvrđeno i kod ječma (Chiba et al. 2009),
kukuruza (Zea Mays) (Mitani et al. 2009) i pšenice (Montpetit et al. 2012).
16
S obzirom na hemijsku sličnost P i Si nije iznenađujuće što je interakcija ova
dva elementa dosta proučavana. Međutim, mehanizam kojim Si pomaže u
prevazilaženju stresa nedostatka fosfora do danas nije poznat. Naučne rasprave o tome
da li se efekat Si ostvaruje u samoj biljci ili u zemljištu sežu deleko u prošlost. Hall i
Morison su još 1906. godine predpostavili da silicijum pokreće reakcije u samoj biljci.
Nešto kasnije, 1955. godine. Rothbuhr i Scott su pokazali da dodavanje Si u
hidroponični rastvor poboljšava usvajanje fosfora kod pšenice za 25 %. Nedugo zatim
su predloženi i drugi mehanizmi ublažavanja deficita P, kao što su povećanje
dostupnosti P u zemljištu, bolje iskorišćavanje fosfora u biljci, ili indirektno poboljšanje
statusa P u biljci, ograničavanjem usvajanja toksičnih elementa, na primer Mn (Ma et
Takahashi 1990; 1991). Povećanje dostupnosti fosfora u zemljištu je moguće na
nekoliko načina: promenom pH vrednosti, smanjenjem sorbpcije fosfata ili zamenom
fosfatnog anjona anjonima Si na mestima adsorbcije, preko mehanizma izmenjive
adsorbcije anjona (Koski-Vahala et al. 2001; Owino-Gerroh et Gascho 2004). Međutim,
u većini zemljišta, ovaj poslednji mehanizam nije mnogo verovatan, sa obzirom da
fosfatni jon ima veći afintet za vezivanje u odnosu na jon silikata (Brinkmann 1993).
Pored interakcije Si i P, poznato je da Si može pomoći i u prevazilaženju stresa
izazvanog toksičnim koncentracijama aluminijuma. Slično P, do interakcije Si i Al
može doći kako u zemljištu, tako i u biljci. Pretpostavljeni mehanizam ublažavanja
toksičnosti aluminijuma silicijumom je formiranje alumosilikatnih kompleksa koji nisu
toksični ili u apoplastu korena ili u zemljištu (Chappell et Birchall 1988; Hodson et
Evans 1995; Ma et al. 1997; Cocker et al. 1998; Birchall 1990; Exley et Birchall 1992,
1993). Pored toga, poznato je da u uslovima toksičnosti Al, ishrana Si može da dovede
do pojačanog efluksa malata ili fenola koji vezuju Al, čineći ga manje toksičnim
(Barceló et al. 1993; Cocker et al. 1998; Kidd et al. 2001).
Takođe, ne treba zanemariti ni alternativu upotrebe CaSiO3 umesto CaCO3, pre
svega sa aspekta ublažavanja efekata klimatskih promena. Prema procenama
Međunarodnog panela za klimatske promene (IPCC 1997) celokupna količina ugljenika
koji se primeni u obliku CaCO3, se oslobađa u atmosferu u vidu CO2, doprinoseći
pojačavanju efekta staklene bašte. Procenjeno je da je u USA, samo tokom 2001.
godine, emisija ugljen-dioksida sa poljoprivrednih površina činila 0.13% od ukupne
17
emisije gasova staklene bašte, što je ekvivalento emisiji gasova staklene bašte sa
teritorije celog Luksemburga (EPA 2004, West et McBride 2005).
1.4. Rizosferni procesi i adaptacije korena biljaka na kiselim
zemljištima 1.4.1. Eksudacija organskih kiselina
Prva interakcija između biljke i zemljišta dešava se u zoni neposredno uz koren
biljke koja se naziva rizosfera. Po definiciji koju je dao Hiltner (1904) rizosfera
predstavlja zonu interakcije korena biljke, mikroorganizama i zemljišta. Kao posledica
ove interakcije stvaraju se izraženi gradijenti (pH, redoks potencijal, koncentracija
mineralnih elemenata) od korena ka okolnom “balk“ zemljištu. Tokom evolucije, biljke
su razvile niz adaptacija koje im omogućavaju da modifikuju osobine rizosfernog
zemljišta. Ove adaptacije uključuju odavanje (efluks) jona (H+, HCO3-, OH-) ili
organskih jedinjenja, poreklom iz primarnog ili sekundarnog metabolizma: ugljene
hidrate, karboksilate, fenole i terpenoide (Schurr et Schulze 1995; Mooney et al. 2002;
Plaxton 2006; Sweetlove et al. 2007; Fernie et Martinoia 2009). Poslednjih godina,
eksudacija korena je privukla veliku pažnju istraživača s obzirom na uticaj u procesima
ishrane biljaka, zaštite korena od toksičnog delovanja pojedinih elemenata, i uticaja na
mikrobiološke procese (Lopez-Bucio et al. 2000; Neumann et Martinoia 2002; Shane et
Lambers 2005). Efluks jona dovodi do promena pH vrednosti rizosfere što može uticati
na mobilnost i dostupnost elemenata u rizosferi.
Važnu grupu eksudata korena čine karboksilne kiseline. Neke od ovih kiselina
predstavljaju intermedijere metabolizima (npr. limunska i jabučna) dok neke druge
kiseline, kao što je oksalna, predstavljaju krajnje produkte nekog metaboličkog puta
(Schurr et al. Schulze 1995; Fan et al. 1997; Marschner et al. 2004; Weisskopf et al.
2006; Badri et al. 2008; van der Merwe et al. 2009). Bez obzira na put njihove
biosinteze, eksudacijom iz simplasta u apoplast, organski anjoni mogu da reaguju sa
mineralnim elementima u rizosferi, jer imaju slobodne karboksilne grupe, koje su
18
negativno naelektrisane na neutralnoj ili kiseloj pH, što im omogućava da reaguju sa
brojim katjonima zemljišta.
Do sada su najbolje proučeni mehanizmi eksudacije malata i citrata (soli jabučne
i limunske kiseline, ponaosob), za koje je pokazano da imaju značaju ulogu u zaštiti
korena od toksičnog delovanja aluminijuma (Al) i u ishrani biljaka fosforom.
Formiranje stabilnih kompleksa između Al i organskog anjona je osnovni mehanizam
detoksikacije Al (Hue et al. 1986; Ma et al. 2001). Organske kiseline u rizosferi mogu
da povećaju mobilnost P na nekoliko načina: promenom pH rizosfere, pomeranjem
hemijske ravnoteže ka uslovima za lakše rastvaranje teško dostupnih oblika P,
menjanjem površinskih osobina minerala zemljišta, ligandnom izmenom sa fosfatim
anjonom, ili kompleksiranjem katjona iz nerastvorljivih kalcijum (Ca) fosfata
(karbonatna zemljišta), fosfata Fe, Al i Mn (kisela zemljišta). Dva najčešća mehanizma
koja se spominju u literaturi su mehanizam razmene liganada i mehanizam rastvaranja
koji je katalizovan ligandom (Hue 1991; Lopes -Hernandez et al. 1986; Earl et al.
1979).
Uticaj karboksilata na povećanje mobilnosti P zavisi od mnogih faktora: tipa i
pH vrednosti zemljišta, koncentracije i tipa karboksilata, ali i koncentracije P (Störm et
al. 2005; Palomo et al. 2006; Khademi et al. 2010; Oburger et al. 2011). S obzirom da
se u citoplazmi organske kiseline nalaze u formi anjona, i da se u tom obliku
transportuju kroz plazmamembranu, efluks ovih anjona mora biti praćen ili usvajanjem
anjona ili ekvivalentim efluksom katjona, što može dovesti do promena rizosferne pH.
Međutim, uticaj eksudacije organskih kiselina na rizosfernu pH nije tako jasan. Kod
bele lupine (Lupinus albus) pokazano je da je efluks citrata praćen efluksom protona
(H+), što dovodi do zakišeljavanja rizosfere. Sa druge strane, kod pšenice je efluks
malata praćen efluksom jona kalijuma (K+) tako da nema velikog uticaja na pH (Ryan et
al. 1995).
Sinergistički efekat deficita P i toksičnosti Al na eksudaciju organskih kiselina u
kiselim zemljištima je poznat, ali slabo izučavan fenomen. Prvi dokaz o eksudaciji
organskih kiselina indukovanoj Al3+ je ustanovljen kod pasulja (Phaseolus vulgaris L.)
(Miyasaka et al. 1991), a nešto kasnije i kod pšenice (Delhaize et al. 1993b). Malati,
citrati i oksalati predstavljaju najčešće helatore aluminijuma. Neke vrste kao što su ovas
19
(Avena sativa), rotkvica (Raphanus sativus), raž (Secale cereale) i uljana repica
(Brassica napus) izlučuju samo malate i citrate (Zheng et al. 1998; Ma et al. 2000; Li et
al. 2000). Iako je efluks malata i citrata kao adaptivni odgovor pšenice na toksičnost Al
dobro proučen (Delhaize et al. 1993; Pellet et al. 1997; Sasaki et al. 2004; Stass et al.
2008; Ryan et al. 2009), uloga ovih karboksilata u akviziciji fosfora još uvek
predstavlja nepoznanicu. Do sada je u samo nekoliko studija jasno pokazano da u
uslovima deficita P kod pšenice dolazi do pojačane eksudacije karboksilata (Li et al.
1995; Pearse et al. 2006; Dotaniya et al. 2013). Nedavno je pokazano i da elfuks citrata
može da poboljša rast pšenice pri ekstremno niskim koncentracijama fosfora (Ryan et
al. 2014). Sa druge strane, kod vrsta kao što su bela lupina, uljana repica i lucerka
(Medicago sativa), i nekih članova familije Proteaceae efluks citrata je primarno
indukovan deficitom P (Dinkelaker et al. 1989; Hoffland et al. 1989; Roelofs et al.
2001).
Efluks organskih anjona iz citoplazme u medijum u smeru elektrohemijskog
gradijenta posredovan je anjonskim kanalima smeštenim u plazma-membrani. Do sada
su identifikovane dve familije proteina uključenih u transport organskih anjona: malatni
transporter aktiviran Al (ALMT; Al-activated malate transporter), koji učestvuje u
transportu malata (Ryan et al. 1997) i transporter MATE (multi drug and toxin
compound extrusion) koji eksportuje citrate (Meyer et al. 2010). Još uvek nije dovoljno
jasno da li ekspresija članova MATE i ALMT familije gena ima ključnu ulogu u
eksudaciji organskih kiselina u uslovima deficita P kod pšenice, kao što je to, na primer,
slučaj sa ječmom (Delhaize et al.2007).
ALMT čini malu familiju proteina koji se sreću samo kod biljaka; prvi anjonski
kanal ovog tipa, TaALMT1, je identifikovan upravo kod pšenice (Sasaki et al. 2004).
To je hidrofobni protein koji ima od 6 do 7 transmembranskih domena (Motoda et al.
2007). Opšte je prihvaćeno mišljenje da je za aktivaciju TaALMT1 u korenu neophodno
prisustvo Al3+ u medijumu. Međutim, način na koji Al utiče na aktivaciju ovog kanala
još uvek nije poznat (Delhaize et al. 2007). Pored toga, istraživanja poslednjih godina
pokazuju da TaAMLT1 može da posreduje pri efluksu organskih anjona, čak i bez
prisustva Al (Pineros et al. 2008).
20
Ekspresija gena TaALMT1 u nekoliko heterolognih sistema koincidira sa
efluksom malata indukovanim Al, a kada se taj gen eksprimira u ćelijama duvana
(Nicotiana tabacum) i ječma (Hordeum vulgare) povećava se njihova otpornost na
toksičnost Al (Sasaki et al. 2004; Delhaize et al. 2004). Kod pšenice, TaALMT1 je
konstitutivno eksprimiran u vršnim delovima korena, a nivo ekspresije se značajno
razlikuje kod osetljivih i tolerantnih genotipova, što u velikoj meri određuje njihovu
otpornost na toksičnost Al (Sasaki et al. 2006). Kod nekih japanskih genotipova pšenice
koji su osetljiviji na Al pokazano je da su potrebni i dodatni faktori (osim prisustva
Al3+) za post-transkripcionu regulaciju TaALMT1 (Sasaki et al. 2006; Delhaize et al.
2007). Homologni proteini su identifikovani i kod drugih biljnih vrsta, npr.
Arabidopsisa (Arabidopsis thaliana; AtALMT1), uljane repice (BnALMT1 i
BnALMT1), kukuruza (Zea mays; ZmALMT1) i raži (ScALMT1) a koji pokazuju
sličnu funkciju kao TaALMT1 (Hoekenga et al. 2006; Ligaba et al. 2006; Pineros et al.
2008; Fontecha et al. 2007) Međutim, funkcionalna analiza ZmALMT1 u oocitama
žabe (Xenopus leavis) sugeriše da je ovaj transporter uključen u opštu mineralnu ishranu
i procese homeostaze, a ne samo kao posrednik u specifičnom oslobađanju karboksilata
(Pineros et al. 2008). Nedavno je pokazano da kod transgenog ječma, gen TaALMT1 iz
pšenice može da poboljša akviziciju P u kiselim zemljištima (Delhaize et al. 2009).
MATE je velika familija proteina koja postoji kod eukariota i prokariota. Ovi
proteini funkcionišu po tipu sekundarnog transporta koristeći elektrohemijski gradijent
drugih jona (Na+, H+) da bi eksportovali čitav spektar sekundarnih metabolita i
ksenobiotika (Hvorup et al. 2003; Magalhaes et al. 2010). Članovi ove familije koji
transportuju citrat su uključeni u mehanizme tolerancije na Al, kao i u ishranu P i Fe
(Udhe-Stone et al. 2005; Durrett et al. 2007). Kod pšenice, kukuruza, raži, Arabidopsisa
i pirinča MATE geni su uključeni u mehanizam tolerancije prema Al (Liu et al. 2009;
Ryan et al. 2009; Maron et al. 2010; Yokosho et al. 2010; Yokosho et al. 2011).
TaMATE1 kod pšenice se razlikuje od ostalih vrsta po tome što nije aktiviran Al, već je
pre u pozitivnoj korelaciji sa konstutivnim efluksom citrata (Ryan et al. 2009).
21
1.4.2. Mobilizacija, usvajanje i translokacija fosfora
Usled male rastvorljivosti i mobilnosti u zemljištu, koncentracija P u rizosferi se
veoma brzo smanjuje (usvajanje P korenom). Tako nastaje gradijent koncentracije P u
radijalnom smeru od površine korena. Rastvorljivi P u rastvoru rizosfernog zemljišta
treba da bude zamenjen i do 50 puta u toku dana P iz okolnog “balk“ zemljišta, kako bi
se zadovoljile potrebe biljke (Marschner 1995). Kao odgovor na nisku dostupnost P u
rizosferi, biljke su razvile morfološke, fiziološke i biohemijske adaptivne mehanizme da
bi modifikovale rizosferu, te na taj način povećale sposobnost usvajanja P (Vance et al.
2003; Lynch et Brown 2008; Zhang et al. 2010; George et al. 2011). Ove adaptacije
uključuju niz promena u morfologiji i arhitekturi korena; povećanje odnosa mase korena
prema masi nadzemnog dela, grananje korena, izduživanje korena, formiranje korenskih
dlaka, stvaranja većeg broja mikoriza (Jungk 2001; Lynch 1995). Sve ove promene
povećavaju zapreminu zemljišta kome biljka može da pristupi i na taj način posredno
obezbedi i više P. Pored toga, biljke izložene deficitu P modifikuju osobine rizosfernog
zemljišta oslobađanjem protona, eksudacijom organskih anjona i enzima fosfataza da bi
se mobilisali teže rastvorljivi oblici fosfora (Marschner 1995; Hinsinger 2001; Jones et
al. 2003; Jain et al. 2007; George et Richardson 2008). Povećanje kapaciteta ćelija
korena da usvoje P indukcijom fosfatnih transportera visokog afiniteta su ključne
adaptacije kod biljaka koje rastu u uslovima deficita ovog makroelementa (Liu et al.
1998; Raghothama 1999; Vance et al. 2003).
nH+
Citrat/malatAl/Fe
Citrat
Malat
oksalacetatPi
PHT1.1
PEPC
PHT1.1
MATE
ALMT
Pi
Citrat
Malat
PiAl/Fe
Pi
RizosferaCitosolPlazma membrana
Slika 3. Mehanizam mobilizacije P u rizosferi
22
Biljke usvajaju fosfor u obliku ortofosfata (H2PO4- ili HPO4
-2) čije se
koncentracije u zemljištu kreću od 1-10 µM (Hinsinger 2001). Fosfatni anjoni nastaju
disocijacijom ortofosforne kiseline. Kod većine poljoprivrednih zemljišta dominantni
joni fosfata su H2PO4- i HPO4
-2 (Lindsay 1979), dok visoka koncentracija H+ jona
(kisela zemljišta) pomera ravnotežu ka više protonovanoj formi:
HPO42- + H+↔ H2PO4
-
Zato na pH vrednostima 4.5-5 dominira usvajanje H2PO4-, dok na većim pH
vrednostima (>7.2) biljke usvajaju pretežno HPO42-.
2 4 6 8 10 12 14
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
H3PO40 H2PO4
- HPO4 2- PO4
3-
pH vrednost
Mol
ski u
deo
Slika 4. Specijacija ortofosfatnog jona u odnosu na pH zemljišta. (Prema: Hinsinger 2001)
Usvajanje i translokacija P je omogućena posredstvom fosfatnih transportera
(PHT). Ovi transporteri imaju ključnu ulogu u regulaciji usvajanja P korenom kao i u
mobilizaciji P u listu (Drew et Saker 1984; Shimogawara et Usuda 1995; Muchhal et al.
1999). Kod biljaka su identifikovana dva fosfatna transportna sistema, odnosno
transporteri visokog i niskog afiniteta prema fosfatima. Transporteri niskog afiniteta
funkcionišu kada je koncentracija neorganskog P (Pi) visoka (Km = 50-300 pM) (Nandi
et al. 1987; Furihata et al. 1992) a ekspresija gena koji ih kodiraju je konstantna
(Raghothama 1999). Transporteri visokog afiniteta funkcionišu kada je koncentracija
23
fosfata niska (Km = 3-10 µM) pa su od većeg značaja za ishranu biljaka (Nandi et al.
1987; Furihata et al. 1992). Fosfatni transporteri se mogu podeliti u 4 grupe: PHT1,
PHT2, PHT3, i PHT4 (Rausch et Bucher 2002). Članovi PHT1 familije su transporteri
visokog afiniteta koji su uključeni u procese usvajanja Pi iz hranljivog medijuma, i ređe
u translokaciju P u biljci (Mudge et al. 2002; Ai et al. 2009). Članovi PHT2 familije su
uključeni u retranslokaciju P između tkiva (Daram et al. 1999), dok su članovi PHT3 i
PHT4 familije uključeni u transport P na subcelularnom nivou, u organelama kao što su
hloroplasti, mitohondrije i Goldži aparat (Karandashov et Bucher 2005; Rouached et al.
2010).
PHT transporteri funkcionišu po tipu simporta sa H+ (Schachtman et al. 1998),
mada kod nekih biljaka (halofita) usvajanje P može biti spregnuto i sa usvajanjem Na+
(Reid et al. 2000).
Slika 5. Shematski prikaz fosfatnog transportera (prema: Smith 2002).
Većina transportera PHT1 familije je i kod monokotila i kod dikotila
eksprimirana u korenu (Muchhal et al. 1996; Leggewie et al. 1997; Liu et al. 1998a,b;
Schunmann et al. 2004; Koyama et al. 2005; Xiao et al. 2005; Nagy et al. 2006;
Tittarelli et al. 2007; Jia et al. 2011; Loth-Pereda et al. 2011). Međutim, neki od ovih
transportera su detektovani i u listu ili cvetu (Nussaume et al. 2011). Homolozi PHT1
gena su identifikovani kod različitih vrsta, uključujuči Arabidopsis, krompir (Solanum
tuberosum) , paradajz (Lycopersicon esculentum), Medicago truncatula, ječam, duvan,
pirinač, kukuruz i pšenicu (Muchhal et al. 1996; Leggewie et al. 1997; Daram et al.
24
1998; Baek et al. 2001; Misson et al. 2004; Xiao et al. 2005; Nagy et al. 2006; Ai et al.
2009; Jia et al. 2011; Liu et al. 2013; Guo et al. 2013). Do sada je kod Arabidopsisa
okarakterisano 9 članova ove PHT1 familije (AtPHT1.1-AtPHT1.9) a kod pirinča čak
13 članova (OsPHT1-OsPH1.13) ( Paszkowsk et al. 2002; Misson et al. 2004).
Kod pšenice su iz PHT1 familije funkcionalno okarakterisani TaPHT1.1 i
TaPHT1.2 (Davies et al. 2002; Liu et al. 2013; Guo et al. 2013). Ovi transportni
proteini imaju 12 konzervisanih membranskih domena u kojima su po 6
transmembranskih domena, odvojeni hidrofilnom petljom (Henderson 1993).
Brojna istraživanja su pokazala da u uslovima deficita P dolazi do značajnog
povećanja transkripata PHT1 (po ranijoj nomenklaturi PT ili PiT) gena. Ovi geni su
“up“-regulisani, kao specifičan odgovor na deficit P kod brojnih biljnih vrsta kao što su
Arabidopsis (AtPHT1.1, AtPH1.2, AtPHT1.4), pirinač (OsPHT1.1; OsPHT1.2 i
OsPHT1.6), pšenica (TaPHT1.1 i TaPHT1.2), ječam (HvPHT1.1), kukuruz (ZmPHT1.2,
ZmPHT1.3, ZmPHT1.4, ZmPHT1.5 i ZnPHT1.6), krompir (StPHT1.1 i StPHT1.2),
paradajz (LePHT1.1 i LePHT1.2) (Muchhal et al. 1996; Leggewie et al. 1997; Liu et al.
1998; Karthikeyan et al. 2002; Rae et al. 2003; Misson et al. 2004; Nagy et al. 2006;
Tittarelli et al. 2007; Seo et al. 2008; Ai et al. 2009; Miao et al. 2009).
Funkcija i mehanizam regulacije Pi transportera pšenice nisu istraženi do detalja.
Pokazano je da mehanizam regulacije zavisi kako od tipa transportera, tako i od
genotipa pšenice (Davies et al. 2002). Na primer, ekspresija TaPHT1.2 kod kineske
sorte pšenice Xiaoyan 54 nije regulisana P statusom, dok je kod druge sorte Jing 411
ekspresija ovog transportera indukovana deficitom P. Osim statusom P, ekspresija
PHT1 transportera može biti regulisana i statusom drugih hraniva. Kod ječma,
ekspresije HvPHT1.1 i HvPHT1.2 su zavisne od statusa Zn u biljci, pri čemu deficit Zn
indukuje ekspresiju ovih gena bez obzira na status P (Huang et al. 2000). Kod
Arabidopsisa overekspresija PHT1.3 ima za posledicu sporo usvajanje arsena (As) u
transgenim biljkama, što ukazuje da je bar deo gena uključen u usvajanje Pi
transkripciono regulisan As (Catarecha et al. 2007). Osim mineralnim elementima
pokazano je da regulacija ovih transportera može biti modifikovana i drugim faktorima.
Na primer, PHT2 je “up“-regulisan svetlom kod kromira i Arabidopsisa (Rausch et al.
2004); kod breze (Betula pendula) je njegova transkripcija indukovana oksidativnim
25
stresom izazvanim ozonom (Kiiskinen et al. 1997). Poslednjih godina su otkrivene i
druge uloge Pi transportera. Kod božura (Paeonia suffruticosa) Pi transporter ima ulogu
u oslobađanju ATP-a tokom dormancije pupoljka (Huang et al. 2008). Ovakvi rezultati
zajedno ukazuju da geni koji kodiraju Pi transportere imaju složene mehanizme
regulacije koji su još uvek nedovoljno proučeni.
26
2. CILJEVI RADA
Glavni ciljevi istraživanja ove doktorske disertacije bili su: 1) ispitivanje kako
primena različitih mera za popravku zemljišta oštećenih rudarskom jalovinom utiče na
procese u rizosferi pšenice, 2) razjašnjavanje složenih fizioloških i molekularnih
mehanizama kojima se pšenica prilagođava deficitu P i toksičnim koncentracijama Cu i
Al u rizosferi, 3) proučavanje fiziološke uloge silicijuma (Si) u prevazilaženju stresa
deficita P kod pšenice, i 4) testiranje različitih oblika Si đubriva, kao inovativne i
ekološki prihvatljive mere popravke sekundarno (antropogeno) zakišeljenih zemljišta.
27
3. MATERIJAL I METODE
3.1. Biljni materijal i uslovi gajenja
Sterilisano seme pšenice (Triticum aestivum ) sorte Pobeda (kratko potapanje u
20% H2O2) je naklijavano u sterilnom, vlažnom kvarcnom pesku. Klijanci pšenice stari
4 dana su prebačeni u zemljište ili u hranljivi rastvor u zavisnosti od tipa eksperimenta
(zemljišne kulture ili hidroponi). Biljke su gajene u kontrolisanim uslovima, u klima
komori na temperaturi 24ºC:20ºC (svetlo:tama), pri vlažnosti vazduha oko 70%,
fotoperiod je bio 16 h svetla i 8 h tame, a fotosintetski aktivna radijacija (PAR) je bila
250 μmol fotona m-2 s-1.
3.2. Eksperiment 1: Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta
oštećenih kiselom rudničkom jalovinom na procese u rizosferi pšenice
Eksperiment 1 je postavljen sa ciljem proučavanja efekta standardnih mera
popravke zemljišta na rizosfene procese i adaptacije korena pšenice na zemljištima
oštećenim kiselom rudničkom jalovinom. Kao standardne metode korišćene su mere
unošenja kreča (kalcizacija zemljišta), NPK đubriva i stajnjaka, i njihova kombinacija.
3.2.1. Zemljište
U eksperimentu su korišćena plavljena poljoprivredna zemljišta (Fluvisol, IUSS
Working Group WRB, 2006 2007) iz donjeg toka Timoka oštećena nanosima rudničke
jalovine sa visokim sadržajem sulfida poreklom iz Borskog rudnika bakra (Nikolić et al.
2011). Zemljišta, uzorkovana sa dva lokaliteta iz okoline sela Rajac, razlikovala su se i
po količini nanešene jalovine (uslovljenoj relativnim položajem oštećene parcele u
odnosu na plavni vodotok) i po intenzitetu oksidativnog raspadanja jalovine
(uslovljenog istorijatom korišćenja parcele; Nikolić 2013). Osobine zemljišta pre setve
pšenice prikazane su u Tabelama 2, 3 i 4. Zemljište označeno L1 je bilo više zagađeno i
28
sa relativno manje izraženim procesom oksidativnog raspadanja jalovine. L1 je ilovača,
sa visokim sadržajem izmenjivog Al, visokim sadržajem dostupnih mikroelemenata, u
prvom redu Cu, a niskim sadržajem dostupnog P. Koncentracija ukupnog P bila je
416±50 mg kg-1. L2 je peskovito kiselo zemljište, oštećeno znatno višim
koncentracijama izmenjivog Al sa veoma izraženim deficitom P. Koncentracija
ukupnog fosfora je bila 72±11 mg kg -1. Pored toga, u ovom zemljištu je došlo do
ispiranja mikroelemenata, pa je pored deficita P prisutan i deficit mikroelemenata.
3.2.2. Dizajn eksperimenta
Po tri klijanca pšenice su prebačeni u svaki rizoboks (slika 6) ispunjen sa 0.6 kg
zemljišta (L1 ili L2), sa sledećim tretmanima:
1. Kontrola (bez dodataka)
2. Stajnjak
3. NPK
4. CaCO3
5. Stajnjak + CaCO3
6. NPK + CaCO3
Slika 6. Rizoboks u kome je gajena pšenica
Stajnjak je primenjen u količini od 8.5 g kg-1, (24 t ha-1). NPK đubrivo je
primenjeno u sledećim količinama: 70 mg kg-1 P u obliku KH2PO4 i 100 mg kg-1 N, što
odgovara ekvivalentoj količini od 200 kg P ha-1 i 285 kg N ha-1. Kalcijum-karbonat je
29
primenjen u količini od 6 g kg-1 zemljišta (17 t CaCO3 ha-1). Svaki tretman je imao po 4
ponavljanja. Vlažnost zemljišta je svaki dan održavana na 70% maksimalnog vodnog
kapaciteta zemljišta. Biljke su uzorkovane 25-og dana nakon setve.
U ovom eksperimentu određivani su sledeći parametri: biomasa korena i
nadzemnog dela pšenice, mineralni sastav lista pšenice i sadržaj mineralnih elemenata u
zemljištu. Pored toga, sakupljani su eksudati korena in vivo, određen je njihov profil,
kao i ekspresija gena uključenih u usvajanje P (TaPHT1.1, TaPHT1.2 koji kodiraju Pi
transportere visokog afiniteta) i anaplerotičku biosintezu (TaPEPC1 koji kodira
fosfoenol piruvat karboksilazu) i eksudaciju (TaMATE1 i TaALMT1 koji kodiraju
eksportere organskih anjona) organskih kiselina.
3.3. Eksperiment 2: Uticaj silicijuma na procese u rizosferi pšenice na
zemljištu oštećenom kiselom rudničkom jalovinom
3.3.1. Testiranje različitih silikatnih đubriva
Eksperiment je postavljen na zemljištu sa lokacije L1 (za osnovna svojstva
zemljišta sa ovog lokaliteta videti Tabele 2, 3 i 4; zbog različitih godina uzorkovanja
zemljišta vrednosti nekih parametara se razlikuju), na kome su, osim niske pH i
izraženog deficita P, visoke koncentracije dostupnog Cu takođe ograničavajući faktor za
rastenje pšenice.
Pšenica je gajena u rizoboksovima sa 0.6 kg zemljišta sa po tri klijanca pšenice u
svakom. Eksperiment je imao 5 tretmana:
1. Kontrola (bez dodataka)
2. Na2SiO3 (Na-Si)
3. CaSiO3 (Ca-Si)
4. Si(OH)4
5. Biosilikatno đubrivo (Bio-Si, Bacillus mucilaginosus)
30
Natrijum-silikat je primenjen u obliku tečnog stakla (Na2SiO3, Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Nemačka). Kalcijum-silikat je primenjen u obliku komercijalnog
preparata (CaSiO3, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemačka). Bio-Silikat je primenjen
u obliku komercijalnog preparata u vidu granula koje su sadržale kulture Bacillus
mucilaginosus (Yigeda Bio-Technology Co., Ltd Kina). B. Mucilaginosos je vrsta
bakterija koja se često nalazi u zemljištu, a veoma se često koristi kao model-organizam
za proučavanje interakcija između bakterija i minerala zemljišta. Ova bakterija je
naročito poznata po tome što pomaže u rastvaranju silikatnih minerala (Mo et Lian
2011). Silicijumska kiselina [Si(OH)4] dobijena je propuštanjem Na2SiO3 (Sigma-
Aldrich Chemie GmbH, Nemačka) kroz kolonu ispunjenu jon-izmenjivačkom smolom
(Amberlite IR-120, H+ form; Fluka, Buchs SG, Switzerland). Svi preparati silicijuma su
primenjeni u količini od 400 mg kg-1, što odgovara ekvivalentnoj količini od 1140 kg Si
ha-1. Svaki tretman je imao 4 ponavljanja. Eksperiment je trajao 4 nedelje.
3.3.2. Mehanizam delovanja silicijuma
3.3.2.1. Zemljište
Za proučavanje mehanizma delovanja Si na ublažavanje deficita P izabrano je
zemljište sa L2 lokacije sa obzirom na znatno niže koncentracije Cu i na izraženiji
deficit P (Tabele 2, 3 i 4). Usled različitog vremena uzrokovanja zemljišta sa ovog
lokaliteta, zemljište je sadržalo znatno niže koncentracije Al3+ u odnosu na zemljište
korišćeno u eksperimentu 1(Tabele 4 i 31).
Po tri klijanca pšenice su prebačena u svaki rizoboks ispunjen sa 0.6 kg
zemljišta. Eksperiment je uključio 3 tretmana:
1. Kontrola 1 (bez dodataka)
2. Kontrola 2 -dodatak mineralnog P (+P)
3. Dodatak Si (+Si)
Fosfor je primenjen u količini od 70 mg kg-1 (200 kg P ha-1) u obliku KH2PO4.
Silicijum je primenjen u obliku Na2SiO3 u količini od 400 mg kg-1 zemljišta (1140 mg
31
Si ha-1). Svaki tretman je imao 4 ponavljanja. Vlažnost zemljišta je održavana na 70 %
maksimalnog vodnog kapaciteta. Biljke su uzorkovane 25 dana nakon setve.
Određivani su sledeći parametri: biomasa nadzemnog dela i korena pšenice,
mineralni sastav pšenice i sadržaj mineralnih elemenata u zemljištu. Osim toga,
analiziran je i nivo ekspresije gena TaPHT1.1, TaPHT1.2, TaPEPC1, TaMATE1 i
TaALMT1. Eskudati korena su uzorkovani nakon pojave simptoma deficita P u
kontrolnim biljkama, u trajanju od 6 dana.
3.3.2.2. Hranljivi rastvor (hidroponi)
U cilju isključivanja svih ostalih faktora, osim fosfora, koji bi mogli uticati na
adaptivni odgovor pšenice postavljen je i eksperiment u hranljivim rastvorima. Na ovaj
način bilo je moguće pratiti uticaj silicijuma na efluks organskih anjona sa vršnih delova
korena u uslovima deficita P, bez mogućeg uticaja ostalih faktora koji bi mogli izazvati
efluks karboksilata, pre svega Al.
Pšenica je gajena u hranljivom rastvoru, sledećeg osnovnog sastava: 0.7mM K2SO4,
0.1mM KCl, 2.0mM Ca(NO3)2, 0.5mM MgSO4, 0.5 µM MnSO4, 0.5 µM ZnSO4, 0.2
µM CuSO4, 0.01 µM (NH4)6Mo7O24, 10 µM H3BO3, 80 µM Fe(III)DTPA. Po 12
klijanaca pšenice (dobijenih kako je opisano u sekciji 3.2) je prebačeno u svaku posudu
zapremine 3l.
Eksperiment je uključio dva tretmana: 1) sa niskim sadržajem (10 µM P) i 2) sa
optimalnim sadržajem (100 µM P) P dodatog u obliku KH2PO4. Svaki P tretman
ponaosob tretiran je Si u obliku ortosilicijumske kiseline [Si(OH)4] u koncentraciji od
1.5 mM (+Si) ili je bio bez dodatka ovog mineralnog elementa (-Si). Silicijumska
kiselina je dobijena propuštanjem vodenog stakla (Na2SiO3,Sigma-Aldrich Chemie
GmbH, Nemačka) kroz kolonu katjonske izmenjivačke smole (Amberlite IR-120, H+
form; Fluka, Buchs SG, Switzerland). Svaki tretman je imao 4 ponavljanja.
Trećeg dana od pojave simptoma deficita P, biljke su izvađene iz hranljivog
rastvora, i sakupljani su eksudati korena. Sa obzirom na to da sakupljanje eksudata
korena nije dovelo do oštećena korena, nakon sakupljanja eksudata, odvojeni su koren i
32
nadzemni deo biljke. Zatim su biljke osušene i izmerena je biomasa, nakon čega je
određen sadržaj P u korenu i nadzemnom delu biljke.
3.4. Analiza biljnog materijala
Nakon žetve, biljke su podeljene na koren i nadzemni deo i detaljno isprane
dejonizovanom vodom. Biomasa nadzemnog dela i korena izmerena je nakog sušenja
na 70°C u trajanju od 48 sati.
3.4.1. Analiza mineralnog sastava
Mineralni sastav nadzemnog dela pšenice određen je nakon digestije biljnog
materijala (0.2 g) u 3 ml koncentrovane HNO3 sa dodatkom 2 ml H2O2 u trajanju od 1
sata u mikrotalasnoj pećnici (Speedwave MWS-3+; Berghof Products + Instruments
GmbH, Eningen, Germany). Nakon digestije uzorci su prebačeni u normalne sudove, a
finalna zapremina uzorka je podešena dejonizovanom vodom na 25 ml. Koncentracija
elemenata je određena metodom optičke emisione spektroskopije sa indukovanom
spregnutom plazmom (ICP-OES; Spectro-Genesis EOP II, Spectro Analytical
Instruments GmbH, Kleve, Germany).
3.4.2. Sakupljanje eksudata korena
Na vršni deo korena (0-20mm) je stavljen navlažen filter papir, a zatim je koren
fiksiran između dva sloja plastične folije (Slika 6). Za sakupljanje eksudata korena
korišćeni su filter papiri za elektroforezu (10 x 5 mm; SERVA Electrophoresis GmbH,
Heidelberg, Germany) koji su predhodno isprani mešavinom etanola i dejonizovane
vode, a zatim osušeni na vazduhu. Da bi se sprečilo isušivanje korena, ostatak koji nije
obuhvaćen papirom za elektroforezu, prekriven je vlažnim filter papirom. Posle 1 sata
deo korena sa koga su sakupljani eksudati je isečen i izmeren. Papiri za elektroforezu sa
adsorbovnim eksudatima su ekstrahovani u mešavini metanol: dejonizovana voda (1:3),
33
centrifugirani, filtrirani kroz filter veličine 0.22µm i skladišteni na -80° pre HPLC
analize.
Slika 7. Sakupljanje eksudata korena
3.4.3. Određivanje organskih kiselina
Za razdvajanje organskih kiselina koriščen je HPLC sistem (Waters, Milford,
MA, USA), koji se sastoji od 1525 binarne pumpe, termostata i autosemplera,
povezanog na Waters 2996 diode array detector (DAD), podešen na 210 nm. Kao
mobilna faza korišćena je 5 mM H2PO4. Kao kolona je korišćena Aminex HPX-87H
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Identifikacija i kvanitifikacija organskih
kiselina urađena je na osnovu hromatograma, poređenjem sa odgovarajućim
standardima (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Za obradu podataka je korišćen
Empower 2 Software (Waters, Milford, MA, USA)
3.4.4. Molekularne analize
3.4.4.1. Izolovanje ukupne RNK i sinteza cDNK
RNK iz biljnog tkiva izolovana je korišćenem kita RNeasy® Mini Kit (Qiagen
GmbH, Hilden, Nemačka). 100 mg korena je zamrzavano u tečnom azotu i mleveno u
34
fini prah, a zatim rastvarano u 450 μL RLT pufera (sa dodatim 4,5 μL β-
merkaptoetanola). Nakon kratkog zagrevanja na 56ºC/2 min suspenzija je prebacivana u
Qia shreder kolonice i centrifugirana 2 min/13000 obr/min u cilju homogenizacije tkiva.
Supernatant je u novoj tubici mešan sa 250 μL etanola u cilju precipitacije RNK, a
zatim prebacivan u Qia kolonice i centrifugiran kratko, da bi se RNK vezala za
kolonicu. Vezana RNK je ispirana centrifugiranjem u puferu RW1 (700 μL) i dva puta u
puferu RPE koji sadrži etanol (2x500 μL). RNK ja eluirana u 50 μL "nuclease free"
vode. Sastavi pufera RLT, RW1 i RPE su zaštićeni od strane proizvođača.
Koncentracija RNK je određivana spektrofotometrijski, merenjem apsorbancije
na 260 nm, pri čemu jedna optička jedinica odgovara koncentraciji RNK od 40 μg/ml.
RNK je čuvana na -70ºC.
Kitom RNAeasy (Qiagen) izoluje se samo RNK, ali je česta pojava zaostatka
malih količina genomske DNK. Stoga je pre cDNK sinteze kontaminacija gDNA
uklanjana iz RNK uzoraka upotrebom kita DNA-free Dnase Treatment and Removal
Reagents (Ambion). U potpunosti je poštovano uputstvo proizvođača.
Za sintezu prvog lanca korišćen je 1 μg RNK. Sinteza je izvršena korišćenjem
reverzne transkriptaze M-MuLV (Fermentas) i odgovarajućeg pufera preporučenog od
strane istog proizvođača. 1 µg RNK inkubirano je sa 10 µM “random hexamer“
prajmera (Applied Biosystems), 2 min na 70ºC. Smeša je zatim prebacivana na led 2
min i potom kratko centrifugirana. Dodat je 1 μL10X M-MuVL pufera pH 8.3 (250 mM
Tris-HCl, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2 50 mM ditiotreitol) (BioLabs), 1μL 10 mM
dNTP smeše i 200 U M-MuLV reverzne transkriptaze (Biolabs), i "nuclease free" voda
po potrebi do finalne zapremine od 10 μL. Reakcija je tekla 1 h 30 min na temperaturi
od 37ºC, a potom je zaustavljena inkubiranjem na 75ºC/ 10 min.
3.4.4.2. Analiza ekspresije izabranih gena
Pre izvođenja Real-time PCR analize sve dobijene cDNK prvo su proveravane
običnom RT-PCR metodom. Uzorci cDNA dobijeni kao što je opisano u odeljku 3.4.4
su razblaženi 5 puta u „nuclease-free” vodi. Reakciona smeša PCR (25 μL) sadržavala
je: 1 μl razblažene cDNK, 0,4 μM svakog od prajmera, 0,2 mM dNTP smeše (0,2 mM
35
svakog dNTP), 2,5 mM MgCl2, pufer (50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,8; 0,08%
Nonidet P40) i 0,04 U/μL enzima Taq polimeraze (Fermentas).
Temperaturni profil reakcije (po 30 ciklusa): inicijalna denaturacija (95ºC/3
min); denaturacija (95°C/ 20 s); aniling (60°C/ 30 s); ekstenzija (72°C/ 1 min); finalna
ekstenzija (72°C/ 10 min).
Uzorci cDNA su rastvoreni u odnosu 1:25 u ”nuclease-free” vodi. Isti alikvoti
cDNK uzoraka su korišćeni za Real-time PCR sa prajmerima dizajniranim i za gen od
interesa i za aktin pšenice kao endogenu kontrolu. Reakcije su izvođene u zapremini od
25 µL i sadržavale su 0,4 μM svakog od prajmera, 1x SYBER Green PCR master mix
(Applied Biosystems) i 5 μL 25x razblažene cDNK matrice. Real-time PCR je izveden
na aparatu ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystem) i to pri
parametrima preporučenim od strane proizvođača (2 minuta na 50oC, 10 minuta na 95oC
i 40 ciklusa 95oC 15 sekundi i 60oC 1 min). Svaka PCR reakcija je rađena u triplikatu, a
u eksperiment su kao negativne kontrole bile uključene reakcije koje nisu sadržavale
matricu. Rezultati su analizirani pomoću 7500 System Software (Applied Biosystems)
programa i normalizovani su kao 2−ΔCt, gde je ΔCt razlika između Ct vrednosti
ispitivanog gena i referentnog gena. Serijska razblaženja cDNK po dva puta korišćena
su za standardnu krivu pri čemu je izračunata efikasnost za sve korišćene prajmere bila
oko 1.9, za aktinske prajmere 2,05 (2 odgovara efikasnosti 100%).
Tabela 1. Prajmeri korišćeni za Real-time PCR.
Gen Sekvenca Pristupni broj
TaPHT1.2 5’-CATCCTCATGGTCCTCTGCT-3’ AJ344240
5’- GTGGCGCTCAGAGGATAGTC-3’
TaPHT1.1 5’-CATCCTCATGGTCCTCTGCT-3’ AF110180
5’-GTGGCGCTCAGAGGATAGTC -3’
TaALMT1 5’-TGTTGCAAGTGATGCATGTG-3 AB081803
5’-ATAACCACGTCAGGCAAAGG-3’
TaMATE1 5’-GATTGCCGCGACCTCTCGTGTT-3’ KF527240
5’-GATGCCGTCGAACACGAACG-3’
TaPEPC1 5’- TGTTGCAAGTGATGCATGTG-3’ AJ007705
5’- GCTGAGTGAGGCTAGGATGG-3
36
3.5. Analiza zemljišta Okolno “balk” zemljište je pažljivo odvojeno od rizosfernog blagim otresanjem
sa korena. Zemljište koje je ostalo prilepljeno na korenu (rizosferno zemljište)
sakupljeno je korišćenjem finih četkica predhodno ispranih destilovanom vodom. Pre
izvođenja analiza obe frakcije zemljišta su osušene na vazduhu u trajanju od 48 sati.
3.5.1. Određivanje pH vrednosti zemljišta
Aktivna kiselost je određena u destilovanoj vodi u odnosu zemljište : voda od
1:2.5, a supstituciona kiselost je određena u 1M KCl u istom odnosu.
3.5.2. Određivanje sadržaja dostupnog fosfora
Sadržaj dostupnog P je određen po amonijum-laktatnoj (AL) metodi (Egner et
al. 1960). Sprašeno zemljište (2.5 g) je ekstahovano u rastvoru amonijum acetata i
amomijum laktata, podešenom na pH 3.7, mućkanjem tokom 2.5 h. Zatim je uzet
alikvot od 5 ml i prebačen u epruvete. U svaki uzorak je dodato 7.5 ml rastvora
amonijum molibdata u sumpornoj kiselini i 0.5 ml rastvora SnCl2 kao reduktanta za
razvijanje plavog kompleksa u toku 30 minutne inkubacije u tami. Koncentracija P je
izmerena kolorimetijski na talasnoj dužini od 580 nm.
3.5.3. Frakciona analiza neogranskog fosfora
Za određivanje sadržaja frakcija neorganskog P korišćena je metoda opisana u
Chang et Jackson (1957). Homogenizovano zemljište (1g) podvrgnuto je serijskim
ekstracijama u različitim ekstrakcionim rastvorima prema sledećoj shemi: I faza (30min):
H2O
rastvorljivi P
II faza
(1 h):
Al-P
III faza
(17 h):
Fe-P
IV faza (15 min):
Reduktibilan
P
V faza (1 h):
Okludovani
P
VI faza
(1 h):
Ca-P
1M NH4Cl 0.5 M NH4F
(pH 8.2) 0.1 M NaOH
0.3 M Na-citrat
+1g Na-ditionit 0.1 M NaOH 0.25M H2SO4
Između svake faze uzorak je bio ispiran zasićenim rastvorom NaCl.
Koncentracija P u različitim ekstrakcionim rastvorima određena je pomoću ICP-OES.
37
3.5.4. Određivanje sadržaja dostupnih mineralnih elemenata
Dostupni elementi su ekstrahovani u rastvoru DTPA-TEA, podešenom na pH
7.3, koristeći odnos zemljište : rastvor 1:2. Koncentracija različitih mineralnih
elemenata (Cu, Zn, Mn, Fe, Mo, Ni, Cr, Pb) je određena pomoću ICP-OES.
3.5.5. Određivanje sadržaja izmenjivog alumijuma
Izmenjivi aluminijum je ekstahovan u 1 M rastvoru KCl, a koncentracija Al je
izmerena pomoću ICP-OES.
3.5.6. Određivanje sadržaja dostupnog silicijuma
Usitnjeno zemljište (10 g) je ekstrahovano u 0.02 M CaCl2 na horizontalnoj
mućkalici u trajanju od 17 sati. Koncentracija dostupnog Si je određena pomoću ICP-
OES.
3.5.7. Određivanje ukupnog sadržaja mineralnih elemenata
Ukupan sadržaj mineralnih elemenata određen je mikrotalasnom digestijom 0.2g
homogenizovanog suvog zemljišta uz dodatak 3 ml koncentrovane HNO3 i 2 ml 30%
H2O2. Posle digestije uzorci su razblaženi do određene zapremine dejonizovanom
vodom, i podvrgnuti multielementarnoj analizi ICP-OES.
3.6. Statistička obrada podataka Za statističku obradu podataka korišćeni su one-way ANOVA i Pirsonov
koeficijent korelacije u okviru programa STATISTICA 6 (StatSoft Inc., Tulsa, OK,
USA). Za grafički prikaz podataka korišćen je softver Sigma Plot for Windows, version
12 (Systat Software Inc., Erkrath, Germany).
38
4. REZULTATI
4.1. Ograničavajući faktori za rastenje pšenice na zemljištima
oštećenim kiselom rudničkom jalovinom
Pre zasejavanja pšenice određen je mineralni sastav zemljišta u cilju utvrđivanja
ograničavajućih faktora rastenja i razvića pšenice u ovakvim zemljištima. Analiza
osnovnih parametara plodnosti zemljišta pokazala je da su glavni ograničavajući faktori
kisela pH reakcija zemljišta, nedovoljna obezbeđenost zemljišta dostupnim P (Tabela 2)
i visoke koncentracije Al i Cu (Tabele 3 i 4).
Tabela 2. Glavne fizičko-hemijske osobine zemljišta L1 i L2 korišćenih za eksperiment Parametri L1 L2 pH (H2O) 3.9±0.4 3.4±0.3 pH (KCl) 3.4±0.1 2.7±0.2 Ukupni N (%) 0.10±0.01 0.032±0.002 C organski (%) 0.74±0.08 0.145±0.01 Dostupni PAL (mg kg-1) 3.7±0.2 1.8±0.2 Dostupni KAL (mg kg-1) 81±7 91±11 CaCO3 (%) <0.01 <0.01 Tekstura Ilovača Peskovita ilovača
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Oba zemljišta spadaju u kategoriju jako kiselih zemljišta, što je daleko ispod
optimalne vrednosti (pH između 6 i 7) za gajenje pšenice. Koncentracija dostupnog P
iznosila je svega 3.75 na L1 i 1.83 mg kg-1 na L2 zemljištu, što je nekoliko puta manje
od optimalne koncentracije P (za AL-metodu: 44-88 mg P kg-1 zemljišta; Egner et al.
1960).
Tabela 3. Koncentracije mikroelemenata u zemljištima korišćenim za eksperiment 1
Mikroelementi Dostupni (DTPA) Ukupni (kuvanje u HNO3) L1 L2
Cu (mg kg-1) 324±32 3.1±0.2 880±98 38±3 Zn (mg kg-1) 14±2 0.09±0.03 65±6 5.0±0.4 Mn (mg kg-1) 26±3 0.41±0.03 185±12 25±2 Fe (mg kg -1) 168±16 115±12 43700±4500 44690±3270 Ni (mg kg-1) 0.35±0.02 0.04±0.01 11±1 1.0±0.01 Mo (mg kg-1) <0.002 <0.002 2.9±0.1 1.7±0.2
Rezultati predstavljaju prosečnu vrednost 4 ponavljanja ± STDEV.
39
Analizom dostupnosti mikroelemenata u rastvoru DTPA konstatovano je da su
koncentracije Cu daleko iznad granica toksičnosti (Tabela 3, Fageria 2001). Pored toga,
na L1 zemljištu i koncentracije Zn se mogu smatrati toksičnim, dok je na L2 zemljištu
dostupnost Zn veoma organičena. Pored toksičnosti mikroelemenata, visoke
koncentracije izmenjivog Al i ukupnog As (Tabela 4) takođe mogu negativno uticati na
rastenje pšenice. Koncentracije teških metala kao što su Ni, Cr, Cd i Co bile su u okviru
graničnih vredosti (Službeni glasnik RS 2010).
Tabela 4. Koncentracije potencijalno toksičnih elemenata na L1 i L2 zemljištu
Mineralni elementi
L1 L2
Izmenjivi AlKCl (mg kg-1) 76±9 200±41 Ukupni As (mg kg-1) 71±7 54±8 Ukupni Pb (mg kg-1) 57±3 41.2±2.4 Dostupni PbDTPA (mg kg-1) 24±2 0.02±0.01 Ukupni Cr (mg kg-1) 17±1 8.6±0.54 Dostupni CrDTPA (mg kg-1) 0.27±0.02 0.06±0.01 Ukupni Cd (mg kg-1) 0.68±0.01 0.004±0.001 Dostupni CdDTPA (mg kg-1) 0.32±0.01 0.04±0.01 Ukupni Co (mg kg-1) 6.4±0.2 1.3±0.3 Dostupni CoDTPA (mg kg-1) 0.63±0.08 0.005±0.001
Rezultati predstavljaju prosečnu vrednost 4 ponavljanja ± STDEV Koncentracije ukupnog As su u oba zemljišta iznad vrednosti koje zahtevaju
preduzimanje mera remedijacije (Službeni glasnik RS 2010). Pored toga, u L1 zemljištu
je i koncentracija ukupnog Cu iznad granice remedijacione vrednosti (Službeni glasnik
RS 2010).
4.2. Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta oštećenih kiselom
rudničkom jalovinom na procese u rizosferi pšenice U cilju proučavanja uticaja standardnih mera popravke zemljišta na rizosferne
procese, rastenje i adaptacije pšenice na zemljištima oštećenim kiselom rudničkom
jalovinom izveden je eksperiment na dva zemljišta različitog stepena oštećenja (L1 i L2,
videti sekciju 3.2.1). Kao mere popravke korišćeni su: kreč (CaCO3) (kalcizacija),
organska (stajnjak) i mineralna (NPK) đubriva, kao i njihove kombinacije (za detaljan
prikaz eksperimenta videti sekciju 3.2.2).
40
4.2.1. Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta na rastenje pšenice
Po završetku eksperimenta (25-og dana nakon setve), kada su znaci oštećenja na
biljkama bili jasno vidljivi, izmereni su parametri rastenja pšenice: suva biomasa
nadzemnog dela i korena i izračunat je relativni odnos biomase korena prema
nadzemnom delu.
Inhibicija rastenja, kako nadzemnog dela tako i korena, bila je jasno uočljiva u
kontrolnim tretmanima na oba zemljišta (Tabele 5 i 6). Pored toga, korenovi su bili
tamne, braonkaste boje, dok je rast bočnih korenova bio inhibiran ukazujući na
rizotoksični efekat Cu i Al. Sve mere popravke zemljišta značajno su povećale biomasu
kako nadzemnog dela, tako i korena pšenice, a uticale su i na alokaciju biomase između
korena i nadzemnog dela (Tabele 5 i 6). Kalcizacija kiselog zemljišta oštećenog
rudničkom jalovinom se pokazala kao efikasna mera poboljšanja rastenja pšenice.
Očekivano, dodatno poboljšanje P statusa (primenom stajnjaka ili NPK đubriva)
pospešilo je rastenje pšenice još više (Tabele 5 i 6).
Tabela 5. Uticaj mera popravke L1 zemljišta na rastenje pšenice.
Tretmani Biomasa
nadzemnog dela (mg)
Biomasa korena (mg)
Odnos biomase korena/ biomase nadzemnog dela
Kontrola 19±1a 3.5±1.2a 0.19±0.07a Stajnjak 46.7±11.5b 6.1±2.2b 0.13±0.02a NPK 41.0±3.1b 6.3±0.8b 0.15±0.03a CaCO3 383±15c 404±67e 1.13±0.02d Stajnjak+ CaCO3 600±66d 317±99d 0.52±0.09c NPK+CaCO3 703±41d 187±57c 0.29±0.09b
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05.
Tabela 6. Uticaj mera popravke L2 zemljišta na rastenje pšenice.
Tretmani Biomasa
nadzemnog dela (mg)
Biomasa korena
(mg)
Odnos biomase korena/ biomase nadzemnog dela
Kontrola 16.00±1.15a 2.50±0.10a 0.16±0.01a Stajnjak 35.33±0.55b 19.93±6.5b 0.46±0.17bc NPK 30.77±3.90b 10.23±1.79c 0.34±0.09ab CaCO3 102±32c 64±27e 0.69±0.08c Stajnjak+CaCO3 210±52d 48±9bd 0.24±0.04a NPK+CaCO3 266±40d 74±13e 0.28±0.06a
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05.
41
Na L1 zemljištu primena NPK đubriva i stajnjaka bez istovremene korekcije pH
vrednosti povećala je biomasu nadzemnog dela pšenice više od 2 puta, dok je
kalcizacija povećala biomasu nadzemnog dela oko 20 puta (Tabela 5). U skladu sa
očekivanjima, korekcija pH vrednosti uz istovremenu eliminaciju deficita P pokazala je
najbolje rezultate. Kombinovano unošenje stajnjaka i kreča povećalo je rast nadzemnog
dela pšenice oko 30 puta, dok je dodatak NPK đubriva povećao biomasu nadzemnog
dela 35 puta (Tabela 5). Rast korena je takođe bio značajno popravljen svim
agrotehničnim merama (Tabela 5). Primena P (kroz stajnjak i NPK) je povećala suvu
biomasu korena 2 puta, dok je korekcijom pH vrednosti biomasa korena bila uvećana
100 puta. Sa druge strane, sasvim očekivano, primena kalcijum-karbonata zajedno sa
stajnjakom povećala je rast korena 90 puta, a primena sa NPK đubrivom 53 puta.
Primenjenje mere popravke su uticale na odnos biomase korena prema nadzemnom delu
tek nakon korekcije pH vrednosti (Tabela 5). Ni stajnjak ni NPK đubrivo ponaosob nisu
u velikoj meri uticali na ovaj odnos, verovatno usled redukcije rasta korena delovanjem
Al i Cu. Sa druge strane, kada je pH korigovana dodavanjem kreča (videti Tabelu 10)
dolazi do značajnog porasta ovog odnosa, više od 10 puta u poređenju sa kontrolnim
tretmanom (Tabela 5). Daleko najveće povećanje odnosa biomase korena prema
nadzemnom delu jasno ukazuje na postojanje deficita fosfora u ovim biljkama.
Slični efekti su zabeleženi i na L2 zemljištu (Tabela 6). Primena stajnjaka
povećala je biomasu pšenice 2.1 puta, a NPK đubriva 1.8 puta. Efekat kalcizacije je bio
nešto slabiji u odnosu na efekat na L1 zemljištu povećavajući biomasu nadzemnog dela
6 puta. Istovremena korekcija pH vrednosti i poboljšanje statusa P je najviše
promovisala rast nadzemnog dela povećavajući biomasu 13 puta, nezavisno od toga da
li je fosfor bio primenjen u organskom ili neorganskom obliku. Rast korena je takođe
poboljšan u svim tretmanima. Primena stajnjaka je povećala rast korena 8 puta, a NPK
đubriva 5 puta. U tretmanu sa dodatkom kreča biomasa korena je bila 25 puta veća.
Primena kreča sa stajnjakom je povećala biomasu korena 19 puta, dok je kombinacija sa
NPK povećala biomasu korena 29 puta. Odnos biomase korena prema nadzemnom delu
je povećan svim merama, pri čemu je najveći efekat imao kreč, povećavajući ovaj odnos
više od 5 puta.
42
Generalno, biomasa pšenice kako nadzemnog dela tako i korena bila je veća na
L1 zemljištu u poređenju sa L2 (Tabele 5 i 6). I ako su sve primenjene mere značajno
povećale biomasu pšenice, efikasnost primenjenih metoda popravke zemljišta je bila
veća na L1 zemljištu. Ovo je bilo naročito izraženo u tretmanima sa primenjenim
CaCO3 gde je porast pšenice bio najmanje duplo veći na L1 zemljištu. Korekcijom pH
vrednosti, tj. eliminacijom toksičnih efekata Al i Cu (videti Tabele 10 i 11), deficit
hraniva, a posebno P postaje glavni ograničavajući faktor za rastenje pšenice. Primer
razlike porasta pšenice prikazan je na Slici 8.
J
STAJNJ
B1 B2L1 L2
STAJNJAK
L1 L2 L1 L2
STAJNJAK NPK CaCO3
a b c
Slika 8. Razlike u porastu pšenice na dva zemjišta različito oštećena rudničkom
jalovinom (L1 i L2) tretiranih stajnjakom (a), NPK đubrivom (b) i krečom (CaCO3) (c).
4.2.2. Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta na mineralni sastav pšenice
4.2.2.1. Makroelementi Vizuelni znaci nedostaka P (ljubičasta obojenost lista; Slika 9a) bili su uočljivi
na pšenici gajenoj u svim tretmanima bez istovremene primene kalcizacije i dodatnih
đubriva. Osim simptoma na listovima simptomi deficita P su bili jasno uočljivi i na
korenu pšenice, pre svega u vidu razvoja korenskih dlačica (Slika 9b).
43
Slika 9. Simptomi nedostatka P na listu (a) i korenu (b) pšenice.
Ukupna količina fosfora u nadzemnom delu pšenice je varirala značajno u
zavisnosti od primenjenih mera, ali i od samog tipa zemljišta (Slika 10).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
1
2
468
101214
Količ
ina
P(m
g po
biljc
i)
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
1
25
6
7
ab
b
c
d d
a
bb
b
c
c
ba
Količ
ina
P(m
g po
biljc
i)
Slika 10. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta na količinu P akumuliranog u nadzemnom delu pšenice gajene na zemljištima L1(a) i L2 (b). Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Na L1 zemljištu bez dodatne kalcizacije, primena stajnjaka je povećala količinu
P u pšenici za oko 50 %, a NPK đubriva za 100 % (Slika 10a). Na istom zemljištu,
kalcizacija je povećala količinu P u pšenici za više od 600%. Pšenica je akumulirala
44
najveću količinu P u nadzemnom delu u kombinovanim tretmanima istovremene
kalcizacije i dodatnog izvora P, nezavisno od toga da li je bilo primenjeno organsko
đubrivo ili mineralni fosfor. Količina P u nadzemnom delu je u velikoj meri uticala na
rastenje pšenice, pokazujući jaku korelaciju sa biomasom nadzemnog dela (r=0.992;
p<0.05; Pirsonov koeficijent korelacije).
Na L2 zemljištu primena stajnjaka, NPK đubriva ili kreča je na sličan način
uticala na sadržaj P u pšenici, povećavajući količinu fosfora za oko 50 % (Slika 10b).
Deleko najviše fosfora pšenica je akumulirala u tretmanima sa istovremenom
korekcijom pH vrednosti i dodatnim unosom đubriva. Takođe, u L2 zemljištu rastenje
pšenice (suva biomasa nadzemnog dela) bilo je uslovljeno količinom akumuliranog P
(r=0.890; p< 0.05).
Akumulacija P u nadzemnom delu pšenice zavisila je od povećanja dostupnosti
P u rizosferi (videti Tabelu 20).
Iako su primenjene mere donekle uticale na povećanje koncentracija K i Ca u
nadzemnom delu (Tabela 7), koncentracije ovih elemenata su i dalje bile na nivou
slabije obezbeđenosti, dok su koncentracije Mg i S varirale u okviru optimalnih
vrednosti za pšenicu (Bergmann 1992).
Tabela 7. Uticaj mera popravke zemljišta L1 i L2 na koncentraciju makroelemenata u nadzemnom delu pšenice.
Tretmani P (%)
K (%)
Ca (%)
Mg (%)
S (%)
Zemljište L1 Kontrola 0.49±0.01c 0.51±0.10a 0.89±0.12a 0.27±0.04a 0.60±0.02bc Stajnjak 0.29±0.06bc 0.81±0.26b 1.03±0.202 0.46±0.13b 0.64±0.25c NPK 0.40±0.06c 0.77±0.15b 0.98±0.15a 0.26±0.06a 0.34±0.10ab CaCO3 0.12±0.02a 1.39±0.08c 2.17±0.29b 0.14±0.02a 0.24±0.05a Stajnjak+ CaCO3 0.17±0.02a 1.20±0.09c 3.34±1.01c 0.17±0.03a 0.26±0.02a NPK+CaCO3 0.14±0.01a 1.24±0.16c 2.26±0.44b 0.14±0.01a 0.26±0.03a
Zemljište L2 Kontrola 0.48±0.03e 0.38±0.02a 0.43±0.01a 0.25±0.01bc 0.87±0.11b Stajnjak 0.38±0.06de 0.36±0.06a 0.65±0.10a 0.36±0.10cd 1.00±0.15b NPK 0.33±0.01d 0.53±0.14ab 0.58±0.10a 0.22±0.04ab 1.11±0.24b CaCO3 0.13±0.01a 0.64±0.08b 1.25±0.28b 0.17±0.01ab 0.49±0.14a Stajnjak+ CaCO3 0.20±0.01b 0.70±0.13b 1.11±0.10b 0.41±0.03d 0.26±0.04a NPK+CaCO3 0.28±0.03b 0.86±0.16b 1.19±0.24b 0.14±0.03a 0.36±0.11a
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
45
Na L1 zemljištu koncentracija K u nadzemnom delu povećana je u svim
tretmanima u odnosu na kontrolu, pri čemu je najveće povećanje koncentracije K (oko
2.5 puta) zabeleženo kod tretmana CaCO3, nezavisno od toga da li je bio primenjen sam
ili u kombinaciji sa drugim đubrivima (organskim ili mineralnim) (Tabela 7). Unos
stajnjaka i NPK đubriva, bez korekcije pH doveli su do povećanja koncentracije K 1.7
puta. Koncentracija Mg u nadzemnom delu pšenice kretala se u okviru optimalnih
vrednosti za tu kulturu (Bergmann 1992), pri čemu primenjene mere popravke zemljišta
nisu imale značajan uticaj na koncentraciju ovog makroelementa. Primena kreča dovela
je do povećanja koncentracije Ca u pšenici oko 2 puta u odnosu na kontrolu.
Sa druge strane, primena stajnjaka na L2 zemljištu nije značajno uticala na
promenu koncentracije K u pšenici u odnosu na kontrolu, dok je primena NPK đubriva
dovela do povećanja koncentracije K oko 1.4 puta (Tabela 7). Primena kreča na L2
zemljištu dovela je povećanja koncentracije Ca u pšenici, dok primena NPK i stajnjaka
nije značajno uticala na koncentraciju Ca u pšenici.
Na oba zemljišta (L1 i L2) primena organskih i mineralnih đubriva u
kombinaciji sa krečom dovela je do smanjenja koncentracije S u nadzemnom delu
pšenice za oko 2 puta, dok ostale mere nisu uticale na koncentraciju S u biljci (Tabela
7).
Paradoksalno, koncentracija P u nadzemnom delu pšenice je na oba zemljišta
bila najveća u kontrolnim tretmanima, i čak se smanjila sa porastom dostupnosti P u
rizosferi (Tabela 7, videti Tabelu 20). Međutim, ovo smanjenje koncentracije P nije
posledica smanjenog usvajanja P, već je pre svega posledica efekta koncentracije usled
inhibiranog rastenja pšenice u kontrolnim tretmanima (Talele 5 i 6).
4.2.2.2. Mikroelementi
Sadržaj mikroelemenata u pšenici zavisio je kako od primenjenih tretmana, tako
i od tipa zemljišta (Slike 11-14,Tabela 8).
Koncentracija Cu u nadzemnom delu pšenice u kontrolama na oba zemljišta (L1
i L2) bila je nekoliko puta veća od optimalnog opsega (Slika 11; 7-15 mg kg-1,
Bergmann 1992). Osim toga, inhibiran rast i tamna obojenost korenova u kontrolnim
46
tretmanima ukazuje na postojanje fitotoksičnosti bakra. Korekcija pH vrednosti (i
smanjenje dostupnosti Cu rizosferi, videti tabelu 10, 16 i 18) unošenjem kreča se
pokazala kao vrlo efikasna mera redukcije fitotoksičnosti Cu.
Na L1 zemljištu kalcizacija per se ili u kombinaciji sa organskim i mineralnim
đubrivima dovela je do smanjenja koncentracije Cu (35 puta) do optimalnog nivoa za
biljku (Slika 11a). Pojedinačna primena stajnjaka ili mineralnog P (NPK đubrivo) nije
značajno uticala na koncentraciju Cu u pšenici. Na fitotoksičnost Cu ukazuje i jaka
negativna korelacija između sadržaja Cu u pšenici i akumulirane biomase (r=-0.750;
p<0.05; Pirsonov koeficijent korelacije).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
10
20
80120
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
01020304050
10002000
aa
a
c
b bd
b
c
aa
ab
a bK
once
ntra
cija
Cu
(mg
kg-1
suve
mas
e)
Kon
cent
raci
ja C
u (m
g kg
-1su
ve m
ase)
Slika 11. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L1 (a) i L2 (b) na koncentraciju Cu u nadzemnom delu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Na L2 zemljištu, osim popravke pH vrednosti (kalcizacija), unošenje stajnjaka
(organske materije) se takođe pokazalo kao efikasna mera smanjenja sadržaja Cu u
nadzemnom delu pšenice (Slika 11b). U poređenju sa kontrolom, tretman stajnjakom je
doveo do smanjenja koncentracije Cu u nadzemnom delu pšenice više od 5 puta.
Međutim, kalcizacija je i na ovom zemljištu bila najefikasnija mera redukcije
fitotoksičnih koncentracija usvojenog Cu. Međuzavisnost biomase nadzemnog dela i
sadržaja Cu u biljci je uočena i na ovom tipu zemljišta (Pirsonov koeficijent korelacije:
r=-0.947; p< 0.05).
47
Koncentracija Zn u nadzemnom delu pšenice prvenstveno je zavisila od tipa
zemljišta (Slika 12). U kontrolnim biljkama gajenim na L1 zemljištu zabeležena je
visoka koncentracija Zn, koja je za pšenicu u opsegu fitotoksičnosti (150-200 mg kg-1
suve materije, Saurbeck 1982), dok je kod kontrolnih biljaka na L2 zemljištu
koncentracija Zn bila u opsegu optimalnih vrednosti (35-100 mg kg-1 suve mase,
Bergmann 1992). Na oba zemljišta koncentracija Zn u biljci prati koncentraciju
dostupnog Zn u rizosferi (videti Tabele 16 i 18).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnja
k+Ca
CO3
NPK+
CaCO
3
010203040
200300400 b
b b
aaa
Kont
rola
Stajn
jak
NPK
CaCO
3St
ajnja
k+Ca
CO3
NPK+
CaCO
3
0
20
40
60
80
100
120
b
aaa
b
c
Konc
entra
cija
Zn
(mg
kg-1
suv
e m
ase)
Konc
entra
cija
Zn
(mg
kg-1
suv
e m
ase)
a b
Slika 12. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L1 (a) i L2 (b) na koncentraciju Zn u nadzemnom delu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Primenjene mere popravke zemljišta su modifikovale koncentraciju Zn u
nadzemnom delu pšenice, pri čemu je unos kreča (kalcizacija) doveo do smanjenja
koncentracija Zn do optimalnog nivoa, nezavisno od toga da li je CaCO3 bio primenjen
sam ili u kombinaciji sa drugim đubrivima (Slika 12a). Međutim, ni u ovom slučaju
koncentracioni efekat usled inhibiranog rastenja pšenice ne može biti zanemaren, pa je
tako moguće da je povećana koncentracija Zn u kontrolnim biljkama bila samo artefakt
bez fitotoksičnog efekta ovog mikroelementa.
Na L2 zemljištu primena organskih i mineralnih đubriva u kombinaciji sa
krečom je takođe dovela do značajnog smanjenja koncentracije Zn u pšenici (Slika
12b). Međutim, pojedinačna primena kreča je čak snizila koncentraciju Zn do 15 mg kg1
što se može smatrati deficitom (Boehle et Lindsay 1969; Bergmann 1992). Na moguće
48
postojanje deficita Zn ukazuje i jaka negativna korelacija između sadržaja Zn u pšenici i
suve mase nadzemnog dela (r=-0.748; p< 0.05).
Koncentracije Mn se takođe značajno razlikuju kod pšenice u odnosu na tip
zemljišta i primenjeni tretman (Slika 13).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
050
100150200500
600 b bb
aa a
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
02468
1050
100b
c
a
b
a
a
Kon
cent
raci
ja M
n (m
g kg
-1 s
uve
mas
e)
Kon
cent
raci
ja M
n (m
g kg
-1 s
uve
mas
e)
a b
Slika 13. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L1 (a) i L2 (b) na koncentraciju Mn u nadzemnom delu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Na L1 zemljištu koncentracija mangana u nadzemnom delu biljke iznosi oko
500 mg kg-1 suve mase što može predstavljati toksične koncentracije (Slika 13a).
Međutim, slično kao i za Zn ovakva akumulacija Mn u kontrolnim biljkama može biti
posledica jake inhibicije rastenja pšenice, bez negativnog uticaja Mn na fiziološke
procese. Na L1 zemljištu koncentracija Mn u nadzemnom delu pšenice prati
koncentraciju dostupnog Mn u zemljištu (r=0.933; p<0.05, Slika 13a, vidi Tabelu 16).
Tretmani krečom su snizili koncentraciju Mn u pšenici na optimalan nivo (133±25 mg
kg-1).
Na L2 zemljištu, u kontrolnoj pšenici koncentracija Mn iznosi 56 mg kg-1 suve
mase što je optimalni nivo (37-116 mg kg-1; Wilhelm et al. 1990). Na ovom zemljištu
primena kreča je takođe dovela do snižavanja koncentracije Mn u nadzemnom delu
pšenice (u proseku 10 puta, čak do nivoa deficita; Wilhelm et al. 1990) bez obzira na
primenu druga dva đubriva (Slika 13b). I na L2 zemljištu koncentracija Mn u
nadzemnom delu pšenice korelira sa koncentracijom dostupnog Mn u zemljištu
49
(r=0.905; p<0.05, Videti Tabelu 18). Slično Zn (Slika 12b), primena stajnjaka povećala
je sadržaj Mn u pšenici za oko 60%.
Na oba zemljišta (L1 i L2) sadržaj Fe u nadzemnom delu pšenice kretao se u
granicama optimalnih vrednosti (>35 mg kg-1), osim u tretmanima sa krečom gde su
koncentracije Fe ukazivale na deficit ovog mikroelementa (Slika 14), ali bez vidljivih
simptoma Fe-hloroze na listovima (videti Slike 7 i 8). Ovaj fenomen je dobro opisan u
literaturi kao paradoks hloroze i objašnjava se manjom zastupljenošću Fe u suvoj masi,
odnosno većim razblaženjem Fe u tkivima lista kod biljaka koje intenzivno rastu, a sa
druge strane pojavom efekta koncentracije usled inhibiranog rastenja (Römheld 2000;
Nikolic et Römheld 2002).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
20
40
60
80
100
120
b
a
b
c
aa
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
50
100
150
200c
b
b
ab
aab
Kon
cent
raci
ja F
e (m
g kg
-1 s
uve
mas
e)
Kon
cent
raci
ja F
e (m
g kg
-1 s
uve
mas
e)a b
Slika 14. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L1 (a) i L2 (b) na koncentraciju Fe u nadzemnom delu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Na L1 zemljištu sve primenjene mere popravke zemljišta dovele su do
smanjivanja koncentracije Fe u pšenici (Slika 14a). Primena đubriva koja su sadržala
kreč dovela je do smanjenja koncentracije Fe oko 7 puta, dok su primena stajnjaka i
NPK đubriva redukovale koncentraciju Fe u nadzemnom delu pšenice oko 2 puta (Slika
14a).
Na L2 zemljištu sve primenjene mere popravke dovele su do smanjenja
koncentracije Fe u pšenici, pri čemu je najveće smanjenje bilo u kombinovanim
50
tretmanima koji su akumulirali i najviše biomase (Slika 14b, Tabela 6). Ovakvi rezultati
dodatno ukazuju na moguće postojanje efekta koncentracije.
Koncentracija Mo u nadzemnom delu pšenice (Tabela 8) na oba zemljišta (L1 i
L2) kretala se u opsegu optimalnih koncentracija (0.09-0.30 mg kg-1, Gupta 1971;
Bergmann 1992). Na L1 zemljištu tretmani sa dodatkom CaCO3 su smanjili
koncentraciju Mo u pšenici oko 6 puta, skoro na nivo deficita (Tabela 8; Mills at Jones
1996 ). Nasuprot tome, na L2 zemljištu tretmani koji su sadržali kreč nisu uticali na
koncentraciju Mo u pšenici, a primena stajnjaka i NPK đubriva je povećala
koncentraciju Mo u pšenici oko 2 puta (Tabela 8).
Koncentracija Ni u pšenici kretala se u optimalnom opsegu (Brown et al. 1987).
Primena đubriva sa krečom na L1 zemljištu je snizila koncentraciju Ni u pšenici, a
primena stajnjaka u kombinaciji sa krečom nije uticala na koncentraciju Ni (Tabela 8).
Na L2 zemljištu nijedna primenjena metoda popravke zemljišta nije uticala na
koncentraciju Ni u pšenici.
Tabela 8. Efekat mera popravke zemljišta L1 i L2 na koncentracije Mo i Ni u nadzemnom delu pšenice.
Ni (mg kg-1)
Mo (mg kg-1)
L1 L2 L1 L2 Kontrola 16±1c 0.78±0.01b 0.90±0.58c 0.37±0.09b Stajnjak 22±7c 1.30±0.12b 0.50±0.08b 0.75±0.18c NPK 26±3c 1.56±0.47b 0.51±0.10b 0.66±0.10c CaCO3 0.43±0.27b 0.52±0.06a 0.15±0.00a 0.38±0.08b Stajnjak+CaCO3 0.26±0.20b 1.01±0.31b 0.14±0.02a 0.22±0.04b NPK+CaCO3 0.10±0.08a 1.19±0.27b 0.13±0.02a 0.17±0.02a
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ±STDEV.Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05 4.2.2.3. Potencijalno štetni elementi
Kao elementi čije bi visoke koncentracije mogle da utiču na rastenje pšenice, a
nisu neophodni za ishranu biljaka, javili su se Al i As, dok su koncentracije Cr, Co i Se
bile u opsegu optimalnih koncentracija.
Kalcizacija zemljišta se još jednom pokazala kao efikasna mera ublažavanja
fitotoksičnosti mineralnih elemenata, ovog puta arsena (Slika 15 a i b). Ova mera
51
popravke zemljišta smanjila je koncentraciju As skoro 4 puta na L1 i skoro 3 puta na L2
zemljištu, nezavisno od toga da li je CaCO3 bio primenjen sam ili u kombinaciji sa
drugim merama popravke. Osim toga, na L1 zemljištu unos NPK đubriva je takođe
ispoljio pozitivan efekat na smanjenje koncentracije As u pšenici, ukazujući na
interakciju između P i As. Poznato je da ishrana biljaka fosforom može smanjiti
usvajanje arsena sa obzirom da oba elementa preko istog transportera u
plazmamembrani mogu ući u koren (Meharg et Hartley-Whitaker 2002). Jaka negativna
korelacija između sadržaja As i akumulirane nadzemne biomase biljke (r=-0.905; r=-
0.807; p<0.05 na L1 i L2 zemljištu ponaosob) ukazuje na mogući fitotoksični efekat As.
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
2
4
6
8
10c
c
b
a a a
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
2
4
6
8
bb
b
a
aa
Kon
cent
raci
ja A
s (m
g kg
-1 s
uve
mas
e)
Kon
cent
raci
ja A
s (m
g kg
-1 s
uve
mas
e)
a b
Slika 15. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L1 (a) i L2 (b) na koncentraciju As u nadzemnom delu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
U kontrolnim biljkama koncentracija Al kretala se iznad prosečne granice za
pšenicu (Slika 16; Mengel et Kirkby 1987). Pored toga, snažna inhibicija rasta korena u
tretmanima gde nije bio primenjen kreč, a naročito u kontrolnim tretmanima, na oba
zemljišta ukazuje na jak fitotoksičan efekat Al. U prilog toksičnom delovanju Al na
zemljištima oštećenim rudničkom jalovinom L1 i L2 govori i jaka negativna korelacija
između sadržaja Al i biomase (r=-906; r=-0.836; p<0.05).
Na L1 zemljištu samo mere koje su sadržale kreč, preko alkalizacije pH
zemljišta (videti Tabelu 10), dovele su do smanjena koncentracije Al u nadzemnom delu
(Slika 16a). U odnosu na kontrolu ove mere su redukovale koncentraciju Al u
52
nadzemnom delu biljke skoro 9 puta, nezavisno od toga da li je kreč bio primenjen sam
ili sa drugim đubrivima.
Ko
ntro
laSt
ajnj
ak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
020406080
100
400
600
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
050
100150200500
100015002000
a
b
b
ab
a
a
a
d
c
d
b
b
a
Kon
cent
raci
ja A
l (m
g kg
-1 s
uve
mas
e)
Kon
cent
raci
ja A
l (m
g kg
-1 su
ve m
ase)
b
Slika 16. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L1 (a) i L2 (b) na koncentraciju Al u nadzemnom delu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Sa druge strane, na L2 zemljištu i primena stajnjaka se pokazala kao efikasna
mera eliminacije negativnog uticaja Al (Slika 16b). U odnosu na kontrolu, primena
stajnjaka je smanjila koncentraciju Al za više od 50%. I ovde se primena kreča pokazala
kao vrlo efikasna mera popravke negativnog uticaja Al (Slika 16b). U tretmanima sa
krečom koncentracija Al u nadzemnom delu pšenice je smanjena za više od 10 puta, pri
čemu je kombinacija sa stajnjakom pokazala sinergistički efekat (dodatno smanjenje
koncentracije Al u nadzemnom delu pšenice). Smanjenje sadržaja Al u pšenici u
tretmanima stajnjakom ukazuje na značaj organske materije u heliranju toksičnih oblika
Al, koji na taj način postaju manje toksični za biljke.
Koncentracije Cr, Co i Se u nadzemnom delu pšenice prikazane su u Tabeli 9.
Generalno, koncentracije Cr, Co i Se u nadzemnom delu pšenice gajene na oba
zemljišta (L1 i L2) i u svim tretmanima bile su ispod fitotoksičnih koncentracija
(Kabata-Pendias et Pendias 1984).
53
Tabela 9. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L1 i L2 na koncentracije Cr, Co i Se u nadzemnom delu pšenice.
Tretmani Cr (mg kg-1)
Co (mg kg-1)
Se (mg kg-1)
L1 L2 L1 L2 L1 L2 Kontrola 3.08±1.13d 0.78±0.01b 13±1c 1.07±0.32b 5.1±0.1b 3.28±0.16a Stajnjak 1.04±0.36c 0.91±0.41b 12±3c 1.42±0.24b 5.6±0.9b 3.87±0.81a NPK 1.18±0.92c 0.95±0.36b 20±3d 1.85±0.33b 4.0±0.8b 4.38±0.89a CaCO3 0.53±0.06b 0.37±0.07a 0.48±0.12b 0.81±0.32a 1.3±0.3a 3.71±0.61a Stajnjak+CaCO3 0.18±0.06a 0.41±0.19a 0.30±0.07b 0.73±0.20a 1.4±0.1a 2.16±0.92a NPK+CaCO3 0.19±0.07a 0.36±0.14a 0.26±0.05a 0.84±0.11a 1.34±0.12a 2.87±0.65a
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
4.2.3. Uticaj standardnih mera za popravku zemljišta na fiziološke adaptacije
korena pšenice
4.2.3.1. Efluks organskih anjona
U eksudatima korena pšenice detektovane su sledeće organske kiseline
Krebsovog ciklusa: ćilibarna (sukcinat), fumarna (fumarat), limunska (citrat) i jabučna
(malat) (Slike 17-21). Pored toga, detektovano je i prisustvo mlečne (laktat) i
šikiminske (šikimat) kiseline.
Slika 17. Hromatogram analiziranih eksudata korena
54
Primenjenje mere su značajno modifikovale eksudaciju organskih kiselina iz
zone vrha korena pšenice nezavisno od tipa zemljišta (Slike 18-21).
Na L1 zemljištu sve primenjene mere koje su sadržale kreč su povećale efluks
sukcinata (Slika 18a), pri čemu nije bilo razlike između tretmana. Fumarat je bio
prisutan u eksudatima korena samo kod pšenice u kontrolnom tretmanu (Slika 18b) a
šikimat samo u eksudatima korena biljaka tretiranih CaCO3 (Slika 18c). Efluks laktata
je u velikoj meri redukovan primenom kreča (Slika 18d). U odnosu na kontrolu
eksudacija laktata je bila smanjenja kalcizacijom zemljišta skoro 2 puta (Slika 18d), a u
kombinaciji sa stajnjakom ili NPK đubrivom dodatno je smanjen efluks laktata (4 puta
u odnosu na kontrolu).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaC
O 3
Staj
njak
+CaC
O 3NP
K+Ca
CO3
Eflu
ks S
ukci
nata
(
mol
g-1
suv
e m
ase
h-1)
0
10
2040
60
80Ko
ntro
laSt
ajnj
akN
PKCa
CO
3St
ajnj
ak+k
rec
NPK+
CaCO
30,00,20,40,60,81,01,21,41,61,8
Eflu
ks F
umar
ata
(m
ol g
-1 s
uve
mas
e h-1
)
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaC
O 3
Staj
njak
+CaC
O 3NP
K+Ca
CO3
0,000,050,100,150,200,250,300,35
Eflu
ks Š
ikim
ata
(m
ol g
-1 s
uve
mas
e h-1
)
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaC
O3
Staj
njak
+kre
cNP
K+Ca
CO3
0
20
40
60
80
Eflu
ks L
akta
ta
(m
ol g
-1 s
uve
mas
e h-1
)
a a
a
ab
b
b
b
aa
a
bb
bb
bb
a b
c d
Slika 18. Efekat mera popravke zemljišta L1 na efluks: sukcinata (a), fumarata (b), šikimata (c) i laktata (d) iz vršne zone korena pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
55
Na L2 zemljištu sve primenjene mere su smanjile efluks sukcinata (Slika 19a).
Fumarat u eksudatima korena bio je detektovan samo u tretmanu sa krečom (Slika 19b).
Eksudacija šikimata takođe nije pokazala nikakvu pravilnost u odnosu na primenjene
mere popravke, a efluks laktata je bio redukovan svim primenjenim merama popravke
zemljišta u odnosu na kontrolu (Slika 19d).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3
Staj
njak
+CaC
O 3NP
K+Ca
CO3
0
20
40
60
80
Eflu
ks S
ukci
nata
(
mol
g-1
suv
e m
ase
h-1)
Eflu
ks F
umar
ata
(m
ol g
-1 s
uve
mas
e h-1
)
Eflu
ks Š
ikim
ata
(m
ol g
-1 s
uve
mas
e h-1
)
Eflu
ks L
akta
ta
(m
ol g
-1 s
uve
mas
e h-1
)
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3
Staj
njak
+CaC
O 3NP
K+Ca
CO3
0,000,050,100,150,200,250,300,35
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3
Staj
njak
+CaC
O 3NP
K+Ca
CO3
050
100150200250300
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3
Staj
njak
+CaC
O 3NP
K+Ca
CO3
0
102030405060
a aa
a
b
abc
aa
b
aa a
b
a
c
a b
c d
Slika 19. Efekat mera popravke zemljišta L2 na efluks: sukcinata (a), fumarata (b), šikimata (c) i laktata (d) iz vršne zone korena pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Eksudacija citrata i malata je značajno varirala u odnosu na primenjene mere
na oba zemljišta, dok se profil eksudacije neznatno razlikovao između dva zemljišta (L1
i L2; Slike 20 i 21). Na oba zemljišta, efluks malata je bio intezivniji u odnosu na efluks
56
citrata, dok je efluks ova dva organska anjona bio u opsegu koncentracija koje se
javljaju u uslovima P deficita i toksičnosti Al kod pšenice (Ryan et al. 2014).
Efluks citrata i malata kod pšenice gajene na L1 zemljištu prikazan je na Slici
20.
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
Eflu
ks C
itrat
a (
mol
g-1
suve
mas
e h-1
)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
a a
b b
c
d
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
5
10
15
20
25
Eflu
ks M
alat
a(
mol
g-1
suv
e m
ase
h-1)
aa
b
c c
dpH H2O 3,9 - 4
pH H2O 6,8 - 7
b pH H2O 3,9 - 4 pH H2O 6,8 - 7a
Slika 20. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L1 na eksudaciju citrata (a) i malata (b) sa korena pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Na L1 zemljištu najintezivniji efluks citrata zabeležen je u tretmanu sa krečom
(Slika 20a). U poređenju sa kontrolom efluks citrata bio je skoro 2 puta veći u tretmanu
sa CaCO3. U tom tretmanu zabeležen je i najširi odnos mase korena i nadzemnog dela
(R/S, Tabela 5), što ukazuje da je maksimalan efluks citrata koincidirao sa izraženim
deficitom P. Dodatno poboljšanje P statusa (Slika 10) uticalo je na značajno
smanjivanje efluksa citrata (Slika 19a). Na niskoj (nekorigovanoj) pH, primena
stajnjaka i NPK đubriva smanjile su efluks citrata 30%, odnosno 20%. Na neutralnoj pH
(korekcija krečom) primena stajnjaka i NPK đubriva takođe su dovele do redukcije
efluksa citrata. Interesantno je da ne postoji značajna razlika u efektu stajnjaka i NPK
đubriva na eksudaciju citrata, bilo na niskim bilo na neutralnim pH vrednostima (Slika
20a). Istovremeno, nije bilo razlike u efektu ove dve mere popravke niti na dva
parametra rastenja koji bi mogli ukazati na deficit P (alokacija biomase između korena i
nadzemnog dela, Tabela 5, i količine P u biljci, Slika 10).
57
Sa druge strane, efluks malata na L1 zemljištu je bio najviši kod kontrolnih
biljaka (Slika 20b). Primenom mera za popravku zemljišta dolazi do značajne redukcije
eksudacije malata, pri čemu je efluks malata redukovan u najvećoj meri tek kada su
eliminisani i toksičnost Al i deficit P u rizosferi (videti Tabele 20 i 24). Interesantno je
da se u tretmanu sa krečom, gde je praktično eliminisan toksičan efekat Al
(koncentracija Al3+u rizosferi <0.20 mg kg-1, Tabela 24), efluks malata kretao u istom
opsegu kao i u tretmanu sa NPK đubrivom gde su bile prisutne daleko veće
koncentracije Al3+ u rizosferi.
Na L2 zemljištu efluks citrata je takođe bio najintezivniji u tretmanu sa krečom
(Slika 21a).
Kont
rola
Stajn
jak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
2
41020304050
Eflu
ks M
alat
a(
mol
g-1
suv
e m
ase
h-1)
pHH2O 3,1 - 3,4
pHH2O 7,3 - 7,5
a
b
c
e
d d
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
2
4
6
8
10pHH2O
3,1 - 3,4 pHH2O 7,3 - 7,5
Eflu
ks C
itrat
a (
mol
g-1
suv
e m
ase
h-1)
aa
bb
d
c
a b
Slika 21. Efekat primenjenih mera poprakve zemljišta L2 na eksudaciju citrata (a) i malata (b) sa korena pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05 Sama kalcizacija zemljišta pojačala je efluks citrata za oko 25%, dok se u
kombinaciji sa unošenjem stajnjaka ili NPK đubriva efluks citrata značajno smanjio
(Slika 21a). Efluks malata na ovom zemljištu pokazuje skoro istovetni trend kao i na L1
zemljištu, sa najvećim vrednostima u kontroli, dok su sve primenjenje mere popravke
zemljišta uticale na smanjenu eksudaciju malata (Slika 21b). Unos stajnjaka i NPK
đubriva smanjili su efluks malata 1.3 puta, dok je kod unosa kreča zabeleženo
smanjenje 3.2 puta u odnosu na kontrolu.
58
4.2.3.2. Ekspresija TaMATE1 i TaALMT1
Ekspresije gena koji kodiraju jonske kanale odgovorne za efluks malata i citrata
kod pšenice su značajno modulirane primenom mera popravke zemljišta (Slike 22 i 23)
i u velikoj meri koreliraju sa efluksom ovih anjona (Slike 20 i 21).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0,0
0,5
1,0
2,0
2,5
3,0
3,5
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Rel
ativ
na e
kspr
esija
Ta
ALMT1
aa
b b
d
c
aa
bc c
d
a b
Rel
ativ
na e
kspr
esija
TaMATE
1
pH H2O 3,9 - 4
pH H2O 3,9 - 4pH H2O
6,8 - 7
pH H2O 6,8 - 7
Slika 22. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L1 na ekspresiju TaMATE1 (a) i TaALMT1 (b) u korenu. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Na L1 zemljištu ekspresija gena koji kodiraju jonske kanale odgovorne za efluks
citrata (TaMATE1) i malata (TaALMT1) pokazuje sličan trend kao i sama eksudacija
(Slike 22 i 20). Najviši nivo ekspresije TaMATE1 je zabeležen u tretmanu gde je pH
vrednost korigovana krečom, ali nije bilo dodatne primene đubriva (Slika 22a). To je
istovremeno i tretman u kome je zabeležen najveći efluks citrata (Slika 20a), kao i
najširi odnos biomase korena i nadzemnog dela (Tabela 5) što ukazuje na deficit P. Sa
druge strane, najveća količina transkripata TaALMT1 je uočena u kontrolnom tretmanu,
gde nisu eliminsani ni deficit P niti toksičnost Al (Slika 22b, videti Sliku 10, Tabele 20 i
24), dok su sve mere popravke uticale na značajno smanjenje njegove ekspresije.
Najniži nivo ekspresije oba gena je postignut kada su eliminisana oba stresna faktora.
Interesanto je da je u tretmanima bez korekcije pH stajnjak doveo do veće redukcije
ekspresije ovog gena nego primena NPK đubriva (Slika 22b). U odnosu na kontrolni
59
tretman, kombinovana primena kreča sa đubrivima je redukovala nivo ekspresije
TaALMT1 za oko 75%. Primena stajnjaka dovela je do smanjenja nivoa ekspresije
TaALMT1 za oko 60%, dok je unos NPK đubriva smanjio nivo ekspresije za oko 50%.
Ekspresija TaMATE1 u uzorcima na L1 zemljištu (Slika 22a) bila je redukovana
primenom stajnjaka (20% od kontrole) i NPK đubriva (30 % od kontrole). Sa druge
strane, u odnosu na kontrolu primena kreča je povećala ekspresiju TaMATE1 2.7 puta.
Na L2 zemljištu mere popravke su takođe uticale na ekspresiju gena koji
kodiraju jonske kanale odgovorne za eksudaciju malata i citrata u korenu pšenice (Slika
23). I ovde eksudacija organskih anjona, citrata i malata (Slika 21) pokazuje isti trend
kao i ekspresija komplementarnih gena (Slika 23). U tretmanu sa krečom dolazi do
pojačane ekspresije TaMATE1 za skoro 60%, dok unos stajnjaka ili NPK đubriva
smanjuje ekspresiju ovog gena nezavisno od korekcije pH vrednosti zemljišta (Slika
23a). Relativna ekspresija TaALMT1 pokazuje najveće vrednosti u kontrolnom tretmanu
(Slika 23b). Pojedinačna mera kalcizacije snizila je ekspresiju TaALMT1 za skoro 75%
u odnosu na kontrolu, dok je primena CaCO3 u kombinaciji sa stajnjakom ili NPK
đubrivom dovela do skoro potpunog izostanka ekspresije ovog proteina. U tretmanima
sa NPK đubrivom i stajnjakom bez korekcije pH vrednosti dolazi do redukcije
ekspersije TaALMT1 za oko 50% (Slika 23b).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0,0
0,5
1,0
1,5
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0pHH2O
3,1 - 3,4
pHH2O 7,3 - 7,5
ab
c
e
dd
pHH2O 3,1 - 3,4
pHH2O 7,3 - 7,5
a a
bb
d
c
Rel
ativ
na e
kspr
esija
Ta
MAT
E1
Rel
ativ
na e
kspr
esija
TaALM
T1
a b
Slika 23. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L2 na ekspresiju TaMATE1 (a) i TaALMT1 (b) u korenu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
60
4.2.3.3. Ekspresija TaPEPC1
Na L1 zemljištu primenjene mere za popravku su uticale na promene nivoa
ekspresije TaPEPC1 samo ukoliko su korigovale nisku pH vrednost zemljišta (unos
kreča). Na ovom zemljištu nivo ekspresije TaPEPC1 je bio povećan dva puta
pojedinačnom kalcizacijom, a čak 27 puta primenom kreča u kombinaciji sa stajnjakom,
odnosno 12 puta primenom kreča u kombinaciji sa NPK đubrivom (Slika 24a). Na L2
zemljištu ekspresija TaPEPC1 je bila povećana jedino u slučaju kada je uz korekciju pH
(unos kreča) poboljšan i status P dodatkom đubriva (Slika 24b). Ovi rezultati ukazuju da
do indukcije TaPEPC1 dolazi kada se poboljšalju opšti uslovi zemljišta za rastenje
pšenice. Sa druge stane, potpuno drugačiji obrazac ekspresije TaPEPC1 (Slika 24) i
efluksa citrata i malata (Slike 20 i 21) ukazuje da do pojačane eksudacije organskih
kiselina ne dolazi usled njihove “de novo“ sinteze (anaplerotičnim tipom biosinteze kao
alternative Krebsovom ciklusu pri deficitu P), već usled aktivacije jonskih kanala i stoga
povećanog efluksa organskih anjona.
Kont
rola
Stajn
jak
NPK
CaCO
3St
ajnjak
+CaC
O 3NP
K+Ca
CO3
0,00,51,01,52,02,53,03,5
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaC
O 3
0
1
2
3203040
Rel
ativ
na e
kspr
esija
Ta
PEPC1
a b
aa
a
b
d
c
aa aa
b b
pH H2O 3,9 - 4
pH H2O 6,8 - 7
pHH2O 3,1 - 3,4
pHH2O 7,3 - 7,5
Rel
ativ
na e
kspr
esija
TaPEPC1
Slika 24. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta na ekspresiju TaPEPC1 u korenu pšenice gajene na L1 (a) i L2 (b) zemljištu. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05 4.2.3.4. Ekspresija fosfatnih transportera i usvajanje fosfora
Ekspresije gena TaPHT1.1 i TaPHT1.2 odgovornih za kodiranje fosfatnih
transportera visokog afiniteta u velikoj meri su modulirane primenjenim merama
61
popravke zemljišta. Osim sadržaja P, kako u biljci tako i u zemljištu, (videti Sliku 10,
Tabelu 20) kao značajan faktor modulacije ekspresije ovih gena javlja se i primena
kreča, odnosno korekcija pH vrednosti kiselih zemljišta (Slike 25 i 26).
Nivo ekspresije TaPHT1.1 na L1 zemljištu je u velikoj meri moduliran
primenjenim merama za popravku zemljišta (Slika 25a). U poređenju sa kontrolnim
tretmanom nivo ekspresije ovog gena je bio redukovan za 70 % u tretmanima sa
stajnjakom i NPK đubrivom, dok je primena kreča dovela do smanjenja nivoa ekspresije
TaPHT1.1 za 60%. Međutim, u zavisnosti od pH vrednosti zemljišta uočavaju se dva
suprotna mehanizma regulacije ovog gena. Na niskoj pH, TaPHT1.1 je bio “up“-
regulisan sadržajem P u biljci (vidi Sliku10), dok na visokim pH dolazi do “down“-
regulacije gde poboljšanje P statusa biljke indukuje snažnu ekspresiju ovog gena (Slika
25a).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaC
O 3
Rel
ativ
na e
kspr
esija
Ta
PHT1
.1
0
1
4
5
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaC
O 3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
Rel
ativ
na e
kspr
esija
TaPHT1.2
0
1
234567
a a b
c
d
da
ab
c
d
d
eb
pH H2O 3,9 - 4
pH H2O 3,9 - 4
pH H2O 6,8 - 7 pH H2O
6,8 - 7
Slika 25. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L1 na ekspresiju TaPHT1.1 (a) i TaPHT1.2 (b) u korenu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Na L1 zemljištu ekspresija TaPHT1.2 takođe je zavisila od pH vrednosti
zemljišta (Slika 25b). U svim tretmanima sa dodatkom kreča (korekcija niske pH) nivo
ekspresije TaPHT1.2 je bio veći u odnosu na odgovarajuće tretmane bez dodatka kreča
(niska pH). Primena kreča znatno je povećala nivo ekspresije ovog gena, nezavisno od
koncentracije P u zemljištu ili biljci (videti Tabelu 20 i Sliku 10). Međutim,
posmatrajući odvojeno nivoe ekspresija na niskoj i na visokoj pH uočava se sličan
62
trend; nivo ekspresije gena se značajno smanjuje sa povećanjem dostupnosti P u
rizosferi (videti Tabelu 20) i akumulacije P u biljci (Slika 10), pokazujući tipičan
mehanizam “up“-regulacije ovog gena. Takođe, na ovom zemljištu se jasno vidi da
ekspresija TaPHT1.2 (Slika 25b) ima isti trend kao i ekspresija TaMATE1 gena
(kodiraju jonske kanale odgovorne za efluks citrata, Slika 22a), što ukazuje na značaj P
statusa biljke u regulaciji aktivnosti ovih gena.
Na L2 zemljištu ekspesija TaPHT1.1 nije pokazala jasan trend (Slika 26a), dok
je TaPHT1.2 bio eksprimiran na sličan način kao i na L1 zemljištu (Slika 26b; videti
sliku 25b).
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0
2
4
Kont
rola
Staj
njak
NPK
CaCO
3St
ajnj
ak+C
aCO 3
NPK+
CaCO
3
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
pHH2O 3,1 - 3,4
pHH2O 7,3 - 7,5
a b b
d
c
a
pHH2O 3,1 - 3,4
pHH2O 7,3 - 7,5
d
ab b
e
c
Rel
ativ
na e
kspr
esija
TaPHT1.1
Rel
ativ
na e
kspr
esija
Ta
PHT1
.2ba
Slika 26. Efekat primenjenih mera popravke zemljišta L2 na ekspresiju TaPHT1.1 (a) i TaPHT1.2 (b) u korenu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
4.2.4. Uticaj standardnih mera za popravku na osobine rizosfernog zemljišta
4.2.4.1. pH vrednost
Kao što je i bilo očekivano, kalcizacija zemljišta je korigovala pH vrednost
podižući pH na nivo neutralne vrednosti, kako u rizosferi tako i u preostalom “balk”
delu zemljišta, pri čemu nije bilo razlike u tome da li je kreč bio primenjen pojedinačno
ili u kombinaciji sa drugim đubrivima (Tabele 10 i 11). Na L1 zemljištu nije bilo
značajne razlike u vrednosti aktivne kiselosti (pH u H2O) između okolnog “balk“
63
zemljišta i rizosfere (Tabela 10). Vrednosti substitucione (pH u 1 M KCl) kiselosti bile
su modifikovane u rizosfernom zemljištu u proseku za 0.2 pH jedinice i to samo u
kontroli i tretmanima sa deficitom P (stajnjak i NPK i CaCO3). Na L2 zemljištu uočeno
je blago zakišeljavanje rizosfernog zemljišta u svim tretmanima, osim u kontroli i u
tretmanu sa stajnjakom (Tabela 11). Korelaciona analiza (Pirsonov koeficijent
korelacije) je pokazala da je rastenje pšenice (biomasa nadzemnog dela i korena, videti
Tabele 5 i 6) na oba zemljišta (L1 i L2) pozitivno spregnuto sa pH vrednosti rizosfernog
zemljišta. Vrednost Pirsonovog koeficijenta korelacije na L1 zemljištu između biomase
nadzemnog dela i substitucione kiselosti (pHKCl) iznosio je r=0.833; p< 0.05; a između
biomase korena i pHKCL r=0,707; p< 0.05. Slične vrednosti korelacionih koeficijenata
dobijene su i između ova dva parametra (biomase nadzemnog dela i korena) rasta i
vrednosti aktivne kiselosti pHH2O (r=0.808 za nadzemni deo i r=0.657 za koren; p<
0.05).
Tabela 10. Efekat primenjenih mera popravke na pH vrednost L1 zemljišta
Tretmani pH (H2O) pH (KCl) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 3.95±0.03aA 3.90±0.04aA 3.10±0.04aA 3.40±0.02aB Stajnjak 4.00±0.16aA 4.04±0.04aA 3.30±0.03aA 3.50±0.02aB NPK 3.90±0.02aA 4.00±0.05aA 3.15±0.03aA 3.40±0.03aB CaCO3 7.00±0.05bA 7.00±0.04bA 6.34±0.04bA 6.60±0.04bB Stajnjak+ CaCO3 6.80±0.02bA 7.13±0.05bA 6.50±0.07 bA 6.50±0.02bA NPK+CaCO3 6.93±0.07bA 7.00±0.07bA 6.50±0.05bA 6.60±0.03bA
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Tabela 11. Efekat primenjenih mera popravke na pH vrednost L2 zemljišta.
Tretmani pH (H2O) pH (KCl) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 3.43±0.04aA 3.40±0.03aA 2.70±0.02aA 2.68±0.02aA Stajnjak 3.43±0.09aA 3.50±0.04aA 2.93±0.02aA 2.93±0.01aA NPK 3.10±0.05aA 3.30±0.02aB 2.68±0.02aA 2.73±0.07aA CaCO3 7.50±0.03bA 7.73±0.05bB 6.90±0.04bA 7.10±0.02bB Stajnjak+ CaCO3 7.30±0.09bA 7.70±0.06bB 6.90±0.02bA 7.18±0.04bB NPK+CaCO3 7.30±0.07bA 7.83±0.07bB 7.00±0.04bA 7.03±0.05bA
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05.
64
Zavisnost rasta pšenice od pH rizosfere uočena je i na L2 zemljištu. Na ovom zemljištu
biomasa pšenice je takođe pozitivno spregnuta sa pHKCl (r=0.806 za nadzemni deo i r=
0.860 za koren; p< 0.05).
4.2.4.2. Dostupnost mikroelemenata
Ukupne koncentracije mikroelemenata (Cu, Zn, Mn, Fe, Ni i Mo) nisu se
značajno razlikovale u tretmanima (Tabele 12-15). Takođe, nije bilo značajne razlike u
ukupnoj koncentraciji mikroelemenata između rizosfernog i okolnog zemljišta.
Tabela 12. Efekat mera popravke L1 zemljišta na ukupne koncentracije Cu, Zn i Mn.
Tretmani Ukupni Cu (mg kg-1) Ukupni Zn (mg kg-1) Ukupni Mn (mg kg-1) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 802±137bA 880±98aA 60±4aA 65±5aA 173±16aA 185±12aA Stajnjak 687±65abA 712±72aA 61±3aA 58±6aA 173±25aA 178±16aA NPK 707±57abA 703±98aA 64±6aA 58±4aA 175±20aA 173±16aA CaCO3 687±69aA 662±82aA 57±6aA 60±3aA 165±24aA 174±21aA Stajnjak+ CaCO3 708±8abA 706±49aA 63±7aA 59±8aA 171±8aA 177±25aA NPK+CaCO3 708±8abA 667±82aA 57±8aA 57±4aA 167±16aA 167±26aA
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05.
Tabela 13. Efekat mere popravke zemljišta L1 na ukupne koncentracije Fe, Ni i Mo.
Tretmani Ukupno Fe (g kg-1) Ukupni Ni (mg kg-1) Ukupni Mo (mg kg-1) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 44±5aA 45±4aA 9.4±0.1aA 11±0.7aA 2.7±0.2aB 2.8±0.1aB Stajnjak 40±3aA 42±4aA 9.1±1.4aA 9.4±0.8aA 2.8±0.1aB 2.5±0.1aB NPK 38±2aA 41±2aA 10±1aA 9.3±0.9aA 2.6±0.3aB 2.7±0.2aB CaCO3 39±5aA 41±4aA 9.3±0.5aA 9.4±0.8aA 2.7±0.1aB 2.7±0.2aB Stajnjak+ CaCO3 39±2aA 41±3aA 9.7±1.aA 9.5±0.4aA 2.6±0aB 2.6±0.3aB NPK+CaCO3 39±3aA 40±5aA 9.5±0.6aA 9.8±0.8aA 2.6±0.4aB 2.7±0.2aB Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05.
65
Tabela 14. Efekat mera popravke zemljišta L2 na ukupne koncentracije Cu, Zn i Mn.
Tretmani Ukupni Cu (mg kg-1) Ukupni Zn (mg kg-1) Ukupni Mn (mg kg-1) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 39±3aA 38±3aA 6.1±0.8aA 5.03±0.41aA 25±2aA 24±2aA Stajnjak 39±4aA 38 ±4aA 6.9±0.7bA 6.78±0.41aA 28±2aA 26±3aA NPK 39±2aA 41±7aA 6.4±0.3abA 6.03±0.49abA 27±3aA 28±2aA CaCO3 37±5aA 38±3aA 5.4±0.7aA 5.43±0.49abA 24±3aA 24±1aA Stajnjak+ CaCO3 38±2aA 38±2aA 6.3±0.8aA 6.28±0.33abA 27±2aA 26±2aA NPK+CaCO3 38±2aA 38±4aA 5.8±0.5aA 5.88±0.65abA 25±3aA 25±2aA
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05.
Tabela 15. Efekat mera popravke zemljišta L2 na ukupne koncentracije Fe, Ni i Mo.
Tretmani Ukupno Fe (g kg-1) Ukupni Ni (mg kg-1) Ukupni Mo (mg kg-1) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 12±2aA 13±1aA 0.40±0.04aA 0.35±0.06aA 1.60±0.32aA 1.75±0.24aA Stajnjak 13±2aA 13±2aA 0.60±0.57aA 0.50±0.08aA 2.02±0.33aA 2.02±0.24aA NPK 13±3aA 13±2aA 0.65±0.12aA 0.70±0.08aA 2.10±0.29aA 2.07±0.41aA CaCO3 13±3aA 13±1aA 0.45±0.03aA 0.65±0.04aA 2.00±0.32aA 2.12±0.04aA Stajnjak+CaCO3 13±1aA 13±1aA 0.50±0.32aA 0.55±0.21aA 2.00±0.40aA 2.10±0.48aA NPK+CaCO3 13±2aA 13±3aA 0.55±0.08aA 0.40±0.01aA 2.00±0.24aA 2.10±0.24aA Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05.
Sa druge strane, koncentracije dostupnih oblika mikroelementa su značajno
varirale u odnosu na primenjene mere popravke (Tabele 16-19).
Koncentracije dostupnog Cu, Zn, Fe i Mn u rizosferi L1 zemljišta bile su u
opsegu vrlo visokih koncentracija, pri čemu se koncentracije Cu mogu smatrati i
fitotoksičnim (Tabela 16 i 17). Kalcizacijom zemljišta (popravkom pH vrednosti) dolazi
do značajnog smanjenja koncentracije ovih mikroelemenata, pri čemu nije bilo značajne
razlike da li je kreč bio primenjen pojedinačno ili zajedno sa organskim i mineralnim
đubrivima. Korekcijom pH vrednosti koncentracija dostupnog Cu je smanjena 2 puta,
koncentracija Zn 4 puta, Mn 9 puta, Fe 4 puta (Tabele 16 i 17). Primena stajnjaka ili
NPK đubriva bez korekcije pH vrednosti nije značajnije uticala na koncentraciju ovih
mikroelemenata u rizosferi (osim povećanja dostupnosti Mn u NPK tretmanu).
Koncentracija dostupnog Fe je bila dodatno modulirana u rizosferi u tretmanima sa
primenjenim krečom, gde je došlo do povećavanja koncentracije Fe u odnosu na okolno
66
zemljište (Tabela 17). Rizosferne koncentracije ostalih mikroelemenata nisu se značajno
razlikovale od koncentracije u “balk“ zemljištu (Tabele 16 i 17).
Tabela 16. Efekat mera popravke zemljišta L1 na koncentracije dostupnih oblika (DTPA-ekstrakcija) Cu, Zn i Mn.
Tretmani Dostupni Cu (mg kg-1) Dostupni Zn (mg kg-1) Dostupni Mn (mg kg-1) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 322±65bA 324±32bA 12±3bA 14±1bA 30±2bA 26±4bA Stajnjak 324±32bA 319±24bA 13±1bA 13±2bA 29±3bA 29±2bA NPK 341±49bA 333±33bA 14±3bA 14±2bA 41±4cA 27±2bA CaCO3 166±32aA 148±20aA 3.2±0.2aA 3.74±0.57aA 4.9±0.5aB 2.73±0.24aA Stajnjak +CaCO3 158±32aA 166±16aA 4.4±0.5aA 4.14±0.73aA 3.5±0.4aB 2.24±0.16aA NPK+CaCO3 170±16aA 153±1aA 3.7±0.3aA 3.92±0.24aA 4.4±0.2aB 2.99±0.24aA
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Tabela 17. Efekat mera popravke zemljišta L1 na koncentracije dostupnih oblika (DTPA-ekstrakcija).
Tretmani Dostupno Fe (mg kg-1) Dostupni Ni (mg kg-1) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 168±16bA 181±20bA 0.84±0.16aA 1.03±0.01bA Stajnjak 176±25bA 183±17bA 0.90±0.02aA 0.97±0.02bA NPK 178±20bA 191±24bA 1.04±0.16aA 1.02±0.05bA CaCO3 43±2aB 35±4aA 0.13±0.02bA 0.15±0.02aA Stajnjak+ CaCO3 46±4aB 40±4aA 0.16±0.02bA 0.17±0.01aA NPK+CaCO3 48±4aB 38±2aA 0.17±0.03bA 0.15±0.05aA
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Koncentracije dostupnih mikroelemenata na L2 zemljištu (isto kao i
koncentracije ukupnih formi, videti Tabele 14 i 15) su mnogo niže nego na zemljištu
L1, i bliže su graničnim vrednostima koje ukazuju na deficit, naročito u slučaju Zn
(Tabele 18 i 19). Koncentracije dostupnih oblika Cu, Fe i Mn su značajno snižene
korigovanjem pH vrednosti, nezavisno od toga da li je kreč bio primenjen sam ili u
kombinaciji sa drugim merama. Međutim, za razliku od L1 zemljišta, primena stajnjaka
značajno je uticala na koncentraciju dostupnih formi Cu, Zn i Mn na L2 zemljištu.
Koncentracija dostupnog Cu snižena je u tretmanu stajnjakom 1.8 puta (Tabela 18).
Nasuprot tome, primenom stajnjaka dostupnost Zn povećala 4 puta u tretmanu bez
67
korekcije pH, a 1.4 puta u tretmanu sa korekcijom pH (Tabela 18). Koncentracija
dostupnog Mn je povećana je 2,5 puta tretmanom stajnjakom. Efekat stajnjaka nije bio
vidljiv na L1 zemljištu usled inače većih koncentracija tih mikroelemenata (Tabele 14 i
16), kao i znatno više početne koncentracije organske materije (Tabela 2) u tom
zemljištu. Koncentracija dostupnog Zn bila je veća u rizosferi u nego u okolnom
zemljištu u skoro svim tretmanima (Tabela 18).
Tabela 18. Efekat mere popravke zemljišta L2 na koncentraciju dostupnih oblika (DTPA-ekstrakcija) Cu, Zn i Mn.
Tretmani Dostupni Cu (mg kg-1) Dostupni Zn (mg kg-1) Dostupni Mn ( mg kg-1) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 3.8±0.3cA 3.1±0.2cA 0.29±0.01bB 0.07±0.00bA 0.51±0.03cA 0.41±0.03cA Stajnjak 2.1±0.4bA 2.2±0.3bA 1.17±0.16eB 0.81±0.08eA 1.74±0.16dA 1.56±0.16dA NPK 3.7±0.6cA 3.1±0.4cA 0.75±0.04dB 0.31±0.00cA 0.52±0.03cB 0.43±0.02cA CaCO3 1.5±0.1aA 1.4±0.2aA 0.05±0.01aA 0.03±0.01aA 0.02±0.001aA 0.025±0.004aA Stajnjak+ aCO3 1.9±0.2aA 1.6±0.2aA 0.40±0.02cB 0.30±0.01dA 0.21±0.01bB 0.11±0.01baA NPK+CaCO3 1.7±0.2aA 1.5±0.2aA 0.28±0.00aA 0.23±0.02dA 0.03±0.001aB 0.023±0.001aA
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Tabela 19. Efekat mera popravke zemljišta L2 na koncentraciju dostupnih oblika (DTPA-ekstrakcija) Fe i Ni.
Tretmani Dostupno Fe (mg kg-1) Dostupni Ni (mg kg-1) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 114±8bA 122±10cA 0.028±0.008aA 0.037±0.001aB Stajnjak 78±7bA 85±8bA 0.031±0.003aA 0.043±0.008aB NPK 93±12bA 90±7bA 0.033±0.002aA 0.039±0.002aB CaCO3 12±1aA 13±1aA 0.023±0.002aA 0.025±0.004bA Stajnjak+ CaCO3 13±2aA 12±1aA 0.031±0.002aA 0.030±0.003aA NPK+CaCO3 12±1aA 11±1aA 0.022±0.002aA 0.026±0.003aA
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. 4.2.4.3. Dostupnost fosfora
Ekstremno niske koncentracije dostupnog fosfora (PAL) bile su prisutne u
kontrolnim zemljištima, a sve primenjene agrotehničke mere su povećale koncentraciju
68
dostupnog fosfora u zemljištu (Tabela 20). Međutim, efikasnost mera zavisila je od tipa
zemljišta.
Tabela 20. Efekat primenjenih mera na koncentraciju dostupnog P (AL-ekstrakcija) u rizosfernom i okolnom (“balk”) zemljištu.
Tretmani Koncentracija dostupnog PAL (mg kg-1)
L1 L2 Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 6.24±0.82aB 3.75±0.23aA 2.85±0.28aB 1.83±0.16aA Stajnjak 12.22±2.72bA 11.17±1.46bA 3.55±0.41bA 2.71±0.24bA NPK 9.51±0.82bA 10.95±0.82bA 5.08±0.37cA 6.57±0.41cA CaCO3 16.76±1.39cB 10.56±1.15bA 2.14±0.16aA 3.50±0.41bB Stajnjak+ CaCO3 25.97±2.83dA 25.31±3.37cA 8.07±0.65dA 12.56±1.14dB NPK+CaCO3 25.53±1.63dA 24.20±7.37cA 7.45±0.33dA 12.8±0.53dB
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Na L1 zemljištu, kalcizacija se pokazala kao efikasna mera povećanja
dostupnosti P kako u rizosfernom, tako i u okolnom (“balk”) zemljištu (Tabela 20).
Primena kreča povećala je dostupnost P u “balk” zemljištu oko 2.8 puta. Unos stajnjaka
ili NPK đubriva, bez korekcije pH vrednosti, imao je nešto slabiji efekat na povećanje
dostupnosti P, (povećanje 2 puta), pri čemu nije bilo značajnih razlika između ova dva
tretmana (Tabela 20). Očekivano, primena CaCO3 u kombinaciji sa stajnjakom ili NPK
đubrivom je još više povećala dostupnost P (>6.5 puta), ali je efekat ovih mera bio
modifikovan u rizosfernom zemljištu. Tako je na primer, u poređenju sa kontrolnim
tretmanom, primena NPK đubriva bez korekcije pH povećala dostupnost P manje od 1.5
puta, dok je primena stajnjaka povećala dostupnost P oko 2 puta u rizosfernom
zemljištu (Tabela 20). Efekat kalcizacije u rizosferi bez dodatnog unosa P (organskog ili
neorganskog) sličan je efektu u okolnom zemljištu, dok je unos P (preko stajnjaka ili
NPK đubriva) pokazao nešto slabiji efekat na povećanje dostupnosti P u rizosfernom
zemljištu (povećanje 4 puta u odnosu na kontrolu).
Sa stanovišta ishrane biljaka, važno je ukazati i na promene u koncentraciji
dostupnog P između dva kompartmenta zemljišta, rizosfernog i okolnog (“balk”)
zemljišta, koje su rezultat usvajanja P korenom biljaka, (što dovodi do smanjenja
koncentracije) kao i mobilizacije P aktivnošću korena (kao što je efluks karboksilata, što
69
dovodi do povećanja koncentracija dostupnog P). Suprotno očekivanjima, u kontrolnom
tretmanu (snažna inhibicija rastenja, Tabela 5, kao i najmanje usvajanje P, Slika 10),
kao i u tretmanu sa krečom (najviši R/S odnos koji ukazuje na deficit P, Tabela 5,
najviši efluks citrata, Slika 20a), došlo je do povećanja dostupnosti P u rizosferi u
odnosu na “balk” zemljište (za 100%, odnosno 50% u odnosu na kontrolu). U ostalim
tretmanima nije bilo značajne razlike u koncentraciji dostupnog P između rizosfere i
okolnog zemljišta, što ukazuje na postizanje dinamičke ravnoteže u sistemu okolno
zemljište-rizosfera-biljka.
Na L2 zemljištu kalcizacija bez dodatnog izvora P povećala je koncentraciju
dostupnog P u ”balk” zemljištu 1.9 puta, dok je primena stajnjaka i NPK đubriva u
kombinaciji sa merama korekcije pH (kalcizacija) povećala dostupnost P 6.5 puta, bez
značajnih razlika između ova dva tretmana (Tabela 20). Sa druge strane, primena
stajnjaka bez korekcije pH vrednosti povećala je dostupnost P 1.5 puta, dok je efekat
NPK đubriva bez korekcije pH bio nešto veći (povećanje dostupnosti P 3.5 puta). Slično
L1 zemljištu, u rizosferi je dostupnost P bila dodatno modifikovana. U poređenju sa
kontrolnim tretmanom u rizosfernom zemljištu sa lokaliteta L2 korekcija pH bez
primene dodatnog izvora P (organskog ili minerealnog P) nije uticala na koncentraciju P
u rizosferi, dok je primena stajnjaka i NPK đubriva u kombinaciji sa merama korekcije
pH (kalcizacija) povećala dostupnost P 2.8 puta, bez razlike u efektu između ova dva
tretmana. Sa druge strane, primena stajnjaka bez korekcije pH vrednosti povećala je
dostupnost P 1.2 puta, dok je efekat NPK đubrenja bez dodatnog unosa kreča bio nešto
veći povećavajući dostupnost P 1.8 puta. Povećanje dostupnosti P u odnosu na “balk”
zemljište uočeno je samo u kontrolnom tretmanu i u tretmanu sa stajnjakom, dok je u
ostalim tretmanima došlo do smanjenja koncentracije rizosfernog P ekstrahovanog AL-
rastvorom u odnosu na okolno zemljište.
4.2.4.4. Frakcije neorganskog fosfora
Analiza frakcija neorganskog P pokazala je da se ova dva zemljišta značajno
razlikuju kako po koncentraciji pojedinih frakcija, tako i po relativnom udelu ovih
frakcija u ukupnoj količini mineralnog P (Tabele 21 i 22). Koncentracije svih frakcija
70
neorganskog P u svim tretmanima su bile veće na L1 zemljištu (osim H2O-rastvorljive
frakcije u pojedinim tretmanima). Frakcija P rastvorljiva u vodi (H2O-rastvorljivi P)
činila je najmanji udeo u ukupnom mineralnom P, čineći samo 0.32% u L1, odnosno
1.2% u L2 zemljištu. Udeo P vezanog za aluminujim (Al-P) je bio 4.9% u L1, odnosno
4.6% u L2 zemljištu. Frakcija P vezanog za gvožđe (Fe-P) u oba zemljišta činila je
najveći udeo u ukupnom mineralnom P (65% u L1 i 44% L2 zemljištu). Reduktibilan P
predstavljao je drugu najzastupljeniju frakciju neorganskog P u oba zemljišta (21% u L1
i 28% u L2 zemljištu). Međutim, najveće razlike između zemljišta ispoljene su u
relativnom udelu okludovanog P i P vezanog za Ca (Ca-P) u ukupnom neorganskom P.
Udeo okludovanog P u L1 zemljištu iznosio je 29.8%, dok je udeo ove frakcije
neorganskog P u L2 zemljištu iznosio svega 2.6%. Takođe, udeo Ca-P frakcije u L1
zemljištu iznosio je 8.9%, dok je na L2 zemljištu njen udeo bio duplo veći (20.3% od
ukupnog neorganskog P).
Korekcija pH vrednosti zemljišta (kalcizacija) bez upotrebe dodatnog izvora P
(stajnjaka ili NPK đubriva) dovela je do značajnih promena u koncentraciji nekih oblika
fosfora u “balku” L1 zemljišta (Tabela 21). U poređenju sa kontrolom ova mera dovela
je do povećanja koncentracija H2O-rastvorljivog P (2 puta), i Ca-P (1.6 puta) u okolnom
(“balk”) zemljištu. Sa druge strane, kalcizacija je uticala na smanjenje koncentracije Al-
P (1.3 puta) i okludovanog P (1.6 puta) u istom zemljišnom kompartmentu, dok je
izostao efekat na frakcije P vezanog za Fe (Fe/P) i reduktibilni P. Kombinovana
primena stajnjaka sa krečom takođe je uticala na promene u koncentraciji neorganskih
frakcija P u L1 zemljištu (Tabela 21). Tako je u okolnom (“balk”) zemljištu došlo do
povećanja koncentracije H2O-rastvorljivog P (5 puta), Al-P (1.6 puta) i Ca-P (1.6 puta),
kao i do smanjenja koncentracije Fe-P (1.3 puta) u odnosu na kontrolu L1 zemljišta.
Ova mera nije značajnije uticala na koncentraciju reduktibilnog i okludovanog P.
Kalcizacija zemljišta zajedno sa unošenjem mineralnog P povećala je koncentraciju
H2O-rastvorljivog P (4.4 puta), Al-P (1.4 puta) i Ca-P (2 puta), dok je koncentracija Fe-
P smanjena (1.1 puta). Reduktibilni i okludovani P nisu se značajno menjali ni u ovom
tretmanu. Primena stajnjaka bez korekcije pH vrednosti dovela je do povećanja H2O-
rastvorljive frakcije P (1.7 puta) i Ca-P (1.6 puta), kao i do smanjenja okludovanog P
(1.7 puta). Primena NPK đubriva bez dodatnog unosa kreča uticala je samo na
71
povećanje koncentracije Fe-P i Ca-P, dok su ostale frakcije neorganskog P ostale
nepromenjene (Tabela 21).
Tabela 21. Efekat primenjenih mera popravke na frakcije neorganskog P u L1 zemljištu
Frakcije P Tretmani Koncentracija P
(mg kg-1) Udeo u ukupnom
neorganskom P (%) Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
H2O Rastvorljivi
P
Kontrola 0.17±0.02aA 1.28±0.16aB 0.05±0.00aA 0.31±0.03aB Stajnjak 2.0±0.2bA 2.17±0.16bA 0.44±0.00bA 0.51±0.02bA NPK 1.9±0.1bA 1.51±0.14bA 0.44±0.01bB 0.33±0.01aA CaCO3 5.0±0.4cB 2.26±0.21cA 1.30±0.19bB 0.59±0.09bA Stajnjak+ CaCO3 6.2±0.4cA 6.2±0.8dA 1.75±0.27cA 1.6±0.1cA NPK+CaCO3 5.1±0.3cA 5.7±0.6dA 1.25±0.19cA 1.4±0.1cA
Al-P
Kontrola 12±1aA 19±1aB 3.8±0.3aA 4.9±0.4bB Stajnjak 20±1bA 22±2aA 4.2±0.2aA 5.2±0.1bB NPK 16±2abA 21±2aB 3.6±0.5aA 4.6±0.6bA CaCO3 22±2cB 15±1bA 5.8±0.9bB 3.9±0.1aA Stajnjak+ CaCO3 23±3cA 30±3cB 6.3±1.0bA 7.8±0.1cB NPK+CaCO3 22±2cA 27±2cB 5.2±1.1bA 6.8±0.8cA
Fe-P
Kontrola 250±24aA 264±32aB 61.1±1bA 65±1bA Stajnjak 301±24bA 272±24aA 64±1bB 23±1aA NPK 291±21bcA 296±32bA 66±1bA 64±3bA CaCO3 220±17aA 251±16aA 56±1Aa 65±1bB Stajnjak+ CaCO3 212±19aA 194±16cA 60±9aB 51±1bA NPK+CaCO3 243±24acA 237±2cA 58±1aA 58±4bA
Reduktibilni P
Kontrola 84±16aA 85±12aA 25±1aB 20±1aA Stajnjak 110±8aA 102±16aA 23±1aA 23±1aA NPK 90±7aA 98±7Aa 20±1aA 21±3aA CaCO3 107±8aA 84±7aA 27±2bB 22±1aA Stajnjak+ CaCO3 95±8aA 105±8aA 18±12aA 27±1bA NPK+CaCO3 101±11aA 90±8aA 24±1baA 22±3aA
Okludovani P
Kontrola 20±2bA 29±2aB 6.1±0.1cA 7.3±0.3cB Stajnjak 13±1aA 17±2bB 2.9±0.1aA 4.1±0.1aB NPK 22±2bA 28±2aA 4.9±0.6bA 6.1±0.1bB CaCO3 13±2aA 18±1bB 3.4±0.2aA 4.7±0.5aB Stajnjak+ CaCO3 30±2cA 31±1aA 8.5±1.3cA 8.2±0.4dA NPK+CaCO3 24±2bA 26±2aA 5.8±0.1b A 6.4±0.6bA
Ca-P
Kontrola 9.8±0.8aA 8.7±0.8aA 2.9±0.1aA 2.2±0.1aA Stajnjak 18±2bB 14.1±1bA 3.9±0.3bA 3.4±0.3bA NPK 21±2bB 13.1±1bA 4.6±0.3bB 3.4±0.3bA CaCO3 21±1bB 14.1±1bA 5.3±0.4cbB 3.6±0.1bA Stajnjak+ CaCO3 17±2bB 14.1±1bA 4.4±0.4bA 3.8±0.1bA NPK+CaCO3 21±2bB 18.1±1bA 5.1±0.6bcB 4.4±03cA
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
72
U rizosferi L1 zemljišta efekat svih mera popravke bio je dodatno modifikovan
(Tabela 21). U poređenju sa kontrolnim tretmanom mera kalcizacije zemljišta,
nezavisno od toga da li je bila primenjena bez ili u kombinaciji sa drugim merama,
uticala je na povećanje koncentracije H2O-rastvorljivog P (30 puta) i koncentracije Ca-P
i Al-P (oko 2 puta) u rizosferi pšenice. Međutim, ni u jednom tretmanu sa krečom nije
bilo izraženih promena u koncentracijama Fe-P i reduktibilnog P u rizosfenom
zemljištu. Nasuprot tome, mera kalcizacije bez dodatnog unosa P uticala je na
smanjenje rizosfernih koncentracije okludovanog P (1.5 puta), dok se u kombinovanom
tretmanu sa stajnjakom rizosferna koncentracija okludovanog P povećala 1.5 puta.
Pojedinačna primenena stajnjaka ili NPK đubriva (bez korekcije pH kalcizacijom) na
sličan način uticala je na sledeće frakcije neorganskog P: H2O-rastvorljivi P (povećanje
11 puta), Fe-P (povećanje 1.2 puta) i Ca-P (povećanje 2 puta), dok ova mera nije
ispoljila efekat na frakciju reduktibilnog P u rizosfernom zemljištu. Unos stajnjaka
uticao je na porast rizosferne koncentracije Al-P (1.6 puta), uz istovremeno smanjenje
rizosferne koncentracije okludovanog P (1.5 puta), dok se ove frakcije neoganskog P u
rizosferi pšenice nisu menjale u tretmanu sa NPK (Tabela 21).
Interesantno je da se efekat pojedinih mera razlikuje između rizosfernog i
okolnog zemljišta. Na primer, u tretmanu CaCO3 H2O-rastvorljiva P frakcija se
povećala samo dva puta u odnosu na kontrolu u okolnom (“balk”) zemljištu, dok je u
rizosferi ovaj efekat bio mnogo izraženiji (povećanje 30 puta, Tabela 21).
Na L2 zemljištu primenjene mere takođe su uticale na promene zastupljenosti
frakcija neorganskog P, kako u rizosfernom tako i u okolnom (“balk”) zemljištu (Tabela
22). Upoređujući efekat mera za popravku na ova dva eksperimentalna zemljišta (L1 i
L2), najveće razlike su uočene kod kalcizacije (Tabele 21 i 22). U balku L2 zemljišta
kalcizacija per se, bez dodatka organskog ili mineralnog P (stajnjak ili NPK) uticala je
samo na koncentraciju H2O-rastorljivog i reduktibilnog P (Tabela 22), pri čemu se
koncentracija H2O-rastvorljive frakcije povećala 1.8 puta, a koncentracija reduktibilne
frakcije P se smanjila 1.6 puta. Kombinacija organskog đubriva (stajnjaka) i kalcizacije
uticala je na promene u koncentraciji skoro svih neorganskih frakcija P (Tabela 22). Sa
jedne strane, ovaj tretman (stajnjak+ CaCO3) uticao je na značajno povećanje
koncentracije H2O-rastvorljivog P (17.6 puta), dvostruko povećanje koncentracije P
73
vezanog za Al (Al-P), smanjenje reduktibilnog P (1.3 puta) i okludovanog P (2 puta), ali
isto tako je uticala i na povećanje koncentracije frakcija P vezanih za Fe (Fe-P, 1.6 puta)
i Ca (Ca-P, 1.3 puta). Interesantno je da je primena kalcizacije u kombinaciji sa NPK
đubrivom (NPK+CaCO3) uticala samo na povećanje H2O-rastvorljivog P (16 puta), Fe-
P (oko 2 puta) i Ca-P (1.5 puta), bez značajnijeg uticaja na ostale frakcije neorganskog
P. Sa druge strane, pojedinačna primena stajnjaka (bez korekcije pH krečom) uticala je
jedino na promenu u okludovanom P (smanjenje 1.4 puta u odnosu na kontrolu).
Primenom NPK đubriva (bez korekcije pH kalcizacijom) povećana je koncentracija svih
neorganskih frakcija P i to H2O-rastvorljivog 2.6 puta, Al-P 2.8 puta, reduktibilnog P
1.4 puta , okludovanog P 2 puta i Ca-P 1.4 puta (Tabela 22).
Slično L1 zemljištu, i kod L2 zemljišta je efekat primene mera za popravku
zemljišta bio dodatno modifikovan procesima u rizosferi (Tabela 22). Nezavisno od
toga da li je kreč bio primenjen samostalno ili u kombinaciji sa organskim i
neorganskim đubrivima, mera kalcizacije (korekcija pH vrednosti zemljišta) uticala je
na smanjenje koncentracija reduktibilnog i okludovanog P (1.8 puta i 1.6 puta,
ponaosob) i dovela do porasta koncentracije Ca-P (oko 1.7 puta). Efekat kalcizacije
posebno je bio izražen kod promena dostupnih frakcija P u rizosferi pšenice. Tako je, na
primer, kalcizacija per se, uticala na povećanje rizosfernih koncentracija H2O-
rastvorljivog P (1.6 puta) i smanjenja Fe-P (1.7 puta). Sa druge strane, u kombinaciji sa
organskim đubrivom (stajnjak), kalcizacija je uticala na povećanje rizosferne
koncentracije H2O-rastvorljivog P (9 puta) Al-P (2.6 puta), međutim bez efekta na
promenu koncentracije Fe-P u rizosferi pšenice. Kombinacija kalcizacije i mineralnog
NPK đubiva uticala je na povećanje koncentracija H2O-rastvorljivog P (11 puta) i P-Fe
(1.6 puta). Samostalna primena stajnjaka (bez korekcije pH kalcizacijom) nije uticala na
promenu rizosfernih koncentracija H2O-rastvorljivog P i Ca-P, ali je uticala na
povećanje rizosfernih koncentracija Al- P (1.8) i Fe- P (1.3 puta), uz istovremeno
smanjenje koncentracija reduktibilnog (1.6) i okludovanog (1.6) P u rizosferi pšenice.
Pojedinačna primena NPK đubiva uticala je na povećanje rizosfernih koncentracija svih
neorganskih frakcija P, osim reduktibilnog i okludovanog P. Dok je povećanje
rizosfernih koncentracija H2O-rastvorljivog P, Fe-P i Ca-P bilo neznatno (1.2-1.6 puta),
koncentracija Al-P u rizosferi povećana je čak 4 puta (Tabela 22).
74
Tabela 22. Efekat primenjenih mera popravke na frakcije neorganskog P u L2 zemljištu
Frakcije P Tretmani Koncentracija P
(mg kg-1) Udeo u ukupnom
neorganskom P (%)
Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
H2O rastvorljivi
P
Kontrola 0.68±0.0aB 0.47±0.03aA 1.7±0.1aA 1.16±0.02aB Stajnjak 0.62±0.04aB 0.48±0.03aA 1.4±0.04aA 1.19±0.01aA NPK 0.79±0.06bA 1.2±0.1cB 1.3±0.1aA 1.7±0.4aA CaCO3 0.96±0.06bA 0.88±0.05bA 3.4±0.7bB 2.39±0.15bA Stajnjak+ CaCO3 6.39±0.49cA 8.3±0.5dA 11±1cA 14.1±0.2cB NPK+CaCO3 7.8±0.6cA 7.8±0.5dA 14.0±1.0dA 11.9±0.3cB
Al-P
Kontrola 1.3±0.2aA 1.8±0.1aB 3.3±0.4bB 4.5±0.1bA Stajnjak 2.3±0.1bA 2.6±0.2bA 5.2±0.1cA 6.4±0.1cB NPK 5.2±0.5dA 4.8±0.4cA 8.8±0.3dB 7.2±0.2cA CaCO3 1.4±0.1aA 1.3±0.2aA 5.1±0.2cB 3.5±0.2bA Stajnjak+ CaCO3 3.4±0.3cA 3.6±0.3cA 6.2±0.4dA 6.2±0.1cA NPK+CaCO3 1.3±0.2cA 1.1±0.1aB 2.4±0.1aA 1.7±0.3aB
Fe-P
Kontrola 17±1bA 17±1aA 44±1bA 42±1aA Stajnjak 22±2cA 18±1aA 52±1cB 44±1aA NPK 20±2cA 32±2bB 52±1cA 47±1aB CaCO3 10±1aA 16±2aB 36±1aA 43±1aB Stajnjak+ CaCO3 29±3cA 27±2bA 52±1cB 45±1aA NPK+CaCO3 28±3cA 33±3bA 52±1cA 50±1bA
Reduktibilni P
Kontrola 14±1bB 11±1bA 37±1cB 28±1bA Stajnjak 13±2bA 12±1bA 32±1cA 30±1cA NPK 14±1bA 16±2cA 24±1bA 25±1bA CaCO3 8.3±0.5aB 6.7±0.4aA 30±1cB 18±1aA Stajnjak+ CaCO3 8.5±0.6aA 8.9±0.8aA 16±1aA 15±1aA NPK+CaCO3 8.4±0.3aB 11±1bA 15±1aA 17±1aA
Okludovani P
Kontrola 1.1±0.1cA 1.06±0.24bA 2.7±0.3bA 2.5±0.4cA Stajnjak 0.45±0.03aB 0.29±0.02aA 1.0±0.1aA 0.71±0.02aA NPK 1.4±0.2cA 2.14±0.10cB 2.5±0.2bA 3.1±0.1dA CaCO3 0.72±0.08bA 1.08±0.16bA 2.5±0.1baA 2.9±0.1cA Stajnjak+ CaCO3 0.70±0.06bB 0.41±0.03aB 1.3±0.2aB 0.69±0.01aA NPK+CaCO3 0.75±0.02bA 1.06±0.08bB 1.3±0.1aA 1.6±0.03bA
Ca-P
Kontrola 4.2±0.3aA 8.2±0.6aB 11±0.2bA 20±1dB Stajnjak 3.8±0.2aA 6.9±0.4aB 8.7±0.2aA 17±1aB NPK 6.8±0.6bA 10±1aB 11±1bA 16±1aB CaCO3 6.6±0.3bA 10±2aB 24±1dA 30±1cB Stajnjak+ CaCO3 7.0±0.6bA 11±1aB 12±1bA 19±1abB NPK+CaCO3 8.2±0.3cA 12±2aB 15±1cA 18±1abB
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Kao posledica rizosfernih procesa koncentracije dostupnih frakcija P mogu se
značajno razlikovati u rizosferi i okolnom zemljištu, a ove razlike mogu posredno
75
ukazati na usvajanje pojedinih frakcija korenom biljke (Hinsinger 2001). Ako se
uporede frakcije neorganskog P u rizosfernom i “balk” kompartmentu, najizraženije
razlike su postojale u kontroli, bez primene mera popravke zemljišta koje su mogle da
maskiraju te promene, pa je efekat rizosfernih procesa u modulaciji dostupnosti P bio
jasnije uočljiv.
U rizosferi kontrolne pšenice gajene na L1 zemljištu bez primene mera za
popravku (kontrola) došlo je do značajnog snižavanja koncentracija H2O-rastvorljivog
P, Al-P i okludovanog P u odnosu na “balk” zemljište (Tabela 21). U ostalim
tretmanima gde su primenjene različite mere popravke zemljišta, koncentracije H2O-
rastvorljive frakcije P u rizosfernom zemljištu nisu se značajno se razlikovale u
poređenju sa okolnim (“balk”) zemljištem (osim u tretmanu sa CaCO3) (Tabela 21).
Interesantno je da se okludovana frakcija P značajno smanjila u svim tretmanima u
kojima je koncentracija dostupnog PAL bila niska (videti Tabelu 20). Koncentracija Al-P
se značajno smanjila u rizosfernom u poređenju sa okolnim (“balk”) zemljištem u većini
tretmana, osim kontrole i CaCO3, dok su koncentracije Ca-P u rizosfernom zemljištu u
poređenju sa okolnim zemljištem bile značajno veće u svim tretmanima (Tabela 21).
Na L2 zemljištu u svim tretmanima došlo je do smanjenja koncentracije
rizosfernog Ca-P u odnosu na okolno zemljište (Tabela 22).
Na L1 zemljištu, visoka pozitivna korelacija utvrđena je između sadržaja P u
biljci i koncentracija H2O-rastvorljive, odnosno okludovane frakcije P, dok je na L2
zemljištu utvrđena pozitivna korelacija između sadržaja P u biljci i koncentracija H2O-
rastvorljivog P i Ca-P (Tabela 23).
Tabela 23. Pirsonov koeficijent korelacija između sadržaja P (mg po biljci) u nadzemnom delu pšenice, odnosno koncentracije dostupnog PAL (AL-ekstrakcija) u rizosferi i koncentracija neorganskih frakcija fosfora u rizosferi kod oba eksperimentalna zemljišta (L1 i L2).
Vodno rastvorljivi P Al-P Fe-P P
reduktibilni P
okludovani Ca-P
L1 zemljište PAL rizosfera 0.916** 0.760** -0.146 0.381 0.566** 0.428 P pšenica 0.941** 0.755** -0.317 0.327 0.613** 0.339
L2 zemljište PALrizosfera 0.828** 0.420 0.839** 0.346 0.016 0.610** P pšenica 0.908** -0.136 0.465 -0.703** 0.343 0.628**
76
4.2.4.5. Izmenjivi aluminijum (Al3+)
Koncentracije izmenjivog Al su bile daleko najveće u kontrolnim tretmanima u
oba zemljišta, pri čemu je koncentracija Al3+ na L2 zemljištu bila ekstremno visoka
(Videti Tabelu 4, Tabela 24). Kalcizacija zemljišta je snizila koncentracije izmenjivog
Al ispod granice detekcije (Tabela 24). Na L1 zemljištu koncentracija Al3+ se primenom
stajnjaka smanjila samo neznatno (20%), dok je kod L2 zemljišta zabeleženo smanjenje
od skoro 4 puta u odnosu na kontrolu. Pored toga, upotreba NPK đubriva je takođe bila
efikasna u smanjivanju koncentracije fitotoksičnog Al3+ na L2 zemljištu (smanjenje 2.3
puta u odnosu na kontrolu).
Tabela 24. Efekat primenjenih mera za popravku na koncentraciju izmenjivog Al (Al3+) u zemljištima
Tretmani Koncentracija izmenjivog Al (mg kg-1)
L1 L2 Rizosfera “Balk” Rizosfera “Balk”
Kontrola 71±7bA 76±8bA 200±25cA 201±31cA Stajnjak 59±8aA 60±6aA 51±1aA 61±7aA NPK 65±4bA 66±9aA 86±8bA 82±7bA CaCO3 <0.2 <0.2 <0.2 <0.2 Stajnjak+ CaCO3 <0.2 <0.2 <0.2 <0.2 NPK+CaCO3 <0.2 <0.2 <0.2 <0.2
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. Statistički značajne razlike između rizosfernog i okolnog (“balk”) zemljišta označene su različitim velikim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
4.2.4.6. Organska materija i CaCO3
Sadržaj organske materije (humusa) nije se značajno menjao ni u jednom od
zemljišta, nezavisno od mera popravke i zemljišnog kompartmenta (rizosfera/“balk“),
dok se sadržaj CaCO3 očekivano povećao u tretmanima sa krečom (Tabela 25).
77
Tabela 25. Efekat mera popravke zemljišta L1 i L2 na sadržaj humusa i CaCO3 u rizosferi eksperimentalnih zemljišta (L1 i L2)
Tretmani L1 L2 Humus (%) CaCO3 (%) Humus (%) CaCO3 (%)
Kontrola 1.20±0.16a 0.00±0.00a 0.25±0.02b 0.00±0.00a Stajnjak 1.17±0.37a 0.00±0.00a 0.25±0.03b 0.00±0.00a NPK 1.28±0.09a 0.00±0.00a 0.18±0.02a 0.00±0.00a CaCO3 1.23±0.08a 0.80±0.01b 0.34±0.03c 1.05±0.00b Stajnjak+ CaCO3 1.17±0.21a 0.60±0.0b 0.34±0.05c 0.82±0.00b NPK+CaCO3 1.22±0.12a 1.05±0.00b 0.22±0.01ab 0.42±0.00b
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između efekta različitih tretmana označene su različitim malim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05. 4.3. Uticaj silicijuma na procese u rizosferi pšenice na zemljištu
oštećenom kiselom rudničkom jalovinom
4.3.1. Testiranje različitih silikatnih đubriva
4.3.1.1. Efekat na rastenje pšenice i status fosfora u biljci
U ovom eksperimentu testirana je efikasnost različitih oblika silikatnih đubriva
kao inovativne mere za popravku kiselog zemljišta oštećenog rudničkom jalovinom
(sekundarna acidifikacija usled oksidacije sulfidnih primesa). Eksperiment je postavljen
na zemljištu sa lokacije L1 (za osnovna svojstva zemljišta sa ovog lokaliteta videti
Tabele 2, 3 i 4; zbog različitih godina uzorkovanja zemljišta vrednosti nekih parametara
se razlikuju), na kome su, osim niske pH i izraženog deficita P, visoke koncentracije
dostupnog Cu takođe ograničavajući faktor za rastenje pšenice. Korišćena su sledeća Si
đubriva: Na-silikat, Ca-silikat, monosilicijumska kiselina [Si(OH)4] i bio-silikatno
đubrivo (Bio-Si) na bazi Si-mobilizirajućih bakterija (Bacillus mucilaginosus). Posle
četiri nedelje tretmana pšenica je požnjevena i izmerena je suva biomasa nadzemnog
dela i korena i obavljena je analiza P u nadzemnom delu. Izgled biljaka pšenice na kraju
eksperimenta prikazan je na Slici 27.
78
Slika 27. Izgled pšenice na kraju eksperimenta.
U Tabeli 26 prikazani su efekti primene različitih oblika silikatnih đubriva kao
mere za popravku kiselih zemljišta oštećenih rudničkom jalovinom na biomasu pšenice
i status P u biljci. Sva primenjena đubriva uticala su na značajno povećanje biomase
nadzemnog dela i korena pšenice u odnosu na kontrolu (bez đubrenja), dok nije bilo
značajnih razlika između različitih Si đubriva. Porast nadzemnog dela pšenice je bio
visoko korelisan sa sadržajem P u biljci (r= 0.873; p <0.05). Svi preparati uticali su na
značajno povećanje koncentracije P u nadzemnom delu, kao i na količinu usvojenog P
(Tabela 26).
Tabela 26. Efekat primene različitih oblika silikatnih đubriva na suvu biomasu i status P pšenice gajene na zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom.
Tretman Suva biomasa (mg po biljci) Relativni odnos
koren/ nadzemni deo
Koncentracija P u nadzemnom delu
(% SM)
Usvojeni P (mg po sudu) Koren Nadzemni
deo Kontrola 12±4a 48±12a 0.25±0.01a 0.20±0.06a 1.2±0.1a Na-silikat 31 ±7b 88±16b 0.41±0.03c 0.31±0.03b 3.1±0.1b Ca-silikat 42 ±3b 110±36b 0.40±0.14b 0.30±0.04b 3.2±0.7b Si(OH)4 35 ±2b 96±16b 0.37±0.04b 0.30±0.04b 2.9±0.7b Bio-Si 20±3ab 84±8Ab 0.24±0.04a 0.35±0.05b 2.9±0.4b Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p <0.05.
79
4.3.1.2. Efekat na glavne ograničavajuće faktore i dostupnost silicijuma u rizosferi
Sva primenjena đubriva na bazi Si uticala su na značajno povećanje pH u
rizosferi u poređenju sa kontrolom, dok razlike između pojedinačnih silikatnih đubriva
nisu bile signifikantne (Tabela 27).
Tabela 27. Efekat primene različitih silikatnih đubriva na pH vrednost i dostupnost P (AL ekstrakcija), Si (CaCl2 ekstrakcija), i Cu (DTPA ekstrakcija) i izmenjivog Al (KCl ekstrakcija) u rizosferi pšenice gajene na zemljištu kompleksno oštećenom rudničkom jalovinom (L1).
Tretman pH (H2O)
Dostupni PAL (mg kg -1)
Dostupni Si (mg kg -1)
Dostupni Cu (mg kg -1)
IzmenjiviAl (mg kg -1)
Kontrola 4.3±0.1a 7.8±0.9a 12±3a 171±2a 131±34b Na-silikat 4.8±0.2b 14±2b 22±4b 165±10a 110±15ab Ca-silikat 4.8±0.1b 35±3c 28±7b 171±21a 153±2b Si(OH)4 4.7±0.2b 11±1b 21±2b 167±11a 148±28b Bio-Si 4.6±0.1b 8.5±0.6a 31±7b 158±7a 92±12a
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p <0.05.
Efekat primene silikatnih đubriva na koncentraciju dostupnog P u rizosferi
pšenice prikazan je u Tabeli 27. Osim biosilikatnog đubriva koje je sadržalo kulturu
bakterija sposobnih da mobilišu Si iz minerala zemljišta, sva ostala đubriva na bazi Si
uticala su na značajno povećanje dostupnog P u rizosfernom zemljištu u odnosu na
kontrolu bez đubrenja. U poređenju sa kontrolnim tretmanom primena Na-silikata
dovela je do povećanja koncentracije PAL 1.8 puta, Ca-silikata 4.5 puta, i Si(OH)4 1.4
puta. Sva primenjena silikatna đubriva uticala su na značajno povećanje koncentracije
dostupnog Si u rizosfernom zemljištu, ali je najbolji efekat imalo biosilikatno đubrivo
(Tabela 27). Sa druge strane, primena silikatnih đubriva kao mera popravke ovog
zemljišta nije uopšte uticala na promenu koncentracija dostupnog bakra, dok je
izmenljivi Al bio smanjen za oko 30% jedino u tretmanu sa bioslikatnim đubrivom.
Koncentracije neorganskih frakcija P u rizosfernom zemljištu prikazane su u
Tabeli 28. U poređenju sa kontrolom, koncentracija H2O-rastvorljive frakcije P
značajno se povećala u tretmanima sa Na- i Ca-silikatom, dok povećanje kod ostalih Si
tretmana nije bilo značajno. Koncentracije reduktibilne i okludovane frakcije P se nisu
značajno menjale u tretmanima Si u poređenju sa kontrolom. Međutim, kod svih
80
tretmana Si došlo je do značajnog smanjenja Fe-P frakcija. Frakcija Al-P u rizosfernom
zemljištu razlikovala se značajno između kontrole i tretmana sa Ca-silikatom, Si(OH)4 i
Bio-Si, dok između kontrole i Na-Si nisu zabeležene značajne razlike u povećanju ove
frakcije P. Sličan trend pokazala je i frakcija Ca-P, s tom razlikom da nije bilo značajnih
razlika ni između kontrole i Si(OH)4.
Tabela 28. Efekat primene različitih silikatnih đubriva na koncentraciju frakcija neorganskog P u rizosferi pšenice gajene na kiselom zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom (L1).
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa p <0.05 4.3.2. Mehanizam delovanja silicijuma
Kako je prethodnim eksperimentom pokazano da sva primenjena silikatna
đubriva jesu uticala na povećanje pH i dostupnog P ali ne i na smanjenje dostupnog Cu
(videti Tabelu 27), u cilju razjašnjavanja mehanizma delovanja Si na prevazilaženje
višestrukog stresa kod pšenice gajene na zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom,
korišćeno je zemljište tipa L2 na kome dostupnost Cu nije ograničavajući faktor, a
deficit P je još izraženiji (videti Tabele 2, 3 i 4 za osnovna svojstva zemljišta sa ovog
lokaliteta). Izabran je tretman sa Na-silikatom koji je pokazao srednji do slabiji efekat
na mobilnost P u rizosferi, dok je njegov efekat na rastenje pšenice i status P u biljci bio
sličan sa ostalim primenjenim Si đubrivima (Tabele 26-28; Slika 27).
4.3.2.1. Rastenje pšenice i status fosfora
U cilju objektivnije procene efekta silicijuma, primenjenog u obliku Na-silikata,
kao inovativne mere za popravku zemljišta sekundarno zakišeljenih rudarskim
Tretman
H2O-rastvorljivi
P (mg kg-1)
Al-P (mg kg-1)
Fe-P (mg kg-1)
Reduktibilni P
(mg kg-1)
Okludovani P
(mg kg-1)
Ca-P (mg kg-1)
Kontrola 0.76±0.08a 8.5±0.6a 138±10b 74±6a 24±4a 3.7±0.2a Na-silikat 0.84±0.07b 7.5±0.3a 114±8a 72±7a 22±2a 2.5±0.4a Ca-silikat 0.93±0.05b 13±1b 103±9a 77±10a 23±3a 8.7±0.8b Si(OH)4 0.78±0.08a 21±2c 96±6a 74±3a 21±2a 3.5±0.5a Bio-Si 0.83±0.11a 9.8±0.9b 105±14a 68±4a 23±3a 16±1c
81
aktivnostima, pored kontrole bez unosa đubriva (Kontrola 1), korišćen je i tretman
mineralnim P đubrivom (superfosfat), kao pozitivna kontrola (Kontrola 2).
Tabela 29. Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku zemljišta na parametre rastenja pšenicе gajene na zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom (L2).
Tretmani Suva masa (mg po biljci) Relativni odnos koren/ nadzemni deo Nadzemni deo Koren
Kontrola 1 (-P) 16.0±1.15a 2.5±0.1a 0.16±0.01a Kontrola 2 (+P) 30.8±3.1b 10.2±1.8b 0.29±0.02b Na-silikat (-P) 94.7±14.0c 39.3±3.4c 0.44±0.05c
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Rezultati su pokazali da unošenje Na-silikata u zemljište može značajno da
poboljša rastenje pšenice na zemljištu oštećenom kiselom rudničkom jalovinom (Slike
27 i 28; Tabela 29). Biljke koje su rasle u tretmanu sa Si akumulirale su značajno veću
suvu biomasu, kako nadzemnog dela tako i korena, u poređenju sa obe kontrole (-/+ P).
Đubrenje Si uticalo je na povećanje suve biomase nadzemnog dela za više od 6 puta
(Tabela 29). U odnosu na kontrolni tretman bez P biomasa korena pšenice je povećana
za oko 16 puta. Alokacija biomase ka korenu rezultirala je povećanim odnosom
biomase korena i nadzemnog dela za čak 250 % u odnosu na Kontrolu 1 (-P).
.
Slika 28. Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku na rastenje pšenicе gajene na zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom.
82
Unošenje Si u zemljište se pokazalo kao efikasna mera poboljšanja statusa P u
nadzemnom delu pšenice (Tabela 30). Primenjeno Na-silikatno đubrivo je imao sličan
ili čak bolji efekat na status P u pšenici nego samo đubrenje fosfatima (Kontrola 2).
Tabela 30. Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku zemljišta na status P kod pšenice gajene na zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom.
Tretmani Koncentracija P u
nadzemnom delu (% SM)
Količina akumuliranog P u nadzemnom delu
(mg P po posudi)
Kontrola 1 (-P) 0.18±0.03b 0.29±0.04 a Kontrola 2 (+P) 0.14±0.01b 0.45±0.08 b Na-silikat (-P) 0.27±0.03a 2.36±0.18 d
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
U odnosu na kontrolni tretman bez P (Kontrola 1), primena Si je uticala na
povećanje koncentracije P u nadzemnom delu pšenice za oko 50 % (Tabela 30). Ova
mera bila je mnogo efikasnija od primene mineralnog P đubriva, tako da je
koncentracija P u nadzemnom delu pšenice đubrene silikatnim đubrivom povećana
skoro duplo u odnosu na biljke đubrene superfosfatom. Efekat dodavanja Si je bio još
izraženiji na ukupnu količinu P akumuliranu u nadzemnom delu pšenice (Tabela 30). U
odnosu na Kontrolu 1 (-P) količina akumuliranog P se povećala 8 puta, a u odnosu na
Kontrolu 2 (+P) 5 puta (Tabela 30). Interesantno je da status P u pšenici nije bio
uslovljen samo koncentracijom dostupnog P u rizosferi (videti Tabelu 31). Tako su i
koncentracija i količina akumuliranog P u biljci đubrenoj mineralnim P bili značajno
manji u poređenju sa pšenicom tretiranom Si, uprkos tome što je koncentracija P u
rizosferi kod P tretmana (Kontrola 2) bila skoro 10 puta veća u odnosu na tretman sa Si
(Table 30 i 31).
4.3.2.2. Promene glavnih faktora mineralnog stresa u rizosfernom zemljištu
Primena Na-silikata eliminisala je stres niske pH rizosfernog zemljišta i smanjila
skoro 7 puta koncentraciju izmenljivog Al, dok samo dodavanje mineralnog P nije
imalo nikakav efekat na ova dva ograničavajuća faktora oštećenog zemljišta (Tabela
83
31). Sa druge strane, primena Si-đubriva nije direktno uticala na eliminaciju stresa
deficita P u ovom zemljištu, za razliku od mineralnog P đubriva koje je povećalo
rizosfernu koncentraciju dostupnog P devet puta (Tabela 31).
Tabela 31. Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku zemljišta na pH vrednost i koncentracije dostupnog P (AL ekstrakcija) i izmenjivog Al u rizosferi pšenice.
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
4.3.2.3. Frakcije neorganskog fosfora u rizosferi
Najveća koncentracija H2O-rastvorljive frakcije P zabeležena je u tretmanu
mineralnim P (Kontrola 2), gde je ova frakcija porasla preko 18 puta u odnosu na
Kontrolu 1 (-P) (Tabela 32). Interesantno, u tretmanu sa Si koncentracija H2O-
rastvorljivog P čak se neznatno smanjila. Sličan trend zabeležen je i kod ostalih frakcija
P: značajno povećanje koncentracija kod Kontrole 2 (+P) i smanjenje koncentracija
(značajno samo kod Fe-P) kod Si tretmana u odnosu na Kontrolu 1 (Tabela 32). Ostale
frakcije fosfora se nisu značajno promenile pod uticajem silikatnog đubrenja. Međutim,
koncentracija Fe-P se apsolutno smanjila samo za 5 mg kg-1, što može da objasni
nemogućnost detekcije značajnih razlika u dostupnom P ekstrahovanom AL-metodom
(Tabela 31). Nezavisno od primenjenog tretmana, frakcija H2O-rastvorljivog P činila je
najmanji deo od ukupnog neorganskog P u svim tretmanima, dok je Fe-P bila
najzastupljenija (Tabela 33). Efekat primenjenog Si na relativan udeo frakcija u
ukupnom neorganskom P pokazao je isti trend kao i koncentracije frakcija P (videti
Tabelu 32).
Tretmani pH pH Dostupni PAL Izmenjivi Al (H2O) (1M KCL) (mg kg-1) (mg kg-1)
Kontrola 1 (-P) 4.07 ± 0.01a 3.01±0.01a 1.32± 0.03a 33.29±2.1b Kontrola 2 (+P) 4.00 ± 0.17a 3.22±0.05b 11.7 ± 0.98b 39.52±4.2b Na-silikat (-P) 6.13± 0.11b 5.44±0.04c 1.25± 0.21a 4.92±0.7a
84
Tabela 32. Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku zemljišta na koncentraciju frakcija neogranskog P u rizosferi pšenice.
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV.Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Tabela 33. Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku zemljišta na relativni udeo pojedinih frakcija u ukupnom neorganskom P u rizosferi pšenice.
Rezultati predstvaljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku zemljišta na mineralni
sastav pšenice gajene na zemljištu oštećenom kiselom rudničkom jalovinom prikazan je
u Tabeli 34. Rezultati su pokazali da u uslovima višestrukog mineralnog stresa (videti
Tabelu 31 i 34.) kod pšenice na L2 zemljištu primena silikatnog đubriva nije uticala na
koncentraciju Al, Mn i Zn u pšenici, dok je sadržaj As bio redukovan skoro za oko 40
%, a sadržaj Cu za oko 50 %. (Tabela 34).
Tabela 34. Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku zemljišta na mineralni sastav pšenice gajene na zemljištima oštećenim kiselom rudničkom jalovinom
Tretman Al As Cu Mn Zn mg kg-1
Kontrola 1 (-P) 47 ±17a 3.4±0.1c 11±1b 33.±2a 7.3±2.4a Kontrola 2 (+P) 42±0.4a 1.0±0.3a 18±2b 24±3a 7.7±0.1a Na-silikat (-P) 54 ±3a 2.1±0.2b 5.6±0.3a 27±3a 7.7±0.9a
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Tretmani H2O-
rastvorljivi P (mg kg -1)
Al-P (mg kg-1)
Fe-P (mg kg-1)
Reduktibilni P (mg kg-1)
Okludovani P (mg kg-1)
Ca-P (mg kg-1)
Kontrola 1 (-P) 0.32±0.08a 2.1±0.3a 17±1b 1.9±0.2a 1.4±0.2a 1.9±0.2a Kontrola 2 (+P) 6.0±0.7b 11±1b 42±8c 12±1b 9.1±0.9b 7.2±0.9b
Na-silikat (-P) 0.25±0.03a 2.2±0.3a 12±1a 1.9±0.2a 1.2±0.1a 2.0±0.2a
Tretmani Relativni udeo (% od ukupnog neorganskog P)
H2O- rastvorljivi P
Al-P Fe-P Reduktibilni P Okludovani P Ca-P
Kontrola 1 (-P) 1.3a 8.4a 69.1b 7.6a 5.9a 7.6a Kontrola 2 (+P) 6.8b 13.2b 47.3c 14.3b 10.3b 8.2b Na-silikat (-P) 1.2a 10.8a 61.9a 9.8a 6.0a 10.2a
85
4.3.2.4. Mobilizacija fosfora u rizosferi pšenice
4.3.2.4.1. Dinamika efluksa organskih anjona
Za praćenje dinamike eksudacije organskih anjona efekat đubrenja Na-silikatom
(+Si) upoređivan je sa kontrolom bez primene mera popravke zemljišta. Sakupljanje
eksudata sa vrhova intaktnih korenova u rizoboksovima (Slika 29) počelo je kada su se
na kontrolnim biljkama pojavili simptomi deficita P (tamno crvena boja listova).
Eksudati korena su sakupljani svakodnevno tokom perioda od 6 dana. Dodatak Si
pokazao je jasan pozitivan efekat na porast korena pšenice (Slika 29).
+Si -Si
10 mm
Slika 29. Intaktni korenovi pšenice u rizoboksu.
Sa pojavom simptoma deficita P došlo je i do porasta efluksa organskih anjona
(Slika 30). Uočljivo je da efluks ukupnih organskih anjona pokazuje najmanje vrednosti
prvog dana pojave simptoma deficita. Nezavisno od toga da li je pšenica bila tretirana Si
86
eksudacija organskih anjona je bila najintezivnija tokom drugog i petog dana od pojave
simptoma deficita P (Slika 30). Unos Na-silikata (+Si) u zemljište uticao je na značajno
pojačanje eksudacije ukupnih organskih anjona u toku drugog i trećeg dana u odnosu na
kontrolu (-Si).
Dani od pojave simptoma P deficita1 2 3 4 5 6
Eflu
ks o
rgan
skih
anj
ona
(g
g-1su
ve m
ase
h-1)
0
500
1000
1500
2000
2500 -Si +Si
ab
c c ccd
deddf
f
ggf
Slika 30. Efekat primene Si na dinamiku efluksa ukupnih organskih anjona u korenu pšenice gajene na zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05 U eksudatima korena pšenice detektovani su sledeći organski anjoni: citrati,
malati, sukcinati, fumarati, laktati i šikimati (Slike 31 i 32). Eskudacija sukcinata kod
kontrolnih biljaka (-Si) se lagano povećavala sve do petog dana od pojave simptoma
deficita P da bi šestog dana naglo opala (Slika 31a). Kod biljaka tretiranih Si efluks
sukcinata se dramatično povećao drugog dana, kada je bio signifikantno veći nego kod
kontrolnih biljaka, a zatim pokazuje trend laganog opadanja. Eksudacija fumarata iz
korena kontrolnih biljaka (-Si) se takođe naglo povećala drugog dana, a zatim je polako
opadala do kraja eksperimenta (Slika 31b). Kod pšenice đubrene Na-silikatom (+Si)
efluks fumarata raste drugog i trećeg, a posebno petog dana, kada pokazuje 3 puta veću
vrednost u odnosu na kontrolne (-Si) biljke. Odavanje laktata sa korena pšenice je uvek
bilo veće kod kontrolnih (-Si) biljaka u odnosu na Si-tretirane (Slika 31c). Ova razlika
je bila najizraženija tokom prvog dana pojave simptoma deficita P, sa izuzetkom petog
dana. Slično ostalim organskim anjonima, efluks šikimata je bio najslabiji tokom prvog
dana, nakon čega značajno raste dostižući svoj maksimum drugog i trećeg dana (Slika
31d). Jedino je prvog dana zabeležen značajno veći efluks šikimata iz korena +Si
87
biljaka u odnosu na kontrolne (-Si) biljke, dok su tokom drugog i četvrtog dana
korenovi –Si biljaka izlučili više šikimata u odnosu na +Si biljke (Slika 31d).
Dani od pojave simptoma P deficita1 2 3 4 5 6
Eflu
ks S
ukci
nata
(g
g-1su
ve m
ase
h-1)
0
200
400
600
800
1000
1200-Si +Si
Dani od pojave simptoma P deficita1 2 3 4 5 6
Eflu
ks F
umar
ata
(g
g-1 s
uve
mas
e h-1
)
0
1
2
3
4-Si +Si
Dani od pojave simptoma P deficita1 2 3 4 5 6
Eflu
ks L
akta
ta(
g g-1
suv
e m
ase
h-1)
0
200
400
600
800
1000-Si +Si
Dani od pojave simptoma P deficita1 2 3 4 5 6
Eflu
ks Š
ikim
ata
(g
g-1 s
uve
mas
e h-1
)
0
1
2
3
4
5
6-Si +Si
a a bccc
d d
ef
g
g
a
b b b b
ccbc
de
cde
ab b b b
cdc
ee
fg
g
a
bbccc dc
dd
ee e
f
a b
c d
Slika 31. Efekat primene Si na dinamiku efluksa organskih anjona sa korena pšenice gajene na zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom. Prikazan je efluks sukcinata (a), fumarata (b), laktata (c) i šikimata (d). Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Efluks citrata i malata je značajno varirao tokom trajanja eksperimenta, a
dodatak Si je dodatno uticao na patern eksudacije (Slika 32). Kod kontrolnih biljaka (-
Si) efluks citrata započinje drugog dana nakon pojave simptoma deficita P i završava se
četvrtog dana od pojave simptoma (Slika 32a). Kod biljaka tretiranih Si citrati u
eksudatu korena bili su prisutni tokom svih šest dana (Slika 32a). Prvi porast stope
eksudacije citrata zabeležen je drugog dana nakon pojave simptoma deficita P. U
periodu od drugog do petog dana efluks citrata je bio konstantan oko (5 µg g-1 h-1) uz
manja variranja. Tokom šestog dana od pojave simptoma deficta P, efluks citrata
pokazuje nagli skok na 10 µg g-1 h-1. Ipak, tokom drugog i četvrtog dana eksperimenta
nije bilo značajne razlike u količini izlučenih citrata između –Si i +Si tretmana.
88
1 2 3 4 5 6
Eflu
ks C
itrat
a(
g g-1
suv
e m
ase
h-1)
02468
101214 -Si
+Si
1 2 3 4 5 6
Eflu
ks M
alat
a (
g g-1
suv
e m
ase
h-1)
0
200
400
600
800
1000
1200 -Si +Si
a a a
b
bcc
b
cc c c
bd
a b
ee
d
e
d d
ff
c
e
Dani od pojave simptoma P deficita Dani od pojave simptoma P deficita
a b
Slika 32. Efekat primene Si na dinamiku efluksa citrata (a) i malata (b) u korenu pšenice gajene na zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Za razliku od citrata, malati su bili prisutni u eksudatima korena tokom svih 6
dana praćenja eksudacije i kod kontrole (-Si) i kod pšenice đubrene Si (Slika 32b).
Prvog dana od pojave simptoma deficita P stopa eksudacije malata je bila za 50 % veća,
dok je trećeg i šestog dana efluks malata iz Si-tretirane pšenice je bio veći za skoro100
% u odnosu na kontrolu (-Si). Međutim, drugog, četvrtog i petog dana nisu uočene
razlike između kontrolnih (-Si) i +Si biljaka (Slika 32b).
Relativni udeo citrata i malata u ukupnoj količini organskih anjona izlučenih iz
korena takođe je bio značajno veći kod pšenice tretirane Si (Slika 33 a i b).
Procenat citrata u ukupnim eksudatima bio je mali, u proseku svega 0.35 %
kod kontrolnih i oko 0.84% kod +Si biljaka (Slika 33a). Kod pšenice tretirane Si
maksimalni udeo citrata postignut je prvog (1.5 %) i šestog (1.6 %) dana od pojave
simptoma deficita P, dok kod kontrolnih biljaka (-Si) udeo citrata u ukupnim
eksudatima korena nije značajnije varirao.
Malati su činili veći deo od ukupnih eksudata, minimalno 10 % i maksimalno
63 % (Slika 33b). Udeo malata kod kontrole (-Si) je naglo porastao od 10% prvog dana
do 40% drugog dana. Posle toga, udeo malata u ukupnim eksudatima korena pšenice
ostaje konstantan (oko 30 %). Kod pšenice tretirane Si, sa izuzetkom drugog dana,
relativni udeo izlučenih malata bio je konstantan (oko 50% od ukupnih eksudata
korena), a šestog dana zabeležen je blagi porast do 63% (Slika 33b).
89
Dani od pojave simptoma P deficita
1 2 3 4 5 60,0
0,5
1,0
1,5
2,0-Si +Si
1 2 3 4 5 60
20
40
60
80-Si +Si
1 2 3 4 5 60
2040
6080
100
120 -Si +Si
a
d
b
bc
b
bc b
c
a
b
a
d
a
def bcde
ab bc
def
bc
defbcd
ef
ab
f
e
a
cd
ab
bcd
a aab
aabc
d
ab
Rel
ativ
ni u
deo
Citr
ata
(%)
Dani od pojave simptoma P deficita
Dani od pojave simptoma P deficita
Rel
ativ
ni u
deo
Mal
ata
(%)
Rel
ativ
ni u
deo
Lakt
ata
(%)
c
b
a
Slika 33. Efekat primene Si na relativan udeo citrata (a), malata (b) i laktata (c), u ukupnim eksudatima korena pšenice gajene na zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05 Laktati su takođe činili znatan deo eksudata korena pšenice, čak 77 % prvog
dana kod kontrole (-Si)(Slika 33c). Međutim, drugog dana udeo laktata u eksudatima
korena naglo opada na 50 %, a zatim nastavlja da opada nešto sporije, sve do 6 dana
kada ponovo raste na 50%. Kod pšenice tretirane Si laktati su činili znatno manji udeo
od ukupnih eksudata korena, maksimalno 33 % tokom petog dana (Slika 33c). Udeo
laktata u ukupnim eksudatima korena pšenice bio je značajno manji kod biljaka
90
tretiranih Si u poređenju sa kontrolom. Razlika između kontrolnog i Si tretmana bila je
najizraženija prvog dana, kada su +Si biljke izlučile 3 puta manje laktata u odnosu na
kontrolne (-Si) biljke.
Šikimati čine samo neznatni deo od ukupno eksudovanih anjona, ne prelazeći
0.8 % (Slika 34a). Kod –Si pšenice u toku prva tri dana udeo šikimata raste dostižući
maksimalnu vrednost trećeg dana (0.72%). Posle toga udeo šikimata opada, a najmanja
vrednost je zabeležena 5 dana (0.03%). Kod Si tretirane pšenice najveći udeo šikimata
je postignut prvog dana (0.71%), a posle toga opada. U odnosu na -Si biljke udeo
šikimata je jedino prvog i petog dana bio veći kod +Si biljka. Sukcinati su činili manji
deo eksudata korena pšenice, varirajući od minimum 8.7 % drugog dana kod kontrole
do maksimalnih 48 % drugog dana kod +Si biljaka (Slika 34b). Nakon drugog dana
udeo sukcinata u ukupnim eksudatima korena kod +Si biljaka opada i dostiže
minimalnu vrednost šestog dana (6.6%). Nasuprot tome, kod -Si pšenice udeo sukcinata
raste sve do četvrtog dana (40%) a zatim opada (Slika 34b). Tokom prva tri dana udeo
sukcinata u ukupnim eksudatima bio je veći kod +Si biljaka, da bi se u toku poslednja
tri dana ovaj trend okrenuo i bio veći kod -Si biljaka. Fumarati su činili samo mali udeo
ukupnih eksudata korena, maksimalno do 0.67 % i to prvog dana kod +Si biljaka (Slika
34c). Posle prvog dana udeo fumarata kod +Si biljaka opada na vrednosti između 0.1 do
0.2 %. Kod kontrolnih (-Si) biljaka fumarati su činili maksimalno 0.35 % od ukupnih
eksudata korena i to trećeg dana.
91
Dani od pojave simptoma P deficita1 2 3 4 5 6
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0-Si +Si
Dani od pojave simptoma P deficita1 2 3 4 5 6
0
10
20
30
40
50
60- SI +SI
Dani od pojave simptoma P deficita
1 2 3 4 5 60,0
0,2
0,4
0,6
0,8-Si +Si
Rel
ativ
ni u
deo
Šik
imat
a (%
) R
elat
ivni
ude
o S
ukci
nata
(%
) R
elat
ivni
ude
o Fu
mar
ata
(%)
ab
c cd d d d d
e
f
g
a a
ccab
b
dd
c
ef
g
aabcb
c cd
e e e
f
gg
a
b
c
Slika 34. Efekat primene Si na relativan udeo šikimata (a), sukcinata (b) i fumarata (c) u ukupnim eksudatima korena pšenice gajene na zemljištu oštećenom rudničkom jalovinom. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
92
4.3.2.4.2. Ekspresija PEP karboksilaze i anjonskih transportera karboksilata
Uticaj Si đubrenja na ekspresiju gena koji su uključeni u efluks malata i citrata
bio je značajno veći od uticaja P đubriva kao mere popravke kiselog zemljišta oštećenog
rudničkom jalovinom (Slike 35 i 36). Đubrenje mineralnim P nije značajno uticalo na
ekspresiju TaPEPC1 gena (uključenih u anaplerotičku fiksaciju C i biosintezu
organskih kiselina nezavisno od fotosinteze) u korenu, dok je kod pšenice đubrene Si
došlo do indukcije ovog gena (Slika 35). U odnosu na kontrolu (-Si) relativni nivo
ekspresije TaPEPC1 bio je značajno veći .
Kontrola 1 (-P)
Na-silikat (-P)
Kontrola 2 (+P)
Rel
ativ
na e
kspr
esija
Ta
PEPC1
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
aa
b
Slika 35. Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku zemljišta na ekspresiju TaPEPC1 gena u korenu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Ekspresija gena koji kodiraju anjonske kanale odgovorne za efluks malata
(TaALMT1) i citrata (TaMATE1) takođe je bila značajno modifikovana primenom
silikatnog đubriva (Slika 36).
93
Kontrola 1 (-P)
Na-silikat (-P)
Kontrola 2 (+P)
Rel
ativ
na e
kspr
esija
gen
a
0
1
2
3
4TaALMT1TaMATE1
a
b
aab
c
Slika 36. Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku zemljišta na ekspresiju TaALMT1(a) i TaMATE1 (b) gena u korenu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05 Đubrenje mineralnim P nije uticalo na ekspresiju TaALMT1 gena u korenu
pšenice, dok je primena Si dovela do tri puta veće ekspresije ovog gena u odnosu na
kontrolu (-Si) (Slika 36). Ekspresija TaMATE1 u korenu pšenice tretirane mineralnim P
bila je redukovana za 20 %, dok je nasuprot tome kod pšenice tretirane Si došlo je do
povećanja ekspresije ovog gena za oko 40 % (Slika 36).
4.3.2.4.3. Ekspresija Pi transportera
Ekspresija gena odgovornih za kodiranje fosfatnih transportera visokog afiniteta
bila je daleko najjača pri primeni Na-silikata, kao mere popravke kiselog zemljišta
oštećenog rudarskom jalovinom (Slika 37), što je u skladu sa najvišom akumulacijom P
u nadzemnom delu pšenice pri ovom tretmanu (videti Tabelu 30). Relativni nivo
ekspresije TaPHT1.1 i TaPHT1.2 pri đubrenju Si bio je visok bez obzira na status P u
zemljištu ili biljci (videti Tabelu 30 i 31).
Na dodavanje mineralnog P đubriva (Kontrola 2) pšenica je reagovala
smanjenjem nivoa ekspresije TaPHT1.1 za 30 % u odnosu na kontrolu bez P (Kontrola
1), dok je dodavanjem Si đubriva u zemljište, pšenica reagovala inverzno; u odnosu na
94
kontrolni (Kontrola 1) tretman ekspesija TaPHT1.1 povećala se oko 4 puta. Takođe,
dodavanje mineralnog P (Kontrola 2) je smanjilo ekspresiju TaPHT1.2 oko 30% u
odnosu na Kontrolu 1, dok je dodavanje Si povećalo ekspresiju ovog gena više od 10
puta (u odnosu na Kontrolu 1, Slika 37).
Kontrola 1 (-P)
Na-silikat (-P)
Kontrola 2 (+P)
Rel
ativ
na e
kspr
esija
gen
a
02468
10121416
aa
b
ab
c TaPHT1.1TaPHT1.2
Slika 37. Efekat primene silikatnog đubriva kao mere za popravku zemljišta na ekspresiju gena koji kodiraju fosfatne transportere TaPHT1.1 (a) i TaPHT1.2 (b) u korenu pšenice. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike između tretmana označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
4.3.2.5. Model eksperiment u hranljivim rastvorima bez aluminijuma
Da bi se otklonio svaki eventualni uticaj Al, koji je bio prisutan u
eksperimentalnom zemljištu (videti Tabelu 31) na eksudaciju organskih kiselina (citrata
i posebno malata), izveden je eksperiment u hranljivom rastvoru sa niskom (10 µM) i
optimalnom (100 µM) koncentracijom P, sa ili bez dodatka Si u obliku
monosilicijumske kiseline.
4.3.2.5.1. Rastenje pšenice i usvajanje fosfora
U skladu sa očekivanjima P je značajno uticao na povećanje suve biomase
pšenice gajene u hranljivom rastvoru, kao i na smanjenje relativnog udela korena u
95
ukupnoj biomasi (Tabela 35). U poređenju sa pšenicom gajenom na adekvatnoj
koncentraciji P (100 µM) suva biomasa nadzemnog dela je manja za 30 % u rastvoru sa
10 µM P. Koncentracija P u hranljivom rastvoru uticala je i na rastenje korena (Tabela
36). U poređenju sa punim hranljivim rastvorom (100 µM P), suva biomasa korena
povećala se za 40 % u hranljivom rastvoru sa niskom koncentracijom P (10 µM). Odnos
biomase korena prema nadzemnom delu takođe se značajno smanjio povećanjem
koncentracije P u hranljivom rastvoru. Dodavanje Si poboljšalo je porast nadzemnog
dela za 12 % u hranljivom rastvoru sa niskom koncentracijom P (10 µM), a nije uticalo
na biomasu nadzemnog dela u punom hranljivom rastvoru (100 µM P). Rastenje korena
takođe je poboljšano dodavanjem Si i to za 29 % kod tretmana sa 10 µM P, odnosno za
40% u punom hranljivom rastvoru (100 µM P). Dodavanje Si nije značajno uticalo na
odnos biomase korena prema nadzemnom delu pšenice (Tabela 35).
Tabela 35. Efekat Si na rastenje pšenice gajene u hranljivim rastvorima sa niskom (10 µM) i optimalnom (100 µM) koncentracijom P.
Koncentracija P (µM) Si
Suva biomasa nadzemnog
dela (mg po biljci)
Suva biomasa korena
(mg po biljci)
Relativni odnos koren/nadzemni deo
10 - 633±50a 334±6c 0.53±0.04a + 715±54b 433±37d 0.61±0.07a
100 - 825±79b 136±16a 0.17±0.03b + 969±29b 191±25b 0.19±0.03b
Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
Koncentracija P u hranljivom rastvoru uticala je na koncentraciju P kako u
nadzemnom delu tako i u korenu pšenice (Slika 38). Dodavanje Si u hranljivi rastvor
nije značajno uticalo na povećanje koncentracije P u nadzemnom delu pšenice, dok se
ukupna količina P u nadzemnom delu pšenice značajno povećala sa dodatkom Si (npr.
za 25 % hranljivom rastvoru sa 10 µM P). Nasuprot tome, sadržaj P u korenu pšenice
gajene u hranljivim rastvorima sa Si značajno se smanjio. Dodavanje Si uticalo je na
smanjenje koncentracije P u korenu pšenice za 37 % (10 µM P), odnosno 29 % (100
µM P).
96
Koncentracija P u rastvoru ()10 100
Kon
cent
raci
ja P
u
nadz
emno
m d
elu
(%)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8-Si +Si
Koncentracija P u rastvoru ()10 100
0100200300400500600700800
Količ
ina
P
u na
dzem
nom
del
u (m
g po
sak
siji)
Koncentracija P u rastvoru ()10 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Kon
cent
raci
ja P
u
kore
nu (%
)
Koncentracija P u rastvoru ()10 100
020406080
100120140
Količ
ina
P
u ko
renu
(m
g po
sak
siji)
a a
b b
ab
c
d
a a
bb
ab
c
d
-Si +Si a b
-Si +Si
dc -Si +Si
Slika 38. Efekat Si na koncentraciju i količinu P u nadzemnom delu i korenu pšenice gajene u hranljivim rastvorima sa niskom (10 µM) i optimalnom (100 µM) koncentracijom P. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, (p<0.05).
Dodavanje Si u hranljivi rastvor uticao je i na alokaciju fosfora između korena i
lista biljke (Slika 39). I na niskim i na adekvatnim zalihama P u odnosu na - Si pšenicu
skoro 50 % više fosfora je alocirano u nadzemni deo pšenice. Kada je u pitanju ukupna
količina akumuliranog fosfora efekat Si na alokaciju fosfora bio je vidljiv samo na
niskoj obezbeđenosti fosfora, dok na adekvatnoj obezbeđenosti P nije bilo razlike
između –Si i +Si biljaka.
Koncentracija P u rastvoru ()10 100
Kon
cent
raci
ja P
(R
elat
ivni
odn
os L
ist/K
oren
)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0 -Si +Si
Koncentracija P u rastvoru ()10 100
0
2
4
6
8
10
a a
bb
aa
b ba b
Kol
ičin
a P
(R
elat
ivni
odn
os L
ist/K
oren
)
- Si +Si
Slika 39. Efekat Si na alokaciju P u pšenici gajenoj u hranljivim rastvorima sa 10 µM i 100 µM P. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa (p<0.05)
97
4.3.2.5.2. Efluks citrata i malata Eksperiment u hranljivom rastvoru potvrdio je pozitivni efekat silicijuma na
izlučivanje citrata i malata sa vrha korena pšenice izložene deficitu P (Slika 40). Na
nižoj koncentraciji P (10 µM) dodavanje Si pojačalo je eksudaciju oba organska anjona,
dok kod pšenice gajene na optimalnoj koncentraciji P (100 µM) dodavanje Si nije
značajno uticalo na eksudaciju citrata i malata (Slika 40). Slično kao i u predhodnim
eksperimentima eksudacija malata je bila intezivnija od citrata. Kod biljaka gajenih u
hranljivim rastvorima sa niskom koncentracijom P, dodavanje Si pojačalo je eksudaciju
citrata za 50 % i eksudaciju malata za skoro 60 % u poređenju sa –Si biljkama. Sa
obzirom na to da je pšenica rasla u hidroponičnim rastvorima, pod kontrolisanim
uslovima (gde je eliminisan mogući efekat drugih mineralnih elemenata) jasno je
pokazano da silicijum ublažava deficit P uključivanjem pojačanog efluksa malata i
citrata (Slika 40).
10 1000,0
0,1
0,2
0,3-Si+Si
Koncentracija P u rastvoru (M )10 100
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5-Si+Si
a
aa
b
aab b
b
Eflu
ks M
alat
a(
molg
-1 s
uve
mas
e h-1
)
Eflu
ks C
itrat
a(
mol
g-1
suve
mas
e h-1
)
a b
Koncentracija P u rastvoru (M )
Slika 40. Efekat Si na efluks malata (a) i citrata (b) sa korena pšenice gajene u hranljivim rastvorima sa niskom (10 µM) i optimalnom (100 µM) koncentracijom P. Rezultati predstavljaju srednje vrednosti 4 ponavljanja ± STDEV. Statistički značajne razlike označene su različitim slovima, na osnovu Tukey-ovog testa, p<0.05
98
5. DISKUSIJA
5.1. Uticaj primene mera za popravku zemljišta na rastenje pšenice
Rezultati ovih istraživanja pokazali su da su glavni ograničavajući faktori za
rastenje pšenice na zemljištima oštećenim rudničkom jalovinom: izrazito niska pH
(sekundarna acidifikacija), vrlo niske koncentracije dostupnog P, visoke koncentracije
razmenjivog Al i dostupnog Cu (Tabela 2,3 i 4; Nikolić et al. 2011; Kostić et al. 2014).
Poznato je da deficit P dovodi do inhibicije rastenja nadzemnog dela biljke, opadanja
neto fotosintetske aktivnosti i zatvaranja stoma (Ghannoum et Conroy 2007; Jacob et
Lawlor 1991; Suriyagoda et al. 2010). Pored toga, inhibicija rastenja pšenice na kiselim
zemljištima može da bude izazvana i toksičnim efektom Al, teških metala i As na koren
(rizotoksičnost), što sve zajedno utiče na smanjeno usvajnje mineralnih hraniva i vode.
Popravka takvih zemljišta ima važnu ulogu sa aspekta gajenja poljoprivrednih kultura,
posebno imajući u vidu da svake godine nestaje velika količina plodnog
poljoprivrednog zemljišta, uz istovremeni skoro eksponencijalni rast ljudske populacije
(UN 2013). Osim toga, neke od mera popravke zemljišta takođe sprečavaju ulazak
opasnih zagađujućih materija u lance ishrane, površinske i podzemne vode.
Mere za popravku zemljišta primenjene u našem istraživanju ispoljile su uticaj
na rastenje pšenice, alokaciju biomase, mineralni sastav, kao i na adaptivan odgovor
korena pšenice, odnosno hemijske promene u rizosferi. Mere popravke imale su istu
vrstu efekta koji se različitim intenzitetom ispoljio na dva tipa ispitivanog zemljišta (L1
i L2 tip, Tabele 5 i 6). Ova dva oštećena zemljišta predstavljaju gradijent oksidativnog
raspadanja piritske jalovine (uslovljenog istorijatom korišćenja parcele), duž koga
dolazi do smenjivanja različitih ograničavajućih faktora za rastenje biljaka (Nikolić et
al. 2011) Uopšteno, zemljišta tipa L1 predstavljaju ranu fazu oksidativnog raspadanja
rudničke jalovine gde je glavni ograničavajući faktor pre svega visoka koncentracija
pristupačnog Cu, dok zemljišta tipa L2 predstavljaju krajnju fazu raspadanja gde je,
nakon ispiranja Cu, rastenje ograničeno niskom pristupačnošću mikro i
makroelemenata, niskim sadržajem organske materije, kao i visokim koncentracijama
izmenjivog Al (Tabele 2-4). Pri tome, oba tipa zemljišta su kisela i generalno siromašna
99
pristupačnim biljnim hranivima, posebno pristupačnim P (Tabele 2-4), a rastenje
pšenice je jednako usporeno na oba (ista produkcija biomase, Tabele 5 i 6).
Iako su sve mere popravke uticale na poboljšani porast pšenice, kao najbolje su
se pokazale one koje su istovremeno korigovale pH vrednost i povećale koncentraciju
pristupačnog P u zemljištu (Tabela 5 i 6). Naši rezultati pokazali su da eliminacija
toksičnog efekta metala, Cu (Tabele 16 i 18) i Al (Tabela 24) nije bila dovoljna da
koriguje sve ograničavajuće faktore ni na jednom tipu oštećenog zemljišta (Tabele 5 i
6). Kalcizacijom zemljišta (korekcija niske pH vrednosti, Tabele 10-11; eliminacija
toksičnosti metala, Tabele 16, 18 i aluminujuma Tabela 24) biomasa nadzemnog dela
pšenice je povećana čak 20 puta na L1 tipu zemljišta (Tabela 5) i 6 puta na zemljištu
tipa L2 (Tabela 6), što ukazuje na činjenicu da je niska pH primarni limitirajući faktor u
odnosu na visoke koncentracije pristupačnog Cu. Unošenje P (putem mineralnog P
đubriva) imalo je isti krajnji efekat na nadzemnu masu pšenice na oba zemljišta kao i
unošenje stajnjaka (povećanje 2 puta, Tabele 5 i 6). Najveći efekat na povećanje
nadzemne biomase (više od 30 puta na L1 zemljištu i više od 10 puta na L2 zemljištu)
imala je kombinovana mera kalcizacije sa unošenjem P (Tabele 5 i 6). Rezultati ukazuju
da se ovim uobičajenim merama popravke uspešnije koriguju ograničavajući faktori
koji postoje na zagađenim zemljištima u ranim fazama oksidativnog raspadanja jalovine
(tip L1), nego u kasnijim fazama (zemljišta tipa L2).
Rastenje korena takođe je bilo značajno pospešeno primenom svih mera za
popravku zemljišta (Tabele 5 i 6). Međutim, očigledno je da u kiselim uslovima
inhibitorni efekat H+, Al3+ i Cu ima dominatan uticaj na rastenje korena. Eliminacijom
ovih faktora stresa putem kalcizacije poboljšan je porast korena (suva biomasa) više od
100 puta na L1, i više od 25 puta na L2 zemljištu (Tabele 5 i 6). Na zemljištu tipa L2
porast korena nakon eliminisanja rizotoksičnih efekata zagađenja je 4 puta slabiji nego
na zemljištu tipa L1, što ponovo ukazuje da se izraziti deficit pristupačnih hraniva na
oštećenim zemljištima u poodmaklom stadijumu oksidativnog raspadanja rudničke
jalovine teže rešava uobičajenim merama popravke nego toksičnost Cu u ranim fazama
raspadanja jalovine. Unošenjem stajnjaka ili mineralnog P u kiselim uslovima (stres H+,
Al3+ i Cu) poboljšan je rast korena 2 puta na L1 zemljištu (Tabela 5), i između 4 i 7 puta
na L2 zemljištu (Tabela 6), što ukazuje da je deficit P na L2 tipu zemljišta bio toliko
100
izrazit da je tek nakon dodavanja P pšenica bila u stanju da ispolji adaptivnu reakciju
pojačanog rastenja korena u uslovima deficita makroelemenata, posebno P (vidi
Bhadoria et al. 2002; Hermans et al. 2006). Zapravo, na ovom tipu zemljišta (L2) sve
primenjene mere popravke su značajno promenile alokaciju biomase prema korenu
(Tabela 6), što ponovo ukazuje na reakciju pšenice na izraziti deficit pristupačnih
hraniva. Odnos suve biomase korena prema nadzemnom delu pšenice najizrazitije je
povećan na oba tipa zemljišta kad su kalcizacijom eliminisani rizotoksični efekti H+,
Al3+ i Cu (više od 10 puta na L1 i više od 25 puta na L2 tipu, Tabele 5 i 6).
Pozitivan efekat stajnjaka na rastenje pšenice je bio naročito izražen na L2
zemljištu deficitarnom u P i mikroelementima (Tabele 6, 18 i 20), gde je primena
stajnjaka poboljšala i status mikroelemenata (Zn i Mn) u pšenici (Slike 12b i 13b). Sa
druge strane, primena stajnjaka istovremeno je umanjila toksičnost Cu i Al u većoj meri
nego primena NPK đubriva (Slika 11b, 16b, Tabela 18 i 24 ). Heliranjem Cu i Al sa
organskim ligandima dolazi do smanjenja pristupačnosti ovih elemenata za biljke
(Menzies et al. 1994; Bloom et al. 1979; Alloway 1999), što bi moglo da ima i praktični
značaj u cilju smanjenja upotrebe ograničenih rezervi P, budući da je stajnjak jevtiniji i
ima manje negativnih uticaja po životnu sredinu. Pozitivan efekat kalcizacije na rast
pšenice može se objasniti sa jedne strane, ograničavanjem dostupnosti potencijalno
toksičnih elemenata u zemljištu korekcijom pH (As, Cu, Al i Zn i Mn, za dostupnost u
zemljištu, videti Tabele 16, 18 i 24), ali i jačanjem adaptivog odgovora pšenice sa druge
strane (Slike 20-21 i 23-24; Kostić-Kravljanac et al. 2014). Kako dostupnost većine
mineralnih elemenata opada sa porastom pH vrednosti zemljišta, povećanjem pH
vrednosti poboljšava se rastvaranje P vezanog za Al i Fe što rezultira u povećanju
dostupnosti P za biljke (Shen et al. 2011).
Pored konvencionalnih mera za popravku kiselih zemljišta, pokazano je i da
đubrenje Si ima visoko pozitivan efekat na rastenje pšenice gajene na zemljištima
oštećenim rudničkom jalovinom (Tabela 26 i 29, Slike 27 i 28). Biljke koje su rasle u
tretmanu sa Si su imale značajno veću biomasu, kako nadzemnog dela tako i korena u
poređenju sa kontrolnom pšenicom (Tabela 26 i 29, Slika 27 i 28.) Takođe Si je
značajno uticao i na mineralni sastav pšenice (Tabela 34). Do sada je Si jedini poznati
mineralni element za koga je pokazano da ublažava abiotski stres uzrokovan toksičnim
101
koncentracijama Al, Cu, Cd, Zn, Mn, As (npr. Cocker et al.1997, Ye et al. 2012;
Rogalla et Römheld 2002; Liang et al. 2005; Dragisić Maksimović et al. 2012; Li et al.
2008; Song et al. 2011). Primena Si uticala je na snižavanje koncentracije As i Cu u
nadzemnom delu pšenice (Tabela 34). Međutim, sa obzirom da je primena Si u ovim
zemljištima dovela do povećanja pH vrednosti (Tabela 31), nije dovoljno jasno da je li
poboljšan rast i redukcija sadržaja ovih potencijalno fitotoksičnih elemenata u pšenici
posledica ograničavanja njihove pristupačnosti u rizosferi (ex planta) ili je u pitanju
direktan efekat Si (in planta detoksifikacija).
Interesantan je efekat koji je Si ispoljio na sadržaj Al. Na L1 zemljištu uprkos
visokim koncentracijama izmenjivog Al, kod Si tretiranih biljaka nije došlo do
redukcije rasta korena, već je rast korena bio poboljšan (Tabela 26). Najverovatnije da
je na L1 zemljištu došlo do smanjenog usvajanja Al, što je verovatno bilo posledica
sinergističkog efekta povećanja pH (stoga smanjenja toksičnost Al3+) i direktnog efekta
Si u detoksifikaciji Al u apoplastu korena, odnosno stvaranja alumosilikata (AS) i
hidroksi alumosilikata (HAS) (Cocker et al. 1998). Na L1 zemljištu, u različitim
tretmanima sa Si, pH vrednost porasla je samo za 0.5 jedinice, dok je koncentracija Al3+
samo neznatno smanjenja (Tabela 27). Pozitivan efekat Si na biljke koje su izložene
toksičnim koncentracijama Al je uočen u mnogim istraživanjima (Kidd et al.2001;
Wang et al. 2004; Cocker et al. 1998; Prabagar et al. 2011). Naši rezultati se u velikoj
meri poklapaju sa istraživanjima Cocker et al. 1998 i Wang et al. 2004, koji ukazuju da
amelioratiovan efekat Si verovatno uključuje “in planta “ mehanizam, a ne interakciju
Al i Si u spoljašnjem medijumu. Ovi autori su predpostavili da dolazi do formiranja
HAS u ćelijskom zidu korena koji nije toksičan za biljke.
Nasuprot tome, na L2 tipu zemljišta pH je značajno porasla, od 4.07 na preko 6,
tako da je očekivani razlog smanjenja koncentracije izmenjivog Al zapravo korekcija
pH vrednosti zemljišta (Tabela 31). Na vrednostima pH iznad 6 dolazi do formiranja
precipitata Al u obliku gipsita, ili se Al vezuje za druge ligante odnosno površine
minerala gline (Conyers et al. 1990; Martin 1991).
102
5.2. Uticaj primene mera za popravku zemljišta na mobilizaciju
fosfora u rizosferi pšenice
5.2.1. Mobilnost fosfora u rizosferi
Neorganska rezerva P u zemljištu sastavljena je od različitih frakcija, manje ili
veće rastvorljivosti (Rose et al. 2010; Shen et al. 2011; Richarson et al. 2011). Biljke
najlakše usvajaju vodno-rastvorljivu frakciju, dok se ostale frakcije smatraju manje
dostupnim. Međutim, čak i takozvane nedostupne frakcije mogu da postanu dostupne u
zavisnosti od vrste biljke i zemljišta (Pheav et al. 2003; Vu et al. 2008; Wang et al.
2007). Tako je, na primer, pokazano da su bela lupina i uljana repica razvile adaptacije
koje im omogućavaju da rastvaraju teško dostupne fosfate (Uhde-Stone et al. 2003;
Zhang et al. 2004; Wang et al.2013). Sa druge strane, pšenica je poznata kao biljna
vrsta koja teže usvaja slabo-rastvorljive oblike P (Pearse et al. 2007). Međutim,
poslednjih godina je pokazano da i pšenica može da iskoristi i neke teže dostupne
oblike, kao što su Fe-P (Osborne et Rengel 2002; Li et al. 2008), Ca-P (Vu et al. 2008, i
Wang et al. 2008), ili Al-P (Pearse et al. 2007; Wang et al. 2008), iako mehanizam koji
stoji u osnovi ovih procesa nije razjašnjen (Kostić-Kravljanac et al. 2014).
Stvaranje gradijenta koncentracija pojedinih frakcija P između rizosfere i
oklonog (“balk”) zemljišta može ukazati na usvajanje ovih frakcija (Hinsinger 2001;
Nuruzzaman et al. 2006; Rose et al. 2010; Shen et al. 2011). Kada se eliminišu uslovi
deficita P, postiže se dinamička ravnoteža između usvajanja i mobilizacije P, pa tako
nema razlike između koncentracija P u rizosfernom i “balk” kompartmentu zemljišta.
Naši rezultati su pokazali da u kontrolnim tretmanima dolazi do snižavanja
koncentracije H2O-rastvorljivog P, Al-P-a i okludovanog P u L1 zemljištu i snižavanje
koncentracija Ca-P u L2 zemljištu (Tabela 21 i 22). Ovi rezultati ukazuju da je biljka
uspela da iskoristi ove frakcije P, s obzirom da u kontrolnom tretmanu nije bilo
dodatnog uticaja đubriva, pa je efekat rizosfere bio jasno vidljiv. Pored toga, i u ostalim
tretmanima je uočeno nekoliko jasnih trendova: u L1 zemljištu dolazi do snižavanja
rizosferne koncentracije okludovanog P u tretmanima sa izraženim deficitom P i Al-P u
103
skoro svim tretmanima (osim u CaCO3 tretmanu); u L2 zemljištu snižavanje rizosferne
koncentracije Ca-P zabeleženo je u svim tretmanima (Tabelei 22). Jaka pozitvna
korelacija između sadržaja P u biljci i ovih frakcija P (Tabela 23) dodatno ukazuje da
pšenica može da iskoristi ove oblike P. Međutim, izgleda da je na različitim zemljištima
stvaranje ovakvog gradijenta bio posledica različitih procesa.
U oba zemljišta najveću rezervu P čini onaj vezan za Fe, što je bilo očekivano s
obzirom da su zemljišta kisele reakcije (Parfitt 1978; Welp et al. 1983). Niska
koncentracija H2O-rastvorljivog P je takođe bila očekivana s obzirom da ova frakcija
uobičajeno čini manje od 1 % ukupnog P u zemljištu. Razlika u procentualnoj
zastupljenosti okludovanog P i Ca-P kod ova dva zemljišta je verovatno posledica
njihovog različitog mineraloškog sastava (Walker et Syers 1976).Svi tretmani popravke
zemljišta su doveli do promena u koncentraciji dostupnog P i Pi frakcija na oba
zemljišta, ali je efekat zavisio kako od primenjenje mere tako i od tipa zemljišta (Tabela
20, 21 i 22).
Mere kalcizacije, unošenja mineralnog P i stajnjaka imale su isti efekat na
povećanje PAL u balku L1 zemljišta (Tabela 20). Međutim, u rizosferi u tretmanu
CaCO3 došlo je do većeg povećanja koncentracije dostupnog P u rizosferi što ukazuje
da adaptivni odgovor korena pšenice može da u velikoj meri modifikuje efekat mera
popravke na dostupnost P u rizosferi (Kostić-Kravljanac et al. 2014). Pored toga, efekat
primenjenih mera popravke na H2O-rastvorljivu frakciju P je bio mnogo izraženiji na
rizosfernom zemljištu (Tabela 21).
Iako su sve primenjene mere za popravku zemljišta povećale dostupnost P u
balku zemljišta, ovo povećanje je bilo rezultat različitih procesa. Tako je kod L1
zemljišta primena CaCO3 dovela do povećanja pH vrednosti, što je rezultiralo
rastvaranjem Al-P, Fe-P i okludovanog P i stoga povećanjem koncentracije H2O-
rastvorljive frakcije. Sa druge strane, primena stajnjaka i NPK đubriva povećala je
koncentraciju skoro svih frakcija P (Tabela 21). U tretmanu sa NPK đubrivom, najveći
deo primenjenog neorganskog P je transformisan u Fe-P rezerevu (oko 30 mg kg-1,
odnosno 40 % od ukupno primenjenog P), dok je samo manji deo imao doprinos
povećanju H2O-rastvorljive frakcije (0.3 mg kg-1). Sa druge strane došlo je i do
značajnog porasta Ca-P frakcije (Tabela 21). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da Fe-P
104
predstavlja glavni sink za P unet u zemljište, što je u skladu da mnogim istraživanjima
(Reddy et al. 1999; Oberson et al. 2001; Waldrip et al. 2011). Primena stajnjaka je
rezultirala nešto većim povećanjem H2O-rastvorljive frakcije P verovatno usled
sinergetičkog efekta unetog P, i povećanja rastvaranja okludovanog P (Tabela 21)
(Kitayama et al. 2004; Song et al. 2007; Roboredo et al. 2012). Stajnjak u principu
sadrži velike količine neorganskog i organskog P kao što su fitati, fosfolipidi i
nukleinkse kiseline koje podležu mineralizaciji, odnosno transformacijama gde su
uključeni enzimi rizosfernih mikroorganizama i korena (fosfataze), što sve zajedno utiče
na povećanje dostuposti P (Dou et al. 2000; Turner et Leytem 2004). Osim toga, mali
organski molekuli mogu da stupe u kompeticiju sa P za mesta sorbcije, te na taj način
mogu dodatno da smanje sorbciju P (Easterwood et Sartain 1990; Guppy et al. 2005).
Kombinacijom kalcijzacije sa tretmanima stajnjakom ili neorganskim P pojačava se
efekat ovih mera popravke (Tabela 21). Očekivano, porastom pH vrednosti (Tabela 10)
dolazi do rastvaranja Fe-P, dok porast koncentracije Al-P u ovim tretmanim ukazuje da
se deo „oslobođenog“ P ponovo vezao za okside Al. Ovakvo povećanje Al-P rezerve P
ukazuje da je ovo značajna razmenjiva frakcija P koja direktno utiče na njegovu
dostupnost za biljke. Kada dođe do smanjivanja jedne frakcije, P iz drugih frakcija
može da bude desorbovan ili rastvoren, pa tako može da zauzme svoje mesto u toj
frakciji. Zato labilne i umereno labilne frakcije P mogu da deluju kao puferi P u
zemljišnom rastvoru (Pavinato et al. 2009). Interesantno je da je koncentracija Ca-P
porasla u svim tretmanima za oko 5 mg kg -1 (Tabela 21) što se može objasniti
činjenicom da je ovo zemljište pre izlivanje kisele rudničke jalovine bilo krečno, a onda
antropogeno zakišeljeno (Nikolić et al. 2011), pri čemu se određena količina dodatnog
P vezala za Ca. Čak i kada P nije direktno primenjen u obliku mineralnog ili organskog
đubriva, značajan udeo “oslobođenog” P ponovo može da se readsorbuje ili istaloži sa
Ca. Generalno, povećanje Ca-P rezerve P nakon primene P đubriva primećeno je u
mnogim zemljištima (Yu et al. 2006; Vu et al. 2010).
Za razliku od L1 zemljišta, kod L2 zemljišta mere primene stajnjaka i
kalcijzacije zemljišta pojedinačno su bile manje efikasne u odnosu na tretman
mineralnim P đubrivom (Tabela 22). Interesantno je da kod L2 zemljišta u tretmanu sa
CaCO3 izostaje rastvaranje Al-P, a rastvaranje Fe-P je zanemarljivo. Ipak, usled
105
povećanja pH i promene redoks uslova došlo je do smanjenja redukovanog P (Tabela
22). Sa druge strane, na pH vrednostima oko 7 dolazi do interakcije između Ca i P
(Fageria et al. 1995; Devau et al. 2011), što je u našem slučaju rezultiralo porastom
frakcije P čvrsto-vezanog za Ca. Primena NPK đubriva povećala je koncentraciju skoro
svih frakcija P, što je bilo i očekivano (Tabela 22). Slično L1 zemljištu najveći deo
primenjenog NPK đubriva (14 mg kg-1) se takođe našao u frakciji P vezanog za Fe. Sa
druge strane, kalcizacija zemljišta zajedno sa primenom stajnjaka ili NPK đubriva
značajno je povećala koncentraciju H2O-rastvorljivog P, verovatno usled sinergetičnog
efekta unetog P i smanjenjem kapaciteta sorbcije fosfata Al- i Fe-oksihidroksidima na
neutralnijim pH vrednostima.
Povećanje dostupnosti P pod uticajem Si je često primećeno (Koski-Vahala et
al. 2001). Zbog hemijske sličnosti Si i P, predložen je mehanizam izmenjive adsorpcije
anjona (Roy 1969, 1971; Koski-Vahala et al. 2001; Owino-Gerroh et Gascho 2004).
Međutim, na kiselim zemljištima, usled niske pH, izmenjiva adsorpcija Si i P nije
mnogo verovatna (Brinkmann 1993). U opsegu pH vrednosti od 4 do 9 očekivano je da
se silicijum konvertuje u ortosilicijumsku kiselinu (H4SiO4). Ortosilicijumska kiselina
(pKa 9.8) ima manje negativnijih površina u poređenju sa fosfatnim anjonom (pKa
ortofosforne kiseline je 2.1) i upravo zbog toga Si ne bi mogao da zameni P (Brinkmann
1993; Koski-Vahala et al. 2001). Pored toga, Si se često primenjuje u obliku Na- ili Ca-
silikata, što dovodi do povećanja pH vrednosti, a samim tim i dostupnosti P na kiselim
zemljištima (Owino-Gerroh et Gascho 2004). Od svih oblika Si đubriva, H2O-
rastvorljiva frakcija P se značajno povećala jedino u tretmanima sa Ca- i Na-silikatima,
gde je došlo i do najveće promene pH vrednosti (Tabela 28). Međutim, Fe-P frakcija je
bila značajno smanjena u svim tretmanima, nezavisno od oblika primenjenog Si
đubriva. Sa druge strane, frakcije Al-P i Ca-P su u velikoj meri zavisile od oblika
primenjenog Si. Ovakva uslovljenost delovanja Si od tipa jedinjenja ukazuje na složene
hemizme koji kontrolišu dostupnost P u zemljištu, a koji do sada nisu dovoljno
razjašnjeni.
106
5.2.2. Eksudacija P-mobilizirajućih jedinjenja
Eksudacija citrata i malata kao adaptivni mehanizam na toskičnost aluminijuma
dobro je proučen kod pšenice (npr. Delhaize et al.1993; Ryan et al.1995a,b; Pellet et al.
1997; Sasaki et al.2004; Stass et al. 2008; Ryan et al.2009). Dosadašnjim istraživanjima
je utvrđeno da je efluks ova dva organska anjona različit (Ryan et al. 2009; Delhaize et
al. 2012). Predpostavlja se da je efluks malata indukovan delovanjem Al na anjonski
kanal TaALMT1, preko mehanizma ligant-indukovanog otvaranja kanala, a ekspresija
gena TaALMT1 je konstituevna (Delhaize et al. 2012). Sa druge strane, kod nekoliko
sorti pšenice je detektovan stalan efluks citrata koji ne zavisi od koncenetracije Al u
spoljašnjem medijumu, dok je ekspresija TaMATE bila takođe konstitutivna (Delhaize
et al. 2012). Međutim, malo je istraživanja do sada objavljeno o sinegrističnom efektu P
i Al, a posebno o efektu deficita P (bez toksičnosti Al) na eksudaciju karboksilata iz
korena pšenice u kompleksim uslovima zemljišta.
U našem istraživanju efluks citrata i malata bio je u opsegu koncentracija kod
biljaka izloženih P deficitu i Al toksičnosti (Slika 20 i 21; Ryan et al. 2014). Naši
rezultati jasno su ukazali da efluks malata iz korena pšenice ne može biti povezan samo
sa delovanjem Al3+ na jonske kanale budući da u tretmanima CaCO3 nije bilo
izmenjivog Al (Al3+), a efluks organskih anjona bio je isti, ili čak veći u poređenju sa
tretmanima sa visokom koncentracijom ovog katjona (Tabela 24; Slika 20b i 21b).
Skorija istraživanja su pokazala da TaALMT1 može da učestvuje u transportu malata i
kada u spoljašnjem medijumu nema Al (Pineros et al. 2008). Sa druge strane, naši
rezultati su jasno pokazali da eflkus citrata, kao i ekspresija TaMATE1 značajno varira u
odnosu na primenjene mere (Slika 20a i 21a; Slika 22a i 23a). Opadanje efluksa malata i
citrata u tretmanima sa visokim koncentracijama P u zemljištu i biljci ukazuje da bi
eksudacija ovih anjona pored Al mogla biti izazvana i P deficitom. Tretmani CaCO3,
gde nije bilo značajne promene ni jednog drugog faktora osim P (koncentracija As, Al,
Cu, Zn, i Mn su u istom opsegu koncentracija i u zemljištu i u biljci u sva tri tretmana,
videti Tabele, 16, 18, 24, Slika 11-13; 15 i 16 ), jasno su ukazali da je efluks ovih
anjona delimično bio moduliran fosforom (Kostić-Kravljanac et al. 2014) iako većina
ranijih istraživanja nije uspela da detektuje veće količine karboksilata kao odgovor na
107
deficit P (Neumann et Romheld 1999; Rose et al. 2010; Veneklaas et al. 2003). Ovo
može biti posledica toga što je pšenica u različitim eksperimentima uzorkova u drugim
fazama razvoja, različitog hranljivog medijuma, ili mikrobiološke degradacije
karboksilata (Delhaize et al. 1993; Ryan et al. 1995a, 1995b; Khademi et al. 2010; Rose
et al. 2010). Moguće je čak da i dominantan oblik P u zemljištu utiče na efluks
karboksilata (Lambers et al. 2002). Kod drugih biljnih vrsta koje su mnogo efikasnije u
mobilizaciji i akviziciji P, kao što su Lupinus albus, Brassica napus, Medicago sativa, i
nekih članovi familije Proteaceae, efluks citrata je primarno uzrokovan deficitom P
(Dinkelaker et al. 1989; Hoffland et al. 1989, Roelofs et al. 2001). Interesantno je da je
ekspresija TaMATE1 bila najizraženija u tretmanima sa CaCO3 (Slike 22a i 23a) što
ukazuje da eksudacija citrata značajno reaguje na promenu stresnih faktora u zemljištu, i
da je najizrazitija kada je kalcizacijom eliminisana rizotoksičnost H+, Al3+ i Cu, a
deficit P nije korigovan (vidi Tabelu 16, 18, 20, i 24 za ove zemljišne parametre).
Međutim, moguća uloga Ca „per se“ ostaje neobjašnjena ovim eksperimentima, a Ca
takođe može doprineti ovakvoj ekspresiji i pojačanom efluksu citrata (Kostić-
Kravljanac et al. 2014). Efluks karboksilata u našem istraživanju odgovara ekspresiji
TaMATE1 i TaALMT1 (Slike 20- 23).
Novija istraživanja su pokazala da TaALMT1 može da učestvuje u transportu
anjona čak i kada u spoljašnjem medijumu nema aluminijuma (Piñeros et al. 2008).
Nedavno su Liang et al. (2013) sugerisali da je ekspresija i funkcija GmALMT1
transportera kod soje (Glycine max) regulisana sa tri faktora: pH, Al, i P. Sa druge
strane, sve je više istraživanja koja pokazuju ulogu ALMT proteina i izvan opsega
otpornosti na toksičnost Al (Piñeros et al. 2008; Meyer et al. 2010; Gruber et al. 2010;
Meyer et al.2011; Ligaba et al. 2012; Liang et al. 2013; De Angeli et al. 2013).
Pokazano je da PEPC služi kao alternativni put u ulasku C u ciklus
trikarbonskih kiselina, te na taj način omogućava pojaču eksudaciju karboksilata i u
uslovima umanjene fotosintetske produkcije ATP-a (Theodoru et Plaxton 1993;
Neumann et Römheld 1999; Toyota et al. 2003). Na primer, kod bele lupine, do 34 %
od ukupnog C koji se zatim eksuduje u obliku citrata je obezbeđeno delovanjem PEPC
aktivnosti (Johnson et al. 1996). Pored toga, PEPC oslobađa Pi sa oksalacetata i na taj
način pomaže recikliranju P u biljnoj ćeliji (Theodoru et Plaxton 1993). Naša
108
istraživanja su pokazala da efluks citrata i malata nije bio povezan sa pojačanom
ekspresijom gena koji kodira PEPC (Slike 20, 21 i 24). Da li pojačana aktivnost i
ekspresija PEPC gena može uticati na pojačan efluks karboksilata ostaje otvoreno
pitanje na koje do danas nema jasnog odgovora. Na primer, kod Al-indukovanog
efluksa malata nema značajne promene u aktivnosti PEPC (Ryan et al. 1995a,b; de
Andrade et al. 2011), dok sa druge strane kod bele lupine, pojačana aktivnost PEPC
predhodi efluksu citrata (Uhde-Stone et al. 2003).
Nivo ekspresije TaPEPC1 je porastao sa porastom P u zemljištu i biljci (Slika
10 i 24, Tabela 20). Slični rezulati su dobijeni za Arabidopsos (Wu et al. 2003) kod
koga je ekspresija PEPC-a bila “down”-regulisana količinom P u zemljištu. Nasuprot
našim istraživanjima, kod mnogih vrsta uključujući pšenicu (Neumann et Römheld
1999), duvan (Toyota et al. 2003) i belu lupinu (Uhde-Stone et al. 2003), deficit P
indukovao je ekspresiju ovog enzima. Ovakvo neslaganje sa rezultatima drugih
istraživačkih grupa moglo bi da bude posledica različite dužine izlaganja biljaka deficitu
P. Pretpostavlja se da odgovor pšenice na deficit P ima dve faze: ranu, koja
podrazumeva brzi odgovor uz aktivaciju PHT gena koji kodiraju Pi transportere, i
kasniji odgovor koji uključuje aktivaciju drugih gena kao što je i PEPC (Toyota et al.
2003). Na primer, kod bele lupine 10 dana nakon izlaganja korena deficitu P, skoro da
nije bilo nikave razlike u ekspresiji PEPC, a tek je 14. dana došlo do pika indukcije
ovog gena (Uhde-Stone et al. 2003).
Efluks organskih kiselina je uobičajena strategija povećanja dostupnosti P u
rizosferi (Hinsinger 2001). Njihov efluks je u velikoj meri posredovan ekspresijom
MATE- i ALMT transportera efluks tipa (Liu et al. 2005; Uhde-Stone et al. 2003b;
Ryan et al. 1995a). Na primer, jaka ekspresija MATE uočena je u korenu P deficitne
bele lupine što ukazuje na ulogu ovog gena kod efluksa citrata indukovanog
nedostatkom P (Uhde-Stone et al. 2005; Liu et al. 2005). Nedavno je pokazano da
TaALMT u korenu pšenice, osim uloge u detoksifikaciji Al u rizosferi, može imati
ulogu i u akviziciji P na kiselim zemljištima (Delhaize et al. 2009).
Kod L1 zemljišta, smanjenje koncentracije okludovanog P u rizosferi se poklapa
sa inteznivnim efluksom citrata i malata, acidifikacijom rizosfere i jačom ekspresijom
TaALMT1 i TaMATE1 (Slika 20 a i b; Slika 22 a i b; Tabele 10 i 21). Iako se
109
okludovani oblik P smatra nedostupnim za biljke (Tiessen et Moir 1993) u izvesnim
uslovima ipak može da dođe do rastvaranja ove frakcije (Yang et Post 2011). Dva
najčešća mehanizma kojima se pripisuje rastvaranje teško rastvorljivih oblika P je
eksudacija karboksilata i efekat promene rizosferne pH. Nedavno su Ryan et al. (2014)
pokazali da stalan efluks citrata sa nekih genotipova pšenice može da poboljša porast
pšenice u ranim fenofazama, na širokom opsegu pH, ali samo u uslovima ekstremnog
deficita P. Takođe, pokazano je da kod transgenog ječma TaALMT1 poboljšava
akviziciju P u kiselim zemljištima verovatno usled pojačanog efluksa malata (Delhaize
et al. 2009). Međutim, efekat organskih kiselina na povećanje dostupnosti P u rizosferi
je još uvek predmet naučne debate (Störm et al.2002; Pearse et al. 2006, 2007; Rose et
al.2010; Dotaniya et al. 2013; Duputel et al. 2013 ; Kostić-Kravljanac et al. 2014).
Efekat organskih kiselina na mobilizaciju P u velikoj meri zavisi kako od pH vrednosti,
tako i od količine P u zemljištu, ali i od tipa i koncentracije karboksilata (Khademi et al.
2010; Oburger et al. 2011; Palomo et al. 2006). Pokazano je takođe da značajnija
mobilizacija P može da se dogodi samo ako je koncentracija organskih kiselina
dovoljno visoka (od 2.5 do 10 μmol anjona po g zemljišta, Oburger et al. 2011).
Na L2 zemljištu nije zabeleženo osiromašenje okludovanog i Al-P, verovatno
usled manje količine ovih frakcija (Tabela 22). Moguće je da usled male koncentracije
P, karboksilati nisu tako efikasni kao u L1 zemljištu (Khademi et al. 2010; Oburger et
al. 2011; Palomo et al. 2006). Sa druge strane, snižavanje koncentracije Ca-P u rizosferi
L2 zemljišta, ne može biti objašnjeno niti eksudacijom karboksilata (videti Sliku 21),
niti efektom promene rizosfene pH (Tabela 10). Kod L2 zemljišta, postoji konzistento
snižavanje koncentrcije Ca-P u rizosferi nezavisno od primenjih tretmana i adaptivnog
odgovora (Tabela 22, vidi Slike 21 i 23), mada je moguće je da je rastvaranje ove
frakcije potpomugnuto i acidifikacijom rizosfere (Tabela 10).
U većini slučajeva očekivano je da dođe do smanjenja rizosfernog P usled
njegovog usvajanja korenom (Hinsinger 2001; Rose et al. 2010; Shen et al. 2011), ali je
u pojednim tretmanima popravke zemljišta u našim eksperimentima došlo čak i do
njegove akumulacije (Tabela 20). To se prvenstveno odnosi na povećanje koncentracije
Al-P frakcije u tretmanu CaCO3 (Tabela 21) . Međutim, u ovom tretmanu je daleko
najinteziviji efluks citrata kao i ekspresija TaMATE1 (Slike 20a i 21a, 22a i 23a), a
110
poznato je da su citrati efikasniji u mobilizaciji P u odnosu na ostale organske anjone
(Kadhemi et al. 2010). Slična akumulacija rizosfernog P je uočena kod nekoliko biljnih
vrsta, kao na primer kod raži i repe (Hinsinger et Gilkes 1996) i kod pasulja (Li et al,
2008), što je bila posledica dodatne mobilizacije P uzrokovane ili acidifikacijom ili
efluksom karboksilata.
Kod pšenice je acidifikacija rizosfere u najvećoj meri uslovljena ishranom N
(Neumann et Römheld 1999; Hinsinger et al. 2003); pH rizosfere opada kada je osnovi
amonijačni izvor N, a raste kada je izvor N nitrat (Tang et al. 1999; Nikolić et Römheld
2003; Curtin et Wen 2004). Acidifikacija rizosfere pšenice je primećena u nekoliko
istraživanja nezavisno od primenjenog oblika N (Akhtar et al. 2008; Nuruzzaman et al.
2006; Wang et al. 2008; Zhang et al. 2009). Studije su pokazale da kod pšenice, na
različitim zemljištima deficitarnim u dostupnom P, ili ne dolazi do promene rizosferne
pH kao u našem istraživanju (Li et al. 2008; Neumann et Römheld 1999) ili čak dolazi
do njene alkalizacije (Betencourt et al. 2012; Pearse et al. 2006; 2007; Rose et al. 2010;
Wang et al. 2010). Međutim, u većini ovih slučajeva alkalizacija rizosfere je najčešće
pripisana prekomernom usvajnju anjona u odnosu na katjone, i /ili je posledica slabog
pufernog kapaciteta ispitivanih zemljišta, tako da konkluzivni dokazi o alkalizaciji kao
fiziološkom odgovoru na deficit P u rizosferi pšenice još ne postoje.
5.2.3. Usvajanje fosfora i ekspresija Pi transportera u korenu pšenice
Porast nadzemnog dela pšenice nije bio uslovljen koncentracijom P (mg P po
jedinici suve mase), već njegovom količinom (mg P po organu ili celoj biljci) (Tabela 7,
Slika 10). Najveća koncentracija P u pšenici je zabeležena u kontrolnim tretmanima sa
najmanjom usvojenom količinom P, što je posledica ekstremne inhibicije rastenja
biljaka, odnosno koncentracionog efekta, što je objašnjeno u literaturi za mikroelemente
(npr. “paradoks Fe-hloroze”, Römheld 2000; Nikolic et Römheld 2002). Zbog toga je
predloženo da se u uslovima deficita P efikasnost biljke za usvajanje i akumulaciju P
fosfora procenjuje na osnovu količine, a ne koncentracije ovog makroelementa u biljci
(Fageria et Baligar 1999; Ozturk et al. 2005; Bertrand et al. 1999; Li et al. 2008).
111
Sa povećanjem količine dostupnog P (PAL) u zemljištu dolazi i do porasta
količine akumuliranog P u pšenici (Tabela 20, Slika 10), pa se može konstatovati da su
sve primenjene mere za popravku kiselih zemljišta uticale na poboljšanje statusa P u
biljci. Međutim, mera kalcizacije ispoljila je različit efekat na zemljištima L1 i L2, što je
prvenstveno bilo uslovljeno različitom dinamikom neorganskih frakcija P u zemljištu
(Tabele 21 i 22). Pojačano usvajanje P je često povezano i sa porastom broja fosfatnih
transportera u plazmamembrani ćelija korena (Drew et Saker 1984; Shimogawara et
Usuda 1995). U većini zemljišta, usled ograničene dostupnosti P, ekspresija Pi
transportera u korenu biljaka je “up”-regulisana deficitom P. Iako je pokazano da kod
mnogih biljnih vrsta, kao što su pšenica, Arabidopsis i krompir (Leggewie et al. 1997;
Karthikeyan et al. 2002; Miao et al. 2009) deficit P dovodi do pomenute indukcije
fosfatnih transportera, o mehanizmima regulacije ovih gena kod pšenice se još uvek
jako malo zna. Tako na primer, ekspresija TaPHT1.2 kod kineske sorte pšenice Xiaoyan
54 nije bila regulisana koncentracijom dostupnog P u zemljištu, dok je kod sorte Jing
411 ekspresija ovog Pi transportera bila indukovana u uslovima deficita P (Davies et al.
2002). Skorašnja istraživanja u poljskim uslovima su pokazala opadanje ekspresije
TaPHT1.1 i TaPHT1.2 sa porastom dostupnog P u zemljištu (Teng et al. 2013). Pored
toga, skoro da ne postoje relevatna naučna istraživanja, publikovana do sada, o
mehanizmima regulacije ovih gena, kod biljaka gajenih u zemljišnim uslovima gde se
različiti stresni faktori prepliću. Naši rezultati su pokazali različit obrazac ekspesije
TaPHT1.1 i TaPHT1.2. (Slika 25 i 26). Tako ekspresija TaPHT1.1 kod pšenice gajene
na L2 zemljištu nije pokazala jasan trend (Slika 26a), dok je kod L1 zemljišta do
smanjenja relativne ekspresije ovog gena došlo samo kada se sadržaj dostupnog P u
zemljištu povećao (Slika 25a, Tabela 20). Profil ekspresije TaPHT1.2 u korenu pšenice
bio je isti kod oba zemljišta, a njegova ekspresija je opadala sa porastom koncentracije
P u zemljištu i biljci, ukazujuću da je ekspersija ovog gena “down” regulisana statusom
P u biljci (Slike25b, 26b, Tabela 20). Međutim, jasno je pokazano i da kalcizacijom
zemljišta dolazi do jače ekspresije ovih transpotrera u odnosu na pšenicu gajenu u
kiselim zemljišnim uslovima, što može ukazati da se pored statusa P, kao snažan
modulator ekspresije ovog gena javlja i pH vrednost zemljišta, odnosno drugi stresni
faktori koji ograničavaju porast korena, kao što je Al3+ (Slike 15 i 16; Tabela 24; Kostić-
112
Kravljanac et al. 2004). Pored poboljšanja opštih uslova za rastenje korena, ne može se
isključiti ni pozitivan uticaj Ca na funkcionalnu strukturu i celovitost membrana (White
et Broadley 2003). Druge istraživačke grupe su pokazale da regulacija Pi transpotrera
može biti modulirana brojim faktorima. Tako je, na primer kod ječma, deficit Zn imao
ključnu ulogu u regulaciji ovih transportera (Huand et al. 2000), dok je kod
Arabidospisa pokazano da As ima ulogu u regulaciji Pi transportera (Catarecha et al.
2007). Međutim i dalje ostaje otvoreno pitanje da li su drugi faktori stresa pri niskoj pH
zemljišta, kao na primer visoke koncentracije Al3+ i H+, uticali na ekspresiju ovih
transportera, ili je njihova niža ekspresija posledica manjeg zahteva za P slabije
razvijenih biljaka koje se nalaze pod višestrukim mineralnim stresom (Kostić-
Kravljanac et al. 2014).
5.3. Fiziološka uloga silicijuma u prevazilaženju deficita fosfora kod
pšenice
Naši rezultati su jasno pokazali da je u svim zemljištima koja su bila đubrena Si
nezavisno od njegovog oblika, pšenica postigla veću biomasu i akumulirala više P u
odnosu na kontrolu bez P, dok su svi tretmani Si imali sličan ili čak bolji efekat kao i
unošenje P đubriva (Tabele 26 i 29). Iako je pozitivan efekat Si na status P kod biljaka
odavno poznat, rezultati su često kontradiktorni i ne postoji jasno objašnjenje ovog
fenomena (Fisher 1929; Ma et Takahashi 1990; Owino-Gerroh et Gascho 2004; Yang et
al. 2008; Adlan 1969; Roy et al. 1971; Roy 1969). Tako oprečni rezulati dobijeni u
pomenutim istraživanjima mogu biti posledica različitog eksperimentalnog dizajna,
različitih eksperimentanih uslova (zemljište ili hranljivi rastvor) ili genotipskih razlika
među eksperimentalnim biljkama. Tako je Roy (1969) prvi pokazao da efekat Si na
usvajanje P prvenstveno zavisi od biljne vrste; Si može da poveća usvajanje P kod
salate (Lactuca sativa), kukuruza, šećerne trske (Saccharum officinarum) i mimoze, a
čak da smanji usvajanje P kod pirinča. Do sada su predloženi različiti mehanizmi kako
Si može da poboljša status P kod biljke, kao na primer: a) povećanje dostupnosti P u
rizosferi (Roy et al. 1971; Koski-Vahala et al. 2001), b) boljim iskorišćenjem P (“P use
efficiency “) u samoj biljci (Fisher 1929); c) indirektno, smanjenim usvajanjem Mn i Al
113
(Ma et Takahashi 1991) ili d) pojačanim usvajanjem P (Rothbuhr et Scott 1955; Gong et
Chen 2012). U tom kontekstu, naši rezultati pokazuju da je više od jednog predloženog
mehanizma delovanja Si uključeno u ublažavanje deficita P kod pšenice (Tabele 26 i
29, Slike 34, 35 i 36). Efekat Si na povećanje dostupnosti P u rizosferi je zavisio i od
vrste Si-đubriva, i od tipa zemljišta. Na primer, dodavanje Na-silikata povećalo je
dostupnost P oko 2 puta na zemljištu tipa L1 (Tabela 27), dok na zemljištu tipa L2 nije
imalo značajan efekat (Tabela 31). Drugo, povećanje dostupnosti P u zemljištu nije
uvek bilo praćeno i odgovarajućim povećanjem P akumuliranog u nadzemnom delu
biljke. Primena različitih Si đubriva izazvala je različitu dostupnost P u zemljištu
(Tabela 27) ali ne i razliku u P statusu biljke (Tabela 26) na L1 tipu zemljišta, dok je na
L2 zemljištu primećeno da je P status biljke bio bolji pri primeni Si-đubriva nego P
đubriva (Tabela 30), iako je u zemljištu PAL imao suprotan trend (Tabela 31). Značajno
povećanje koncentracije i količine P u nadzemnom delu pšenice (Tabele 26 i 30),
nezavisno od količine pristupačnog P u zemljištu (Tabele 27 i 31) ukazuje na ulogu Si u
regulaciji procesa vezanih za usvajanje i akviziciju P u biljci. Tako je đubrenje Si
pojačalo skore sve adaptivne mehanizme koji se uobičajeno javljaju u uslovima deficita
P, kao što je povećanje odnosa korena prema nadzemnom delu (Tabela 26 i 29, Slika 29
), indukcija gena odgovornih za usvajanje fosfora TaPHT1.1 (Slika 37) i onih
uključenih u mehanizam eksudacije organskih kiselina (TaPEPC1, TaMATE, i
TaAMLT1) (Slike 35 i 36) kao i pojačana eksudacija citrata i malata (Slike 32 a i b 33,
40).
Poboljšan porast korena, što je uobičajena adaptacija na deficit P (Bhadoria et
al. 2002; Hermans et al. 2006) uočen je kod svih Si-tretiranih biljaka (Tabele 26 i 29).
Nezavisno od izvora Si, povećana biomasa korena je rezultirala i porastom relativnog
odnosa biomase korena prema biomasi nadzemnog dela, što je omogućilo pšenici da
iskoristi veću zapreminu zemljišta za akviziciju P. Pojačana ekspresija testiranih gena je
uočena je kod svih Si-tretiranih biljaka (Slike 35-37). Posebno je izražena bila indukcija
TaPHT1.1 kod Si-tretiranih biljaka što je uslovilo i povećano usvajanje i akumulaciju P
(Slike 37, tabele 26, 30 ). Pojačana eksudacija organskih kiselina u tretmanu sa Si
odgovara jačoj ekspresiji TaPEPC1, TaMATE1 i TaALMT1 (Slika 35-37)
114
Pojačana eksudacija organskih anjona kod biljaka tretiranih Si registrovana je i u
eksperimentu sa hranljivim rastvorima, gde je eliminisan svaki drugi mineralni stres
osim deficita P, a posebno višak Al. Pored toga, veći procenat malata i citrata u odnosu
na ukupnu količinu izlučenih organskih anjona (Slika 33 a i b), podržava tvrdnju da Si
može da utiče na metabolizam organskih kiselina u smeru njihove pojačane biosinteze.
Najverovatnije, pojačana ekspresija TaPEPC1 kod Si-tretiranih biljaka (Slika 35) je
omogućila pojačanu biosintezu organskih kiselina u Krebsovom ciklusu trikarbonskih
kiselina, dok je pojačana ekspresija TaMATE1 i TaALMT1 (Slika 36) omogućila efluks
citrata i malata iz simplasta korena pšenice (Slika 32 i 40). Sa druge strane, naučna
zajednica je podeljenog mišljena kada je u pitanju direktan uticaj Si na metabolizam
organskih kiselina kod različitih biljnih vrsta. Na primer, pokazano je da Si dovodi do
promene u metabolizmu organskih kiselina kod jagode (Fragaria nilgerrensis) (Wang
et Gallett 1989) i krastavca (Cucumis sativus) (Pavlovic et al. 2013), dok kod kukuruza
nije uočena takva veza (Wang et al. 2004). Međutim, značajno variranje u biosintezi i
eksudaciji organskih kiselina tokom vremena (Slika 31 i 32 ) ukazuje na važnost
odabira vremenskog okvira u kome će se uzrokovati eksudati korena.
Rezultati iz eksperimenta u hidroponima (bez Al) pokazali su da pri optimalnoj
količini P u hranljivom rastvoru Si nema efekat na rastenje pšenice (Tabela 35),
usvajanje P (Slika 38) niti na izlučivanje malata i citrata iz korena (Slika 40). Izostanak
efekta Si u uslovima kada nema stresa se u velikoj meri poklapa sa studijama drugih
autora koje ukazuju da Si nema ili ima vrlo mali efekat na metabolizam biljke u
odsustvu stresnog faktora (npr. Epstein 2009; Chain et al. 2009; Fauteux et al. 2006:
Pavlovic et al. 2013). Tokom poslednje decenije posebno narastaju naučni dokazi da Si
može da modulira i ekspresiju gena, i da na taj direktan način utiče na različite
biohemijske procese kod biljaka kada su one izložene bilo biotskom ili abiotskom stresu
(Chain et al. 2009; Fauteux et al. 2006; Pavlovic et al. 2013). Nedavna analiza pšenice
izložene delovanju patogena (Blumeria graminis f. sp. tritici) je pokazala da kod
neinficiranih biljaka Si deluje na mali broj gena, dok nakon infekcije Si modulira veliki
broj gena pomerajući njihov mehanizam regulacije od “up“ ka “down“ regulaciji (Chain
et al. 2009). Međutim, na koji način Si utiče na regulaciju ekspresije gena još uvek nije
poznat.
115
6. ZAKLJUČCI
1. Na mineralni stres koji ograničava rastenje useva na poljoprivrednim
zemljištima oštećenim rudničkom jalovinom pšenica se prilagođava promenama
metabolizma korena što uključuje pojačan efluks organskih anjona (citrata i
malata) uz indukciju gena koji kodiraju anjonske kanale (TaMATE1 i
TaALMT1), i aktiviranje fosfatnih transportera visokog afiniteta (TaPHT1.1 i
TaPHT1.2), kao i alokacijom biomase ka korenu. Ove adaptivne reakcije
korena, prvenstveno prema deficitu P, mogu biti dodatno modifikovane
(inhibirane ili pojačane) drugim nepovoljnim zemljišnim faktorima koji postoje
na ovim zemljištima kao što su niska pH i visoke koncentracije izmenljivog Al i
dostupnog Cu.
2. Primenom različitih mera popravke zemljišta dodatno se pojačavaju adaptivne
reakcije korena prema deficitu P. Ovo je osim kod kalcizacije (standardne mere
popravke kiselih zemljišta), primenjene pojedinačno ili u kombinaciji sa
mineralnim i organskim đubrivima, posebno bilo izraženo kod mere unošenja
silikatnih đubriva, što predstavlja inovaciju postojećih tehnologija za popravku
rudničkih zemljišta i stoga važan doprinos za praksu.
3. Dinamika P u zemljištu je značajno modulirana rizosfernim procesima pre svega
mobilizacijom teško rastvorljivih oblika P u zemljištu putem izlučivanja
organskih kiselina.
4. Mere za popravku zemljišta ispoljile su indirektan efekat na mobilnost P u
rizosferi, koji se ogleda u eliminisanju nepovoljnih faktora za rastenje korena i
reparaciji narušenog P-mobilizirajućeg kapaciteta, pre nego što su direktno
uticale na mobilnost P u rizosferi pšenice.
5. Unošenje đubriva na bazi Si imalo je za posledicu pojačavanje adaptavnog
odgovora pšenice na deficit P, odnosno na molekularnom nivou indukciju
ekspresije gena uključenih u biosintezu organskih kiselina (TaPEPC1) i
anjonskih transportera za njihovo izlučivanje iz korena (TaMATE1, TaALMT1),
kao i gena koji kodiraju ekspresiju fosfatnih transportera (TaPHT1.1 i
TaPHT1.2).
116
7. LITERATURA: Adams F (1984) Crop response to lime in the southern United States. In: F. Adams, ed. Soil
Acidity and Liming, 2nd ed. Madison, WI: Soil Science Society of America pp. 211–265. Adlan HA (1969) Effect of pH, silicon and phosphorus treatments on growth and yield of
papaya (Carica papaya L) PhD thesis. University of Hawaii. Ae N, Arihara J, Okada K, Yoshihara T, Johansen C (1990) Phosphorus uptake by pigeon pea
and its role in cropping systems of the Indian subcontinent. Science 248:477–480. Ai P, Sun S, Zhao J, Fan X, XinW, Guo Q, Yu L, Shen Q,Wu P, Miller AJ (2009) Two rice
phosphate transporters, OsPht1;2 and OsPht1;6, have different functions and kinetic properties in uptake and translocation. Plant Juornal 57: 798–809.
Alloway BJ (1999) Heavy Metals in Soils. Halsted Press, New York. Allen BL, Hajek BF (1989) Mineral occurrence in soil environments. In: J.B. Dixon, S.B.
Weed, eds. Minerals in Soil Environments, 2nd ed. Madison, WI: Soil Science Society of America pp. 199–278.
Alva AK, Edwards DG, Asher CJF, Blamey FPC (1986) Relationships between root length of
soybean and calculated activities of aluminum monomers in nutrient solution. Soil Science Society of America Journal 50:959–962.
Alexander M (1977) Microbial transformations of phosphorus. In: Introduction to Soil Microbiology. New York: Wiley. Akhtar MS, Yoko O, Tadashi A (2008) Intraspecific variations of phosphorus absorption
and remobilization, P forms, and their internal buffering in Brassica cultivars exposed to a P-stressed environment. Journal of Integrative Plant Biology 50: 703–716.
Anderson G (1967) Nucleic acids, derivatives, and organic phosphorus. In: A.D. McLaren GH,
Peterson, eds. Soil Biochemistry 1. New York: Marcel Dekker. Antonijević MM, Dimitrijević MD, Stevanović ZO, Šerbula SM, Bogdanović GD (2008)
Investigation of the possibility of copper recovery from the flotation tailings by acid leaching. Journal of Hazardous Materials 158: 23–34.
Antonović G (1974) Zemljišta basena Timoka. Centar za poljoprivredna istraživanja, Beograd. Arai Y, Sparks DL (2007) Phosphate reaction dynamics in soils and soil minerals: a multiscale approach. Advances in Agronomy 94:135–179. Badri DV, Loyola-Vargas VM, Broeckling CD (2008) Altered profile of secondary metabolites
in the root exudates of Arabidopsis ATP-binding cassette transporter mutants. Plant Physiology 146: 762–771.
Baek SH, Chung IM, Yun SJ (2001) Molecular cloning and characterization of a tobacco leaf
cDNA encoding a phosphate transporter. Molecular Cell 11: 1–6.
117
Baker DE, Senef JP (1995) Copper in B.J. Alloway (Ed.) Heavy Metals in Soils, Blackie and Son Ltd., London, pp. 179–205.
Banks D, Younger P, Arnesen R, Egil R, Banks S (1997) Mine-water chemistry: the good, the
bad and the ugly. Environmental Geology 32:157-174. Banješević M (2010) Cretaceous magmatic suites of the Timok Magmatic Complex. Geološki
anali balkanskog poluostrva 71: 12-22. Batjes NH (1997) A world data set of derived soil properties by FAOUNESCO soil unit for
global modelling. Soil Use Managagment 13: 9–16. Barceló J, Guevara P, Poschenrieder C (1993) Silicon amelioration of aluminum toxicity in
teosinte, Zea mays L. ssp. mexicana. Plant and Soil 154: 249-255. Benbi DK, Gilkes RJ (1987) The movement into soil of P from superphosphate grains and its
available to plants. Fertilizer research 12: 21–36. Bergmann W (1992) Nutritional disorders of plants: development, visual and analytical
diagnosis. Gustav Fischer, Jena. Bertrand I, Hinsinger P, Jaillard B, Arvieu JC (1999) Dynamics of phosphorus in the
rhizosphere of maize and rape grown on synthetic, phosphated calcite and goethite. Plant and Soil 211:111–119.
Betencourt E, Duputel M, Colomb B, Desclaux D, Hinsinger P (2012) Intercropping
promotes the ability of durum wheat and chickpea to increase rhizosphere phosphorus availability in a low P soil. Soil Biology and Biochemistry 46:181-190.
Bhadoria PS, Steingrobe B, Claassen N, Liebersbach H (2002) Phosphorus efficiency of wheat
and sugar beet seedlings grown in soils with mainly calcium, or iron and aluminium phosphate. Plant and Soil 264: 41-52.
Birchall JD (1990) The role of silicon in biology. Chemistry in Britain 26: 141-144. Bloom PR, McBride MB, Weaver RM (1979) Aluminum organic matter in acid soils: Buffering
and solution aluminum activity. Soil Science Society of America Journal 43:488–493. Bogdanović G, Antonijević M, Milanović Z, Šerbula S, Milić S (2007) Analiza stanja rudničkih
voda Rudnika bakra Bor, Zbornik radova II Simpozijum reciklaţne tehnologije i odrţivi razvoj, Sokobanja, Srbija 269-27.
Bogdanović G, Trumić M, Trumić M, Antić DV (2011) Upravljanje Otpadom Iz Rudarstva i
Mogućnost Prerade. Reciklaža i održiv razvoj 4: 37-43. Bogdanović G, Trumić M, Stanković V, Antić D, Trumić M, Milanović Z (2013) Rudničke
Vode Iz Rudnika Rtb Bor – Resurs Za Dobijanje Bakra Ili Zagađivač Životne Sredine.Reciklaža i održivi razvoj 6: 41-50.
118
Boehle J, Lindsay WL (1969) Micronutrients. The Fertilizer Shoe-Nails. Pt. 6. In the Limelight-Zinc. Fertilizer Solutions 13: 6-12.
Brankov J, Milijašević D, Milanović A (2012) The assessment of the surface water quality
using The water pollution index: a case study of the timok river (the danube river basin), Serbia. Archives of environmental protection 38:49 -61.
Brinkmann A (1993) A double-layer model for iron adsorption onto metal oxides, applied to
experimental data and to natural sediment of lake Veluwe, the Netherland. Hydrobiologia 253: 31-45.
Brown PH, Welch RM, Cary EE, Checkai RT (1987) Beneficial effects of nickel on plant
growth Journal of Plant Nutrition 10:2125–2135. Brumme R, Besse F (1992) Effect of liming and nitrogen feritization on emission on CO2 and
N2O from a temporate forest. Journal of geophysical research 12:12851-12858. Cameron R, Ritchie GSP, Robson R (1986) Relative toxicities of inorganic luminium
complexes tobarley. Soil Science Society of America Journal 50:1231–1236. Catarecha P, Segura MD, Franco-Zorrilla JM, García-Ponce B, Lanza M, Solan R, Paz-Ares J,
Leyva A (2007) A mutant of the Arabidopsis phosphate transporter PHT1;1 displays enhanced arsenic accumulation. Plant Cell 19: 1123–1133.
Chang SC, Jackson ML (1957) Fractionation of soil phosphorus. Soil Science 84:113–144. Chain F, Côté-Beaulieu C, Belzile CF, Menzies JG, Bélanger RR (2009) A Comprehensive
Transcriptomic Analysis of the Effect of Silicon on Wheat Plants Under Control and Pathogen Stress Conditions Molecular Plant-Microbe Interactions 22: 1323–1330.
Chappell JS, Birchall JD (1988) Aspects of the interactions of silicic acid with aluminium in
dilute solutions and its biological significance. Inorganica Chimica Acta 153: 1-4. Chiba Y, Yamaji N, Mitani N, Ma J (2009) HvLsi1 is a silicon influx transporter in barley. The
Plant Journal 57: 810-818. Clarkson DT, Sanderson J (1969) The uptake of a polyvalent cation and its distribution in root
apices of Allium cepa, tracer and autoradiographic studies. Planta 89:136–154. Clemente R, Walker D, Bernal M (2005) Uptake of heavy metals and As by Brassica juncea
grown in a contaminated soil in Azñalcóllar (Spain): the effect of soil amendments. Environmental Pollution 138:46-58.
Cocker KM, Evans DE, Hodson MJ (1998) The amelioration of aluminium toxicity by
silicon in higher plants: Solution chemistry or an in planta mechanism. Physiologia Plantarum 104:608–61.
COM (2006) Communication from the Commission to the Council, the European Parliament,
the European Economic and Social Committee and the Committee of the Regions - Thematic Strategy for Soil Protection.
119
Conyers M (1990) The control of aluminium solubility in some acidic Australian Soils. Journals in Soil Science. 41:147–156.
Cosgrove DJ (1977) Microbial transformations in the phosphorus cycle. In: M. Alexander, ed.
Advances in Microbial Ecology New York: Plenum Press. Curtin D, Wen G (2004) Plant cation-anion balance as affected by the ionic composition of the
growing medium. Plant and Soil 267: 109–115. Daram P, Brunner S, Rausch C, Steiner C, Amrhein N, Bucher M (1999) Pht2;1 encodes a low-
affinity phosphate transporter from Arabidopsis.The Plant Cell11: 2153–2166. Davies TGE, Ying J, Xu Q, Li ZS, Li JY (2002) Expression analysis of putative high-affinity
phosphate transporters in Chinese winter wheats. Plant, Cell and Environment 25:1325-1340.
de Andrade LRM, Ikeda M, Amaral LIV, Ishizuka J (2011) Organic acid metabolism and
root excretion of malate in wheat cultivars under aluminium stress. Plant Physiology and Biochemistry 49: 55-60.
de Angeli A, Zhang J, Meyer S, Martinoia E (2013) AtALMT9 is a malate-activated
vacuolar chloride channel required for stomatal opening in Arabidopsis. Nature Communications 4: 1804.
Delhaize E, Ryan PR, Randall PJ (1993) Aluminum tolerance in wheat (Triticum aestivum L.)
II. Aluminum-stimulated excretion of malic acid from root apices. Plant Physiology 103: 695–702.
Delhaize E, Ryan PR, Hebb DM, Yamamoto Y, Sasaki T, Matsumoto H (2004) Engineering
high-level aluminum tolerance in barley with the ALMT1 gene. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101: 15249–15254.
Delhaize E, Gruber BD, Ryan PR (2007) The roles of organic anion permeases in aluminium
resistance and mineral nutrition. FEBS Letters 581: 2255–2262. Delhaize E, Taylor P, Hocking PJ, Simpson RJ, Ryan PR, Richardson AE (2009) Transgenic
barley (Hordeum vulgare L.) expressing the wheat aluminium resistance gene (TaALMT1) shows enhanced phosphorus nutrition and grain production when grown on an acid soil. Plant Biotechnology Journal 7: 391–400.
Delhaize E, Ma JF, Ryan PR (2012) Transcriptional regulation of aluminium tolerance genes.
Trends in Plant Science 17: 341–348. Devau N, Hinsinger P, Le Cadre E, Colomb B, Gérard F (2011) Fertilization and pH effects on
processes and mechanisms controlling dissolved inorganic phosphorus in soils. Geochimica et Cosmochimica Acta 75:2980–2996.
Dinkelaker B, Römheld V, Marschner H (1989) Citric acid excretion and precipitation of
calcium citrate in the rhizosphere of white lupin (Lupinus albus L.). Plant, Cell and Environment 12: 285–292.
120
Domínguez M, Marañón T, Murillo J M, Schulin R, Robinson B (2010) Nutritional status of mediterranean trees growing in a contaminated and remediated area. Water, Air, and Soil Pollution 205:305-321.
Dotaniya ML, Datta SC, Biswas DR, Meena BP (2013) Effect of solution phosphorus
concentration on the exudation of oxalate ions by wheat (Triticum aestivum L.). Proceedings of the National Academy of Sciences, India Section B: Biological Sciences 83: 305–309.
Dou Z, Toth JD, Galligan DT, Ramberg CF, Ferguson JD (2000) Laboratory procedures for
characterizing manure phosphorus. Journal of Environmental Quality 29: 508–514. Dragisic Maksimovic J, Bogdanovic J, Maksimovic V, Nikolic M (2007) Silicon modulates the
metabolism and utilization of phenolic compounds in cucumber (Cucumis sativus L.) grown at excess manganese. Journal of Plant Nutrition and Soil Science 170: 739–744.
Drew MC, Saker LR (1984) Uptake and long-distance transport of phosphate, potassium and
chloride in relation to internal ion concentrations in barley: evidence of non-allosteric regulation. Planta 160: 500–507.
Dudka S, Adriano D (1997) Environmental impacts of metal ore mining and processing: a
review. Journal of Environmental Quality 26:590-602. Drovenik M, Antonijević I, Mićić I (1962) Novi pogledni na magmatizam i geološku građu
Timočke eruptivne oblasti. Vesnik Zavoda za geološka i geofizička istraživanja, Beograd, Ser. A, knj. XX:67-69.
Durrett TP, Gassmann W, Rogers EE (2007) The FRD3-mediated efflux of citrate into the root
vasculature is necessary for efficient iron translocation. Plant Physiology 144: 197–205. Duputel M, Florence Van Hoyea F, Joële Toucet J, Gérarda F (2013) Citrate adsorption can
decrease soluble phosphate concentration in soil: Experimental and modeling evidence. Applied Geochemistry 39 :85–92.
Earl KD, Syers JK, McLaughlin JR (1979) Origin of the Effects of Citrate, Tartrate, and Acetate
on Phosphate Sorption by Soils and Synthetic Gels. Soil Science Society of America Journal 43: 674–678.
Easterwood GW, Sartain JB (1990) Clover residue effectiveness in reducing
orthophosphate sorption on ferric hydroxide coated soil. Soil Science Society of America Journal 54: 1345–1350.
Egner H, Riehm H, Domingo W (1960) Untersuchungen über die chemische Bodenanalyse
als Grundlage für die Beurteilung des Nährstoffzustandes der Böden. II. Chemische Extraktionsmethoden zur Phosphor und Kaliumbestimmung. K. Lantbrukshoegskolans Annaler 26: 199–215.
EEA (2010) The European environment — State and Outlook 2010 Soil. Luxembourg.
Publications Office of the European Union, 2010
121
EPA (2004) Inventory of U.S. Greenhouse Gas Emissions and Sinks: 1990–2002, EPA 430-R-04-003. U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC.
Epstein E (1994) The anomaly of silicon in plant biology. Proceedings of the National Academy
of Sciences USA 91: 11-17. Epstein E (1999) Silicon. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 50:
641-664. Epstein E (2009) Silicon: its manifold roles in plants. Annals of Applied Biology 155:155–160. Exley C, Birchall JD (1992) Hydroxyaluminosilicate formation in solutions of low total
aluminium concentration. Polydedron 11: 1901-1907.
Exley C, Birchall JD (1993) A mechanism of hydroxyaluminosilicate formation. Polydedron 12: 1007-1017.
EC (2010) European Commission forecasts average crop production for 2010 in the EU despite
extreme weather. Press release IP/10/1027, European Commission, Brussels. Available at http://europa.eu/ rapid/press-release_IP-10-1027_en.
Fageria NK, Zimmermann FJP, Baligar VC (1995) Lime and phosphorus interactions on growth
and nutrient uptake by upland rice, wheat, common bean, and ncorn in an Oxisol. Journal of Plant Nutrition 18: 2519–2532.
Fageria NK, Baligar VC (1999) Phosphorus-use efficiency in wheat genotypes. Journal of
Plant Nutrition 22: 331–340. Fageria NK (2001) Adequate and toxic levels of copper and manganese in upland rice, common
bean, corn, soybean, and wheat grown on an oxisol. Communications in Soil Science and Plant Analysis 32:1659-1676.
Fan TW, Pedler M, Lane J, Crowley AN, Higashi RM (1997). Comprehensive analysis of
organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry 251: 57-68.
Fauteux F, Chain F, Belzile F, Menzies JG, Belanger RR (2006) The protective role of silicon in
the Arabidopsis–powdery mildew pathosystem. Proceedings of the National Academy of Sciences 17: 554–559.
FAO (2009) How to feed the world in 2050. High-level experts forum. Rome: Food and
Agriculture Organization of the United Nations. Fernie AR, Martinoia E (2009) Malate. Jack of all trades or master of a few? Phytochemistry
70:828–832. Fisher RA (1929) A preliminary note on the effect of sodium silicate in increasing the yield of
barley. Journal of Agricultural Science 19: 132-139.
122
Fontecha G, Silva-Navas J, Benito C, Mestres MA, Espino FJ, Hernandez-Riquer MV, Gallego FJ (2007) Candidate gene identification of an aluminum-activated organic acid transporter gene at the Alt4 locus for aluminum tolerance in rye (Secale cereale L.). Theoretical and Applied Genetics 114: 249–260.
Foy CD, Lafever HN, Schwartz JW, Fleming AL (1974) Aluminium tolerance of wheat
cultivars related to region of origin. Agronomy Journal 66: 751-758. Foy CD, Chanley RL, White MC (1978) The physiology of metal toxicity in plants. Annual
Review of Plant Biology 29:511–566. Foy CD (1988). Plant adaptation to acid, aluminum-toxic soils. Communications in Soil Science
and Plant Analysis 19:959–987. Furihata T, Suzuki M, Sakurai H (1992) Kinetic characterization of two phosphate uptake
systems with different affinities in suspension-cultured Catharanthus roseus protoplasts. Plant and Cell Physiology 33: 1151 – 115.
George TS, Fransson A-M, Hammond JP, White PJ (2011) Phosphorus nutrition: rhizosphere
processes, plant response and adaptations. In Bünemann E, Oberson A, Frossard E, eds, Phosphorus in Action: Soil Biology 100: 245–271.
George TS, Richardson AE (2008) Potential and limitations to improving crops for enhanced
phosphorus utilization. In: JP Hammond, PJ White, eds, The ecophysiology of plant – phosphorus interactions. Dordrecht: Springer, pp 247–270.
Ghannoum O, Conroy JP (2007) Phosphorus deficiency inhibits growth in parallel with
photosynthesis in a C3 (Panicum laxum) but not two C4 (P. coloratum and Cenchrus ciliaris) grasses. Functional Plant Biology 34: 72–81.
Golez NV, Kyuma K (1997) Influence of pyrite oxidation and soil acidification on some
essential nutrient elements. Aquacultural Engineering 16:107-124. Gong H, Chen (2012) The regulatory role of silicon on water relations, photosynthetic gas
exchange, and carboxylation activities of wheat leaves in field drought conditions. Acta Physiologiae Plantarum 34: 1589–1594.
Granados G, Pandey S, Ceballos H (1993) Response to selection for tolerance to acid soils in a
tropical maize population. Crop Science 33: 936–940. Gruber BD, Ryan PR, Richardson AE, Tyerman SD, Ramesh S, Hebb DM, Howitt S, Delhaize
E (2010) HvALMT1 from barley is involved in the transport of organic anions. Journal of Experimental Botany 61:1455–1467.
Guo CJ, Zhao XL, Liu XM, Zhang LJ, Gu JT, Li XJ, Lu WJ, Xiao K (2013) Function of wheat
phosphate transporter gene TaPHT2;1 in Pi translocation and plant growth regulation under replete and limited Pi supply conditions. Planta 237:1163–1178.
Gupta UC (1971) Boron and molybdenum nutrition of wheat, barley, and oats grown in Prince
Edward Island soils. Canadian Journal of Soil Science 51:415–422.
123
Guppy CN, Menzies NW, Moody PW, Blamey FPC (2005) Competitive sorption reactions between phosphorus and organic matter on soil: a review. Australian Journal of Soil Research 43: 189–202.
Hall AD, Morison CGT (1906) On the function of silica in the nutrition of cereals. Proceedings
of the Royal Society 77: 455-477. Halstead RL, McKercher RB (1975) Biochemistry and cycling of phosphorus. In: A. Paul, A.D.
McLaren, eds. Soil Biochemistry Vol. 4. New York: Marcel Dekker. Harrison AF (1987) Soil Organic Phosphorus—A Review of World Literature. CAB
International, Wallingford, Oxon, UK, pp 257. Haynes RJ (1982) Effects of liming on phosphate availability. Plant and Soil 68: 289–308. Henderson PJF (1993) The 12-transmembrane helix transporters. Current Opinion in Cell
Biology 5:708–721. Hermans C, Hammond JP, White PJ, Verbruggen N (2006) How do plants respond to nutrient
shortage by biomass allocation? Trends in Plant Science 11: 610–617. Hiltner L (1904) Über neuere Erfahrungen und Probleme auf dem Gebiete der
Bodenbakteriologie unter besonderer Berücksichtigung der Gründüngung und Brache. Arbeiten der Deutschen Landwirtschaftlichen Gesellschaft 98, 59–78.
Hinojosa B, Carreira J, Garcia-Ruiz R, Rodríguez-Maroto J, Daniell T, Griffiths B (2010) Plant
treatment, pollutant load, and soil type effects in rhizosphere ecology of trace element polluted soils. Ecotoxicology and Environmental Safety 73:970-981.
Hinsinger P, Gilkes RJ (1996) Mobilization of phosphate from phosphate rock and alumina-
sorbed phosphate by the roots of ryegrass and clover as related to rhizosphere pH. European Journal of Soil Science 47: 533–544.
Hinsinger P (2001) Bioavailability of soil inorganic P in the rhizosphere as affected by root-
induced chemical changes: a review. Plant and Soil 237: 173–195. Hinsinger P, Plassard C, Tang C, Jaillard B (2003) Origins of root-induced pH changes in the
rhizosphere and their responses to environmental constraints: a review. Plant and Soil 248: 43–59.
Hinsinger P, Courchesne F (2008) Biogeochemistry of metals and metalloids at the soil–root
interface. In: Violante A, Plant Soil 321:385–408. Hodson MJ, Evans DE (1995) Aluminium/ silicon interactions in higher plants. Journal of
Experimental Botany 46: 161-171. Hoekenga OA, Maron LG, Pineros MA, Cancado GMA, Shaff J (2006) AtALMT1, which
encodes a malate transporter, is identified as one of several genes critical for aluminum tolerance in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. USA 103: 9738–9743.
124
Hoffland E, Findenegg GR, Nelemans JA (1989) Solubilization of rock phosphate by rape. II. Local root exudation of organic acids as a response to P-starvation. Plant and Soil 113:161–165
. Hoffland E (1992) Quantitative evaluation of the role of organic acid exudation in the
mobilization of rock phosphate by rape. Plant and Soil 140: 279–289. Huand C, Barker SJ, Langridge P, Smith FW, Graham RD (2000). Zinc deficiency up-regulates
expression of high-affinity phosphate transporter genes in both phosphate-sufficient and -deficient barley roots. Plant Physiology 124: 415–422.
Huang X, Zhu W, Dai S, Gai S, Zheng G, Zheng C (2008). The involvement of mitochondrial
phosphate transporter in acceleratingnbud dormancy release during chilling treatment of tree peonyn (Paeonia suffruticosa). Planta 228:545–552.
Hue NV, Craddock GR, Adams F (1986) Effect of organic acids on aluminum toxicity in
subsoils. Soil Science Society of America Journal 50:28–34. Hue NV (1991) Effects of organic acids/anions on P sorption and phytoavailability in soils with
different mineralogies. Soil Science 152: 463. Hvorup RN, Winnen B, Chang AB, Jiang Y, Zhou XF, Saier MH (2003) The
multidrug/oligosaccharidyl-lipid/ polysaccharide (MOP) exporter superfamily. European Journal of Biochemistry 70: 799–813.
ICSG (2014) World refined copper production and usage trends.dostupno online:
http://www.icsg.org/index.php/component/jdownloads/finish/165/871. IPCC (1997) IPCC Guidelines for National Greenhouse Gas Inventories: Reporting
Instructions, 3 vols. IPCC/OECD/IEA, Paris. IUSS Working Group WRB (2006) World reference base for soil resources 2006. 2nd ed.
World Soil Resources Reports No. 103. FAO, Rome. Jarvis SC (1987) The uptake and transport of silicon by perennial ryegrass and wheat. Plant and
Soil 97: 429-437. Jacob J, Lawlor DW (1991) Stomatal and mesophyll limitations of photosynthesis in phosphate
deficient sunflower, maize and wheat plants. Journal of Experimental Botany 42:1003–1011.
Jain A, Vasconcelos MJ, Raghothama KG, Sahi SV (2007) Molecular mechanisms of plant
adaptation to phosphate deficiency. Plant Breeding Reviews 29: 359–419. Jia HF, Ren HY, Gu M, Zhao JN, Sun SB, Zhang X, Chen J, Wu P, Xu G (2011) The phosphate
transporter gene OsPht1;8 is involved in phosphate homeostasis in rice. Plant Physiology 156.
Jones DL, Dennis PG, Owen AG, van Hees PAW (2003) Organic acid behavior in soils-misconceptions and knowledge gaps. Plant and Soil 248: 31–41.
125
Johnson JF, Allan DL, Vance CP, Weiblen G (1996) Root carbon dioxide fixation by phosphorus-deficient Lupinus albus. Contribution to organic acid exudation by proteoid roots. Plant Physiology 112 :19-30.
Jovanović B (1985) Smelting of copper in the eneolithic period of the Balkans. British Museum
Research Laboratory, London. Jungk A (2001) Root hairs and the acquisition of plant nutrients from soil. Journal of Plant
Nutrition and Soil Science 164: 121-129. Kabata-Pendias A, Pendias H (1984) Trace elements in soils and plants. Boca Raton, FL: CRC
Press. Karamata S, Knezevic V, Pecskay Z, Djordjevic M (1997) Magmatism and metallogeny of the
Ridanj-Krepoljin belt (Eastern Serbia) and their correlation with northern and eastern analogues. Miner Deposita 32:452-458.
Karandashov V, Bucher M (2005) Symbiotic phosphate transport in arbuscular mycorrhizas.
Trends in Plant Science 10: 22–29. Karthikeyan AS, Varadarajan DK, Mukatira UT, D’Urzo MP, Damsz B, Raghothama KG
(2002) Regulated expression of Arabidopsis phosphate transporters. Plant Physiology 130: 221–233.
Khademi Z, Jones DL, Malakouti MJ, Asadi F (2010) Organic acids differ in enhancing
phosphorus uptake by Triticum aestivum L.—effects of rhizosphere concentration and counterion. Plant and Soil 334: 151–159.
Kidd PS, Lluugan M, Poschhenrieder C, Gunsĕ B, Barceló J (2001) The role of root exudates in
aluminum resistance and silicon induced amelioration of aluminum toxicity in three varieties of maize (Zea mays L.). Journal of Experimental Botany 52: 1339-1352.
Kiiskinen M, Korhonen M, Kangasjärvi J (1997). Isolation and characterization of cDNA for a
plant mitochondrial phosphate translocator (Mpt1): ozone stress induces Mpt1 mRNA accumulation in birch (Betula pendula Roth). Plant Molecular Biology 35: 271–279.
Kinraide TB, Parker DR (1990) Apparent phytotoxicity of mononuclear hydroxy-aluminum to
four dicotyledonous species. Physiologia Plantarum 79:283–288. Kitayama K. Aiba S, Takyu M, Majalap N, R. Wagai R (2004) Soil phosphorus fractionation
and phosphorus-use efficiency of a Bornean tropical montane rain forest during soil aging with podozolization. Ecosystems 7:259–274.
Ko WH, Hora FK (1970) Production of phospholipases by soil microorganisms. Soil Science
10:355–358. Kochian LV, Hoekenga OA, Piñeros MA (2004) How do crop plants tolerate acid soil?
Mechanisms of aluminum tolerance and phosphorus efficiency. Annual Review of Plant Biology 55:459–493.
126
Koski-Vahala J, Hartikainen H, Tallberg P (2001) Phosphorus mobilization from various sediment pool in response to increase pH and silicate concentration. Journal of Environmental Quality 30: 546–552.
Kostić LJ, Nikolić N, Samardzić J, Milisavljević M, Vuk Maksimović V, Dragan Čakmak,
Manojlovic D, Nikolic M (2014) Liming of anthropogenically acidified soil promotes phosphorus acquisition in the rhizosphere of wheat. Biology and Fertility of Soils DOI 10.1007/s00374-014-0975-y.
Koyama T, Ono T, Shimizu M, Jinbo T, Mizuno R, Tomita K, Mitsukawa N, Kawazu T,
Kimura T, Ohmiya K, Sakka K (2005) Promoter of Arabidopsis thaliana phosphate transporter gene drives root-specific expression of transgene in rice. Journal of Bioscience and Bioengineering 99: 38-42.
Lambers H, Juniper D, Cawthray GJ, Erik J, Veneklaas EJ, Martinez- Ferri E (2002) The
pattern of carboxylate exudation in Banksia grandis (Proteaceae) is affected by the form of phosphate added to the soil. Plant and Soil 238: 111–122.
Larsen S (1967) Soil phosphorus. Advances in Agronomy 19: 151–210. Leggewie G, Willmitzer L, Riesmeier JW (1997) Two cDNAs from potato are able to
complement a phosphate uptake-deficient yeast mutant: identification of phosphate transporters from higher plants. Plant Cell 9: 381–392.
Li H, Shen J, Zhang F, Clairotte M, Drevon JJ, Le Cadre E, Hinsinger P (2008) Dynamics of
phosphorus fractions in the rhizosphere of common bean (Phaseolus vulgaris L.) and durum wheat (Triticum turgidum durum L.) grown in monocropping and intercropping systems. Plant and Soil 312:139–150.
Li J, Liu X, Zhou W, Sun J, Tong Y, Liu W, Li ZS, Wang P, Yao S (1995) Technique of wheat
breeding for efficiently utilizing soil nutrient elements. Science in China Series B: Chemistry 38: 1313–1320.
Li J, Lesiner SM, Frantz J (2008) Alleviation of copper toxicity in Arabidopsis thaliana by
silicon addition to hydroponic solutions. Journal of the American Society for Horticultural Science 133: 670-677.
Li XF, Ma JF, Matsumoto H (2000) Pattern of aluminum-induced secretion of organic acids
differs between rye and wheat. Plant Physiology 123: 1537–1543. Liang CA, Piñeros MA, Tian J, Yao Z, Sun L, Liu J, Shaff J, Coluccio A, Kochian LV, Liao H
(2013) Low pH, Aluminum, and Phosphorus Coordinately Regulate Malate Exudation through GmALMT1 to Improve Soybean Adaptation to Acid Soils. Plant Physiology 161: 1347–1361.
Liang YC, Wong JWC, Wei L (2005) Silicon-mediated enhancement of cadmium tolerance in
maize (Zea mays L.) grown in cadmium contaminated soil. Chemosphere 58: 475-483. Liang Y, Sun W, Zhu Y-G, Christie P (2007) Mechanisms of silicon mediated alleviation of
abiotic stresses in higher plants: a review. Environmental Pollution 147: 422–428.
127
Ligaba A, Katsuhara M, Ryan PR, Shibasaka M, Matsumoto H (2006) The BnALMT1 and BnALMT2 genes from rape encode aluminum-activated malate transporters that enhance the aluminum resistance of plant cells. Plant Physiology. 142: 1294–1303.
Ligaba A, Maro LG, Shaff J, Kochian LV, Piñeros MA (2012)Maize ZmALMT2 is a root anion
transporter that mediates constitutive root malate efflux. Plant, Cell and Environment 35: 1185–1200.
Lindsay WL, Frazier AW, Stephenson HF (1962) Identification of reaction products from
phosphate fertilizers in soils. Proceedings - Soil Science Society of America 26: 446–452. Lindsay WL (1979) Chemical equilibria in soils. John Wiley & Sons,New York, USA. Lindsay WL, Vlek PLG, Chien SH (1989) Phosphate minerals. In JB Dixon, B Weed, eds,
Minerals in Soil Environment, Ed 2. Soil Science Society of America, Madison, WI, pp 1089–1130.
Liu C, Muchhal US, Mukatira U, Kononowicz AK, Raghothama KG (1998) Tomato phosphate
transporter genes are differentially regulated in plant tissues by phosphorus. Plant Physiology 116: 91–99.
Liu J, Samac DA, Bucciarelli B, Allan DL, Vance CP (2005) Signaling of phosphorus
deficiency-induced gene expression in white lupin requires sugar and phloem transport. The Plant Journal 41: 257–268.
Liu J, Magalhaes JV, Shaff J, Kochian LV (2009) Aluminum-activated citrate and malate
transporters from the MATE and ALMT families function independently to confer Arabidopsis aluminum tolerance. Plant Journal 57: 389–399.
Liu X, Yang L, Zhou X, Zhou M, Lu Y, Ma L, Ma H, Zhang Z (2013). Transgenic wheat
expressing Thinopyrum intermedium MYB transcription factor TiMYB2R- �1 shows enhanced resistance to the take-all disease. Journal of Experimental Botany 64:2243-2253.
López-Bucio J, Martínez de la Vega O, Guevara-García A, Herrera-Estrella L (2000) Enhanced
phosphorus uptake in transgenic tobacco plants that overproduce citrate. Nature Biotechnology 18:450–453.
Lopez-Hernandez DG, Siegert G, Rodriguez JV (1986) Competitive Adsorption of Phosphate
with Malate and Oxalate by Tropical Soils. Soil Science Society of America Journal 50: 1460–1462.
Loth-Pereda V, Orsini E, Courty PE, Lota F, Kohler A, Diss L, Blaudez D, Chalot M, Nehls U,
Bucher M, Martin F (2011) Structure and expression profile of the phosphate Pht1 transporter gene family in mycorrhizal Populus trichocarpa. Plant Physiology 156:2141–2149.
Lottermoser B (2003). Mine wastes: characterization, treatment and environmental impacts.
Springer Verlag, Berlin. Lynch J (1995) Root architecture and plant productivity. Plant Physiology 109: 7 – 13.
128
Lynch JP, Brown KM (2008) Root strategies for phosphorus acquisition. Springer Science, Dordrecht, The Netherlands, pp 83–111.
Ma JF, Takahashi E (1990) Effect of silicon on the growth and phosphorus uptake of rice. Plant
and Soil 126: 115-119. Ma JF, Takahashi E (1991) Effect of silicate on phosphate availability for rice in a P-deficient
soil Plant and Soil :151-155. Ma JF, Sasaki M, Matsumoto H (1997) Al-induced inhibition of root elongation in corn, Zea
mays L. is overcome by Si addition. Plant and Soil 188: 171-176. Ma JF, Ryan PR, Delhaize E (2000) Aluminum tolerance genes on the short arm of
chromosome 3R are linked to organic acid release in triticale. Plant Physiology 122: 687–694.
Ma JF, Ryan PR, Delhaize E (2001) Aluminium tolerance in plants and the complexing role of
organic acids. TRENDS Plant Sci. 6:273–278. Ma JF, Nagao S, Sato K, Ito H, Furukawa J, Takeda K (2004) Molecular mapping of a gene
responsible for Al-activated secretion of citrate in barley. Journal of Experimental Botany 55: 1335– 1341.
Ma JF, Yamaji N (2006) Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends in Plant
Science 11:392-397. Magalhaes JV (2010) How a microbial drug transporter became essential for crop cultivation
on acid soils: aluminium tolerance conferred by the multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family. Annals of Botany 106:199–203.
Maron LG, Pineros MA, Guimaraes CT, Magalhaes JV, Pleiman JK, Mao CZ, Shaff J, Belicuas
SNJ, Kochian LV (2010) Two functionally distinct members of the MATE (multi-drug and toxic compound extrusion) family of transporters potentially underlie two major aluminum tolerance QTLs in maize. The Plant Journal 61:728-740.
Marschner H (1995) Mineral nutrition of higher plants. Academic Press, London. Marschner P. Crowley D, Yang CH (2004) Development of specific rhizosphere bacterial
communities in relation to plant species, nutrition and soil type. Plant and Soil 261: 199–208.
Martin RB (1991) Fe 3+ and Al 3+ hydrolysis equilibria. Cooperativity in Al 3+ hydrolysis
reactions. Journal of Inorganic Biochemistry 44:141–147. Mengel K, Kirkby EA (1987) Principles of plant nutrition. Kluwer, Dordrecht Mengel D, Rehm G (2000) Fundamentals of fertilizer application. In: M.E. Sumner, ed.
Handbook of Soil Science. Boca Raton, FL: CRC Press, pp. 155–174.
129
Menzies NW, Bell LC, Edwards DG (1994) Exchange and solution phase chemistry of acid, highly weathered soils: II. Investigation of mechanisms controlling Al release into solution. Australian Journal of Soil Research 32:269–283.
Meharg AA, Hartley-Whitaker J (2002) Arsenic uptake and metabolism in arsenic esistant and
nonresistant plant species. New Phytologist 154:29–43 Meyer S, Mumm P, Imes D, Endler A, Weder B, Al-Rasheid KAS, Geiger D, Marten I,
Martinoia E, Hedrich R (2010) AtALMT12 represents an R-type anion channel required for stomatal movement in Arabidopsis guard cells. The Plant Journal 63:1054–1062.
Meyer S, Scholz-Starke J, De Angeli A, Kovermann P, Burla B, Gambale F, Martinoia E (2011)
Malate transport by the vacuolar AtALMT6 channel in guard cells is subject to multiple regulation. Plant Journal 67:247–257.
Miao J, Sun J, Liu D, Li B, Zhang A, Li Z, Tong Y (2009) Characterization of the promoter of
phosphate transporter TaPHT1.2 differentially expressed in wheat varieties. Journal of Genetics and Genomics 36: 455–466.
Mills H, Jones JB (1996) Plant Analysis Handbook II. Athens, Ga.: Micro Macro Publishing,
Inc., p. 422. Misson J, Thibaud MC, Bechtold N, Raghothama K, Nussaume L (2004) ranscriptional
regulation and functional properties of Arabidopsis Pht1;4, a high affinity transporter contributing greatly to phosphate uptake in phosphate deprived plants. Plant Molecular Biology 55: 727-741.
Mitani N, Yamaji N, Ma JF (2009) Identification of maize silicon influx transporters. Plant Cell
Physiology 50: 5-12. Miyasaka SC, Buta JG, Howel RK, Foy CD (1991) Mechanism of aluminum tolerance in
snapbeans: Root exudation of citric acid. Plant Physiology 96:737–743. Mo B, Lian B (2011) Interactions between Bacillus mucilaginosus and silicate minerals
(weathered adamellite and feldspar): weathering rate, products, and reaction mechanisms. Chinese Journal of Geochemistry 30:187–192.
Mooney BP, Miernyk JA, Randall DD (2002) The complex fate of alpha-ketoacids. Annual
Review of Plant Biology 53:357–375. Montpetit J, Vivancos J, Mitani-Ueno N, Yamaji N, Remus-Borel W, Belzile F, Ma JF,
Bélanger RR (2012) Cloning, functional characterization and heterologous expression of TaLsi1, a wheat silicon transporter gene. Plant Molecular Biology 79: 35-46.
Motoda H,Sasaki T, Kano Y,Ryan P,Delhaize E,Matsumoto H,Yamamoto (2007) The membrane topology of ALMT1, an aluminum-activated malate transport protein in wheat (Triticum aestivum). Plant Signaling and Behaviour 2:467–472.
130
Muchhal US, Pardo JM, Raghothama KG (1996) Phosphate transporters from the higher plant Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 93: 10519 – 10523.
Mudge SR, Rae AL, Diatloff E, Smith FW (2002) Expression analysis suggests novel roles for
members of the Pht1 family of phosphate transporters n Arabidopsis. The Plant Journal 31: 341–353.
Nagy R, Vasconcelos MJ, Zhao S, McElver J, Bruce W, Amrhein N, Raghothama KG, Bucher
M (2006) Differential regulation of five Pht1 phosphate transporters from maize (Zea mays L.). Plant Biology 8: 186–197.
Nandi SK, Pant RC, Nissen P (1987) Multiphasic uptake of phosphate by corn roots. Plant, Cell
& Environment 10: 463 – 474. Nellemann C, MacDevette M, Manders T, Eickhout B, Svihus B, Prins AG, Kaltenborn BP
(2009) The environmental food crisis–The environment’s role in averting future food crises. A UNEP rapid response assessment. Nairobi: United Nations Environment Programme (UNEP).
Neumann G, Römheld V (1999) Root excretion of carboxylic acids and protons in phosphorus-
deficient plants. Plant and Soil 211:121–130. Neumann G, Martinoia E (2002) Cluster roots – an underground adaptation for survival in
extreme environments. Trends in Plant Science 7: 162–167. Neumann G, Römheld V (2002) Root-induced changes in the availability of nutrients in the
rhizosphere. In Y Waisel, A Eshel, U Kafkafi, eds, Plant Roots, The Hidden Half, Ed 3. Marcel Dekker, Inc., New York, pp 617–649.
Nye PH, Tinker PB (1977) Solute Movement in the Soil-Root System. University of California
Press, Berkeley, CA. Nikolić M, Römheld V (2002) Does high bicarbonate supply to roots change availability of iron
in the leaf apoplast? Plant and Soil 241: 67-74. Nikolić M, Romheld V (2003) Nitrate does not result in iron inactivation in the apoplast of
sunflower leaves. Plant Physiology 132: 1303–1314. Nikolić M, Nikolić N, Liang Y, Kirkby EA, Römheld V (2007) Germanium-68 as an
adequate tracer for silicon transport in plants. Characterization of silicon uptake in different crop species. Plant Physiology 143: 495-503.
Nikolić N, Kostić Lj, Djordjević A, Nikolić M (2011) Phosphorus deficiency is the major limiting factor for wheat on alluvium polluted by the copper mine pyrite tailings: a black box approach. Plant and Soil 339: 485-498.
Nikolić N, Nikolić M (2012) Gradient analysis reveals a copper paradox on floodplain soils
under long-term pollution by mining waste. Science of the Total Environment 425:146-154.
131
Nikolić N. 2013. Ecology of Alluvial Arable Land Polluted by Copper Mine Tailings: New Insights for Restoration. PhD Thesis. University of Hohenheim.
Norrish K and Rosser H (1983) Mineral phosphate. In Soils: an Australian viewpoint. pp. 335–
361. Academic Press, Melbourne, CSIRO/London, UK, Australia. Nuruzzaman M, Lambers H, Bolland MDA, Veneklaas EJ (2006) Distribution of carboxylates
and acid phosphatase and depletion of different phosphorus fractions in the rhizosphere of a cereal and three grain legumes. Plant and Soil 28: 109–120.
Nussaume L, Kanno S, Javot H, Marin E, Pochon N, Ayadi A, Nakanishi TM, Thibaud MC
(2011) Phosphate import in plants: focus on the Pht1 transporters. Frontiers in Plant Science 2: 1–12.
Oberson A, Friesen DK, Rao IM, Bühler S, Frossard E (2001) Phosphorus transformations in an
oxisol under contrasting land-use systems: the role of the soil microbial biomass. Plant and Soil 237: 197-210.
Oburger E, Jones DK, Wenzel WW (2011) Phosphorus saturation and pH differentially regulate
the efficiency of organic acid anion-mediated P solubilization mechanisms in soil. Plant and Soil 341: 363–382.
Oldeman LR, Hakkeling RTA, Sombroek WG (1991) Second revised edition. World map of the
status of human-induced soil degradation. An explanatory note. Wageningen. UNEP, Nairobi . International Soil Reference and Information Centre (ISRIC) pp.35.
Osborne LD, Rengel Z (2002) Genotypic differences in wheat for uptake and utilization of P
from iron phosphate. Australian Journal of Agricultural Research 53:837–844. Owino-Gerroh C, Gascho GJ (2004) Effect of Silicon on Low pH Soil Phosphorus Sorption and
on Uptake and Growth of Maize. Communications In Soil Science And Plant Analysis 35: 2369–2378.
Ozturk L, Eker S, Torun B, Cakmak I (2005) Variation in phosphorus efficiency among 73
bread and durum wheat genotypes grown in a phosphorus-deficient calcareous soil. Plant and Soil 269: 69–80.
Palomo L, Claassen N, Jones DL (2006) Differential mobilization of P in the maize rhizosphere
by citric acid and potassium citrate. Soil Biology and Biochemistry 38: 683–692. Parfitt RL (1978) Anion adsorption by soils and soil materials. Advances in Agronomy 30: 1–50. Parker DR, Kinraide, TB, Zelazny LW (1988) Aluminum speciation and phytotoxicity in dilute
hydroxylaluminum solutions. Soil Science Society of America Journal 52:438–444. Paszkowski U, Kroken S, Roux C, Briggs SP (2002) Rice phosphate transporters include an
evolutionarily divergent gene specifically activated in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99: 13324–13329.
132
Pavan MA, Bingham FT (1982) Toxicity of aluminum to coffee seedlings grown in nutrient solution. Soil Science Society of America Journal 46:993–997.
Pavinato PS, Merlin A, Rosolem CA (2009) Phosphorus fractions in Brazilian Cerrado soils as
affected by tillage. Soil and Tillage Research 105: 149–155. Pavlovic J, Samardzic J, Maksimovic V, Timotijevic G, Stevic N, Laursen KH, Hansen TH,
Husted S, Schjoerring JK, Liang YC, Nikolic M (2013) Silicon alleviates iron deficiency in cucumber by promoting mobilization of iron in the root apoplast. New Phytologist 198:1096–1107.
Pheav S, Bell RW, White PF, Kirk GJD (2003) Fate of applied fertilizer phosphorus in a highly
weathered sandy soil under lowland rice cropping, and its residual effect. Field Crops Research 81:1–16.
Pearse SJ, Veneklaas EJ, Cawthray GR, Barber MDA, Lambers H (2006) Triticum aestivum
shows a greater biomass response to a supply of aluminium phosphate than Lupinus albus, despite releasing less carboxylates into the rhizosphere. New Phytologist 169:515–524.
Pearse SJ, Veneklaas, EJ, Cawthray G, Bolland MDA, Lambers H (2007) Carboxylate
composition of root exudates does not relate consistently to a crop species’ ability to use phosphorus from aluminium, iron or calcium phosphate sources. New Phytologist 173:181–190.
Pellet DM, Papernik LA, Kochian LV (1996) Multiple aluminum-resistance mechanisms in
wheat: Roles of root apical phosphate and malate exudation. Plant Physiology 112:591–597.
Pineros MA, Cancado GMA, Kochian LV (2008) Novel Properties of the Wheat Aluminum
Tolerance Organic Acid Transporter (TaALMT1) Revealed by Electrophysiological Characterization in Xenopus Oocytes: Functional and Structural Implications. Plant Physiology 147: 2131–2146.
Plaxton WC, Podesta FE (2006) The functional organization and control of plant respiration.
Critical Reviews in Plant Sciences 25: 159–198. Prabagar S, Hodson MJ, Evans DE (2011) Silicon amelioration of aluminium toxicity and cell
death in suspension cultures of Norway spruce (Picea abies (L.) Karst.). Environmental and Experimental Botany 70: 266-276.
Rae AL, Cybinski DH, Jarmey JM, Smith FW (2003) Characterization of two phosphate
transporters from barley; evidence for diverse function and kinetic properties among members of the Pht1 family. Plant Molecular Biology 53: 27–36.
Raghothama KG (1999) Phosphate acquisition. Annual Review of Plant Physiology and Plant
Molecular Biology 50:665–693. Rains DW, Epstein E, Zasoki RJ, Aslam M (2006) Active silicon uptake in wheat. Plant and
Soil 280: 223-228.
133
Rausch C, Bucher M (2002) Molecular mechanisms of phosphate transport in plants. Planta 216: 23–37.
Raven JA (2003) Cycling silicon–the role of accumulation in plants. New Phytologist 158: 419-
421. Raynal DJ, Joslin JD, Thornton FC, Schaedle M, Henderson GS (1990) Sensitivity of tree
seedlings toaluminum: III. Red spruce and loblolly pine. Journal of Environmental Quality 19:180–187.
Reddy DD, Rao AS, Takar PN (1999) Effects of repeated manure and fertilizer phosphorus
additions on soil phosphorus dynamics under soybean–wheat rotation. Biology and Fertility of Soils 28:150–155.
Reid RJ, Mimura T, Ohsumi Y, Walker NA, Smith FA (2000) Phosphate transport
in Chara:membrane transport via Na/Pi cotransport. Plant, Cell and Environment 23: 223 – 228.
Reuther W, Labanauskas CK (1966) Copper. In: H.D. Chapman, ed. Diagnostic Criteria for
Plants and Soils. Berkeley, CA: University of California Division of Agricultural Sciences Press, 1966, pp. 394–404.
Richardson AE (2009) Regulating the phosphorus nutrition of plants: molecular biology
meeting agronomic needs. Plant and Soil 322: 17–24 Richardson AE, Lynch JP, Ryan PR, Delhaize E, Smith FA, Smith SE, Harvey PR, Ryan
MH, Veneklaas EJ, Lambers H (2011) Plant and microbial strategies to improve the phosphorus efficiency of agriculture. Plant and Soil 349: 121–156.
Richmond KE, Sussman M (2003) Got silicon? The non-essential beneficial plant nutrient.
Current Opinion in Plant Biology 6: 268-272. Roboredo M, Fangueiro D, Lage S, Coutinho J (2012) Phosphorus dynamics in soils amended
with acidified pig slurry and derived solid fraction. Geoderma 190:328–333. Rodrigues FÁ, Benhamou N, Datnoff LE, Jones JB, Bélanger RR (2003) Ultrastructural and
cytochemical aspects of silicon-mediated rice blast resistance. Phytopathology Journal 93: 535-546.
Roelofs, RFR, Rengel Z, Cawthray GR, Dixon KW, Lambers H (2001) Exudation of
carboxylates in Australian Proteaceae: chemical composition. Plant, Cell and Environment 24:891–903.
Rogalla H, Römheld V (2002) Role of leaf apoplast in silicon-mediated manganese tolerance of
Cucumis sativus L. Plant, Cell and Environment 25: 549-555. Römheld V (2000) The chlorosis paradox: Fe inactivation as a secondary event in chlorotic
leaves of grapevine. Journal of Plant Nutrition 23: 1629-1643.
134
Rose TJ, Hardiputra B, Rengel Z (2010) Wheat, canola and grain legume access to soil phosphorus fractions differs in soils with contrasting phosphorus dynamics. Plant and Soil 326:159–170.
Rouached H, Arpat AB, Poirier Y (2010) Regulation of phosphate starvation responses in
plants: signaling players and cross-talks. Molecular Plant 3: 288–299. Rothbuhr L, Scott F (1955) A Study of the Uptake of Silicon and Phosphorus by Wheat Plants,
with radiochemical Methods. Biochemical Journal 65: 241-245. Roy AC (1969) Phosphorus silicon interaction in soil and plants, PhD thesis. University of
Hawaii. Roy AC, Ali MY, Fox RL, Silva JA (1971) Influence of Calcium Silicate on Phosphate
Solubility and Availability in Hawaiian Latosols. Proceedings of the International Symposium on Soil Fertility Evaluation 1: 757-765.
Runge-Metzger A (1995) Closing the cycle: obstacles to efficient P management for improved
global security. In H Tiessen, Ed, Phosphorus in the Global Environment: Transfers, Cycles and Management. John Wiley & Sons, New York, pp 27–42.
Ryan PR, Delhaize E, Randall PJ (1995)a. Characterisation of Al stimulated efflux of malate
from the apices of Al-tolerant wheat roots. Planta 196: 103–110. Ryan PR, Delhaize E, Randall PJ (1995)b. Malate efflux from root apices and tolerance to
aluminium are highly correlated in wheat. Australian Journal of Plant Physiology 22:531–536.
Ryan PR, Skerrett M, Findlay GP, Delhaize E, Tyerman D (1997) Aluminum
activates an anion channel in the apical cells of wheat roots. Proceedings of the National Academy of Sciences 12:6547-6552.
Ryan PR, Raman H, Gupta S, Horst WJ, Delhaize E (2009) A second mechanism for aluminum resistance in wheat relies on the constitutive efflux of citrate from roots. Plant Physiology 149:340–351.
Ryan PR, James RA, Weligama C, Delhaize E, Rattey A, Lewis DC, Bovill WD, McDonald G,
Rathjen TM, Wang E, Fettell NA, Richardson AE (2014) Can citrate efflux from roots improve phosphorus uptake by plants? Testing the hypothesis with near-isogenic lines of wheat. Physiologia Plantarum 151:230-242.
Sarmiento A, Del Valls A, Nieto J, Salamanca M, Caraballo M (2011) Toxicity and potential
risk assessment of a river polluted by acid mine drainage in the Iberian Pyrite Belt (SW Spain). Science of the Total Environment 409:4763-4771.
Sasaki T, Yamamoto Y, Ezaki B, Katsuhara M, Ahn SJ, Ryan PR, Delhaize E, Matsumoto H
(2004) A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal 37:645–653.
135
Sasaki T, Ryan PR, Delhaize E, Hebb DM, Ogihara Y, Kawaura K, Noda K, Kojima T, Toyoda A, Matsumoto H, Yamamoto Y (2006) Sequence upstream of the wheat (Triticum aestivum L.) ALMT1 gene and its relationship to aluminum resistance. Plant and Cell Physiology 47: 1343–1354.
Sauvé S, McBride MB, Norvell WA, Hendershot WH (1997) Copper solubility and speciation
of in situ contaminated soils: effects of copper level, pH and organic matter. Water, Air, and Soil Pollution 100:133–149.
Sauerbeck D (1982) Welche Schwermetallgehalte in Pflanzen duerfen nicht ueberschritten
werden,um Wachstumsbeein traechtigungen zu vemeiden?, Landw Forsch 39: 108–129. Schachtman DP, Reid RJ, Ayling SM (1998) Phosphorus uptake by plants: from soil to cell.
Plant Physiology 116: 447–453. Schünmann PHD, Richardson AE, Smith FW, Delhaize E (2004) Characterisation of promoter
expression patterns derived from the Pht1 phosphate transporter genes of barley (Hordeum vulgare L.). Journal of Experimental Botany 55: 855–865.
Schurr U, Schulze ED (1995) The concentration of xylem sap constituents in root exudate, and
in sap from intact, transpiring castor bean plants (Ricinus communis L.). Plant, Cell & Environment 18:409–420.
Shen J, Yuan L, Zhang J, Li H, Bai Z, Chen X, Zhang W, Zhang F (2011) Phosphorus
Dynamics: From Soil to Plant Update on Phosphorus Dynamics in the Soil-Plant Continuum. Plant Physiology 156:997–1005.
Shane MW, Lambers H (2005) Cluster roots: a curiosity in context. Plant and Soil 274: 101–
125. Shimogawara K, Usuda H (1995) Uptake of inorganic phosphate by suspension-cultured
tobacco cells: kinetics and regulation by Pi starvation. Plant and Cell Physiology 36: 341–351.
Službeni glasnik RS 2010. Uredba o programu sistemskog praćenja kvaliteta zemljišta,
indikatorima za ocenu rizika od degradacije zemljišta i metodologiji za izradu remedijacionih programa. br. 88.
Seo HM, Jung Y, Song S, Kim Y, Kwon T, Kim DH, Jeung SJ, Yi YB, Nam MH, Nam J (2008)
Increased expression of OsPT1, a high-affinity phosphate transporter, enhances phosphate acquisition in rice. Biotechnology Letters 30: 1833–1838.
Smith FW, Rae AL, Hawkesford MJ (2000) Molecular mechanisms of phosphate and sulfate
transport in plants. Biochimica et Biophysica Acta 1465: 236 – 245. Song AL, Li P, Li ZJ, Fan FL, Nikolic M, Liang YC (2011) The alleviation of zinc toxicity by
silicon is related to zinc transport and antioxidative reactions in rice. Plant and Soil 344: 319-333.
136
Song C, Han XZ, Tang C (2007) Changes in phosphorus fractions, sorption and release in udic mollisols under different ecosystems. Biology and Fertility of Soils 44:37–47.
Stass A,Inga Smit I, Eticha D, Oetter G, Horst WJ (2008) The significance of organic anion
exudation for the aluminum resistance of primary triticale derived from wheat and rye parents differing in aluminum resistance. Journal of Plant Nutrition and Soil Science 17: 634–642.
Stigliani W, Doelman M, Salomons P, Schulin W, Smidt, R, van der Zee, GRB (1991) Chemical time bombs: predicting the unpredictable. Environment 33 : 430.
Stjernman Forsberg L, Ledin S (2006) Effects of sewage sludge on pH and plant availability of
metals in oxidising sulphide mine tailings. Science of the Total Environment 358:21-35. Ström L, Godbold DL, Owen AG, Jones DL (2002) Organic acid mediated P mobilization in the
rhizosphere and uptake by maize roots. Soil Biology and Biochemistry 34: 703–710. Ström L, Andrew GA, Owen DL, Godbold DL, Jones DL (2005) Organic acid behaviour in a
calcareous soil implications for rhizosphere nutrient cycling. Soil Biology and Biochemistry 37: 2046–2054.
Suriyagoda LDB, Ryan MH, Renton M, Lambers H (2010) Multiple adaptive responses of
Australian native perennial legumes with pasture potential to grow in phosphorus- and moisture-limited environments. Annals of Botany 105:755–767.
Sweetlove LJ, Fait A, Nunes-Nesi A, Williams T, Fernie AR (2007) The mitochondria: an
integration point of cellular metabolism and signaling. Critical Reviews in Plant Sciences 26:17–43.
Takahashi E, Ma JF, Miyake Y (1990) The possibility of silicon as an essential element for
higher plants. Comments on Agricultural and Food Chemistry 2: 99-122. Tamai K, Ma JF (2003) Characterization of silicon uptake by rice roots. New Phytologist 158:
431-436. Tanaka A,Tadano T, Yamamoto Y, Kanamura KN (1978) Comparison of toxicity to plants
among Al3, AlSO4 , and Al-F complex ions. Soil Science and Plant Nutrition 33:43–55. Tang C, Unkovich MJ, Bowden JW (1999) Factors affecting soil acidification under legume.
III. Effects of nitrate supply. New Phytologist 143: 513–521. Teng W, Deng Y, Chen XP, Xu XF, Chen RY, Lv Y, Zhao YY, Zhao XQ, He X, Li B, Tong
YP , Zhang FS, Li ZS (2013) Characterization of root response to phosphorus supply from morphology to gene analysis in field-grown wheat. Journal of Experimental Botany 64: 1403–1411.
Terman GL, Bouldin DR, Lehr JR (1958) Calcium phosphate fertilizers: I. Availability to plants
and solubility in soils varying in pH. Soil Science Society of America, Proceedings. 22:25–29.
137
Theodoru ME, Plaxton WC (1993) Metabolic adaptations of plant respiration to nutritional phosphate deprivation. Plant Physiology 101: 339–344.
Tiessen H, Moir JO (1993) Characterization of available P by sequential extraction. In: Carter
MR (ed) Soil sampling and methods of analysis. Canadian Society of Soil Science, Lewis Publishers, Boca Raton, pp. 75–86.
Tittarelli A, Milla L, Vargas F, Morales A, Neupert C, Meisel LA, Salvo GH, Peñaloza E,
Muñoz G, Corcuera LJ, Silva H (2007) Isolation and comparative analysis of the wheat TaPT2 promoter: identification in silico of new putative regulatory motifs conserved between monocots and dicots. Journal of Experimental Botany 58: 2573–2582.
Toyota K, Koizumi N, Sato F (2003) Transcriptional activation of phosphoenolpyruvate
carboxylase by phosphorus deficiency in tobacco. Journal of Experimental Botany 54: 961–969.
Turner BL, Leytem AB (2004) Phosphorus compounds in sequential extracts of animal
manures: chemical speciation and a novel fractionation procedure. Environmental Science and Technology 38: 6101–6108.
UNEP (2007) Global environmenal outlook. GEO 4 United Nations Environment Programme.
Progress Press Ltd. Valletta, Malta. UN (2013) World population prospects: The 2012 revision, highlights and advance tables.
Working Paper No. ESA/P/WP.228, United Nations, Department of Economic and Social Affairs, Population Division, New York.
UNEP, UNCHS (1999) The Kosovo Conflict – Consequences for the environment and human
settlements. Report of the UNEP/UNCHS Balkans Task Force. United Nations Environment Programme/UNCHS, Nairobi; dostupno online: [http://www.grid.unep.ch/btf].
Uhde-Stone C, Gibert G, Johnson JMF, Litjens R, Zinn KE, Temple SJ, Vance CP, Allan D L
(2003) Acclimation of white lupin to phosphorus deficiency involves enhanced expression of genes related to organic acid metabolism. Plant and Soil 248: 99–116.
Uhde-Stone C, Liu J, Zinn KE, Allan DL, i Vance CP (2005) Transgenic proteoid roots of white
lupin: a vehicle for characterizing and silencing root genes involved in adaptation to P stress. The Plant Journal 44: 840–853.
Valente TM, Gomes LC (2009) Occurrence, properties and pollution potential of environmental
minerals in acid mine drainage. Science of the Total Envirronment 407: 1135 – 1152. Vance CP, Uhde-Stone C, Allan D (2003) Phosphorus acquisition and use: critical adaptations
by plants for securing a nonrenewable resource. New Phytologist 157: 423–447. van der Merwe MJ et al. (2009) Decreased mitochondrial activities of malate dehydrogenase
and fumarase in tomato lead to vealtered root growth and architecture via diverse mechanisms. Plant Physiol. 149: 653–669.
138
Veneklaas EJ, Stevens T, Cawthray GR, Turner NC, Grigg AM, Lambers (2003). Chickpea and white lupin rhizosphere carboxylates vary with soil properties and enhance phosphorus uptake. Plant and Soil 248: 187–197.
von Uexküll HR, Mutert E (1995) Global extent, development and economic impact of acid soils. Plant and Soil 171: 11–15.
Vu DT, Tang C, Armstrong RD (2008) Changes and availability of P fractions following 65
years of P application to a calcareous soil in a Mediterranean climate. Plant and Soil 304:21–33.
Waldrip HM, He Z, Erich SM (2011) Effects of poultry manure amendment on phosphorus
uptakeby ryegrass, soil phosphorus fractions and phosphatases activity. Biology and Fertility of Soils 47:407–418.
Walker LR (ed) (1999) Ecosystems of disturbed ground. Ecosystems of the world 16. Elsevier,
Amsterdam. Walker T, Syers J (1976) The fate of phosphorus during pedogenesis. Geoderma 15: 1–19. Wang E, Ridoutt BG, Luo Z, Probert ME (2013) Using systems modelling to explore the
potential for root exudates to increase phosphorus use efficiency in cereal crops. Environmental Modelling & Software 46:50-60.
Wang SY, Galletta GJ (1998) Foliar application of potassium silicate induces metabolic
changes in strawberry plants. Plant Nutrition 21:157-67. Wang Y, Stass A, Horst WJ (2004) Apoplastic binding of aluminum is involved in silicon-
induced amelioration of aluminum toxicity in maize. Plant Physiology 136: 3762–3770. Wang X, Lester DW, Guppy CN, Lockwood PV, Tang C (2007) Changes in phosphorus
fractions at various soil depths following long-term P fertiliser application on a Black Vertosol from southeastern Queensland. Australian Journal of Soil Research 45: 524–532.
Wang X, Tang C, Guppy CN, Sale PWG (2008) Phosphorus cquisition characteristics of cotton
(Gossypium hirsutum L.), wheat (Triticum aestivum L.) and white lupin (Lupinus albus L.) under P deficient conditions. Plant and Soil 312: 117– 128.
Wang X, Tang C, Guppy CN, Sale PWG (2010) Cotton, wheat and white lupin differ in
phosphorus acquisition from sparingly soluble P sources. Environmental and Experimental Botany 69:267–272.
Welp G, Hermes V, Brümmer G (1983) Einfluß von Bodenreaktion, Redoxbedingungen und
organischer Substanz auf die Phosphatgehalte der Bodenlösung. Z. Pflanzenernähr. Bodenk 146:38–52.
West TO, McBride AC (2005) The contribution of agricultural lime to carbon dioxide emissions
in the United States: dissolution, transport, and net emissions. Agriculture, Ecosystems and Environment 108-145–154.
139
White PJ , Broadley MR (2003) Calcium in plants. Annals of Botany 92: 487-511. White RT (1999). Principles and Practice of soil science. University of Melbourne. WHO (2013) Nutrition: micronutrient deficiencies. World Health Organization, Geneva.
Dostupno online www.who.int/nutrition/topics/ ida/en/. Weisskopf L, Tomasi N, Santelia D, Martinoia E, Langlade NB, Tabacchi R, Abou-Mansour E
(2006) Isoflavonoid exudation from white lupin roots is influenced by phosphate supply, root type and cluster-root stage. New Phytologist 171:657-668.
Wilhelm NS, Graham RD, Rovira AD (1990) Control of Mn status and infection rate by
genotypes of both host and pathogen in the wheat take-all interaction. Plant and Soil 123:267–275.
Wolt JD (1981) Sulfate retention by acid sulfate-polluted soils in the copper basin area of
Tennessee. Soil Science Society of America Journal 45:283–287. Wolkersdorfer C, Bowell R (2004) Contemporary reviews of mine water studies in Europe: part
1. Mine Water and the Environment 23:162-182. Wolkersdorfer C, Bowel R (2005) Contemporary reviews of mine water studies in Europe: part
2. Mine Water and the Environment 24:2-37. World resources 1992-93. A report by the World Soil Resources Institute in collaboration with
the United Nations Environmental Programme and the United Nations Development Programme, New York. Oxford University Press. 385 pp.
Wu P, Ma L, Hou X, Wang M, Wu Y, Liu F, Deng XW (2003). Phosphate starvation triggers
distinct alterations of genome expression in Arabidopsis roots and leaves. Plant Physiology 132:1260–1271.
WWF (2012) Living planet report 2012. Biodiversity, biocapacity and better choices. Geneva:
World Wildlife Fund World Soil Resources. Xiao K, Harrison MJ, Wang ZY (2005) Transgenic expression of a novel M.truncatula phytase
gene results in improved acquisition of organic phosphorus by Arabidopsis. Planta 222: 27–36.
Yokosho K, Yamaji N, Ma, JF (2011). An Al-inducible MATE gene is involved in external
detoxification of Al in rice. The Plant Journal 68: 1061–1069. Yokosho K, Yamaji N, and Ma JF (2010). Isolation and characterisation of two MATE genes in
rye. Functional Plant Biology 37: 296–303. Yang X, Post WM (2011) Phosphorus transformations as a function of pedogenesis:A synthesis
of soil phosphorus data using Hedley fractionation method. Biogeosciences 8: 2907–2916.
140
Yang Y, Li Y, Shi H, Ke Y, Yuan Y, Tang Z (2008) Alleviation of Low-P Stressed Maize (Zea may L.) seedling under Hydroponic culture condition. World journal of agricultural science 2: 168-172.
Ye J, Yan CL, Liu JC, Lu HL, Liu T, Song ZF (2012) Effects of silicon on the distribution of
cadmium compartmentation in root tips of Kandelia obovata (S., L.) Yong. Environmental Pollution 162: 369-373.
Yu S, He Z, Stoffella P, Calvert D, Yang X, Banks D, Baligar V (2006) Surface runoff
phosphorus (P) loss in relation to phosphatases activity and soil P fractions in Florida sandy soils under citrus production. Soil Biology and Biochemistry 38: 619–628.
Zhang F, Shen J, Zhang J, Zuo Y, Li L, Chen X (2010) Rhizosphere processes and management
for improving nutrient use efficiency and crop productivity: implications for China. Advances in Agronomy 107: 1.
Zhang WH, Ryan PR, Tyerman SD (2004) Citrate-permeable channels in the plasma membrane
of cluster roots from white lupin. Plant Physiology 136:3771–3783. Zhang, H, Huang Y, Ye X, Shi L, Xu F (2009) Genotypic differences in phosphorus acquisition
and the rhizosphere properties of Brassica napus in response to low phosphorus stress. Plant and Soil 320:91–102.
Zheng SJ, Ma JF, Maatsumoto H (1998) High aluminum resistance in buckwheat. I. Al-induced specific secretion of oxalic acid from root tips. Plant Physiology 117: 745–751.
.
141
BIOGRAFIJA
Ljiljana Kostić Kravljanac rođena je 19.10. 1978. u Beogradu. Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu (Еkologija i zaštita životne sredine), završila je 2005. godine sa prosečnom ocenom 9.31 i diplomskim radom “Zemljište kao stanište“, koji je ocenjen sa najvišom ocenom (10). Doktorske akademske studije na Univerzitetu u Beogradu, na smeru Upravljanje životnom sredinom upisla је 2005. godine. Od 2006. do 2011. godine bila je zaposlena u Institutu za zemljište u Topčideru (Beograd), najpre kao istraživač-pripravnik, a od 2009. godine kao istraživač saradnik, gde bila angažovana na projektima tehnološkog razvoja iz oblasti biotehnike. U toku 2009. godine pohađala je međunarodni seminar “Low Carbon Green Growth“ u okviru “Europe-Korea Next-Generation Leaders Program”. Od marta 2011. prelaskom u Institut za multidisciplinarna istraživanja započinje izradu doktorske disertacije u okviru projekta osnovnih istraživanja 173028 “Mineralni stres i adaptacije biljaka na marginalnim poljoprivrednim zemljištima”, u okviru kojeg je kao prvi autor publikovala jedan rad u vodećem međunarodnom časopisu Biology and Ferility of Soils, a kao koautor dva rada takođe u vodećim međunarodnim časopisima Plant and Soil i PLOS ONE.
142
Izjava o autorstvu
Potpisani-a Ljiljana M. Kostić Kravljanac
broj indeksa 6/05
Izjavljujem
da je doktorska disertacija pod naslovom
„MODULIRANJE RIZOSFERNIH PROCESA I PRILAGOĐAVANJE PŠENICE RAZLIČITIM MERAMA POPRAVKE ZEMLJIŠTA OŠTEĆENIH RUDNIČKOM JALOVINOM“
• rezultat sopstvenog istraživačkog rada,
• da predložena disertacija u celini ni u delovima nije bila predložena za dobijanje bilo koje diplome prema studijskim programima drugih visokoškolskih ustanova,
• da su rezultati korektno navedeni i
• da nisam kršio/la autorska prava i koristio intelektualnu svojinu drugih lica.
Potpis doktoranda
U Beogradu_________________
_________________________
143
Izjava o istovetnosti štampane i elektronske verzije doktorskog rada
Ime i prezime autora Ljiljana M. Kostić Kravljanac
Broj indeksa 6/05
Studijski program Upravljanje životnom sredinom
Naslov rada „MODULIRANJE RIZOSFERNIH PROCESA I PRILAGOĐAVANJE PŠENICE RAZLIČITIM MERAMA POPRAVKE ZEMLJIŠTA OŠTEĆENIH RUDNIČKOM JALOVINOM“
Mentor: dr Miroslav Nikolić, naučni savetik, Institut za multidisciplinarna istraživanja, Univerzitet u Beogradu
Potpisani/a Ljiljana M. Kostić Kravljanac
Izjavljujem da je štampana verzija mog doktorskog rada istovetna elektronskoj verziji koju sam predao/la za objavljivanje na portalu Digitalnog repozitorijuma Univerziteta u Beogradu.
Dozvoljavam da se objave moji lični podaci vezani za dobijanje akademskog zvanja doktora nauka, kao što su ime i prezime, godina i mesto rođenja i datum odbrane rada.
Ovi lični podaci mogu se objaviti na mrežnim stranicama digitalne biblioteke, u elektronskom katalogu i u publikacijama Univerziteta u Beogradu.
Potpis doktoranda
U Beogradu, ________________________
_____________________
144
Izjava o korišćenju
Ovlašćujem Univerzitetsku biblioteku „Svetozar Marković“ da u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu unese moju doktorsku disertaciju pod naslovom:
„MODULIRANJE RIZOSFERNIH PROCESA I PRILAGOĐAVANJE PŠENICE RAZLIČITIM MERAMA POPRAVKE ZEMLJIŠTA OŠTEĆENIH RUDNIČKOM JALOVINOM“
koja je moje autorsko delo.
Disertaciju sa svim prilozima predao/la sam u elektronskom formatu pogodnom za trajno arhiviranje.
Moju doktorsku disertaciju pohranjenu u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu mogu da koriste svi koji poštuju odredbe sadržane u odabranom tipu licence Kreativne zajednice (Creative Commons) za koju sam se odlučio/la.
1. Autorstvo
2. Autorstvo - nekomercijalno
3. Autorstvo – nekomercijalno – bez prerade
4. Autorstvo – nekomercijalno – deliti pod istim uslovima
5. Autorstvo – bez prerade
6. Autorstvo – deliti pod istim uslovima
(Molimo da zaokružite samo jednu od šest ponuđenih licenci, kratak opis licenci dat je na poleđini lista).
Potpis doktoranda
U Beogradu, ________________________
_____________________
145
1. Autorstvo - Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence, čak i u komercijalne svrhe. Ovo je najslobodnija od svih licenci.
2. Autorstvo – nekomercijalno. Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence. Ova licenca ne dozvoljava komercijalnu upotrebu dela.
3. Autorstvo - nekomercijalno – bez prerade. Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, bez promena, preoblikovanja ili upotrebe dela u svom delu, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence. Ova licenca ne dozvoljava komercijalnu upotrebu dela. U odnosu na sve ostale licence, ovom licencom se ograničava najveći obim prava korišćenja dela.
4. Autorstvo - nekomercijalno – deliti pod istim uslovima. Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence i ako se prerada distribuira pod istom ili sličnom licencom. Ova licenca ne dozvoljava komercijalnu upotrebu dela i prerada.
5. Autorstvo – bez prerade. Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, bez promena, preoblikovanja ili upotrebe dela u svom delu, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence. Ova licenca dozvoljava komercijalnu upotrebu dela.
6. Autorstvo - deliti pod istim uslovima. Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence i ako se prerada distribuira pod istom ili sličnom licencom. Ova licenca dozvoljava komercijalnu upotrebu dela i prerada. Slična je softverskim licencama, odnosno licencama otvorenog koda.
