Modulo 4

Una proteina in azione

Mioglobina ed emoglobina: un esempio di

funzionamento di una proteina

La funzione della maggior parte della proteine globulari è mediata dall’interazione

reversibile con altre molecole dette ligandi: piccole molecole ma anche altre

macromolecole.

Il sito in cui avviene il contatto con il ligando: sito di legame: è complementare al

ligando stesso per dimensione, forma, carica, e carattere idrofilico o idrofobico.

Rende il legame specifico.

L’ossigeno (O2) ha una bassa solubilità in acqua (sangue = 3ml/L). E’ necessaria

una via per legare l’ossigeno e trasportarlo in sufficiente quantità ai tessuti.

Proteine come la mioglobina e l’emoglobina si sono evolute a questo

fondamentale scopo.

La mioglobina (Mb) e l’emoglobina

(Hb): proteine cruciali nella

conversione dalla vita anaerobica a

quella aerobica.

La mioglobina è la proteina che lega

l’ossigeno nei muscoli.

Presente nei muscoli dei vertebrati, abbondante nei mammiferi marini (foche, balene) che

consente loro di immagazzinare ossigeno da usare durante le immersioni.

Proteina globulare, compatta, singola catena,153 amminoacidi Mw 16,700.

Mb composta in gran parte da α-elica (8 eliche) indicate con le lettere A-

H e da regioni non elicoidali.

2 forme: deossimioglobina e ossimioglobina: questa lega O2

Legame all’O2: presenza di un gruppo

prostetico detto eme covalentemente

legato alla proteina racchiuso in una

profonda infossatura tra le eliche con

accessibilità limitata al solvente.

Il legame all’O2 avviene tramite l’eme

Eme: 1. parte organica, porfirine: composti macrociclici con 4 anelli

pirrolici uniti da ponti CH. Hb e Mb hanno la protoporfirina IX.

(protoporfirina IX + Fe = Eme)

2. atomo di Fe2+: legato al centro della porfirina 0,4 Å sopra il piano

porfirinico.

Legami del Fe: 4 legami di coordinazione con 4 N pirrolici, il quinto

legame si forma col l’istidina F8 (istidina prossimale) della Mb. Il

sesto è libero o occupato dall’ossigeno. L’ossigeno si lega all’eme

solo

Legame dell’O2 a Mb avviene su Fe 2+ :

provoca un cambiamento

conformazionale dell’eme e della

proteina: Il Fe si sposta verso il piano

dell’eme.

La struttura che si forma è descritta dalla combinazione di

due strutture di risonanza:

Ragione funzionale della parte globinica

Funzione della parte proteica: Mb stabilizza il complesso con

l’ossigeno in modo da rilasciare O2 ed evitando l’ossidazione

del Fe.

.His E7 (istidina distale) forma un legame H con la forma di

superossido dell’ossigeno. Svolge un ruolo protettivo

fondamentale dall’ossidazione.

La CO si lega al ferro eminico in

competizione con l’O2. Quando l’eme è

contenuto nella mioglobina, l’affinità per

CO diminuisce di 100 volte

Il legame del CO non è ottimale per l’ingombro sterico

dovuto alla HisE7, , il legame dell’O2 che forma un angolo

di 120° con il piano dell’eme, non viene influenzato

sfavorevolmente all’interno della proteina.

l’Ossigeno rilasciato deve essere allo stato O2 e non come anione superossido (tossico), Fe deve rimanere allo stato ferroso (Fe2+) Mb che contiene Fe3+ (metamioglobina) non è più in grado di legare l’ ossigeno.

Curva di saturazione (legame, ossigenazione)

dell’ossigeno alla mioglobina

Il legame reversibile dell’O2 alla mioglobina, può essere descritto dall’equilibrio:

[ ] Y

[ ] [ ] Mb MbO

MbO

2

2

+ =

[ ] [ ] [ ] MbO

O Mb Kd

2

2 = O2 Mb MbO 2 + La Kd di equilibrio (dissociazione) della ossi Mb:

Y = Siti di legame occupati

Totale dei siti di legame

[O2] trattandosi di gas può

essere espresso come pO2

(pressione parziale dell’O) si

ottiene:

Kd pO

pO

2

2

+ = Y Equazione iperbole rettangolare

[ ] [ ] Kd O

O

2

2

+ = Y

Ricavando [MbO2] dall’equazione 1 si ottiene:

(1)

Con 0<Y<1 Definiamo come Y (saturazione frazionale) il rapporto:

P50 = valore di pO2 al quale Y= 0,5 (50% di saturazione).

Curva di legame dell’O2 alla

mioglobina

1 Torr = 1 mmHg

Interazioni molto forti coinvolgono i dimeri α1β1, α2β2. altre interazioni interessano

i contatti α1β2 e α2β1. Non ci sono interazioni che coinvolgano le catene dello

stesso tipo. I gruppi eme sono distanziati di 30-40 A°

Struttura 2 2

Le subunità dell’emoglobina sono

strutturalmente simili alla mioglobina Quasi tutto l’ossigeno presente nei vertebrati è legato e trasportato

dall’emoglobina Hb negli eritrociti (gl rossi) costituisce > 30% del peso.

Hb: Mw 64500

4 catene a due a due

uguali: 2 α e 2 β: coppia di

dimeri identici (α1β1,

α2β2) giustapposti.

Catene α β sono simili tra

loro. Con struttura

tridimensionale simile

Presenza di 4 eme.

Il ripiegamento globinico è conservato

Allineamento tra le catene α e

β della Hb con sequenza della

Mb: 25% di identità

La struttura tridimensionale è

simile: prende il nome di

ripiegamento globinico (figura

in basso)

Le 2 catene α e 2 catene β

sono correlate evolutivamente

tra loro.

I residui cruciali sono tutti

conservati.

L’emoglobina è una molecola

molto più complessa e

sensibile della mioglobina

La curva di legame dell’ Hb è differente da

quella della Mb

La curva di legame dell’ Hb ha una

forma sigmoide, quella della Mb è una

iperbole.

P50 = valore di pO2 alla quale Y= 0,5

(50% di saturazione).

P50 di Mb è sempre << della P50 di HB

HB lega l’O2 con minor affinità rispetto

allaMb.

Curva sigmoide: a basse pO2 bassa

affinità, ad elevate pO2 affinità aumenta.

suggerisce che le reazioni dei legame ai

4 siti di legame non sono tra loro

indipendenti: effetto cooperativo.

L’emoglobina (Hb) è una molecola molto più complessa e sensibile a fattori esterni

della mioglobina

Significato fisiologico della cooperatività

La cooperatività tra i siti di legame rende più efficiente il trasporto dell’ossigeno

Livelli di saturazione: Hb:

Polmoni 98%

Tessuti 32%

% siti di legame che

contribuiscono al trasporto

dell’O2: 98-32=66%

Hb senza cooperatività:

63-25= 38%

Mb: 98-91= 7%

Conformazione tesa (tense, T)

favorita nella deossiemoglobina

Conformazione rilassata (relaxed,

R) favorita nella ossiemoglobina

(forma totalmente ossigenata)

Cambiamenti strutturali dell’Hb in seguito

alla ossigenazione

L’analisi strutturale evidenzia: due conformazioni alternative: stato R e stato T. In

equilibrio tra loro.

O2 si lega ad entrambe ma con > affinità per R e stabilizza lo stato R. La transizione

tra la forma T a R dipende dalle interazioni α1β2 e α2β1 tra le diverse subunità.

Effetto del legame dell’O2 all’eme

di una subunità

Il riarrangiamento dell’interfaccia tra

dimeri è un sistema in grado di far

comunicare le diverse subunità rendendo

cooperativo il legame dell’ossigeno.

Il movimento del Fe2+ in seguito al legame

di un 02 porta l’His F8 verso il piano

porfirinico.

HisF8 parte dell’elica F si muove di

conseguenza. Il C-terminale dell’elica giace

all’interfaccia di un dimero αβ.

La transizione strutturale iniziata sullo ione

ferroso si propaga alle altre subunità.

Blue: deossiHb, rosso ossiHb.

Variazioni conformazionali del legame dell’ossigeno

ad’una subunità di emoglobina

Affinità (P50) di differenti Hb per l’ossigeno

P50 misura convenzionale dell’affinità dell’Hb per

l’ossigeno

P50 = pO2 tale che Y=1/2 (50% saturazione)

YO2

PO2 (mmHg)

Curva di dissociazione dell’Hb che

mostra l’affinità relativa per O2 in

differenti specie di vertebrati ed

invertebrati.

Le differenti P50 dipendono da

variazioni della struttura.

(1kPa = 7,5 mmHg)

Capacità di trasporto dell’ossigeno

1kPa = 7,5 mmHg

Gruppo animale Pigmento resp. mL O2 100 ml-1

Acqua 0.6

Molluschi Hc 1-4

Crostacei Hb, Hc 1-4

Teleostei Hb 4-20

Uccelli Hb 10-22

Mammiferi Hb 14-32

Il contenuto di ossigeno nel sangue

(quantità di pigmento) in funzione della

pressione parziale di O2 rivela differenze

sia nella forma della curva (affinità) sia

nella capacità complessiva di trasporto

dell’ossigeno tra gli animali

Capacità massima di

trasporto dell’ossigeno nel

sangue (100 ml) di diversi

animali

L’affinità per l’ossigeno viene modulata da

regolatori: il 2,3 BPG

Il 2,3 bisfosfoglicerato (2,3BPG), contenuto nei globuli rossi ad

una concentrazione pari alla Hb (2 mM) stabilizza la forma T

dell’emoglobina: determina > rilascio di O2 a livello tissutale.

Si lega al centro del tetramero tra due subunità β in una tasca

presente solo nella forma T presso un sito distinto da quello

dell’O2. È un regolatore allosterico dell’ emoglobina.

Regolazione allosterica

Regolatore allosterico (effettore allosterico): molecola che si lega alla proteina

(ligando) in un sito diverso dal sito attivo: sito allosterici

Il regolatore allosterico può essere un attivatore o un inibitore

Gli ioni idrogeno e la CO2 promuovono il

rilascio di O2

H+ e CO2 sono effettori allosterici che regolano affinità per O2 si legano

all’emoglobina presso siti distinti da quello dell’O2.

I tessuti a rapido metabolismo

producono H+ e CO2. L’affinità di

Hb per O2 diminuisce al

diminuire del pH determinando

nei tessuti un maggior rilascio di

ossigeno (77%).

Significato biologico: L’Hb rilascia

maggiori quantità di ossigeno

dove c’e’ ne più bisogno (Effetto

Bohr).

Meccanismo molecolare dell’effetto Bohr

A livello molecolare i responsabili

dell’effetto Bohr sono principalmente:

alcuni grippi amminici terminali delle

catene α, alcuni residui di istidina con

valori di pKa ~ 7 il cui livello di

dissociazione dipende dal pH.

Caso in figura: nella deossiemoglobina

His146 forma due legami ionici, di cui

quello con Asp 94 avviene solo se His è

protonato. Queste interazioni ioniche

stabilizzano lo stato T.

A pH maggiori His 146 si deprotona ed

il legame non si forma favorendo la

forma R.

Coinvolgimento della His146 nell’effetto

Bohr

L’emoglobina ha un ruolo nel

trasporto della CO2

La CO2 prodotta nei tessuti viene trasportata:

1) Come ione HCO3- disciolto. Provoca una diminuzione

del pH (effetto Bohr).

2. Una parte è legata

covalentemente all’emoglobina

(circa 15%). La CO2 reagisce

con le catene amminoterminali:

forma residui di carbammato.

pH 7,4 no CO2

pH 7,2 no CO2

pH 7,2 CO2 40 Torr

L’anidrasi carbonica del

globulo rosso accelera il

processo di conversione

della CO2 a H2CO3 e

quindi HCO3 + H+

Emocianine, proteine respiratorie di molluschi e artropodi.

Due atomi di rame (Cu+) sono legate come gruppo prostetico a tre residui di istidina.

L’ossigeno si lega come (O22- ) a due differenti atomi di rame.

Forma deossigenata(incolore ) Forma ossigenata (blu)

Cu(I) Cu(I)

CuII CuII

O

|

O

CuI CuI

O2

Emocianine trasportano ossigeno nel sangue (non nelle cellule) di molti

molluschi e diversi artropodi.

Emocianine dei molluschi

• Subunità da 300-450 con:

Domini funzionali (FU) da 50

kDa polipeptidi da 7 o 8

subunità unite a formare

decameri .

• Ogni polipeptide lega 7-8

molecole di 02

La struttura delle emocianine dei molluschi è quella di un ciclindro costruito da

decameri di subunità da 300-450 kDa.

Le emocianine presentano effetto cooperativo ma meno efficiente che in Hb

L’affinità per O2 è regolata da pH (effetto Bohr),

Concetti principali

Le proteine sono strutture dinamiche soggette a cambiamenti

conformazionali piu o meno accentuati.

La variazioni di pochi residui può avere effetti importanti sulla

funzionalità o sulla modulazione dell’attività della proteina.

Il legame di molecole regolatrici (effettori allosterici) ha un

profondo effetto sull’attività della proteina.

Funzioni simili nei diversi organismi possono essere compiute da

proteine diverse, non evolutivamente correlate (evoluzione

convergente) che possiedono proprietà simili.