Curso de Biología Tisular 2008

Discusiones Grupales y Protocolo del Práctico del

Modulo de Hematología

Depto. de Bioquímica Depto de Inmunobiología

Discusión grupal sobre ERITROCITO

1.- Se efectuó la purificación de la hemoglobina proveniente de dos muestras de sangre diferentes, una de un hombre adulto normal (muestra A) y la otra de un feto en el 7° mes del embarazo (muestra B). Ambas muestras de hemoglobina se obtuvieron con muy alto grado de pureza, eliminándose todos los posibles componentes orgánicos contaminantes. Grafique el tipo de curva de saturación por el oxígeno de cada una de estas muestras de hemoglobina indicando, si corresponde, cuál estará más desplazada hacia la izquierda. ¿Los resultados son similares con respecto a los que se pueden observar con una muestra recién obtenida a partir de glóbulos rojos normales? ¿Por qué? ¿Alguna de las muestras analizadas presenta similitudes con respecto a los resultados que se pueden observar con una muestra de mioglobina?

2.- La anemia falciforme es una enfermedad de origen molecular, determinada por la síntesis de una hemoglobina anormal, la HbS. La única diferencia bioquímica con respecto a la HbA radica en que la HbS presenta valina en la posición 6 de la cadena β, en lugar de ácido glutámico. La confirmación del diagnóstico de esta enfermedad sólo puede realizarse mediante estudios a nivel molecular. Analice los resultados obtenidos con dos procedimientos diferentes: A) Electroforesis de hemoglobinas. Estudio efectuado en acetato de celulosa.

HbA

HbF HbS

HbA2

1 2 3 4 5

+

-

El carril 1 corresponde a una muestra de sangre proveniente de un recién nacido normal, el 2 a una muestra obtenida de un hombre adulto normal, y las muestras analizadas en los carriles 3, 4 y 5 corresponden a diferentes pacientes, afectados por anemias causadas por alteraciones de la hemoglobina. ¿Es posible afirmar que alguno de los pacientes estudiados presenta una anemia falciforme? En caso de haber más de uno, ¿las afecciones son de la misma severidad? ¿Cómo se explica la diferente migración electroforética entre la HbA y la HbS? ¿Qué utilidad podría tener para este diagnóstico un procedimiento analítico basado en las diferencias en el peso molecular de las proteínas? Si un paciente con anemia falciforme recibió una transfusión de sangre hace dos semanas, ¿pueden haber cambios en el perfil electroforético? ¿Por qué? ¿Por qué desarrollan anemia los pacientes con HbS? ¿Cuál podría ser la base molecular de la anemia del paciente estudiado en el carril 5? B) Estudio utilizando PCR (reacción en cadena de la polimerasa), para la amplificación de un sector específico de ADN, seguido de tratamiento con la enzima de restricción MstII y electroforesis en gel de agarosa. 1 2 3 4 5

MstII Pro Glu Glu

Pro Val Glu

CCT

GAG GAG

CCT

GTG GAG

5 6 7

1,35 Kb

1,15 Kb 0,2 Kb

β

βS

A

En el carril 1 se colocaron muestras de ADN control. En los carriles 2, 3. 4, y 5 se observan los resultados obtenidos a partir del ADN de cuatro individuos. De acuerdo con la información aportada en el esquema, correspondiente a un sector de la secuencia del gen que codifica a la cadena β de la globina y al sitio donde corta la enzima MstII, ¿cuál o cuáles de las personas estudiadas poseen el gen que codifica para la HbS? ¿Se puede determinar si la o las personas afectadas son homocigotas u heterocigotas para el gen que determina la formación de la HbS? ¿El estudio realizado aporta alguna información adicional en relación al de electroforesis de hemoglobinas previamente analizado? Los dos procedimientos de electroforesis acá analizados poseen diferentes cualidades y posibilidades metodológicas ¿Cuáles son las principales diferencias entre ellos? 3.- La deficiencia de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa eritrocitaria ("favismo") es una de las enzimopatías más frecuentes que afecta, aproximadamente, a 400 millones de personas a nivel mundial. El gen que codifica dicha enzima se localiza en el brazo largo del cromosoma X. Se han identificado más de 400 mutaciones diferentes, responsables de una deficiente actividad en dicha enzima. Las manifestaciones clínicas más frecuentes son la ictericia neonatal y crisis hemolíticas agudas en respuesta a diferentes sustancias oxidantes, infecciones e ingesta de habas. La gran mayoría de los episodios hemolíticos son intravasculares, asociados con hemoglobinuria. ¿Podrá existir alguna diferencia entre hombres y mujeres con respecto a la frecuencia de la enfermedad? Para la identificación de los individuos que presentan una mutación en el gen de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, ¿sería de utilidad un procedimiento de diagnóstico basado en PCR, seguido por corte con una enzima de restricción, como el utilizado para la HbS? ¿Por qué un agente oxidante podrá desencadenar una crisis hemolítica en estas personas? ¿Es posible que una actividad disminuida de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa modifique la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno? Fundamente la respuesta. ¿Puede haber alguna diferencia entre la hemólisis intravascular y la extravascular para la reutilización de los componentes de la hemoglobina? ¿Por qué? La malaria es una enfermedad parasitaria causada por el Plasmodium falciparum, cuyas principales manifestaciones son anemia y fiebre. El parásito prolifera dentro de los glóbulos rojos, evadiendo diferentes mecanismos de defensa del organismo. Existe una alta correlación entre la distribución geográfica de esta enfermedad, la anemia falciforme y la deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (en el esquema adjunto en color claro se muestran las áreas afectadas). ¿Esto es sólo coincidencia o puede haber alguna relación entre estas enfermedades?

Malaria hace 100 años HbS

Análisis de los contenidos del artículo: Higher blood flow and circulating NO products offset high-altitude hypoxia among Tibetans, S. C. Erzurum et al Proc. Natl. Acad. Sci. (2007), 104: 17593-17598.

a) ¿Cuál es el objetivo de este artículo? b) ¿Cuáles son las características principales de la población de este estudio? c) ¿Por qué el porcentaje de saturación de la Hb en la población del Tibet es menor

que la población de EEUU? ¿Qué significado tienen los “P value” de la tabla 1? d) ¿Cómo serían los valores de 2,3-DPG y eritropoyetina en estas dos poblaciones

analizadas? ¿Cómo serían las curvas de asociación de oxígeno a la Hb en ambos grupos? Planifique como haría el experimento y que resultados espera encontrar.

e) ¿Cómo se relaciona el flujo sanguíneo y la resistencia vascular en ambos grupos de estudio? ¿Qué sucede con la entrega tisular de oxígeno en ambos grupos? ¿Cómo explica la diferencia entre “Arterial O2 content” (Table 1) y “Oxygen delivery” (Table 2)?

f) ¿Qué sucede frente a las pruebas de ejercicio físico? g) ¿Qué importancia tiene los niveles de nitrito y nitrato en el plasma de estos grupos

analizados? ¿En qué otras situaciones puede aumentar los niveles de nitrito y nitrato en plasma? ¿Cuál es su relación con el óxido nítrico (NO)?¿Es lo mismo SON-Hb y HbFeIINO?

h) Si Ud fuera entrenador de la selección uruguaya de fútbol y tiene que enfrentar a la selección de Bolivia en la ciudad de La Paz (3.593 m) ¿Qué datos presentados en este artículo le resultarían de utilidad práctica?

Higher blood flow and circulating NO products offsethigh-altitude hypoxia among TibetansS. C. Erzurum*†, S. Ghosh*, A. J. Janocha*, W. Xu*, S. Bauer‡§, N. S. Bryan‡§, J. Tejero*, C. Hemann¶, R. Hille¶,D. J. Stuehr*, M. Feelisch‡�, and C. M. Beall**††

Departments of *Pathobiology and †Pulmonary, Allergy, and Critical Care, Cleveland Clinic, Cleveland, OH 44195; ‡Whitaker Cardiovascular Institute, BostonUniversity School of Medicine, Boston, MA 02118; §Institute of Molecular Medicine, University of Texas–Houston Health Science Center, Houston, TX 77030;¶Department of Molecular and Cellular Biochemistry, Ohio State University, Columbus, OH 43210; �Department of Experimental Medicine and IntegrativeBiology, University of Warwick, Coventry CV4 7AL, United Kingdom; and **Department of Anthropology, Case Western Reserve University,Cleveland, OH 44106

Edited by Louis J. Ignarro, University of California School of Medicine, Los Angeles, CA, and approved September 18, 2007 (received for reviewAugust 9, 2007)

The low barometric pressure at high altitude causes lower arterialoxygen content among Tibetan highlanders, who maintain normallevels of oxygen use as indicated by basal and maximal oxygenconsumption levels that are consistent with sea level predictions.This study tested the hypothesis that Tibetans resident at 4,200 moffset physiological hypoxia and achieve normal oxygen deliveryby means of higher blood flow enabled by higher levels ofbioactive forms of NO, the main endothelial factor regulatingblood flow and vascular resistance. The natural experimental studydesign compared Tibetans at 4,200 m and U.S. residents at 206 m.Eighty-eight Tibetan and 50 U.S. resident volunteers (18–56 yearsof age, healthy, nonsmoking, nonhypertensive, not pregnant, withnormal pulmonary function) participated. Forearm blood flow, anindicator of systemic blood flow, was measured noninvasively byusing plethysmography at rest, after breathing supplemental ox-ygen, and after exercise. The Tibetans had more than double theforearm blood flow of low-altitude residents, resulting in greaterthan sea level oxygen delivery to tissues. In comparison to sea levelcontrols, Tibetans had >10-fold-higher circulating concentrationsof bioactive NO products, including plasma and red blood cellnitrate and nitroso proteins and plasma nitrite, but lower concen-trations of iron nitrosyl complexes (HbFeIINO) in red blood cells.This suggests that NO production is increased and that metabolicpathways controlling formation of NO products are regulateddifferently among Tibetans. These findings shift attention from thetraditional focus on pulmonary and hematological systems to vas-cular factors contributing to adaptation to high-altitude hypoxia.

circulation � endothelium

The low barometric pressure at high altitude causes lowerarterial oxygen content among Tibetan highlanders, who

maintain normal levels of oxygen use as indicated by basal andmaximal oxygen consumption levels that are consistent with sealevel predictions (1–3). Hypothetically, the unavoidably lowsupply of oxygen in the air and the blood could be offset byincreasing blood flow to improve oxygen delivery. Blood flow isdetermined by numbers, length, and diameter of blood vesselsthat in turn are largely determined directly or indirectly by levelsof NO, a potent vasodilator synthesized in the endothelial cellslining the vessels (4–7). Tibetans have high levels of NOsynthesis in the lungs (8), and pulmonary blood flow correlatedwith NO in a sample studied at 4,200 m (8, 9). This suggests thehypothesis that Tibetan highlanders offset hypoxia with highersystemic blood flow and higher levels of circulating, biologicallyactive metabolites of NO. After synthesis by the endothelium,NO rapidly undergoes reaction in the blood to form productsthat have circulatory and metabolic effects, including nitrite,nitrate, nitrosothiol proteins (proteins containing NO-cysteinecovalent bonds), and �-nitrosyl hemoglobin (HbFeIINO), inwhich NO occupies the heme binding site for oxygen in hemo-globin (5, 10–13). A sample of 88 Tibetans at 4,200 m had

forearm blood flow more than double that of a sample of 50 sealevel residents at 206 m and circulating concentrations of bio-logically active forms of NO �10-fold higher. These resultshighlight blood flow and its regulation as central components ofTibetans’ adaptation to high-altitude hypoxia.

ResultsArterial Oxygen Content, Delivery, and Forearm Blood Flow. Eighty-eight Tibetan native residents at 4,200 m and 50 U.S. sea levelresidents at 206 m (all healthy, normotensive, nonsmoking, non-pregnant volunteers, 18–55 years of age) participated in this naturalexperiment (Table 1). Tibetans were shorter and lighter and hadlower arterial oxygen saturation and content. Tibetan men andwomen had higher forearm blood flow as compared with the sealevel group (Fig. 1A and Table 2). Sea level blood flow rates werein the previously reported range (10, 14, 15). Forearm blood flowdid not correlate with age, body mass index, arterial oxygen content,or blood pressure in either sample (all P � 0.05). Importantly,Tibetans had greater forearm blood flow and yet maintained lowervascular resistance as compared with those at sea level (Table 2).As a consequence of the greater tissue blood flow and higherhemoglobin concentration, Tibetans delivered more than two timesmore oxygen to the capillary beds of the forearm despite lowerarterial oxygen content as compared with sea level (Fig. 1 B–D).

Effects of Oxygen Supplementation and Exercise on Forearm BloodFlow. Experiments designed to investigate blood flow regulationtested for the presence of hypoxic vasodilation and exercise-inducedvasodilation. First, the presence of a hypoxia-induced vasodilationwas determined by oxygen supplementation. Experimental relieffrom hypoxia by inhalation of 50% oxygen caused Tibetans toachieve oxygen saturations �98% and caused a small reduction offorearm blood flow and systolic blood pressure among Tibetanwomen, but not men (Table 2). Diastolic blood pressure was notaffected by oxygen breathing, but Tibetans experienced a 16%decline in pulse with oxygen breathing (pulse while breathingsupplemental oxygen: Tibetan men, 62 � 2; Tibetan women, 66 �1 beats per minute). These findings suggest modest systemic hypoxicvasodilation and tachycardia; however, even after relief of hypoxiaby supplemental oxygen, forearm blood flow of the Tibetansremained double that of sea level controls (Table 2). Experimen-tally increasing oxygen demand with 5 min of forearm exercise

Author contributions: S.G. and A.J.J. contributed equally to this work; S.C.E., A.J.J., D.J.S.,M.F., and C.M.B. designed research; S.G., A.J.J., W.X., S.B., N.S.B., J.T., C.H., R.H., M.F., andC.M.B. performed research; S.C.E., S.G., A.J.J., W.X., D.J.S., M.F., and C.M.B. analyzed data;and S.C.E., S.G., A.J.J., W.X., D.J.S., M.F., and C.M.B. wrote the paper.

The authors declare no conflict of interest.

This article is a PNAS Direct Submission.

††To whom correspondence should be addressed at: Case Western Reserve University, 238Mather Memorial Building, Cleveland, OH 44106-7125. E-mail: cynthia.beall@case.edu.

© 2007 by The National Academy of Sciences of the USA

www.pnas.org�cgi�doi�10.1073�pnas.0707462104 PNAS � November 6, 2007 � vol. 104 � no. 45 � 17593–17598

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increased forearm blood flow of participants at both altitudes;however, Tibetans had much greater flow increase than sea levelindividuals (Table 2). Taken together, the response to relief ofhypoxia and the response to the increased demands of exercisedemonstrate that blood flow of Tibetans is actively regulated in theexpected ways around a much higher baseline.

Circulating NO Reaction Products: Plasma Nitrite and Nitrate. Greatertissue blood flow of Tibetans could be related to greater numbersor length of vessels and/or vasodilation. NO is the main vasoregu-lator of blood flow to capillaries where oxygen is released to tissues,and plasma nitrite and nitrate concentrations are stable and reliablemeasures of systemic NO production (5, 6, 16–18). Hence, circu-lating reaction products of NO were evaluated in Tibetans. Nitriteand nitrate were measured in deproteinated and delipidated plasma

from Tibetan and sea level samples initially by an amperometric NOsensor method after release of NO from nitrite or from total nitriteand nitrate. Tibetan men and women had average plasma nitrite of4.8 � 1.4 �M and 11 � 2 �M, respectively, whereas sea level menand women had undetectable levels (Fig. 2 A–C). Measurementsbased on the Griess reaction confirmed the high levels of nitrite inTibetan plasma. To detect nitrite in sea level samples and todefinitively confirm the unexpectedly high levels of nitrite in theTibetan sample, a more sensitive high-performance liquid chroma-tography assay was performed and confirmed �10-fold-highernitrite among Tibetans and low levels for sea level samples aspreviously reported [Tibet, 12 � 2 �M (n � 7); sea level, 0.55 � 0.03�M (n � 10)] (13). As for nitrate, Tibetan men and women had10-fold-higher plasma levels of 234 � 31 �M and 158 � 13 �M, ascompared with 23 � 4 �M and 30 � 4 �M for their sea level

Table 1. Tibetan (4,200 m) and U.S. sea level (206 m) sample characteristics (mean � SEM)

Subjects nAge,years Height, m

Weight,kg

Hemoglobin,g/dl

O2 saturation,% of

hemoglobin

Arterial O2

content,* mlof O2/g of

hemoglobin

Pulse,beats perminute

Systolicblood

pressure,mm Hg

Diastolicblood

pressure,mm Hg

Meanarterial

pressure,†

mm Hg

Tibetanmales

25 32 � 2 1.62 � 0.01 47 � 1 16.5 � 0.3 83.7 � 0.7 18.2 � 0.2 74 � 2 113 � 2 77 � 2 89 � 1

Tibetanfemales

63 30 � 1 1.54 � 0.05 44.5 � 0.5 14.6 � 0.1 85.2 � 0.5 17.4 � 0.2 79 � 1 113 � 1 76 � 1 89 � 1

U.S.males

23 35 � 2 1.78 � 0.01 86 � 2 15.5 � 0.2 96.9 � 0.2 20.8 � 0.3 70 � 2 127 � 2 76 � 1 93 � 1

U.S.females

27 38 � 2 1.64 � 0.01 68 � 3 13.3 � 0.2 98.1 � 0.2 19.3 � 0.4 72 � 1 114 � 2 69 � 1 84 � 1

P value‡ 0.2 �0.001 �0.001 0.01 �0.001 �0.001 0.13 �0.001 0.7 0.06P value§ 0.001 �0.001 �0.001 �0.001 �0.001 �0.001 �0.001 0.9 �0.001 0.004

*Estimated as [hemoglobin in g/dl � % oxygen saturation � 1.39 ml of O2 per gram of hemoglobin].†Mean arterial pressure was calculated as [2 � (diastolic blood pressure) � systolic blood pressure]/3.‡Comparison of Tibetan males (n � 25) and U.S. males (n � 23).§Comparison of Tibetan females (n � 63) and U.S. females (n � 27).

Fig. 1. Hemodynamics and oxygen delivery among Tibetan and sea level populations. (A and B) Tibetan forearm blood flow (A) and oxygen delivery (B) weregreater than sea level controls. (C) The greater forearm blood flow of Tibetans compared with the sea level population accounts for the greater oxygen delivery(R2 � 0.96 and P � 0.001). (D) Higher hemoglobin concentrations of Tibetans as compared with sea level population contributes modestly to greater oxygendelivery (R2 � 0.13 and P � 0.001).

17594 � www.pnas.org�cgi�doi�10.1073�pnas.0707462104 Erzurum et al.

counterparts (P � 0.001) (Fig. 2C). High-performance liquidchromatography analyses confirmed higher plasma nitrate amongTibetans [Tibet, 237 � 98 �M (n � 7); sea level, 26 � 7 (n � 10);P � 0.02]. Tibetan women had higher nitrite and lower nitrate thanTibetan men whereas there were no gender differences in nitrite ornitrate in the sea level samples. The nitrate levels of the sea levelsamples were similar to previous reports using the same techniques(13, 19). Tibetan plasma nitroso protein levels were found to be onlymodestly higher than sea level [Tibet, 47 � 9 nM (n � 7); sea level,14.5 � 0.5 nM (n � 8); P � 0.02]. This suggests that the metabolicpathways governing NO product formation are different in theTibetan and the sea level samples.

The plasma nitrite and nitrate concentrations of Tibetans areunprecedented for healthy people. Average concentrations of ni-trite and nitrate exceeded those typically seen in septic shockpatients (20), although Tibetans had no sign of systemic inflam-mation (C-reactive protein; data not shown) (9) Consistent withand confirmatory of the orders of magnitude greater nitrateconcentrations in vivo, Tibetans had higher urinary nitrate than sealevel controls (urine nitrate/creatinine: Tibet, 105 � 49 mmol/mol;sea level, 7.8 � 0.6 mmol/mol; P � 0.001). The high urine nitratewas consistent with intact renal clearance of nitrate and excluded

potential causes of increased nitrate on the basis of renal function.Overall, these findings indicate a much greater total body nitrite andnitrate in Tibetans and led us to evaluate whether other NOreaction products were also increased.

Red Blood Cell Nitrite, Nitrate, Nitroso Proteins, and Nitrosyl Products.NO and/or plasma nitrite and nitrate may enter the red blood cell,where reactions lead to formation of nitroso proteins and nitrosylproducts (5, 11). Thus, in a subgroup of samples, cellular nitrosoproteins (RXNO, mainly SNO-hemoglobins) and nitrosyl products(HbFeIINO), and levels of nitrite and nitrate, were measured.Tibetans had abundant red blood cell nitroso protein levels whereasthe sea level sample had very low levels [Tibet, 2,409 � 705 nM (n �7); sea level, �10 nM (n � 3); P � 0.001]. The Tibetan sample hadintracellular nitrosoprotein levels that were much higher than theplasma levels whereas the sea level sample had intracellular levelsroughly the same as the plasma levels. Thus, it appears that thepathways governing the formation and diffusion of NO productsdiffer between the two samples. Tibetan red blood cell nitrite wassimilar to sea level (Tibet, 0.66 � 0.08 �M; sea level, 0.50 � 0.07�M; P � 0.6), whereas red blood cell nitrate levels were higher(Tibet, 43 � 14 �M; sea level, 4.9 � 0.4 �M; P � 0.03). Despite the

Table 2. Tibetan and U.S. sea level forearm hemodynamics and oxygen delivery (mean � SEM)

Subjects

Blood flow,ml/min/100ml of tissue

Vascularresistance,* mmHg/ml/min/100

ml of tissueOxygen delivery,† ml ofO2/min/100 ml of tissue

Blood flow during 50%fractional insipired

oxygen, ml/min/100 mlof tissue

Blood flow duringexercise,‡

ml/min/100 ml oftissue

Tibetan males 4.9 � 0.3 21 � 2 96 � 8 4.9 � 0.6§ 11.0 � 0.7Tibetan females 5.7 � 0.2 17.2 � 0.9 98 � 5 4.5 � 0.2¶ 9.4 � 0.3U.S. males 2.3 � 0.1 44 � 3 47 � 3 Not done 3.1 � 0.8U.S. females 2.0 � 0.1 47 � 3 36 � 3 Not done 3.1 � 0.5P value� �0.001 �0.001 �0.001 �0.001P value** �0.001 �0.001 �0.001 �0.001

*Calculated as mean arterial pressure divided by forearm blood flow.†Calculated as forearm blood flow multiplied by the arterial oxygen content.‡All within-group comparisons for forearm blood flow with exercise to baseline (P � 0.001, paired t test).§Nineteen Tibetan men provided measurements at baseline and while breathing oxygen (P � 0.5, paired t test).¶Fifty-two Tibetan women provided measurements at baseline and while breathing oxygen (P � 0.006, paired t test).�Comparison of Tibetan males and U.S. males.**Comparison of Tibetan females and U.S. females.

Fig. 2. NO products in the circulation of Tibetan and sea level populations. (A) Amperometric detection (pA) of plasma NO release from nitrite. Arrows identifysample injections. (B and C) Tibetan nitrite (B) and nitrate (C) levels in plasma samples were higher than sea level controls (all P � 0.001). (D) EPR determinationof HbFeIINO in red blood cell samples. EPR spectra of the tetranitrosyl HbFeIINO standard is shown in Left. EPR spectra of blood obtained from a Tibetan participant(Right) revealed lower levels of HbFeIINO complex than blood obtained from a sea level volunteer (Center). Data shown are representative of the mean valuesof the population samples (P � 0.03).

Erzurum et al. PNAS � November 6, 2007 � vol. 104 � no. 45 � 17595

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greater nitrate and nitroso levels, Tibetans had lower levels of ironnitrosyl complexes in red blood cells than sea level cells as evaluatedby electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy (% oftotal Hb that is the nitrosyl product, HbFeIINO: Tibet, 0.03 � 0.01;sea level, 0.18 � 0.05; P � 0.03) (Fig. 2D). Together, the predom-inantly cell-associated nitroso proteins but lower levels of ironnitrosyl levels indicate that nitroso protein products preferentiallyform within Tibetan red blood cells. Overall, the metabolic path-ways converting NO to other products are regulated differentlyamong Tibetans than among sea level natives.

Exogenous Sources of NO Reaction Products. High-nitrate meals ordrinks can increase circulating NO metabolites because of entero-salivary circulation of nitrate and reduction by oral commensalbacteria (21, 22). To exclude a dietary source of circulating NOproducts, nitrite and nitrate levels were measured in householdwater supply and meals from 10 participants. Water, tea, and barleybeer had undetectable or low levels (�15 �M nitrite and �70 �Mnitrate). Likewise, foods contained low levels of nitrite or nitrate(�0.4 mg/kg nitrite and �125 mg/kg nitrate). Overall, the averagedaily consumption was not at a level expected to significantlyincrease circulating nitrate or nitrite (17, 22). These results suggestthat endogenous NO production is up-regulated.

Factors Regulating NO Synthesis: L-Arginine and Arginase. Becausemost plasma nitrite, and much of plasma nitrate, is derived fromendothelial NO synthesis (eNOS) (5, 6, 16–18), the high nitrite andnitrate concentrations detected likely indicate higher endothelialNO formation in Tibetans. Circulating red blood cells synthesizeNO (23); however, lower levels of intracellular nitrite and nitrate,as compared with plasma levels, suggested that formation was notprimarily within red blood cells. Although information about eNOSexpression and endothelial enzymatic activity is difficult to obtainin field studies, measure of factors that regulate NO synthesis canprovide a useful hint. Availability of L-arginine, the substrate foreNOS, is a major determinant of the amount of NO synthesized byeNOS in vivo (24). The intracellular L-arginine availability for NOsynthesis is determined by both uptake from blood and intracellularmetabolism, in particular via arginase enzymes (24–26). Here,L-arginine availability was estimated by measures of circulatingL-arginine and arginase activity. Plasma L-arginine levels in theTibetan circulation were similar to reported sea level values (54 �5 �M arginine). However, Tibetans’ plasma arginase activity wasless than half of sea level controls [Tibetans, 18 � 2 milliunits/ml(n � 84); sea level, 50 � 11 milliunits/ml (n � 20); P � 0.001], andarginase activity was inversely related to plasma nitrate levels (r ��0.24 and P � 0.01). These findings support the concept thatTibetans may have more intracellular L-arginine available to causehigher endogenous NO synthesis.

DiscussionThe primary finding of this study is that Tibetans at 4,200 m havesubstantially higher blood flow that is achieved without thepotential cost of hypertension or elevated vascular resistance.The greater blood flow enables greater oxygen delivery andoffsets the low arterial oxygen content unavoidably associatedwith high-altitude residence. The second main finding is that NOand its products, which control blood flow and cellular respira-tion, are present in the circulation of Tibetans at remarkably highlevels as compared with the sea level population. These findingsreorient attention from the traditional focus on pulmonary andhematological factors to vascular factors for adaptation tochronic hypoxia.

The L-arginine/NO synthase pathway is the most likely explana-tion for high concentrations of circulating NO products in Tibetans.Although a precise quantitative assessment of NO formation inTibetan highlanders compared with the sea level control group isdifficult to make without further knowledge about possible differ-

ences in NO synthase enzyme kinetics, NO metabolism in bloodand tissues, and NO product elimination characteristics, a roughestimate can be made based on plasma and urine levels consideringthat nitrate is the final end product of NO metabolism in vivo(17–19). Based on the plasma nitrate levels determined in this studyand its distribution volume in 30% of body weight (18, 19), theaverage total body pool of nitrate is estimated to correspond to 3.4and 2.1 mmol in Tibetan men and women and just 0.53 and 0.47mmol in sea level men and women, respectively. The total body poolof nitrate estimated for sea level participants in this study is similarto previous reports (18, 19). Based on urine nitrate levels andassuming similar renal function and insignificant contributionsfrom dietary sources, Tibetans appear to have �4-fold-higher NOproduction than sea level controls. The differences in NO produc-tion among the Tibetans and sea level controls estimated by nitrateexcretion are consistent with the relative increase of total body poolof nitrate estimated by plasma nitrate levels, i.e., 6.5-fold and4.4-fold higher in Tibetan men and women than in sea level menand women, respectively.

Although the nature and significance of the bioactive pools ofNO products in blood remain controversial (10, 12), the globalincrease of NO products in Tibetans provides strong support for theconcept that NO is critical for oxygen transport and delivery in thischronically hypoxic population. The very high levels of NO ob-served in Tibetans may have effects in addition to those demon-strated for vascular tone, blood flow, and oxygen delivery. At sealevel ambient oxygen availability, NO has well established effects tooptimize intracellular oxygen utilization; high levels of NO decreaseoxygen consumption and enhance coupled respiration and ATPcontent while increasing mitochondrial numbers through biogene-sis (6, 27, 28). In fact, healthy sea level subjects ingesting high levelsof nitrate daily for 3 days achieve a significant reduction of oxygenconsumption at submaximal exercise through improved efficiencyof energy production during cellular respiration (29). These studiesat sea level suggest that the high levels of NO products in Tibetansmay affect metabolic as well as circulatory parameters. However,studies of muscle ultrastructure found that Sherpas (a Tibetanhigh-altitude subpopulation) and Tibetans born and raised at 1,300m have fewer mitochondria per volume of muscle tissue and agreater muscle capillary density than lowland natives of differentethnic groups (30, 31). Although the NO levels of these samples areunknown, the findings suggest that the populations have intrinsicdifferences in muscle ultrastructure and/or that hypoxia influencesNO effects.

Acclimatization of sea level populations to hypoxia during exer-cise or acute exposure to high altitude or illness provides insight intosome of the mechanisms that preserve oxygen delivery to tissues.Although not to the magnitude achieved by Tibetans in this study,well trained athletes at sea level acquire enhancement of endoge-nous NO production and forearm blood flow in response to therepetitive intermittent increases in oxygen demand during endur-ance training. The acclimatization to exercise is associated withimprovements in oxygen delivery through blood flow and increasedtissue capillary density but is likewise accompanied by improve-ments in cellular respiration and oxygen consumption duringexercise (14, 15, 32, 33). Previous studies have identified that atransient and acute fractional increase in blood flow occurs uponinitial ascent of healthy sea level men and women to altitude, whichis related to cardiovascular effects (34, 35). However, increasedtissue blood flow is not sustained and returns to near normal sealevel values within 7–10 days. Similarly, patients with hypoxiarelated to lung diseases also acclimatize. Although the number ofcapillaries per muscle fiber in patients with tissue hypoxia due tochronic obstructive pulmonary disease is generally less than inhealthy controls (36), �30% of patients are able to maintain a highcapillary-to-muscle fiber ratio and tissue blood flow and thus avoidthe rapid muscle fatigue during exercise seen in patients with lowcapillary density (37). Strikingly, capillary length and surface area

17596 � www.pnas.org�cgi�doi�10.1073�pnas.0707462104 Erzurum et al.

within the diaphragm are markedly increased in emphysema pa-tients as compared with controls, which apportions greater tissueblood flow and oxygen delivery to this continuously active essentialmuscle (38). These examples of vascular acclimatization of sea levelpopulations to hypoxia suggest that the microvasculature responsesmay occur relatively rapidly. The current study evaluated Tibetansonly at high altitude and cannot determine whether the high NOand tissue blood flow are reversible at prolonged exposure to lowaltitude, although experiments suggest these features are not im-mediately relieved by oxygen supplementation. Nevertheless, theseadaptive responses enable Tibetans chronically exposed to high-altitude hypoxia to circumvent the limitations of reduced oxygenavailability to achieve work capacities similar to sea level dwellers.

The very high systemic blood flow, rate of oxygen delivery, andlevels of NO further underscore the contrasting patterns of func-tional adaptation found among Tibetans as compared with Andeanhighlanders (8, 39). For example, at the same altitude, Tibetanshave lower hemoglobin concentration and percent of oxygen sat-uration of hemoglobin and do not exhibit the hypoxic pulmonaryvasoconstriction characteristic of their Andean counterparts (9).Higher levels of NO synthesis and NO-regulated vasodilation andblood flow in the pulmonary and systemic vasculature may beimportant mechanisms underlying the distinctive, effective Tibetanresponse to high-altitude hypoxia. In conclusion, the newly discov-ered importance of high blood flow and circulating levels of NOproducts among Tibetans increases understanding of the mecha-nisms of human adaptation to extreme ambient hypoxia andpredicts that treatments based on similar strategies may be effectivefor patients with diseases associated with tissue hypoxia at anyaltitude.

Materials and MethodsHigh-Altitude Population. Data collection took place from June toAugust 2002 in Panam Xiang, a rural agropastoral district ofXigatse Prefecture, Tibet Autonomous Region, at 4,200 m aspreviously reported (9). A field laboratory was established where 88normotensive, nonsmoking (by self-report and verification by ex-haled carbon monoxide level), healthy, nonpregnant, high-altitudenative Tibetan volunteers 18–55 years of age with normal pulmo-nary function provided measures of height, weight, blood pressure,forearm blood flow, exhaled breath, venous blood, and percentoxygen saturation of hemoglobin. A second data collection periodduring June 2005 in the same location involved five men and fivewomen with the same characteristics, 19–32 years of age, whoprovided measures of exhaled breath, blood pressure, urine, reportsof 24-h dietary intake, and aliquots of the foods. Six peopleparticipated in both studies. Hemoglobin concentration was deter-mined in duplicate by using the cyanmethemoglobin technique(hemoglobinometer from Hemocue, Angelholm, Sweden) imme-diately after drawing a venous blood sample. Percent oxygensaturation of hemoglobin was determined by pulse oximetry (Criti-care Model 503; Criticare Systems, Waukeshau, WI) as the averageof six readings taken 10 seconds apart as in our previous studies(40). The research described herein adheres to the principles of theDeclaration of Helsinki and Title 45 of the U.S. Code of FederalRegulations, Part 46, Protection of Human Subjects. The Institu-tional Review Board of the Cleveland Clinic and Case WesternReserve University approved the protocol, and informed consentwas obtained from all participants.

Sea Level Population. Two low-altitude reference samples composedof healthy (by self-report), nonsmoking volunteers with normal lungfunction, 18–55 years of age, were measured at the Cleveland Clinic(Cleveland, OH) at 206 m. A sample of 20 volunteers provided dataon age, height, weight, exhaled NO, and venous blood in 2003 asreported previously (9). In 2005, a sample of 50 healthy volunteersscreened with the same criteria provided data on height, weight,

blood pressure, forearm blood flow, exhaled breath, venous blood,percent oxygen saturation of hemoglobin, and urine.

Ambient Conditions. The ambient conditions at the time of morningcalibrations in Tibet during 2002 have been reported (9). Theambient conditions at the time of morning calibrations in Tibetduring 2005 were 18.5°C average temperature, 31% relative hu-midity, 2.4 ppb NO in ambient air, and 469 Torr barometricpressure. The average temperature at the time of forearm bloodflow measurements was 19 � 0.3°C. In Cleveland, ambient condi-tions were 23°C, 29% relative humidity, in a climate-controlledroom. Measurements were made when ambient NO was �10 ppb.The barometric pressure in Cleveland was 754 Torr.

Blood Collection and Food Sampling. Blood was collected intoheparinized tubes for plasma separation. Tibetan study participantsprovided aliquots of food and drinks from their own meals. Foodwas mainly grain. The staple food was toasted barley flour. High-nitrate-containing foods (such as leafy green vegetables) were rare.Fluids were mainly butter tea and barley beer.

NO-Related Products. Three distinct methods were used to measurenitrite and nitrate in plasma samples: (i) an amperometric NOsensor in combination with acidified iodide for the detection of NOderived from nitrite, or from total nitrite and nitrate after cadmium/copper-mediated reduction of nitrate to nitrite (ISO-NOP, Nitra-lyzer II; World Precision Instruments, Sarasota, FL) (26); (ii) nitriteand nitrate (after reduction) using the classical Griess reaction (41);and (iii) nitrite and nitrate quantification using a dedicated HPLCsystem (ENO-20; Eicom) (13). All three methods were in goodagreement with high concordance for plasma nitrite and nitratevalues (all comparisons R2 � 0.6 and P � 0.005). Nitrite and nitrateconcentrations were determined in all samples after removal offatty/particulate materials and proteins by ZnSO4/NaOH using theamperometric technique, and by Griess reaction and HPLC. Forthe determination of total nitroso products (RXNO), plasma waspreincubated with NEM/EDTA for thiol blockade to preventartificial nitrosation before nitrite removal by sulfanilamide andsubsequent analysis by gas phase chemiluminescence (42, 43).During the field study, samples of venous blood were sometimescentrifuged for separation of plasma after sitting at ambient tem-perature for up to 6 h. Nitrite is converted to nitrate in blood. Thefinding of high levels of nitrite in the Tibetan samples despitethe delays in separating plasma from red blood cells suggests thatthe original levels of nitrite may have been even higher than thoseobserved during analysis. Comparing the levels of nitrite and nitrateamong samples processed within minutes to those processed hoursafter collection revealed no significant differences in the levels ofnitrite or nitrate. Therefore, the estimates of nitrite are perhapsbiased toward low values. In a subgroup of samples for whicherythrocytes were also available, erythrocyte nitrite, nitrate, andRXNO were evaluated. Erythrocytes were lysed 1:4 in hypotonicwater containing 10 mM NEM/2.5 mM EDTA. For total nitrite andnitrate analysis, the lysate was further diluted 1:2 with methanol andcentrifuged for removal of hemoglobin; for nitroso analysis, sampleswere injected into an iodine/iodide-containing reaction solutionafter preincubation with acidified sulfanilamide for 15 min andanalyzed by gas phase chemiluminescence as described elsewhere(43). Because sample volume was limiting, no evaluation of thesensitivity of the RXNO pool to degradation by HgCl2 (for deter-mination of the nitrosothiol portion of the signal) was performed.

The extent of artificial nitrosation that may have occurredbecause of inevitable delays between blood sampling, centrifuga-tion, and the freeze/thaw process under field conditions was inves-tigated in a separate set of experiments carried out in human bloodfrom U.S. sea level controls (resident in Boston or Cleveland).Blood was spiked with 30, 100, or 300 �M nitrite or nitrate, withdifferent delays imposed between sampling and processing (i.e.,

Erzurum et al. PNAS � November 6, 2007 � vol. 104 � no. 45 � 17597

MED

ICA

LSC

IEN

CES

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THRO

POLO

GY

centrifugation and freezing) to match those experienced under fieldconditions. No nitroso products were detected upon spiking withnitrate. Nitrite-mediated nitrosation was highest immediately afteraddition of nitrite to blood and gradually declined with increaseddelay between sampling and processing, but levels did not exceed0.5% in plasma and 1.9% in red blood cells under any condition.Thus, although the higher concentration of nitroso species inTibetan plasma may be a result of their high constitutive nitritelevel, the levels of nitroso compounds in red blood cells far exceedthose achievable by constitutive nitrite.

Iron Nitrosyls. The presence of HbFeIINO in heparinized red bloodcells was evaluated by EPR spectra recorded on a Bruker ESP 300EPR spectrometer equipped with an ER 035 NMR G meter and aHewlett-Packard 5352B microwave frequency counter. All spectrawere obtained at 150 K by using a microwave power of 2 mW,microwave frequency of 9.45 GHz, modulation amplitude of 5.0 G,and modulation frequency of 100 kHz. Ten to 20 scans per samplewere accumulated to improve signal-to-noise ratio, and spin quan-titations were calculated by double integration as compared with aHbFeIINO standard analyzed under the same measurement con-ditions. To evaluate the stability of the HbFeIINO complex inaerobic conditions, another sample was prepared following thesame procedure but transferred to an Eppendorf tube exposed toroom air for 30 min before freezing. Spin quantitation indicatedthat 70% of the original spin concentration was recovered. Fullreduction by dithionite was used to evaluate potential higheroxidation states of HbFeNO.

Blood Flow. Forearm blood flow (milliliters of blood per 100 ml oftissue per minute) was measured noninvasively by strain gaugevenous occlusion plethysmography (44). The mercury strain gauge

plethysmography technique (model EC5R Strain Gauge and Pho-toplethysmograph; D.E. Hokanson) consists of a thin mercury-filled rubber tube encircling the widest part of the forearm thatstretches as the volume of the forearm changes with each heartbeat.The stretch increases the electrical resistance in the tube that isconveyed in analog form for calculations (noninvasive vascularprogram). A wrist cuff inflated to suprasystolic blood pressureserved to exclude circulation from the hand, and a rapid, automaticblood pressure cuff was inflated to 50 mm Hg every 7 seconds. Thisallowed arterial blood to enter the forearm circulation for 7 secondswhile preventing venous outflow, resulting in a distension of theforearm proportional to the inflow. Increase in forearm blood flowafter 5 min of exercise with a hard rubber ring offering 11.3 kg ofresistance quantified blood flow responses to increased oxygendemands. Exercise consisted of 5 min of repetitive handgrips of 10seconds of contraction of the dynamometer followed by 5 secondsof relaxation. The average of a series of five determinations takenimmediately at the end of the 5 min of exercise quantifies the bloodflow response to exercise. Forearm blood flow was also measuredafter 10 min of breathing 50% fractional inspired oxygen in Tibetansubjects.

Arginase Activity. Arginase activity in plasma was determined as theconversion of [14C-guanidino]L-arginine (PerkinElmer, Boston,MA) to [14C]urea, which was further converted to 14CO2 by ureaseand trapped as Na2

14CO3 for scintillation counting as describedpreviously (26).

We acknowledge the valuable assistance of D. Laskowski, J. Sharp, M.Baaklini, S. A. A. Comhair, K. P. Strohl, I. Kushner, and D. Rzewnicki.The research was supported by National Science Foundation GrantsNSF0452326 and NSF0215747 and National Institutes of Health GrantsHL60917, HL69029, M01 RR018390, and M01 RR00080.

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Discusión grupal sobre METABOLISMO DEL HIERRO

Historia clínica Nº 1. Ficha patronímica: J. B. sexo masculino, 75 años, procedente de Montevideo. Fecha de ingreso: 21/11/03, emergencia. Motivo de consulta: astenia y adinamia. Enfermedad actual: comienza hace 3 meses con astenia, adinamia(1) y fatigabilidad fácil frente a pequeños esfuerzos. Concomitantemente fosfenos(2) y acufenos(3). En ocasiones palpitaciones(4). Sus familiares lo notan pálido. Refiere recibir una dieta balanceada. Relata presencia de cabello frágil, quebradizo. Niega fiebre. Tránsito urinario: niega presencia de sangre en la orina. Tránsito digestivo: refiere dolor epigástrico urente que calma con líquidos fríos. Niega vómitos con sangre. Niega diarrea. Antecedentes personales: historia de dolores articulares en cadera y miembros inferiores de larga data que lo obligan a tomar analgésicos (ácido acetilsalicílico). Antecedentes familiares: sin antecedentes de hemopatías en su familia. Antecedentes socio económico-ambientales: niega exposiciones a tóxicos ambientales; vive con su esposa; recibe apoyo económico de sus hijos. Examen físico: paciente vigil, bien orientado en tiempo y en espacio, bien hidratado; Temperatura axilar 36°C. Piel, mucosas y faneras: palidez cutáneo-mucosa intensa(5), no petequias(6), no equimosis(7). Coloración azulada de escleróticas(8); pelo fino y quebradizo(9). Uñas con estriación longitudinal(10). Bucofaringe: lengua depapilada en el borde(11). Linfoganglionar: normal. Cuello: s/p. Cardiovascular: ritmo regular de 110 ciclos por minuto(12). No edemas(13) de miembros inferiores. Respiratorio: s/p. Abdomen: s/p Neurológico: s/p

Precisiones relacionadas con la situación clínica del paciente: 1) Astenia, adinamia: pérdida de la voluntad, pérdida global de la fuerza, decaimiento 2) Fosfenos: percepción visual de destellos luminosos como “chispas”. 3) Acufenos: percepción auditiva de un zumbido 4) Palpitaciones: percepción conciente de los latidos cardíacos. 5) Palidez cutáneo-mucosa: palidez de piel y mucosas que conduce al diagnostico clínico de anemia. Es el signo principal en el síndrome anémico y está presente en las anemias de cualquier origen. 6) Petequias: sangrado de pequeño tamaño (1 mm de diámetro) de color rojo, que no se borra con la digito-presión. Traduce la alteración en el número o función plaquetaria o patología de pequeños vasos. 7) Equimosis: lesión cutánea, rojo-violácea, plana de varios centímetros de diámetro. 8) Coloración azulada de escleróticas: coloración particular de la esclerótica ocular que característica de ferropenia. 9) Pelo fino y quebradizo: pelo con falta de brillo, frágil, en ocasiones asociado a caída fácil del cabello. Son síntomas y signos característicos de ferropenia.

10) Uñas con estriación longitudinal: la presencia de una marcada estriación longitudinal junto con la fragilidad de las uñas, constituyen signos de ferropenia. 11) Lengua depapilada en el borde: la presencia de una lengua lisa y brillante exclusivamente sobre el borde de la lengua es un signo orientador a ferropenia. 12) Frecuencia cardiaca: la frecuencia cardiaca normal se encuentra entre 60 y 100 ciclos por minuto. 13) Edemas: exceso de líquido a nivel intersticial, observado a nivel de partes blandas y que predomina en zonas declives. A partir de la información que brinda esta historia clínica, ¿qué estudios de laboratorio serían los más importantes para precisar el diagnóstico de la enfermedad? Discuta los mismos con la información que le brinda el docente al respecto. ¿Se puede afirmar que el paciente tiene una anemia? ¿Por qué? ¿Existen elementos que sugieren que el paciente presenta una alteración en el metabolismo del hierro? Fundamente la respuesta. Rellene el siguiente cuadro del metabolismo del hierro:

Elementos involucrados Absorción por el organismo Transporte Captación celular Almacenamiento Liberación por la célula

¿Pueden existir modificaciones de algunos de estos elementos en el paciente en estudio, al ser comparados con un individuo normal? La transferrina es la principal proteína transportadora de hierro a nivel plasmático. El laboratorio de Análisis Clínico habitualmente informa sobre la cantidad de hierro en el plasma y el porcentaje de saturación de la transferrina plasmática de hierro. En el gráfico se muestran los niveles normales de hierro y la saturación total de hierro:

0

100

200

300

400

500

Normal Paciente

hier

ro µ

g/10

0 m

l

a) ¿Cómo sería el gráfico del paciente analizado anteriormente?

b) ¿Cómo es la estructura de la transferrina y cuántas moléculas de hierro es capaz de unir?

El ARNm para la ferritina y para el receptor de transferrina posee en su secuencia una estructura llamada elementos que responden al hierrro (iron responsive elements, IRE) que adquieren una estructura tipo "loop" y participan en controlar la vida media del ARNm. Para el caso de la ferritina el IRE esta en el extremo 5´del ARNm y en el caso del receptor de transferrina en el extremo 3´

a) ¿Cuál es el elemento que vincula los IRE y los niveles de hierro?

b) ¿Qué sucede con la vida media del ARNm de la ferritina y del receptor de transferrina, en situación de sobrecarga y en situación de déficit de hierro? c) ¿Este mecanismo tiene alguna relación con lo observado en los niveles de ferritina y de receptores de transferrina en el paciente analizado?

Hemograma Test Resultado Rango de referencia Glóbulos blancos 7.400 μL 4.100 – 10.900 μL Linfocitos 2.300 μL (31,7%) 600 – 4.100 μL Granulocitos 4.600 μL (62,1%) 2.000 – 7.800 μL Otros leucocitos 500 μL (6.2%) 0 – 1.800 μL Glóbulos rojos 4.540.000 μL 4.200.000 – 6.300.000 μL Hematocrito 24,8 % 37 – 51% Hemoglobina 8,1 g/dL 12 – 18 g/dL Plaquetas 421.000 μL 140.000 – 440.000 μL

Metabolismo del Hierro Test Resultado Rango de referencia Sideremia 45 60 – 160 μg/dL Transferrina 430 250 – 350 μg/dL Indice de saturación 11% 16 – 50% Ferritina 8 50 – 300 ng/mL

Discusión grupal sobre PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

Historia clínica Nº 2.Ficha Patronímica: E.C., sexo masculino, 58 años, procedente de Montevideo. Fecha de Ingreso: 07/01/04, emergencia. Motivo de Consulta: distensión abdominal Enfermedad Actual: comienza hace 20 días con distensión abdominal progresiva, agregando edemas(1) de miembros inferiores, indoloros y fríos que llegan hasta raíz de muslo. De igual evolución presenta astenia y adinamia(2). Refiere aumento de peso de 8 a 10 kg en el último mes. Desde hace 15 días nota equimosis(3) y hematomas(4) a mínimos traumatismos. Tránsito urinario: oliguria(5). Niega orinas espumosas(6). Tránsito digestivo: s/p. Niega diarrea. Antecedentes personales: alcoholista intenso, de hasta 3 litros de vino en el día, consumiendo esa cantidad durante al menos los últimos 8 a 10 años, habiendo iniciado el hábito hace aproximadamente 30 años. Niega hepatitis; niega haber sido transfundido con sangre o hemoderivados. Niega adicción a drogas intravenosas. Antecedentes familiares: padre alcoholista intenso. Antecedentes socio económico-ambientales: paciente en situación de calle, vive solo, no mantiene contacto con su familia. Desempleado. Examen físico: paciente vigil, bien orientado en tiempo y espacio, bien hidratado, disminución del panículo adiposo. Temperatura axilar 37°C. Hipertrofia parotídea y lacrimal(7), teleangiectasias(8). Piel, mucosas y faneras: piel suave, angiomas estelares en cara y tórax(9); ginecomastia bilateral(10). Disminución del vello corporal (principalmente axilar), disposición ginoide del vello pubiano(11). Múltiples equimosis y hematomas en miembros inferiores. Ictericia(12) a nivel de mucosa conjuntival. Bucofaringe, linfoganglionar y cuello: s/p Cardiovascular: edemas blandos, blancos, fríos, indoloros, simétricos, que llegan a raíz de muslo y dejan godet(1). Resto s/p. Respiratorio: s/p Abdomen: gran distensión abdominal, con cicatriz umbilical desplegada. Abdomen tenso, indoloro. No se palpa borde inferior hepático(13). Presenta matidez flanco-desplazable(14). Tacto rectal: s/p. Sistema nervioso: temblor fino distal. Resto s/p.

Precisiones relacionadas con la situación clínica del paciente: 1) Edemas: exceso de líquido a nivel intersticial, observado a nivel de partes blandas y que predomina en zonas declives. La instalación de edemas requiere de tiempo (días-semanas) y se manifiesta clínicamente con la presencia de al menos 5 litros de líquido a nivel intersticial. El signo de godet (fovea): en zonas donde hay edema la presión digital deja un hueco, denominado fóvea o signo de godet. 2) Astenia, adinamia: pérdida de la voluntad, pérdida global de la fuerza, decaimiento. 3) Equimosis: lesión cutánea rojo-violácea plana de varios centímetros de diámetro.

4) Hematomas: lesión cutánea rojo-violácea sobre elevada de varios centímetros de diámetro. 5) Oliguria: disminución del volumen urinario en 24 horas. La eliminación de orina diaria oscila entre 1200 – 1500 ml (producción de 0,5 a 1 ml / kg peso / hora). 6) Orinas espumosas: traducción de la presencia de proteínas en cantidad patológica en la orina. 7) Hipertrofia parotídea y lacrimal: el aumento del volumen de las parótidas (a nivel preauricular) y el de las glándulas lacrimales es otro signo que evidencia el consumo de alcohol crónico. 8) Teleangiectasias: dilataciones de pequeños vasos que predominan en nariz y cara. Puede presentarse sin orientar a ninguna patología pero en este contexto clínico debe sugerirnos una evidencia (estigma) de consumo de alcohol crónico. 9) Angiomas estelares (arañas vasculares): malformación vascular de color rojo, con un punto central del cual salen finas ramificaciones radiadas. La presión digital sobre ellas las hace palidecer, reapareciendo al disminuir la presión. Suelen traducir la presencia de aumento de estrógenos en sangre (hiperestrogenismo). 10) Ginecomastia: aumento del volumen de la glándula mamaria. Suele traducir la presencia de hiperestrogenismo. 11) Disminución del vello corporal (principalmente axilar): suele traducir la presencia de hiperestrogenismo. Disposición ginoide del vello pubiano: implantación del vello pubiano con borde superior horizontal sin ascenso hacia el ombligo (como en la mujer). Suele traducir la presencia de hiperestrogenismo. 12) Ictericia: coloración amarillenta de piel y/o de mucosas producida por el aumento de bilirrubina en sangre por arriba de 1 mg%. 13) Borde inferior hepático: a nivel del hipocondrio derecho en situación normal no se logra palpar el borde del hígado. 14) Matidez flanco desplazable: la percusión del abdomen sobre un flanco, primero en decúbito lateral y (sin sacar la mano del lugar) luego en decúbito dorsal, pone en evidencia cambios en la sonoridad del abdomen que traducen clínicamente la presencia de líquido libre en la cavidad abdominal (ascitis). ¿Cuáles aspectos destaca dentro de la afectación de este paciente? ¿Cuál podría ser el órgano más afectado? ¿Podrían influir en algo los antecedentes personales? ¿Por qué? ¿Qué estudios de laboratorio serían importantes para confirmar el diagnóstico? A continuación se muestra un proteinograma electroforético del suero sanguíneo de un individuo normal:

- ¿A qué tipos de proteínas corresponden las fracciones que aparecen en el mismo? - ¿Cuáles podrían ser las principales modificaciones que tendría el proteinograma en

el paciente en estudio? - ¿Qué característica tendrá en este paciente el intercambio hídrico entre sangre e

intersticio a nivel capilar? - ¿Un nuevo proteinograma podría ayudar para evaluar la evolución de la

enfermedad? El laboratorio informa que el paciente tiene un hematocrito de 40% y albuminemia de 2.500 mg/dl.

- ¿Cuál es el déficit de albúmina, expresado en gramos, que padece el individuo? Considere una volemia de 5 litros y como normoalbuminemia a 4.500 mg/dl.

- ¿Qué tipo de estudios debió efectuar el laboratorio para determinar que la albuminemia es de 2.500 mg/dl?

¿Es posible que una persona pueda tener una enfermedad diferente que también se manifieste por edemas generalizados y ascitis, debido a una alteración de las proteínas plasmáticas? Fundamente la respuesta.

Proteína plasmática Función

Albúmina Transporte de cobre Transporte de hierro Hemopexina Haptoglobina Reconocimiento específico de patógenos Sistema complemento Lipoproteínas Protrombina Transporte de bilirrubina En el siguiente experimento se prepara albúmina humana marcada con iodo radiactivo (I131) y se inyecta a individuos normales. Se realizan extracciones de sangre de estos individuos cada 12 h y se mide la radiactividad en un contador de centelleo. A continuación se grafica la radiactividad detectada (cpm) en función del tiempo en una escala semi logarítmica y en la línea punteada se muestra el ajuste en la zona lineal de este gráfico a un tipo de ecuación:

I131(t) = I131

(0) · e -k t

Donde: I131

(0) es la radiactividad inicial (a tiempo cero), I131(t) es la radiactividad medida a los

distintos tiempos y k es la constante de velocidad de decaimiento de la radiactividad de la fase lenta.

a) ¿Cómo explica la primera porción de la gráfica donde se observa una caída más rápida de la albúmina marcada con I131? b) ¿Cómo explica la segunda fase más lenta en la gráfica? ¿Cómo se obtiene el valor de vida media de 17.5 días? c) ¿Qué sucedería si al paciente de la historia clínica anterior se inyecta albúmina-I131 y se mide la radiactividad en función del tiempo como en la gráfica anterior? d) Si un individuo tiene un total de unos 295 g de albúmina ¿cuánto sería la síntesis diaria de albúmina para mantener un nivel constante en la circulación y dónde se produce este fenómeno? Utilice los datos de la gráfica y la ecuación presentados más arriba.

Discusión grupal sobre HEMOSTASIS PRIMARIA

1.- Mediante la evaluación de los cambios en la transmitancia de la luz, es posible evaluar la dinámica de la agregación plaquetaria en un plasma rico en plaquetas (PRP). Ante la adición de un estímulo agonista, las plaquetas agregan y la transmitancia aumenta. A continuación se muestran los resultados obtenidos utilizando dos agonistas plaquetarios fisiológicos a tres concentraciones diferentes cada uno: colágeno (figuras A, B y C) y ADP (figuras D, E y F). A B C

D E F

¿Cuál es el interés biológico de los agonistas utilizados para este estudio? De acuerdo con estos resultados, ¿sería correcto afirmar que para ambos agonistas la agregación plaquetaria es dependiente de la concentración utilizada? ¿Se puede concluir que el colágeno es un agonista plaquetario más potente que el ADP? ¿Se observaron situaciones de agregación plaquetaria irreversible? Si se evalúa la presencia de receptores gpIIb/IIIa de alta afinidad en la superficie plaquetaria, ¿en qué muestras no serían detectables? Empleando anticuerpos anti-trombospondina, ¿podríamos detectar su presencia en la superficie de algunas de las plaquetas estudiadas? ¿Qué significado tiene su presencia? Si se detecta la trombospondina en el exterior de la plaqueta, ¿se puede afirmar que ya se sintetizó tromboxano A2 por parte de la misma? ¿Puede modificarse el resultado de estos estudios si se adiciona previamente factor de von Willebrand al medio?

2.- El siguiente es un esquema sobre la formación de tromboxano A2 (Tx A2): ____________________

Fosfolipasa A2 ____________________

Ciclo-oxigenasa ____________________

Tromboxano-sintetasa ____________________ a) Indique a que sustancias corresponden los espacios libres. b) ¿En qué tipos celulares se desarrolla esta vía metabólica? c) ¿Es posible que la presencia de calcio iónico influya sobre la actividad catalítica de alguna de estas enzimas? En caso afirmativo, indique como repercute sobre la actividad de la vía. d) ¿Cuál es la regulación fisiológica de la formación de Tx A2? e) ¿Existen posibilidades de regulación farmacológica? 3.- La prostaciclina ( PG I2) es un antiagregador plaquetario. a) ¿Cómo y dónde es producida? b) ¿Cómo explica a nivel molecular su acción como antiagregador plaquetario? c) ¿Es posible que algún inhibidor farmacológico de la síntesis de Tx A2 afecte también la formación de prostaciclina? Discuta su significado en la regulación de la hemostasis. 4.- Un individuo tiene un trastorno de la hemostasis caracterizado por: - tiempo de sangría aumentado - en el PRP no se observa aglutinación en presencia de ristocetina - las plaquetas aglutinan cuando al PRP se le adiciona plasma fresco de un individuo normal. Indique lo correcto sobre el individuo estudiado:

a) las plaquetas poseen la glicoproteína Ib. b) carece de los receptores plaquetarios para el fibrinógeno. c) tiene hemofilia. d) tiene afectada la hemostasis primaria. e) tiene una deficiencia (cuantitativa o cualitativa) en el factor de von Willebrand. Luego de cumplida la primera etapa de diagnóstico, se efectuó la dosificación del factor de von Willebrand (VWF) en el plasma, observándose que el paciente presentaba valores dentro del rango de normalidad. Ante ello se efectuó un estudio de electroforesis de baja resolución, para evaluar la presencia de agregados del VWF. Los resultados obtenidos se muestran en la figura. En el carril 1 se encuentra la muestra del plasma del paciente en estudio; en el carril 2 el plasma de un paciente heterocigoto para una deficiencia cualitativa del VWF; el carril 3 corresponde al VWF normal recombinante; mientras que en el carril 4 se estudió un "pool" de plasma proveniente de individuos controles sanos.

1 2 3 4

+

- Ante el resultado obtenido en la electroforesis, ¿qué opina en relación al diagnóstico del paciente en estudio? ¿Cuál es la base molecular de la enfermedad que presenta? 5.- El ácido acetilsalicílico ha demostrado un significativo efecto protector en la prevención secundaria de un accidente isquémico. Ello ha alentado la profundización en las líneas de investigación orientadas al desarrollo de agentes con selectiva actividad anti-plaquetaria. ¿Qué moléculas podrían constituirse en buenos blancos terapéuticos al respecto? ¿Qué estrategias utilizaría para actuar sobre ellas?

Discusión grupal sobre COAGULACIÓN, FIBRINOLISIS, ENDOTELIO

1.- El correcto uso de los anticoagulantes es de fundamental importancia médica, tanto para obtener muestras de sangre en condiciones apropiadas para estudios de diagnóstico, como para su administración con fines terapéuticos a determinados pacientes. A continuación se indican una serie de sustancias. Indique cuáles son apropiadas para uso in vitro, cuáles para uso in vivo, fundamentando la respuesta en base al mecanismo de acción de cada una.

Sustancia Uso in vitro Uso in vivo Mecanismo de acción Heparina Warfarina Ac. acetilsalicílico Prostaciclina EDTA ¿Cómo funciona el sistema anticoagulante de la proteína C activa? ¿Su activación es factible para mantener la sangre anticoagulada in vitro? ¿Por qué? 2.- Existe una variante del factor V de la coagulación, conocida como factor VLeiden, cuya evaluación es de interés biomédico. A continuación se muestran una serie de experimentos realizados a los efectos de comparar la funcionalidad del factor V y del factor VLeiden para la formación de trombina (Van 't Veer, C. et al. J. Biol. Chem. 272:20721-20729,1997). Se accede a la versión completa del trabajo en la dirección: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=9252393. La muestra de "plasma sintético" contenía las concentraciones normales de los factores de la coagulación. La reacción se desencadenó mediante activación de la vía extrínseca, con la adición de factor tisular. La composición de cada una de las muestras evaluadas fue la siguiente: Nº Factor V Factor VLeiden Proteína C Trombomod. Proteína S 1 + 2 + 3 + + + + 4 + + + 5 + + + + 6 + + +

Los resultados obtenidos se expresan en la figura siguiente

¿Puede afirmarse que el factor V y el factor VLeiden poseen similares cualidades procoagulantes, favoreciendo la formación de trombina? ¿Cuál es la mayor diferencia funcional entre el factor V y el factor VLeiden? ¿Cuál sería la diferencia a nivel molecular entre el factor V y el factor VLeiden, que pueda explicar el comportamiento observado? ¿Qué haría usted para demostrar lo que plantea al respecto? ¿En el artículo publicado por Van 't Veer, y cols. existe algún otro resultado que aporte información al respecto? 3.- Existen diferentes factores pueden aumentar el riesgo para el desarrollo de trombosis, pudiendo ser de base genética, medicamentosa o asociada a enfermedades. El conocimiento de los mismos es importante para prevenir el desarrollo de enfermedades. En la tabla a continuación, se muestra la influencia del uso de anticonceptivos orales y de la presencia del factor VLeiden sobre el riesgo para el desarrollo de trombosis venosas. Estado trombofílico Riesgo relativo de trombosis venosaNormal 1 Uso de anticonceptivos orales (ACO) 4 Factor VLeiden, heterocigoto 5-7 Factor VLeiden, heterocigoto + ACO 30-35 Factor VLeiden, homocigoto 80 Factor VLeiden, homocigoto + ACO >100 ¿Podría considerarse que la expresión del factor VLeiden constituye un factor de riesgo genético de trombosis? ¿Por qué? De acuerdo con lo expresado en la tabla, ¿cómo se debería actuar ante la identificación de una persona con dicha mutación? Ante la identificación de un individuo con riesgo trombogenético aumentado, ¿es posible que otras personas, integrantes de la misma familia, también tengan riesgo trombogenético aumentado? Teniendo en cuenta la información que se brinda en el esquema siguiente, sobre el sector del factor V en el que se localiza la mutación que da lugar a la formación del factor VLeiden, ¿cómo diseñaría un procedimiento de diagnóstico en vistas a la identificación de los individuos normales y de los mutados?

Alelo normal Alelo mutado

Sitio de corte con MnII Ausencia del sitio de corte con MnII

4.- La fibrinolisis es el mecanismo de control final que limita la formación del coágulo. El control de la misma es fundamental para mantener el balance hemostático. Por otra parte, algunos componentes de este sistema pueden ser utilizados en el tratamiento de algunas enfermedades. ¿Cuál es, en condiciones fisiológicas, el principal activador del sistema fibrinolítico? ¿Qué es lo que determina que su actividad tenga lugar fundamentalmente en el sitio de formación del coágulo? La α2-antiplasmina es el principal inhibidor fisiológico de la plasmina. ¿Qué factor determina que la unión α2-antiplasmina-plasmina sea rápida o lenta? ¿Qué otro tipo de factores pueden ser de relevancia en la inhibición de la fibrinolisis? ¿Cuál puede ser su función biológica? ¿Qué componente del sistema fibrinolítico puede ser de utilidad para el tratamiento de un infarto agudo de miocardio? ¿Por qué? ¿Cuál podría ser una limitante para su utilización? 5.- Las células endoteliales son activas protagonistas de todas las etapas de la hemostasis. A continuación se indican diversas sustancias presentes en las mismas. Comente sobre qué tipo de moléculas (o células) actúan y qué acciones biológicas determinan.

Sustancia Blanco molecular Efecto biológico Prostaciclina CD39 Trombomodulina Antitrombina tPA Factor de von Willebrand Inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1)

Heparina Óxido nítrico (NO)

Universidad de la República Facultad de Medicina Departamento de Bioquímica

Abril 2008 Estudio de la Hemoglobina:

Espectros de absorción de la hemoglobina y caracterización electroforética de distintas hemoglobinas

Introducción Hemoglobina El cuerpo humano contiene alrededor de 2.5 x 1013 eritrocitos, cada uno de los cuales posee en su interior 3 x 108 moléculas de hemoglobina, proteína encargada del transporte de oxígeno. La hemoglobina es un tetrámero (PM 64.000), compuesto por dos subunidades α y dos β, las cuales están enfrentadas entre sí en torno a una cavidad en el centro de la molécula. Cada subunidad contiene un grupo hemo, por lo cual la hemoglobina puede unir cuatro moléculas de oxígeno.

El grupo hemo consiste en un sistema anular tetrapirrólico plano (porfirina), que une mediante enlaces de coordinación, Fe2+. Existen seis ligandos que fijan el átomo de Fe2+ en su posición. Cuatro de estos ligandos son los átomos de nitrógeno del sistema tetrapirrólico, el quinto es un residuo de histidina de la porción proteica y el sexto sitio de coordinación del Fe 2+ está vacío en la desoxihemoglobina mientras que en la oxihemoglobina (OxiHb) está ocupado por una molécula de O2.

La Hb puede existir en distintos estados de oxidación. La oxidación de OxiHb da lugar a O2.-

y metahemoglobina (MetHb) en la cual el hierro del grupo hemo se encuentra como Fe3+. Si la estructura de la globina se desestabiliza, la metHb puede convertirse en hemicromo, en el cual un ligando externo ocupa la sexta posición de coordinación del hemo férrico. Los hemicromos precipitan rápidamente. Si la hemoglobina se desnaturaliza y la porfirina se hidroxila o se rompe entonces la proteína recibe el nombre de coleglobina. Los estados de oxidación de la hemoglobina pueden distinguirse por sus diferencias en los espectros de absorción en el rango entre 500 y 700 nm, presentando también diferencias en torno a los 400 nm donde presentan el pico de absorción denominado Banda de Soret común a todas las proteínas con grupo hemo. La coleglobina practicamente no absorbe en este rango.

La tabla presenta coeficientes de extinción molecular de la hemoglobina en sus distintas formas:

Coeficiente de extinción (ε) (mM-1cm-1) Derivado Longitud de onda (nm)

560 577 630 Oxihemoglobina 8.6 15 0.17

Metahemoglobina 4.3 4.45 3.63 Hemicromo 8.6 6.8 0.92

Las cadenas polipeptídicas de la globina de la hemoglobina se encuentran plegadas formando un bolsillo hidrofóbico dentro del cual se ubica el hemo. Se plantea que el entorno del hemo evita que el Fe2+ se oxide, perdiendo la capacidad de unirse al oxígeno. Por esto la estructura nativa de la proteína es fundamental para su función y el tratamiento de ésta con agentes desnaturalizantes afecta su función.

Espectrofotometría La cantidad de luz absorbida por la sustancia depende del número de moléculas interpuestas en el trayecto del haz, de la naturaleza de la sustancia en solución y de la longitud de onda (λ) de la luz monocromática empleada. Así para una misma sustancia y para una misma longitud de onda la cantidad de luz absorbida depende de la concentración de la sustancia en solución y del espesor de la masa de solución interpuesta (l). Se define transmitancia (T) a la relación: T= I/Io Fig 1 Io I I l La ecuación que relaciona la transmitancia con la concentración del soluto (c) y con el espesor de la masa de solución interpuesta (l) se conoce con el nombre de Ley de Lambert y Beer:

T= 10-ε.c.l

ε: coeficiente de extinción molecular, depende de la naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda del haz incidente. c: es la concentración molar del soluto l: es el espesor de la masa de solución interpuesta expresada en cm. Se define absorbancia (A) o densidad óptica (D.O) al cologaritmo de la transmitancia:

A= - log T A= ε.c.l

Las medidas de transmitancia se expresan como porcentaje y las de absorbancia en unidades de absorbancia (U.A). Espectro de absorción: Como ya mencionamos la absorbancia de una sustancia depende de la longitud de onda. El gráfico de la absorbancia de una sustancia en función de la longitud de onda constituye el espectro de absorción de esa sustancia. Electroforesis La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; las partículas migran hacia el polo – o + (cátodo o ánodo, respectivamente), en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. La electroforésis es un método fundamental para separar proteínas que se basa en la migración diferencial de las proteínas en un campo eléctrico. La movilidad electroforética de una proteína (µ) en un campo eléctrico constante, depende de la siguiente relación:

fq

Evµ ==

Donde E corresponde al potencial eléctrico, v la velocidad de la partícula, q la carga eléctrica neta y f un coeficiente de fricción. En el caso de las proteínas esta relación es más compleja que expresado en la ecuación anterior, pero señala un aspecto importante que es la dependencia de la movilidad electroforética con el pH del medio y con el pI de la proteína. Esta técnica fue desarrollada inicialmente en 1937 por Arne Tiselius y originariamente se desenvolvía enteramente en solución. Fue sustituida por la llamada electroforesis de zona donde la muestra proteica se siembra sobre un soporte sólido que esta impregnado con una solución amortiguadora. Los soportes son polímeros porosos (como papel de filtro, acetato de celulosa, agarosa) que restringen el movimiento de la proteína y la muestra proteica forma una banda o zona. La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS) (PAGE-SDS) es el método más utilizado para separar proteínas. La poliacrilamida es un soporte formado por la polimerización de la arcrilamida con la N, N´metilenbisacrilamida, es químicamente inerte, de propiedades uniformes. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro. El SDS desnaturaliza la estructura secundaria y terciaria de las proteínas y se une en una relación relativamente constante a la proteína (1.4 g de SDS por g de proteína o una molécula de SDS cada dos aminoácidos). La gran carga negativa del SDS apantalla la carga de la proteína y genera una relación masa carga eléctrica homogénea. Como consecuencia las proteínas se separan de acuerdo a sus masas moleculares en el poro que genera la poliacrilamida. [CH3-(CH2)10-CH2-O-SO3

-]Na+ SDS Procedimiento Experimental.

1- Espectros de Absorción de la Hb Utilizando el espectrofotómetro Kontron se realizarán espectros de distintas preparaciones de Hb Espectro de la oxi-hemoglobina

1- A partir de una solución stock de Hb realizar dos diluciones: una dilución para llegar a una concentración final de 20 µM y otra dilución para llegar a un concentración de Hb 8 µM, ambas en amortiguador de fosfato 10 mM pH 7.4. 2- Realicé espectros de absorción en el rango 400-700 nm de ambas diluciones (20 y 8 µM) de Hb.

3- Guarde los espectros obtenidos en un disco y anote los principales picos de absorbancia observados, así como los valores de absorbancia alcanzados en ambas diluciones.

Espectro de la desoxi-hemoglobina

4- Realicé un nuevo espectro de absorción a la muestra de 20 µM de Hb preparada en el punto 1 en el rango de 500 a 700 nm. 5- Agregue una pequeña cantidad de granitos o una punta de espátula de ditionito de sodio (Na2S2O4) sólido (aprox. 10 mg), se mezcla una vez y se realiza otro espectro de absorción superpuesto al espectro anterior sin Na2S2O4. 6- Burbujee aire dentro de la cubeta de la muestra 5 por medio de una pipeta Pasteur, espere unos 3 min y vuelva a correr un espectro. Guarde los espectros obtenidos en un disco.

Espectro de la meta-hemoglobina.

7- Prepare una nueva dilución de Hb 20 µM en amortiguador de fosfato y realicé un espectro de absorción. 8- Agregue nitrito de sodio (NO2

-) para alcanzar una concentración de 1.2 mM y. registre la absorbancia en el rango 500-700 nm tomando espectros cada 1 min durante 5 min. Guarde los espectros obtenidos en un disco.

2- Caracterización electroforética de la Hb y plasma humano. Se realizará una electroforesis de zona utilizando como soporte acetato de celulosa.

1- Buffer de corrida es TBE (Tris-borato-edta pH 8.9) en el caso de Hb y amortiguador de veronal (dietilbarbiturato 40 mM pH 10) para las proteínas plasmáticas. 2- Las tiras de acetato de celulosa están sumergidas en metanol al 40%, se deben colocar en el buffer de corrida 15 min antes de la misma. 3- Secar bien las tiras de acetato de celulosa con papel de filtro antes de montarlas en la cuba. 4- Montar las tiras de acetato de celulosa en la cuba de electroforesis con la superficie absorbente hacia arriba (cara mate no brillante) y con los extremos tocando las soluciones de buffer de corrida o a través de conectores hechos con papel de filtro impregnados en mismo amortiguador de corrida. (Cada tira tendrá un corte diagonal de referencia que debe estar ubicado hacia el ángulo inferior derecho). 5- Sembrar las muestras a 2 cm del polo negativo (cátodo). 6- Cerrar la cuba de electroforesis en forma hermética. 7- Correr las muestras a 200 volt por 45 min para la Hb y 30 min para las proteínas plasmáticas. 8- Una vez finalizada la corrida sumergir la tiras de acetato de celulosa en una solución de Rojo Ponceau (0.5 % de rojo Ponceau en 5% de tricloroacético) durante 5-10 minutos, para eliminar el background colocar las tiras en agua.

TBE pH=8,9 10.2 g de Tris, 0.6 g de EDTA y 3,2 g de acido borico. Agregar 800ml de agua y llevar a ph 8.9 . completar a 1000ml. Se muestra las mismas muestras corridas en un gel desnaturalizante de SDS-PAGE.

Problemas La concentración de las distintas formas de Hb en una solución que contiene una mezcla de ellas se puede calcular midiendo la absorbancia de la solución a más de una longitud de onda. En el

caso de una solución formada solamente por una mezcla de OxiHb y MetHb, las concentraciones están dadas por las siguientes ecuaciones, determinadas a partir de los ε: [OxiHb] (µM) = 66 A577 – 80 A630 [MetHb] (µM) = 279 A630 – 3 A577

donde [OxiHb] y [MetHb] representan en realidad la concentración de grupos hemo y no la de hemoglobina. (Recordar que cada molécula de Hb posee 4 cadenas proteicas, cada una de las cuales contiene un grupo hemo). a- Calcule la concentración de Oxi- y de meta-hemoglobina presente en muestra. b- Calcule que porcentaje de hemoglobina total se encuentra como Oxi-hemoglobina. c- Analice las distintas bandas que se observan en la electroforésis de acetato de celulosa. ¿Qué se

puede intuir en relación a los pI de las diferentes muestras sembradas? d- Comparé las mismas muestras en la corrida hecha en clase y la corrida del gel desnaturalizante de

poliacrilamida (SDS-PAGE). e- Identifique las distintas fracciones del proteinograma electroforético de las proteínas plasmáticas

y compare con el gel con SDS-PAGE.