MOKSLINIŲ TYRIMŲ IR TAIKOMOSIOS VEIKLOS PROGRAMOS · 4 1. Įvadas Lietuvai integruojantis į ES, Rusijos ir kitų šalių rinką, būtina nuolat gerinti pieno produktų kokybę,

KAUNO TECHNOLOGIJOS UNIVERSITETO MAISTO INSTITUTAS

TVIRTINU: ………………………

KTU Maisto instituto direktorius

Antanas Šarkinas

2013 m. lapkričio mėn. 11 d.

MOKSLINIŲ TYRIMŲ IR TAIKOMOSIOS VEIKLOS PROGRAMOS „MAISTO KOKYBĖ IR SAUGA“

Taikomojo tyrimo Nr. MT/13-19

METODIKOS INHIBITORINIŲ MEDŽIAGŲ NUSTATYMUI ŽALIAME PIENE

MODIFIKUOTAIS MIKROBIOLOGINIAIS LPT IR LPT2 TESTAIS PARENGIMAS

2013 M. GALUTINĖ ATASKAITA

Darbo vadovė

Joana Šalomskienė

Kaunas

2013

2

VYKDYTOJŲ SĄRAŠAS

Valė Marytė Navikienė, KTU Maisto

instituto Mikrobiologijos mokslo

laboratorijos inžinierė

Preparato terpių ruošimas

Zita Rekštienė, KTU Maisto instituto

Mikrobiologijos mokslo laboratorijos

inžinierė

Kultūrų ruošimas tyrimams

Joana Šalomskienė, KTU Maisto instituto

Mikrobiologijos mokslo laboratorijos

vedėja, vyresnioji mokslo darbuotoja,

habilituota daktarė

Vadovavimas darbui, tyrimų organizavimas,

ataskaitos rengimas ir redagavimas, straipsnio

redagavimas

Renata Žvirdauskienė, KTU Maisto

instituto mikrobiologijos mokslo

laboratorijos jaunesnioji mokslo

darbuotoja, daktarė

Tyrimų atlikimas, dalyvavimas rengiant ataskaitą,

straipsnio rengimas

3

Turinys

1. Įvadas ............................................................................................................................................. 4

2. Literatūros apžvalga ....................................................................................................................... 5

3. Tyrimų objektai ir metodai ............................................................................................................ 7

3.1. Difuzijos į agarą (įdubų) metodas ........................................................................................... 8

3.2. Sporų suspensijos gamyba ...................................................................................................... 9

3.3. Preparatų gamyba .................................................................................................................. 10

3.3.1. Terpės ruošimas.................................................................................................................. 10

3.3.2. Preparatų vartojimo būdas .................................................................................................. 11

3.3.3. Preparatų jautrumo tikrinimas ............................................................................................ 11

3.4. Matematinės statistikos metodai ........................................................................................... 11

4. Tyrimų rezultatai .......................................................................................................................... 13

4.1. Preparatų terpės modifikavimas ............................................................................................ 13

4.1.1. Geobacillus stearothermophilus sporų sudygimo stimuliatorių atranka............................ 13

4.2. Geobacillus stearothermophilus kultūrų DSM 6790 ir ATCC 10149 jautrumo tyrimai ...... 18

4.2.1. Preparatų, pagamintų su Geobacillus stearothermophilus DSM 6790 ir ATCC 10149

kultūromis, tyrimai ....................................................................................................................... 18

4.2.2. Tirpaus krakmolo priedu papildytų preparatų, pagamintų su Geobacillus

stearothermophilus DSM 6790 ir ATCC 10149 kultūromis tyrimai ........................................... 19

4.3. LPT ir LPT2 testų modifikavimas ........................................................................................ 25

4.4. Projekto rezultatų sklaida ...................................................................................................... 42

5. Išvados ir rekomendacijos ............................................................................................................ 43

5.1. Išvados .................................................................................................................................. 43

5.2. Rekomendacijos .................................................................................................................... 44

6. Literatūra ...................................................................................................................................... 45

PRIEDAI .......................................................................................................................................... 47

1 PRIEDAS. Mikrobiologinių metodų inhibitorinių medžiagų nustatymui aptikimo ribos ............ 48

2 PRIEDAS. Tyrimų planas ............................................................................................................. 49

3 PRIEDAS. Straipsnio projektas................................................................................................... 50

4 PRIEDAS. Inhibitorių likučių nustatymas piene modifikuotais LPT ir LPT2 testais .................. 66

4

1. Įvadas

Lietuvai integruojantis į ES, Rusijos ir kitų šalių rinką, būtina nuolat gerinti pieno produktų

kokybę, o tuo pačiu – griežtinti reikalavimus žaliavai. Didžiausius leistinus farmakologiškai aktyvių

medžiagų likučių kiekius (DLK) gyvūniniuose maisto produktuose nustato Europos Parlamento ir

Tarybos Reglamentas (EB) Nr. 470/2009, pakeitęs prieš tai galiojusį EEB Reglamentą 2377/90.

Inhibitorių likučių kontrolė turi apsaugoti vartotojus nuo kenksmingo šių medžiagų poveikio.

Kaip rūšiavimo metodai, pieno pramonėje dažniausiai taikomi mikrobiologiniai antibiotikų ir

inhibitorių nustatymo metodai, kurių esmę sudaro aerobinių sporinių bakterijų metabolizmo reakcijų

slopinimas. Stabdomas tikslinių bakterijų kultūrų augimas, sulėtėja ar sustoja rūgšties gamyba ir kartu

pakinta dažų, pridėtų į terpę, spalva. Mikrobiologiniai antibakterinių medžiagų likučių nustatymo

metodai skirti plačiam medžiagų spektrui, todėl be β-laktaminį žiedą turinčių antibiotikų jais galima

nustatyti ir kitas medžiagas. Mikrobiologiniai metodai plačiai naudojami, kadangi jais galima aptikti

daugelio antimikrobinių medžiagų likučius, metodų jautrumas atitinka ES reikalavimus, be to, jie

nebrangūs, lyginant su chromatografiniais ir imuninio arba receptorių tyrimo metodais.

Chromatografiniai metodai paprastai naudojami kaip patvirtinimo metodai, kuriais galima identifikuoti

antimikrobinių medžiagų likučius. Spartieji (fermentiniai bei imuninio arba receptorių tyrimo) metodai

paprastai skirti vienam arba dviems antibiotikams ar jų grupei nustatyti ir naudojami pieno supirkimo

metu. Nors dažniausiai veterinarijos praktikoje yra naudojamos β-laktaminės grupės antibakterinės

medžiagos, gali būti aptinkami taip pat sulfonamidai, tetraciklinai ir kiti antibiotikai.

2010 m. Lietuvos standartizacijos departamentas išleido pamatinį standartinį metodą su

Bacillus stearothermophilus var. calidolactis ATCC 10149 (identiškos NIZO padermei C953) kultūros

sporomis1. VĮ „Pieno tyrimai” pagal šį standartą gamina testus LPT ir LPT2 žalio pieno tyrimams

atsiskaitymo su pieno gamintojais tikslams. LPT ir LPT2 testai yra mikroplokštelių pavidalo.

Naudojant vietoje mėgintuvėlių, nurodytų standarte, mikroplokšteles, atitinkamomis proporcijomis

sumažintas dozuojamos terpės bei pieno mėginio kiekis. Šių testų galiojimo trukmė yra 3 paros 0-5 ºC

temperatūroje su sąlyga, kad mėgintuvėliai bus uždengti (pvz., Parafilm lipnia juosta), kad būtų

išvengta garavimo.

Darbo tikslas – prailginti testų LPT ir LPT2, skirtų inhibitorinėms medžiagoms piene

nustatyti, galiojimo trukmę 3-27 dienomis, parengiant modifikuotų LPT ir LPT2 testų metodiką.

Darbo uždaviniai:

1. Palyginti Geobacillus stearothermophilus dviejų kultūrų (pamatinės kultūros DSM 6790, įsigytos iš

DSMZ (Vokietijos mikroorganizmų kolekcijos), ir ATCC 10149, įsigytos iš Centrinės pieno tyrimų

1 LST ISO/TS 26844:2010 Pienas ir pieno produktai. Antimikrobinių medžiagų likučių nustatymas. Difuzijos

mėgintuvėliuose metodas (tapatus ISO/TS 26844:2006)

5

stoties, Nyderlandai) jautrumą inhibitorinėms medžiagoms modifikuotoje terpėje (terpės sudėtis bus

papildyta nauju komponentais, skatinančiais sporų sudygimą);

2. Atlikti LPT ir LPT2 testų ir modifikuotų LPT ir LPT2 testų palyginamąjį įvertinimą;

3. Nustatyti modifikuotų testų galiojimo trukmę;

4. Parengti metodiką inhibitorinių medžiagų nustatymui žaliame karvių piene modifikuotais LPT ir

LPT2 testais.

2. Literatūros apžvalga

Mikrobiologiniuose metoduose antimikrobinėms medžiagoms nustatyti dažniausiai

naudojamos bakterijų kultūros yra Geobacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Streptococcus

thermophilus [15; 17] ir Kocuria rhizophila (anksčiau žinama kaip Micrococcus luteus) [39]. Jautrių

kultūrų padermės įsigyjamos iš oficialių kultūrų kolekcijų, kad būtų garantuotas jų jautrumas

antimikrobinėms medžiagoms, kuris turėtų nekisti dėl daugkartinio persodinimo laboratorinėmis

sąlygomis. Tyrimams reikalinga G. stearothermophilus, B. subtilis ar Bacillus cereus sporų suspensija

gaunama šias kultūras auginant, persodinant, plaunant, centrifuguojant ir kaitinant (paprastai 70 C

temperatūroje 30 min) [37; 38]. Taip paruošta sporų suspensija gali būti ilgai naudojama, kultūrų

nereikia dažnai persodinti ir atnaujinti.

Metodai, kurių veikimo principai pagrįsti šiomis kultūromis, yra naudojami daugelio pasaulio

šalių oficialiose kontrolės laboratorijose. Jais galima aptikti įvairių rūšių antibiotikus (β-laktaminius

antibiotikus, tetraciklinus, aminoglikozidus, makrolidus) ir sulfonamidus [4]. Šios jautrios bakterijų

kultūros naudojamos taip vadinamuose kokybiniuose metoduose, kurie duoda atsakymą, ar yra

tiriamoje medžiagoje antimikrobinių medžiagų. Terpės pH dažniausiai svyruoja tarp 7 8.

Mikrobiologinių metodų antimikrobinėms medžiagoms nustatyti jautrumui įtakos turi tokie

veiksniai: bakterijų kultūros jautrumas inhibuojančioms medžiagoms, sporų susidarymas bei sporų

augimo intensyvumas, jautrios kultūros kiekis terpėje. Ne mažiau svarbūs veiksniai yra ir mėginio

paruošimas tyrimui, naudojamų terpių savybės, nes atskirų antibiotikų išskyrimui naudojamos

skirtingų pH terpės [2; 11; 14].

Kiekybiniuose mikrobiologiniuose metoduose jautri kultūra ir terpės pH parenkami

atsižvelgiant į tyrimo tikslą. Tiriant penicilino likučius, optimalia kultūra laikoma

G. stearothermophilus ir mažesnio rūgštingumo terpė, kurios pH 8,0, tetraciklino B. cereus ir terpė,

kurios pH 5,7 5,9, aminoglikozidus – B. subtilis ir terpė, kurios pH 8,0 [5; 6; 27; 30; 31]. Tinkamas

terpės pH parinkimas sudaro galimybę geresniam antibiotiko difundavimui iš tiriamos medžiagos [3].

Svarbu ne tik parinkti jautrią kultūrą, bet ir nustatyti tinkamą tos kultūros kiekį terpėje.

Paprastai jis svyruoja nuo 104

iki 106 KSV/ml terpės. Priimta, kad norint gauti didesnį testo jautrumą,

būtina parinkti mažiausią optimalią jautrios kultūros koncentraciją terpėje [32; 33]. Testo jautrumas

6

sumažėja, kai sporų koncentracija per maža, nes tuomet neužtikrinamas reikiamas kultūros augimas

duotu laiko momentu, ir per didelė, nes tuomet pastebimas per didelis bakterijų augimas ir augimo

sustabdymo zonos tampa neaiškiomis [9].

Sporas sudarančioms bakterijoms sporų susidarymas natūralus fiziologinis procesas, tačiau

jis nėra būtinas gyvybės ciklo etapas. Esant palankioms mitybos sąlygoms, šios bakterijos gali ilgai

vystytis, nesudarydamos sporų. Sporų susidarymui optimali temperatūra ir pH tokie pat, kaip ir

bakterijų vystymuisi. Daug kartų pastebėta, kad daugelis organinių medžiagų ir mineralinių jonų

sustiprina sporų susidarymą [13].

Sporos yra žymiai atsparesnės už vegetatyvines ląsteles aukštai temperatūrai, spinduliuotei,

įvairioms cheminėms medžiagoms, išdžiūvimui [37].

Kad sporų susidarymo procesas vyktų tinkamai, reikia užtikrinti normalų vegetatyvinį kultūros

augimą. Po to, kai prasideda sporų susidarymas, sąlygas galima pakeisti sporų susidarymas gali vykti

ir ant skurdesnių mitybos terpių. Manoma, kad vieno mitybos terpės komponento išeikvojimas kaip tik

ir yra tas variklis arba signalas, kuris pastūmėja kultūrą pereiti prie sporų sudarymo. Vienai ir tai pačiai

kultūrai tokiu signalu gali būti deguonies, azoto šaltinio išsekimas, aeracijos sąlygos [23].

Sporų išaugimu vadinamas jos virtimas vegetatyvine ląstele, šios ląstelės branduolio

medžiagos morfologiniai, o vėliau – biocheminiai pokyčiai [23]. Būtina to sąlyga – reikiamas drėgmės

kiekis, kai sporos sugeria vandenį ir išbrinksta. Visų pirma, susidaro dengiamieji sluoksniai:

peptidoglikano (korteksas arba sporos žievė) ir kiti sporos sluoksniai (sudaryti tik iš sporai unikalių

baltymų), kurių skaičius, storis ir sandara skirtingi įvairiose bakterijose [37].

Žinoma, kad sporų sudygimą skatina daugelis veiksnių: pH, temperatūra, terminis apdorojimas,

sporų koncentracija ir terpės sudėtis [29]. Kaip vyksta skatinimo procesas, nėra aišku, tik žinoma, kad

kai kurioms bakterijų rūšims šis procesas yra grįžtamas. Vienu iš charakteringų procesų, lydinčių

sporų susidarymą, yra piridino-2,6-dikarbolinės rūgšties (dipikolinė rūgštis, angl. DPA) [37] ir kalcio

jonų susikaupimas jose ekvimoliariniais kiekiais.

Bakterijų sporoms augimo procesas susideda iš kelių etapų: aktyvavimo, inicijavimo ir

išaugimo. Bendras aktyvavimo faktorius terminis sporų suspensijos apdorojimas. Įvairūs autoriai

siūlo skirtingus terminio apdorojimo režimus: 65-85 C be išlaikymo [25], 80 C per 10 min [20],

115 C per 1 s [19]. Suteikus sporoms atitinkamą stimulą, jos sudygsta ir suaktyvėja jų metabolinės

reakcijos. Tada sporų populiacijoje sudygimas yra inicijuojamas žymiai greičiau. Sporų sudygimo

aktyvacija įvairioms bakterijų rūšims šiek tiek skiriasi [37]. Sporos suaktyvinimas įvyksta tada, kai ji

gauna atitinkamą cheminį signalą. Tam tikros sporogeniškųjų bakterijų rūšys turi specialius

receptorius, kurie praneša apie aplinkoje esančius energijos šaltinius: L-alaniną, adenoziną ir kt. Jungtį

su aktyvatoriais aktyvina sporoje esantis autolizinas, pvz., lizocimas, kuris greitai suardo kortekso

peptidoglikaną [23].

7

Po aktyvavimo sporos įgyja gebėjimą sudygti. Sporų sudygimo skatinimas daugeliui rūšių gali

būti sukeltas, panaudojus tam tikrus junginius, pvz., nukleozidus, amino rūgštis, cukrus, druskas,

dipikolinę rūgštį ir ilgų grandinių alkilaminus. Kai kurių bakterijų rūšių sporos sudygti gali būti

skatinamos neorganinėmis druskomis – mangano, geležies, magnio. Tikslus mechanizmas, kodėl šie

junginiai skatina sporų sudygimą, nėra aiškus [37]. Efektyviausi sporų sudygimo stimuliatoriai –

angliavandeniai, amino rūgštys ir neorganiniai jonai. Iš angliavandenių sporų išaugimui būtiniausia

gliukozė. Tikslus angliavandenių poveikio mechanizmas iki šio laiko nėra tiksliai nustatytas, neaiškus

ir dabar. Angliavandenių priedai 0,0083 mol/l fosfatiniame buferyje (pH 7,1) stimuliuoja Bacillus

stearothermophilus NCA 1518 sporų sudygimą: monosacharidai – 0,001 mol/l ir 0,1 mol/l gliukozės,

0,01 mol/l fruktozės koncentracija; disacharidai – 0,1 mol/l sacharozės koncentracija; polisacharidai –

2 % dekstrino ir 2 % krakmolo koncentracija [12]. Kaip vienas iš būdų aktyvuoti

G. stearothermophilus sporų sudygimą gali būti jų inkubavimas 0,2 M natrio nitrito tirpale (pH 8,0)

30 ºC temperatūroje 17 h [40]. Sporų aktyvavimo nitritais mechanizmas niekada nebuvo tirtas detaliai,

tačiau manoma, kad jis susijęs su sporų kortekso kovalentine modifikacija dėl azoto rūgšties poveikio

[Ando Y. (1980)]. Teigiama tirpaus krakmolo įtaka nustatyta ir anksčiau [26].

Termofilinių bakterijų sporų sudygimui reikalingas kritinis kalcio dipikolinato kiekis. Intensyvus

G. stearothermophilus sporų susidarymas pastebimas pridedant į mitybos terpę 0,1 K, Na nitratų [23].

Reikiamu momentu panaudojant vieną ar keletą galimų sporų sudygimo stimuliatorių ir suderinus

kitus veiksnius – optimalią temperatūrą, terpės pH ir kt., galima tikėtis ne tik padidinti preparato inhibitorių

piene nustatymui jautrumą vienai ar kitai antibiotikų grupei, sutrumpinti tyrimo laiką, bet ir prailginti

preparatų vartojimo trukmę. Preparatų vartojimo trukmės prailginimas šiuo metu yra aktuali problema,

kadangi LPT ir LPT2 galiojimo trukmė yra 3 paros, laikant juos nuo 0 ºC iki +5 ºC temperatūroje.

3. Tyrimų objektai ir metodai

Tyrimų objektai – dvi Geobacillus stearothermophilus kultūros (DSM 6790 ir ATCC 10149),

LPT ir LPT2 testai.

Testams gaminti naudotos jautrios antibiotikams Geobacillus stearothermophilus kultūros:

pamatinė kultūra DSM 6790, įsigyta iš DSMZ (Vokietijos mikroorganizmų kolekcijos) mėgintuvėlyje

ant nuožulniai sustingdinto agaro, ir ATCC 10149, įsigyta iš Centrinės pieno tyrimų stoties

(Nyderlandai), sporų suspensijos, užšaldytos minus 20 C temperatūroje, pavidale.

Tyrimų metu naudoti antibiotikų standartiniai tirpalai: penicilino (penicillin G potasium salt),

sulfametazino, sulfadiazino, neomicino (neomycin sulfate), eritromicino, oksitetraciklino

(oxytetracycline dihidrate) - ICN Biomedicals Inc. (Ohio, JAV), dapsono (4-aminophenyl sulfone) –

Sigma Aldrich Chemie Gmbh. (Vokietija).

8

Standartiniai antibiotikų tirpalai buvo ruošiami: pirmieji skiediniai – steriliame vandenyje, pora

paskutiniųjų skiedinių – piene be inhibitorių. Kadangi ne visi antibiotikai tirpūs vandenyje, dapsonas,

sulfametazinas ir eritromicinas tirpinti 96 etanolyje, oksitetraciklinas – 0,1 mol/l druskos rūgštyje

(HCl), neomicinas – fosfatiniame buferiniame tirpale.

Visų tyrimų metu naudota neigiama kontrolė – pienas be inhibitorių.

Sporų sudygimo stimuliatorių atrankos tyrime naudoti angliavandeniai - laktozė, krakmolas,

sacharozė, maltozė, gliukozė; neorganinės druskos – Na3PO4×12H2O, MgSO4, ZnSO4, MnSO4,

KH2PO4, K2HPO4, CoCl2, NaCl, CaCl2, K2SO4, KCl, NaHCO3, CuSO4×5H2O, CoSO4, FeSO4,

NaNO2, MnSO4; amino rūgštys: DL-alaninas, L-alaninas, L-argininas, cisteinas; lizocimas;

adenozinas.

Preparatų terpės ruošimui naudoti: trimetoprimas Sigma Aldrich Chemie Gmbh. (Vokietija),

chloramfenikolis Oxoid ltd. (Anglija), bromkrezolis Merck (JAV). Modifikuojant terpę, jos sudėčiai

papildyti naudoti atrinkti sporų sudygimo stimuliatoriai: angliavandeniai (tirpus krakmolas, sacharozė,

papildomas gliukozės kiekis), amino rūgštis L-alaninas, natrio nitritas.

Naudotos mitybos terpės:

Mitybos agaras („Plate count agar“ – PCA), kurios sudėtis: kazeino triptonas 5,0 g; mielių

ekstraktas 2,5 g; bevandenė gliukozė 1,0 g; agaras 10-15 g; vanduo 1000 ml.

Sporuliacijos terpė, kurios sudėtis: mielių ekstraktas 2,0 g; peptonas 5,0 g; mėsos ekstraktas

1,0 g; natrio chloridas (NaCl) 5,0 g; mangano sulfatas (MnSO4H2O) 35 mg; agaras 15 g; distiliuotas

vanduo 1000 ml.

3.1. Difuzijos į agarą (įdubų) metodas

Nustatant darbinės kultūros jautrumą antibiotikams difuzijos į agarą (įdubų) metodu, sporų

suspensija su atitinkamu ląstelių skaičiumi pilama į ištirpintą ir atvėsintą iki 45 ºC temperatūros

mitybos agarą (PCA). Terpės ir jautrios kultūros mišinys išpilstomas į 90 mm skersmens lėkšteles po

10 ml. Terpei leidžiama sustingti ant horizontalaus paviršiaus. Po to specialiu prietaisu agare

išpjaunamos apvalios 7,5 mm skersmens įdubos. Į kiekvieną padarytą įdubą sulašinama po 0,05 ml

paruoštų standartinių antibiotikų tirpalų. Lėkštelės inkubuojamos 24 h (63±1) C temperatūroje ir tada

vertinami rezultatai [28].

3.1 pav. Atsparumo antibiotikams įvertinimas difuzijos į agarą (įdubų) metodu

9

Bakterijos auga lėkštelėje, o aplink įdubą susidaro jautrios bakterijų kultūros augimo slopinimo

zonos, aiškiai matomos išaugusių sporų fone. Iš skaidrios zonos dydžio sprendžiama apie bakterijų

jautrumą atitinkamam antibiotikui [28]. Augimo slopinimo zonos plotis matuojamas slankmačiu.

Matuojamos slopinimo zonos skersmuo turi eiti per įdubos centrą. Pamatavus visą skersmenį bei

žinant duobutės skersmenį, slopinimo zonos plotis apskaičiuojamas pagal formulę:

2

dDH

čia: H – slopinimo zonos plotis, mm;

D – bendras sterilios zonos ir skritulio skersmuo, mm;

d – įdubos skersmuo, mm.

Yra tam tikra priklausomybė tarp slopinimo zonos pločio ir bakterijų jautrumo antibiotikams

(3.2.1 lent.) [21], pagal kurią vertinami gauti rezultatai.

3.1 lentelė. Bakterijų jautrumo antibiotikams laipsnio įvertinimas pagal augimo slopinimo zonos plotį

Bakterijų jautrumo laipsnis antibiotikams Augimo slopinimo zonos plotis, mm

Labai jautrūs >10

Jautrūs Nuo 5 iki 10

Mažai jautrūs Nuo 4 iki 5

Atsparūs < 4

3.2. Sporų suspensijos gamyba

Sporų suspensija ruošta remiantis LST ISO/TS 26844:20102 B priede aprašyta metodika.

Gauta kultūra persėjama kilpele ant nuožulniai sustingdinto mitybos agaro ir inkubuojama 48 h

(631) C temperatūroje aerobinėmis sąlygomis. Po inkubacijos į mėgintuvėlį su šviežia kultūra ant

nuožulniai sustingdinto agaro įpilama 5 ml distiliuoto vandens ir kultūra nuplaunama. Gauta sporų

suspensija nupilama į kitą mėgintuvėlį. 0,5 ml sporų suspensijos pipete įpilama į Petri lėkštelę su

sporuliacijos terpe ir lygiai išskirstoma stikliniu glaistikliu. Po inkubavimo 72 h (631) C

temperatūroje į kiekvieną Petri lėkštelę įpilama fiziologinio druskos tirpalo ir kultūra, traukiant

glaistiklį per terpės paviršių, sumaišoma su fiziologiniu tirpalu ir supilama į sterilų buteliuką. Tokiu

būdu sporų suspensija surenkama nuo visų lėkštelių. Buteliukas uždaromas ir stipriai supurtomas.

Sporų suspensija du kartus po 5 min. centrifuguojama 2000 g greičiu, praplaunant fiziologiniu druskos

tirpalu. Gauta sporų suspensija 10 min kaitinama 80 oC temperatūroje vandens vonelėje ir atvėsinama.

2 LST ISO/TS 26844:2010 Pienas ir pieno produktai. Antimikrobinių medžiagų likučių nustatymas. Difuzijos

mėgintuvėliuose metodas (tapatus ISO/TS 26844:2006)

10

Sporų suspensijos koncentracija nustatoma taip, kad būtų apytikriai 5,0x106 KSV/ml, nustatant PCA

terpėje po inkubavimo nuo 18 h iki 24 h (63±1) o

C temperatūroje. Sporų suspensija išpilstoma mažais

kiekiais ir laikoma žemesnėje kaip -20 C temperatūroje ne ilgiau kaip metus. Prieš naudojant sporų

suspensija atšildoma 20 C temperatūroje vandens vonelėje.

3.3. Preparatų gamyba

3.3.1. Terpės ruošimas

Mitybos terpė preparatų plokštelių ir kiuvečių užpildymui gaminta pagal LST ISO/TS

26844:2010 reikalavimus.

pH 7 terpės ruošimas. 23,5 g terpės bendram mikroorganizmų skaičiui nustatyti (PCA, Difco 0479)

ištirpinama 1000 ml distiliuoto vandens. Į terpę, laikomą (65±1) °C vandens vonelėje, įpilama 20 ml

bromkrezolio purpurinio (2,5 mg/ml) tirpalo ir 15 ml chloramfenikolio (0,2 mg/ml) tirpalo. Terpės

turinys gerai išmaišomas ir 2 N NaOH tirplu paderinamas terpės pH iki 7,0. Terpė atvėsinama iki

50 °C temperatūros ir, laikant terpę 50 °C temperatūros vandens vonelėje, įpilama 20 ml sporų

suspensijos. Tokia terpė išpilstoma į plokšteles po 165 l arba į kiuvetes po 300 l, gaunamas

preparatas pH 7,0 (testas LPT2).


ištirpinama 1000 ml distiliuoto vandens. Į terpę, laikomą (65±1) °C vandens vonelėje, įpilama 20 ml

bromkrezolio purpurinio (2,5 mg/ml) tirpalo ir 6 ml trimetoprimo (25 g/ml) tirpalo. Terpės turinys

gerai išmaišomas ir 2 N NaOH tirplu paderinamas terpės pH iki 8. Terpė atvėsinama iki 50 °C

temperatūros ir, laikant terpę 50 °C temperatūros vandens vonelėje, įpilama 20 ml sporų suspensijos.

Tokia terpė išpilstoma į plokšteles po 165 l arba į kiuvetes po 300 l, gaunamas preparatas pH 8

(testas LPT).

Testai LPT ir LPT2 gaminti pagal LST ISO/TS 26844:2010 reikalavimus, modifikuoti testai

LPTm ir LPT2m testai gaminti, papildant standartinės sudėties preparatų terpę įvairiais priedais ir

modifikuojant terpės gamybos sąlygas. Kontroliniai ir modifikuoti testai, priklausomai nuo išpilstymo

būdo, žymėti taip:

1) kontrolinių testų su terpės pH 8 plokštelių ir kiuvečių žymenys buvo atitinkamai LPT-P ir

LPT-K, o su pH 7 – LPT2-P ir LPT2-K;

2) bandomųjų (modifikuotų) testų su terpės pH 8 plokštelių ir kiuvečių žymenys buvo

atitinkamai LPTm-P ir LPTm-K, o su pH 7 – LPT2m-P ir LPT2m-K.

11

3.3.2. Preparatų vartojimo būdas

Į kiekvieną plokštelės duobutę dozuota po 50 µl kontrolinio ar tiriamojo pieno mėginio, o į

kiuvetę – po 100 µl mėginio. Po vieną duobučių eilutę plokštelėje palikta tuščią, antra eilutė skirta

kontroliniams pieno be inhibitorių mėginiams. Likusios plokštelės duobučių eilutės užpildytos pieno

mėginiais su antibiotikų tirpalais (antibiotikų koncentracija parinkta pagal ES reikalavimus metodo

jautrumui patikrinti) (1 priedas).

3.3.3. Preparatų jautrumo tikrinimas

Preparatų jautrumas tikrintas su standartiniais antibiotikų tirpalais, kurie ruošti piene be

inhibitorių:

Penicilinas 1 g/kg, 2 g/kg, 3 g/kg;

Neomicinas 30 g/kg;

Eritromicinas 10 g/kg;

Sulfametazinas 400 g/kg;

Sulfadiazinas 100 g/kg, 150 g/kg, 200 g/kg;

Oksitetraciklinas 100 g/kg, 150 g/kg, 200 g/kg;

Dapsonas 1 g/kg.

Preparatai su tiriamaisiais mėginiais inkubuoti 63±1 C temperatūroje termostate 4,0-6,0 h

(priklausomai nuo terpės pH). Rezultatai vertinti pagal terpės spalvą plokštelių duobutėse arba

kiuvetėse. Tinkama inkubavimo trukmė nustatyta pagal neigiamą kontrolę – duobutės arba kiuvetės su

kontroliniu mėginiu terpės spalva turi būti pasikeitusi iš violetinės į geltoną.

Rezultatų vertinimas:

Teigiamas rezultatas „+“ (visiškai ar iš dalies violetinė tiriamosios terpės spalva) – inhibitorių

rasta;

Neigiamas rezultatas „“ (visiškai geltona, šviesiai gelsva tiriamosios terpės spalva) – inhibitorių

nerasta;

Įtariamas teigiamas rezultatas “±„ (violetiniai gelsva, melsvai žalsva tiriamosios terpės spalva) –

įtariama, kad gali būti inhibitorių, tyrimą rekomenduojama pakartoti.

3.4. Matematinės statistikos metodai

Tyrimų duomenys skaičiuoti EXCEL (Microsoft, JAV) programa. Palyginamieji tyrimų

duomenys apdoroti naudojant SPSS programinį paketą (SPSS Inc., Il, JAV). Skirtingų preparatų –

analogų palyginimui naudotas MacNemar testas, kuris naudojamas tuomet, kai tas pats dvireikšmis

12

kintamasis matuojamas du kartus, t.y. populiacijos yra priklausomos, o tiriamas kintamasis yra

kokybinis.

Dažniausiai šio kintamojo reikšmės koduojamos „+“ ir „–“. Mūsų atveju tarpusavyje lyginti

inhibitorių likučių nustatymo preparatai. Žymėjimas „+“ reiškia – rasta inhibitorių likučių, o „–“

reiškia – inhibitorių likučių nerasta. Sudaryta rezultatų lentelė:

3.4 lentelė. MacNemar testo rezultatų lentelė

A (modifikuotas

preparatas)

B (kontrolinis preparatas)

Suma + (teigiami

rezultatai) (neigiami

rezultatai)

+ (teigiami

rezultatai) a (+/+) b (/+)

a+b

(neigiami

rezultatai) c (+/) d (/)

c+d

Suma a+c b+d NN

čia a – dalis tyrimų, kur abiem preparatais inhibitorių likučių rasta, d – dalis tyrimų, kur abiem

preparatais inhibitorių likučių nerasta, b – dalis tyrimų, kur preparatu B inhibitorių likučių rasta, o

preparatu A inhibitorių likučių nerasta, c – dalis tyrimų, kur preparatu A inhibitorių likučių rasta, o

preparatu B inhibitorių likučių nerasta.

Tikrinta pagrindinė (nulinė) hipotezė H0 – abiem metodais gauti rezultatai statistiškai patikimai

nesiskiria. Norėdami patikrinti iškeltąją pagrindinę hipotezę, iš turimos imties duomenų skaičiuota 2

reikšmė.

Pagrindinė hipotezė priimta, kai stebimas reikšmingumo lygmuo (p reikšmė) yra mažesnė arba

lygi pasirinktam reikšmingumo lygmeniui , mūsų atveju =0,05. Priešingu atveju pagrindinė

hipotezė atmetama ir daroma išvada, kad abiem metodais gauti rezultatai skiriasi, todėl lyginamų

preparatų jautrumas skiriasi.

Skaičiuotas sutapimo koeficientas kappa (), kuris taikomas rezultatų suderinamumui nustatyti.

Koeficiento reikšmė 1 rodo visišką rezultatų sutapimą.

13

4. Tyrimų rezultatai

4.1. Preparatų terpės modifikavimas

4.1.1. Geobacillus stearothermophilus sporų sudygimo stimuliatorių atranka

Pirmame tyrimų etape nustatytas G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensijos

jautrumas standartiniams antibiotikų tirpalams. Tikrintas G. stearothermophilus ATCC 10149

kultūros tinkamumas, atliekant jos jautrumo inhibitorių koncentracijoms tyrimą difuzijos į agarą

(įdubų) metodu (4.1.1 lent.). Tyrimams naudota G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensija,

kurios koncentracija N=1,3×106 KSV/ml. Nustatyta, kad bakterijos yra jautrios standartinėms

antibiotikų tirpalų koncentracijoms: 2 g/kg penicilino G; 150 g/kg sulfadiazino, 30 g/kg

neomicino; 10 g/kg eritromicino; 100 g/kg oksitetraciklino, kadangi bakterijų augimo stabdymo

zonos dydis, esant antibiotikų, buvo didesnis už 4 mm. Tyrimas atliktas ir su didesnėmis antibiotikų

koncentracijomis, norint įsitikinti, ar bakterijos nėra įgijusios atsparumo standartinėms

koncentracijoms.

4.1.1 lentelė. G. stearothermophilus ATCC 10149 bakterijų sporų jautrumo standartinėms antibiotikų

tirpalų koncentracijoms tyrimų rezultatai

Antibiotikas Koncentracija, g/kg Augimo stabdymo zonos dydis,

mm

Penicilinas G

10

4

2

12,5 ± 0,17

9,8 ± 0,05

7,8 ± 0,09

Sulfadiazinas

400

200

150

6,2 ± 0,15

5,8 ± 0,3

5,4 ± 0,15

Neomicinas

100

60

30

5,5 ± 0,2

4,8 ± 0,1

4,8 ± 0,05

Eritromicinas

50

20

10

5,1 ± 0,15

4,8 ± 0,07

4,8 ± 0,15

Oksitetraciklinas

400

200

100

11,5 ± 0,05

11,3 ± 0,20

10,8 ± 0,15

Naudojant įvairias chemines medžiagas sporų sudygimui skatinti, tiriamųjų medžiagų skirtingų

koncentracijų tirpalai pilti į ištirpintą po sterilizavimo mitybos agarą (PCA) sporų skaičiui nustatyti.

Kontroliniu variantu laikytas sporų skaičius, išaugęs mitybos agare be priedų – 1,3×106

KSV/ml.

Dviejų atskirų mikrobiologinio tyrimo rezultatų, gautų vieno tyrėjo per trumpiausią įmanomą laiką,

taikant tą patį metodą ir ta pačia įranga tiriant tapačius mėginius, absoliutus skirtumas ne daugiau kaip

5 % atvejų gali būti didesnis kaip 30 % nuo mažesnio rezultato3. Remiantis tuo, priimta, kad ištirtos

3 LST ISO 6730:2005 Pienas. Psichrotrofinių mikroorganizmų kolonijas sudarančių vienetų skaičiavimas. Kolonijų

skaičiavimo 6,5 oC temperatūroje metodas (tapatus ISO 6730:2005).

14

medžiagos turėjo įtakos sporų išaugimui tuomet, kai išaugusių sporų skaičius buvo 50 % didesnis už

kontrolę.

Įpylus į terpę nuo 0,1 % iki 1 % koncentracijos angliavandenių tirpalų ir palyginus išaugusių

kolonijų skaičių su kontrole, nustatyta, kad sporų sudygimą skatino 1 % krakmolo ir daugiau kaip

0,5 % sacharozės, kurių įpylus į terpę sudygo atitinkamai 69 % ir 85 % sporų daugiau lyginant su

kontrole (4.1.1 pav.).

4.1.1 pav. Angliavandenių įtaka G. stearothermophilus sporų sudygimui

Didinant sacharozės koncentraciją atitinkamai didėjo ir sudygusių sporų skaičius – esant

sacharozės koncentracijai 0,75 %, sudygo 115 %, o 1 % - sudygo 131 % daugiau sporų, lyginant su

kontrole. Kiti įvairių koncentracijų angliavandeniai neturėjo reikšmingos įtakos sporų sudygimui.

Laktozė, maltozė ir gliukozė nestimuliavo G. stearothermophilus sporų sudygimo, o 0,5 % ir 1 %

maltozės bei 0,5 % gliukozės koncentracija šiek tiek jį stabdė (4.1.1 pav.).

Naudojant aminorūgštis sporų sudygimo skatinimui, nustatyta, kad cisteinas ir DL-argininas

turėjo nedidelę įtaką G. stearothermophilus sporų sudygimui. Tuo tarpu 0,2 % DL-alanino ir 0,03 %,

0,05 % bei 0,2 % L-alanino suaktyvino sporų sudygimą daugiau nei 50 %.

Tos pačios DL- ir L-alanino koncentracijos skirtingai veikė sporų sudygimą (4.1.2 pav.). 0,01 %,

0,03% ir 0,05 % L-alanino koncentracijos labiau skatino sporų sudygimą nei DL-alaninas, taip yra

todėl, kad L-alaninas labiau sąveikauja su sudygusiose sporose esančiais baltymais ir labiau skatina

sporų sudygimą agaro terpėje [Magdoub M.N.I. ir kt. (1984)].

1,3 1,3 1,3 1,31,51,9

1,4 11,3

2 1,9

1

1,92,3

1,811,4

21,5 1,4

2,6 2,6

1,5 1,3

0

1

2

3

4

DL-alaninas L-alaninas DL-argininas Cisteinas

Sp

orų

skai

čiu

s, m

ln

KS

V/m

l

Aminorūgštis, koncentracija

0% 0,01% 0,03% 0,05% 0,10% 0,20%

4.1.2 pav. Aminorūgščių įtaka G. stearothermophilus sporų sudygimui

15

Ištirta 16 neorganinių druskų įvairių koncentracijų įtaka sporų sudygimo aktyvinimui. Šių

medžiagų įtaka G. stearothermophilus sporų sudygimui pateikta 4.1.3 ir 4.1.4 paveiksluose. Kadangi

sporose yra nemažai protonų, tokių kaip Ca2+

, Mg2+

, Mn2+

, Zn2+

katijonų, kuriems atsipalaidavus

pirmomis minutėmis po sporų sudygimo pilnai suyra sporų peptidoglikanas ir sporos tampa

metaboliškai aktyvios, buvo manoma, kad, pridėjus į terpę įvairių druskų, tam tikri jonai suaktyvins

sporų sudygimą.

4.1.3 pav. Neorganinių druskų koncentracijų 0,005-0,04 % įtaka G. stearothermophilus sporų

sudygimui

Į terpę įpylus įvairių koncentracijų fosfatų tirpalų: Na3PO4·12H2O, KH2PO4, K2HPO4 nustatyta,

kad labiausiai sporų sudygimą aktyvino 0,4 % KH2PO4 ir 0,2 % K2HPO4, kurių įtaka sporų sudygimui

atitinkamai buvo 69 % ir 100 %. Kitų koncentracijų KH2PO4 ir K2HPO4 druskų tirpalai arba neturėjo

įtakos sporų sudygimui, arba ji buvo labai nedidelė. Didžiausia Na3PO4·12H2O koncentracija,

skatinanti sporų sudygimą 46 %, buvo 0,02 %.

Tiriant sulfatų įtaką nustatyta, kad ZnSO4 ir CoSO4 visiškai inhibuoja sporų sudygimą ir

sudygusių sporų ląstelių augimą, nes panaudojus net mažiausią 0,005 % šių druskų koncentraciją,

nesudygo nė viena spora. MnSO4 ir CuSO4 tirpalų koncentracijos, didesnės nei 0,01 %, taip pat

slopino sporų sudygimą. Gali būti, kad šios medžiagos deaktyvuoja fermentų, „gaminančių“ sudygimo

medžiagas veiklą, todėl sporų sudygimas yra inhibuojamas. Kitų sulfatų vienos koncentracijos skatino

sporų sudygimą nežymiai – esant 0,1 % MgSO4 (4.1.3 pav.) ir 0,005 % MnSO4 (4.1.4 pav.)

koncentracijai terpėje sudygo atitinkamai 31 % ir 38 % sporų daugiau lyginant su kontrole, o kitos

koncentracijos neturėjo įtakos – įpylus į agaro terpę įvairių koncentracijų FeSO4 (4.3 pav.) ir K2SO4

(4.1.4 pav.) druskų tirpalų, sporų sudygo mažiau lyginant su kontrole.

Ištyrus chloridų įtaką sporų sudygimui nustatyta, kad KCl, CaCl2 ir NaCl neturėjo įtakos –

įvairios šių druskų koncentracijos (0,01–0,2 %) neskatino G. stearothermophilus sporų sudygimo

daugiau nei 31 % (4.1.4 pav.). Sporų sudygimą šiek tiek skatino 0,03 % ir 0,05 % koncentracijų CoCl2

tirpalai, kurių įpylus į terpę išaugo 46 % daugiau sporų lyginant su kontrole. Tuo tarpu kitos

neorganinės druskos - 0,05 % NaHCO3 ir 0,03 % NaNO2 - sporų sudygimą stimuliavo net 69 %, o

0,03 % NaHCO3 – 54 % lyginant su kontrole.

16

4.1.4 pav. Neorganinių druskų koncentracijų 0,01-0,4 % įtaka G. stearothermophilus sporų sudygimui

G. stearotermophilus bakterijų sporų išaugimas taip pat buvo skatinamas, papildant terpės sudėtį

lizocimu bei adenozinu. Literatūros duomenimis [10] tam tikros sporogeniškųjų bakterijų rūšys turi

specialius receptorius, kurie praneša apie aplinkoje esančius energijos šaltinius, pvz., L-alaniną,

adenoziną ir kt. Analizuojant literatūrą rasta, kad optimaliausia lizocimo koncentracija, skatinanti

sporų sudygimą, yra 50 g/ml, o adenozino optimali koncentracija – 0,01 mol/l. Skatinant sporų

sudygimą šiomis medžiagomis buvo panaudotos ir tarpinės koncentracijos (4.1.2 lentelė).

4.1.2 lentelė. Lizocimo ir adenozino įtaka sporų sudygimui agaro terpėje

Terpės priedai Priedo koncentracija

agaro terpėje

Sporų skaičius,

mln KSV/ml

Sporų skaičiaus

padidėjimas lyginant

su kontrole, %

Be priedų

(kontrolė) 0,0 g/ml (mol/l) 1,3 ± 0,18 0

Lizocimas

5 g/ml

10 g/ml

25 g/ml

50 g/ml

2,3 ± 0,06

1,5 ± 0,57

1,1 ± 0,01

1,2 ± 0,06

77

15

- 15 (sumažėjo)

- 8 (sumažėjo)

Adenozinas

0,005 mol/l

0,003 mol/l

0,01 mol/l

0,013 mol/l

0,02 mol/l

1,6 ± 0,21

1,0 ± 0,01

3,0 ± 0,01

1,9 ± 0,04

1,8 ± 0,41

23

- 38 (sumažėjo)

130

46

38

Lizocimas +

adenozinas 5 g/ml

0,01 mol/l 2,4 ± 0,09 84

Labiausiai sporų sudygimą stimuliavo lizocimo 5 g/ml tirpalas, t.y. papildžius juo terpę, sudygo

77 % daugiau sporų, lyginant su kontrole. Įpylus į terpę skirtingų koncentracijų adenozino nustatyta,

kad sporų išaugimą 130 % stimuliavo 0,01 mol/l adenozino tirpalas. Sporų sudygimo skatinimui

naudotos kitos adenozino tirpalų koncentracijos reikšmingos įtakos sporų sudygimui neturėjo (4.1.2

lentelė).

Nustačius optimalias G. stearotermophilus sporų sudygimą skatinančias lizocimo ir adenozino

koncentracijas, buvo pabandyta terpę su sporomis papildyti 5 g/ml lizocimo ir 0,01 M adenozino

mišiniu. Nustatyta, kad šios medžiagos sporų sudygimą skatino 84 % lyginant su kontrole.

17

4.1.5 pav. G. stearothermophilus sporų sudygimo stimuliatorių atrankos schema

Atrinktais sporų sudygimo stimuliatoriais bandyta papildyti preparato terpės sudėtį ir ištirti jų

poveikį preparato su neigiamo pieno mėginiais spalvinei reakcijai po inkubavimo. Tyrimų metu

nustatyta, kad didžiausios įtakos preparato terpės spalvinei reakcijai po inkubavimo (63±1) °C

temperatūroje turėjo 1 tirpaus krakmolo, 1 sacharozės, 0,2 L-alanino, 0,03 NaNO2 priedai,

todėl jie parinkti tolimesniam preparato terpės modifikavimui.

18

4.2. Geobacillus stearothermophilus kultūrų DSM 6790 ir ATCC 10149 jautrumo tyrimai

4.2.1. Preparatų, pagamintų su Geobacillus stearothermophilus DSM 6790 ir ATCC 10149

kultūromis, tyrimai

Siekiant ištirti galimybę preparato inhibitorių piene tyrimams gamybai naudoti Geobacillus

stearothermophilus DSM 6790 jautrią kultūrą, pagaminta šviežia G. stearothermophilus DSM 6790

sporų suspensija, kurios koncentracija 5,0 x 106

KSV/ml.

Pagal standartą LST ISO/TS 26844:2010 pagaminta 4 rūšių terpė preparatams su

G. stearothermophilus DSM 6790 ir G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensijomis.

4.2.1. lentelė. Preparatų terpės sudėtis

Eil.

Nr. Jautri bakterijų kultūra

Sporų

suspensijos

koncentracija,

KSV/ml

Sporų

suspensijos

kiekis

terpėje,

Sporų

stimuliatorius

Terpės

pH Terpės priedas

1 G. stearothermophilus ATCC

10149 6,0x10

6 2 nedėta 7

Chloramfenikolio

0,2 mg/ml tirpalas

2 G. stearothermophilus DSM

6790 5,0x10

6 2 nedėta 7

Chloramfenikolio

0,2 mg/ml tirpalas


10149 6,0x10

6 2 nedėta 8

Trimetoprimo

25 g/ml tirpalas


6790 5,0x10

6 2 nedėta 8

Trimetoprimo

25 g/ml tirpalas

Terpė išpilstyta į kiuvetes po 300 μl. Kontrolei naudotas Delvotest SP-NT preparatas, tiriamųjų

preparatų jautrumas tikrintas naudojant pieno mėginius su standarte LST ISO/TS 26844:2010

nurodytomis penicilino, sulfametazino, oksitetraciklino ir eritromicino koncentracijomis.

Pastebėta, kad preparato, kurio terpės pH 7 ir kurio gamybai naudota G. stearothermophilus

DSM 6790 sporų suspensija, terpės su neigiamos kontrolės mėginiu spalva pasikeitė iš violetinės į

geltoną per 3 h (reakcijos laikas sutrumpėjo 1 h, lyginant su kontroliniu preparatu), tačiau buvo

nejautrus penicilinui. Analogiško preparato, kurio terpės pH 8, terpės su neigiamos kontrolės mėginiu

spalva nepasikeitė iš violetinės į geltoną ir po 6 h inkubavimo (4.2.2 lent.).

4.2.2 lentelė. Preparatų, pagamintų su skirtingomis G. stearothermophilus sporų suspensijomis, tyrimai

(preparatų laikymo trukmė po pagaminimo – 1, 3, 7 dienos, laikant nuo 0 ºC iki +5 ºC temperatūroje)

Mėginys,

tyrimo diena

po preparato

pagaminimo

Delvotest SP-NT

Terpė pH7 Terpė pH8

Geobacillus stearothermophilus padermė

ATCC 10149 DSM 6790 ATCC 10149 DSM 6790

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezultatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezultatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezultatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezultatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezultatas

Neigiama

kontrolė 3,0 - 4,0 - 3,0 - 5,0 - 6,0 +

Penicilinas

2 μg/kg (1) 3,0 + 4,0 + 3,0 - 5,0 + 6,0 +

Penicilinas

2 μg/kg (3) 3,0 + 4,0 + 3,0 - 5,0 + 6,0 +

19

Mėginys,

tyrimo diena

po preparato

pagaminimo

Delvotest SP-NT


Geobacillus stearothermophilus padermė

ATCC 10149 DSM 6790 ATCC 10149 DSM 6790

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezultatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezultatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezultatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezultatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezultatas

Penicilinas

2 μg/kg (7) 3,0 + 4,0 + 3,0 - 5,0 + 6,0 +

Penicilinas

3 μg/kg (1) 3,0 + 4,0 + 3,0 - 5,0 + 6,0 +

Penicilinas

3 μg/kg (3) 3,0 + 4,0 + 3,0 ± 5,0 + 6,0 +

Penicilinas

3 μg/kg (7) 3,0 + 4,0 + 3,0 ± 5,0 + 6,0 +

Sulfametazinas

400 μg/kg (1) 3,0 + 5,0 + 6,0 +

Sulfametazinas

400 μg/kg (3) 3,0 + 5,0 + 6,0 +

Sulfametazinas

400 μg/kg (7) 3,0 + 5,0 + 6,0 +

Oksitetraciklinas

100 μg/kg (1) 3,0 + 4,0 + 3,0 +

Oksitetraciklinas

100 μg/kg (3) 3,0 + 4,0 + 3,0 +

Oksitetraciklinas

100 μg/kg (7) 3,0 + 4,0 + 3,0 +

Eritromicinas

10 μg/kg (1) 3,0 + 4,0 + 3,0 - 5,0 - 6,0 +

Eritromicinas

10 μg/kg (3) 3,0 + 4,0 + 3,0 - 5,0 - 6,0 +

Eritromicinas

10 μg/kg (7) 3,0 + 4,0 + 3,0 - 5,0 - 6,0 +

Rezultatai: + inhibitorių rasta, – inhibitorių nerasta, ± įtariama, kad yra inhibitorių

Tos pačios gamybos preparatai tirti dar du kartus – po 3 dienų ir 7 dienų laikymo – ir visų

tyrimų rezultatai gauti tokie patys, kaip ir pirmąją dieną. Todėl nuspręsta G. stearothermophilus DSM

6790 sporų jautrumą padidinti, pridedant į terpę parinktus sporų sudygimą skatinančius stimuliatorius.

Terpės papildymui pasirinktas 1 tirpaus karakmolo priedas.

4.2.2. Tirpaus krakmolo priedu papildytų preparatų, pagamintų su Geobacillus

stearothermophilus DSM 6790 ir ATCC 10149 kultūromis tyrimai

Terpė preparatams gaminta pagal standartą LST ISO/TS 26844:2010, į vieną terpės dalį

papildomai pridedant 1 tirpaus krakmolo. Kaip ir pirmojo tyrimo metu, pagaminti analogiški

preparatai su G. stearothermophilus ATCC 10149 ir G. stearothermophilus DSM 6790 sporų

suspensijomis. Pagaminta 8 rūšių terpė preparatams.

20

4.2.3 lentelė. Preparatų terpės sudėtis

Eil.


Sporų

suspensijos

koncentracija,

KSV/ml

Sporų

suspensijos

kiekis

terpėje,

Sporų

stimuliatorius

Terpės

pH Terpės priedas


10149 6,0x10

6 2 nedėta 7

Chloramfenikolio

0,2 mg/ml tirpalas


10149 6,0x10

6 2

1 tirpaus

krakmolo 7

Chloramfenikolio

0,2 mg/ml tirpalas


6790 5,0x10

6 2 nedėta 7

Chloramfenikolio

0,2 mg/ml tirpalas


6790 5,0x10

6 2

1 tirpaus

krakmolo 7

Chloramfenikolio

0,2 mg/ml tirpalas


10149 6,0x10

6 2 nedėta 8

Trimetoprimo

25 g/ml tirpalas


10149 6,0x10

6 2

1 tirpaus

krakmolo 8

Trimetoprimo

25 g/ml tirpalas


6790 5,0x10

6 2 nedėta 8

Trimetoprimo

25 g/ml tirpalas


6790 5,0x10

6 2

1 tirpaus

krakmolo 8

Trimetoprimo

25 g/ml tirpalas

Terpė išpilstyta į į kiuvetes po 300 l. Preparatai tirti pagaminimo dieną, 3-ią ir 6-ą dieną po

pagaminimo, laikant preparatus nuo 0 ºC iki +5 ºC temperatūroje. Preparatų tyrimo rezultatai pateikti

4.2.4 lentelėje.

Preparatų, su tirpaus krakmolo priedu, pagamintų su G. stearothermophilus DSM 6790 sporų

suspensija, neigiamos kontrolės spalva nepasikeitė iš violetinės į geltoną ir po 6 h inkubavimo

(63±1) C temperatūroje, kai analogiško preparato, pagaminto su G. stearothermophilus ATCC 10149

sporų suspensija, neigiamos kontrolės spalva pasikeitė iš violetinės į geltoną per 4 h (4.2.4 lent.).

Preparato su tirpaus krakmolo priedu ir terpės pH 8, pagaminto su G. stearothermophilus DSM 6790

sporų suspensija, neigiamos kontrolės spalva pasikeitė iš violetinės į geltoną jau po 3 h inkubavimo

(63±1) C temperatūroje, nepriklausomai nuo tiriamojo mėginio – pagelto preparato terpė ir su

neigiama kontrole, ir su antibiotikų tirpalais (4.2.4 lent.). 1 tirpaus krakmolo priedas turėjo

inhibuojantį poveikį ir preparato, pagaminto su G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensija

jautrumui, nes preparato su tirpaus krakmolo priedu ir terpės pH 8 neigiamos kontrolės spalva taip pat

nepasikeitė iš violetinės į geltoną ir po 6 h inkubavimo (63±1) C temperatūroje, kai analogiško

preparato be tirpaus krakmolo priedo neigiamos kontrolės spalva pasikeitė iš violetinės į geltoną po 5 h

inkubavimo. Kadangi ką tik pagamintų preparatų tyrimo rezultatai netenkino, preparatai toliau

nelaikyti ir netirti. Atlikus pakartotinį tyrimą, gauti analogiški rezultatai – preparatai, pagaminti su

G. stearothermophilus DSM 6790 sporų suspensija nebuvo jautrūs nei prie pH 7, nei prie pH 8. Todėl

buvo pagaminta šviežia G. stearothermophilus DSM 6790 sporų suspensijos partija.

21

4.2.4 lentelė. Kiuvečių formos preparatų, pagamintų su skirtingomis G. stearothermophilus sporų suspensijomis ir papildant terpės sudėtį tirpiu krakmolu,

tyrimai (pagaminimo diena)

Mėginys

Delvotest SP-NT


Geobacillus stearothermophilus padermė, terpės priedas

ATCC 10149 ATCC 10149,

1 krakmolo DSM 6790

DSM 6790,

1 krakmolo ATCC 10149

ATCC 10149,

1 krakmolo DSM 6790

DSM 6790,

1 krakmolo

Inku-

bavimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Neigiama

kontrolė 3,0 - 4,0 - 4,0 - 6,0 + 6,0 + 5,0 - 6,0 + 3,0 - 3,0 -

Penicilinas

2 μg/kg 3,0 + 4,0 + 4,0 + 6,0 + 6,0 + 5,0 + 6,0 + 3,0 - 3,0 -

Penicilinas

3 μg/kg 3,0 + 4,0 + 4,0 + 6,0 + 6,0 + 5,0 + 6,0 + 3,0 - 3,0 -

Sulfametazinas

400 μg/kg 3,0 + 4,0 ± 4,0 - 6,0 + 6,0 + 5,0 + 6,0 + 3,0 - 3,0 -

Oksitetraciklinas

100 μg/kg 3,0 + 4,0 + 4,0 + 6,0 + 6,0 + 5,0 - 6,0 + 3,0 - 3,0 -

Rezultatai: + inhibitorių rasta, – inhibitorių nerasta, ± įtariama, kad yra inhibitorių

22

Su naujai pagaminta G. stearothermophilus DSM 6790 sporų suspensija, kurios

koncentracija 7,0x106 KSV/ml ir su atšildyta G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensija,

kurios koncentracija 6,0 x 106 KSV/ml, pagaminta 8 rūšių terpė preparatams, į vieną terpės dalį

papildomai pridedant 1 tirpaus krakmolo.

4.2.5 lentelė. Preparatų terpės sudėtis

Eil.


Sporų

suspensijos

koncentracija,

KSV/ml

Sporų

suspensijos

kiekis

terpėje,

Sporų

stimuliatorius

Terpės

pH Terpės priedas


10149 6,0x10

6 2 nedėta 7

Chloramfenikolio

0,2 mg/ml tirpalas


10149 6,0x10

6 2

1 tirpaus

krakmolo 7

Chloramfenikolio

0,2 mg/ml tirpalas


6790 6,0x10

6 2 nedėta 7

Chloramfenikolio

0,2 mg/ml tirpalas


6790 6,0x10

6 2

1 tirpaus

krakmolo 7

Chloramfenikolio

0,2 mg/ml tirpalas


10149 6,0x10

6 2 nedėta 8

Trimetoprimo

25 g/ml tirpalas


10149 6,0x10

6 2

1 tirpaus

krakmolo 8

Trimetoprimo

25 g/ml tirpalas


6790 6,0x10

6 2 nedėta 8

Trimetoprimo

25 g/ml tirpalas


6790 6,0x10

6 2

1 tirpaus

krakmolo 8

Trimetoprimo

25 g/ml tirpalas

Visų skirtingų rūšių preparatų terpė išpilstyta į plokšteles po 165 l. Preparatai tirti sekančią

dieną, 4-ą, 7-ą ir 10-ą dieną po pagaminimo, saugant preparatus nuo 0 ºC iki +5 ºC temperatūroje.

Tyrimų rezultatai pateikti 4.2.6 lentelėje.

23

4.2.6 lentelė. Preparatų, pagamintų su skirtingomis G. stearothermophilus sporų suspensijomis ir papildant terpės sudėtį tirpiu krakmolu, tyrimai

(preparato laikymo trukmė - 1, 4, 7, 10 dienų nuo 0 ºC iki +5 ºC temperatūroje)

Mėginys,

tyrimo diena

po preparato

pagaminimo

Delvotest SP-NT



ATCC 10149 ATCC 10149,

1 krakmolo DSM 6790

DSM 6790,


ATCC 10149,

1 krakmolo DSM 6790

DSM 6790,

1 krakmolo

Inku-

bavimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Neigiama

kontrolė 3,0 - 3,5 - 3,0 - 3,0 - 3,5 - 4,0 - 5,0 - 6,0 + 6,0 +

Penicilinas

2 μg/kg (1) 3,0 + 3,5 + 3,0 + 3,0 - 3,5 + 4,0 + 5,0 + 6,0 + 6,0 +

Penicilinas

2 μg/kg (4) 3,0 + 4,0 + 3,0 + 3,0 + 4,0 + 4,5 + 4,5 + 6,0 + 6,0 +

Penicilinas

2 μg/kg (7) 3,0 + 4,5 ± 3,5 + 4,5 + 4,5 + 5,0 ± 5,0 ± 6,0 + 6,0 +

Penicilinas

2 μg/kg (10) 3,0 + 4,5 ± 4,0 + 4,5 + 4,5 + 5,0 ± 5,0 ± 6,0 + 6,0 +

Penicilinas

3 μg/kg (1) 3,0 + 3,5 + 3,0 + 3,0 - 3,5 + 4,0 + 5,0 + 6,0 + 6,0 +

Penicilinas

3 μg/kg (4) 3,0 + 4,0 + 3,0 + 3,0 + 4,0 + 4,5 + 4,5 + 6,0 + 6,0 +

Penicilinas

3 μg/kg (7) 3,0 + 4,5 + 3,5 + 4,5 + 4,5 + 5,0 + 5,0 + 6,0 + 6,0 +

Penicilinas

3 μg/kg (10) 3,0 + 4,5 + 4,0 + 4,5 + 4,5 + 5,0 + 5,0 + 6,0 + 6,0 +

Sulfametazinas

400 μg/kg (1) 3,0 + 3,5 - 3,0 - 3,0 - 3,5 - 4,0 - 5,0 - 6,0 + 6,0 +

Sulfametazinas

400 μg/kg (4) 3,0 + 4,0 - 3,0 - 3,0 - 4,0 - 4,5 + 4,5 + 6,0 + 6,0 +

Sulfametazinas

400 μg/kg (7) 3,0 + 4,5 - 3,5 - 4,5 - 4,5 - 5,0 + 5,0 + 6,0 + 6,0 +

24

Mėginys,

tyrimo diena

po preparato

pagaminimo

Delvotest SP-NT



ATCC 10149 ATCC 10149,

1 krakmolo DSM 6790

DSM 6790,


ATCC 10149,

1 krakmolo DSM 6790

DSM 6790,

1 krakmolo

Inku-

bavimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Rezul-

tatas

Sulfametazinas

400 μg/kg (10) 3,0 + 4,5 ± 4,0 ± 4,5 - 4,5 - 5,0 + 5,0 + 6,0 + 6,0 +

Oksitetraciklinas

100 μg/kg (1) 3,0 + 3,5 ± 3,0 + 3,0 - 3,5 + 4,0 - 5,0 - 6,0 + 6,0 +

Oksitetraciklinas

100 μg/kg (4) 3,0 + 4,0 + 3,0 + 3,0 + 4,0 + 4,5 - 4,5 - 6,0 + 6,0 +

Oksitetraciklinas

100 μg/kg (7) 3,0 + 4,5 + 3,5 + 4,5 + 4,5 + 5,0 - 5,0 - 6,0 + 6,0 +

Oksitetraciklinas

100 μg/kg (10) 3,0 + 4,5 + 4,0 + 4,5 + 4,5 + 5,0 - 5,0 - 6,0 + 6,0 +

25

Tyrimų metu paaiškėjo, kad ir su naujai pagaminta G. stearothermophilus DSM 6790 sporų

suspensija preparatai, kurių terpės pH 8, buvo nejautrūs, todėl pagaminta dar viena partija sporų

suspensijos (7,0 x 106 KSV/ml) ir jos jautrumas patikrintas su standartiniais antibiotikų tirpalais.

Sporų suspensijos jautrumas antibiotikams patikrintas, paruošus preparatus, kurių terpė

gaminta pagal standartą LST ISO/TS 26844:2010. Sporų suspensijos jautrumas tikrintas su

antibiotikų tirpalais, ruoštais žaliame piene: penicilino 2 μg/kg ir 3 μg/kg; eritromicino 10 μg/kg;

neomicino 30 μg/kg; dapsono 2 μg/kg; oksitertaciklino 100 μg/kg; sulfametazino 400 μg/kg.

4.2.7 lentelė. Sporų suspensijos G. stearothermophilus DSM 6790 jautrumo įvertinimas

Antibiotikas Koncentracija,

μg/kg

Delvotest SP-NT Terpė pH7 Terpė pH8

Inkubavimo

laikas, h rezultatas

Inkubavimo


Inkubavimo


Penicilinas 2 3,0 + 3,0 - 5,0 -

Penicilinas 3 3,0 + 3,0 + 5,0 +

Eritromicinas 10 3,0 + 3,0 - 5,0 -

Neomicinas 30 3,0 + 3,0 - 5,0 -

Dapsonas 2 3,0 + 3,0 - 5,0 -

Oksitetraciklinas 100 3,0 + 3,0 + 5,0 -

Sulfametazinas 400 3,0 + 3,0 + 5,0 +

Tyrimų rezultatai patvirtino (4.2.7 lent.), kad G. stearothermophilus DSM 6790 netinka

preparatų gamybai ir toliau preparatų gamybai ir tyrimams naudota tik G. stearothermophilus

ATCC 10149 sporų suspensija.

4.3. LPT ir LPT2 testų modifikavimas

Modifikuojant preparatų terpę, jos sudėtis papildyta ankstesnių tyrimų metu atrinktais sporų

sudygimo stimuliatoriais. Pagamintos skirtingos preparatų terpės, naudojant jautrios kultūros

G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensiją ir pridedant į terpę skirtingus priedus,

atrinktus tyrimų metu ir remiantis literatūros duomenimis [18; 22; 25; 40]: tirpų krakmolą,

gliukozės, išrūgų miltelių ir lieso pieno miltelių mišinį, gliukozę, sacharozės ir L-alanino mišinį,

krakmolo ir gliukozės mišinį, NaNO2.

Paruošti 7 skirtingi variantai terpės:

1) terpė be priedo (kontrolinis preparatas);

2) terpė su 0,2 gliukozės, 0,8 išrūgų miltelių ir 2,0 lieso pieno miltelių priedu;

3) terpė su 1,0 sacharozės ir 0,2 L-alanino priedu;

4) terpė su 1,0 tirpaus kramolo ir 0,2 gliukozės priedu;

5) terpė su 0,2 gliukozės priedu;

6) terpė su 1,0 tirpaus krakmolo priedu;

7) terpė su 0,03 NaNO2 priedu.

26

Preparatų terpės pH 63 C temperatūroje paderintas iki pH 7, įpilta 0,2

G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensijos ir išpilstyta į mikroplokštelių duobutes po

165 l bei į kiuvetes po 300 l. Analogiškai paruošti preparatai, kurių terpės pH 8.

Pagamintų preparatų (plokštelių ir kiuvečių) jautrumas tikrintas gamybos dieną, 3-ią dieną po

pagaminimo, 7-ą dieną po pagaminimo, 14-ą dieną po pagaminimo. Kiuvečių preparatų jautrumas

dar tikrintas 22-ą dieną po pagaminimo ir 30-ą dieną po pagaminimo.

Tyrimai parodė, kad preparato LPT terpės sudėčiai papildyti labiausiai tiko 0,03 NaNO2

priedas, nes preparatas su šiuo priedu, buvo jautrus standarte nurodytoms antibiotikų

koncentracijoms visų tyrimų metu (4.3.1-4.3.6 lent.). Jo jautrumas labiausiai sutapo su kontrolinio

preparato (preparato LPT, kurio terpė nebuvo papildyta jokiais priedais) jautrumu. Plokštelių

formos preparatai išlaikė savo jautrumą 7 dienas, nesikeičiant tyrimo trukmei (4.3.3 lent.). Kiuvečių

formos preparatai buvo jautrūs 21 dieną, nuo 22 dienos tyrimo trukmė pailgėjo (4.3.4 lent.).

Preparato LPT2 terpės sudėčiai papildyti labiausiai tiko 1,0 tirpaus krakmolo priedas, nes

plokštelių formos preparatas, kurio terpė buvo papildyta šiuo priedu, išlaikė savo jautrumą standarte

nurodytoms antibiotikų koncentracijoms 7 paras, kiuvečių formos preparatas išlaikė savo jautrumą

30 parų (4.3.1-4.3.6 lent.).

Preparatai, kurių terpė buvo papildyta kitais sporų sudygimą skatinančiais priedais –

gliukozės, išrūgų miltelių ir lieso pieno miltelių mišiniu, gliukoze, sacharozės ir L-alanino mišiniu,

krakmolo ir gliukozės mišiniu arba nebuvo pakankamai jautrūs tiriamų antibiotikų tirpalams, arba

jų jautrumas neišilaikė ilgiau nei 3 paras laikant preparatus nuo 0 C iki +5 C temperatūroje.

27

4.3.1 lentelė. Modifikuotų preparatų LPT ir LPT2 terpės jautrumo antibiotikams įvertinimas (pagaminimo diena)

Eil.

Nr.

Preparatas,

laikymo

trukmė,

dienos

Terpės priedas

Terpės

pH

Inkubavimo

trukmė, h

Tiriamasis mėginys

Pavadinimas

Kon-

centra-

cija,

Neigiama

kontrolė P2 P3 E10 N30 D2 O100 S400

1 LPT2

paga-

minimo

diena

Be priedų 7,0 3,5 – + + – – ± ± –

2

Gliukozė

Išrūgų milteliai

Lieso pieno milteliai

0,2

0,8

2,0 7,0 3,5 – + + – – + ± –

3 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 7,0 4,0 – + + – – ± ± ±

4 Krakmolas

Gliukozė

1,0

0,2 7,0 4,0 – + + – – – ± ±

5 Gliukozė 0,2 7,0 4,0 – + + – – – ± ±

6 NaNO2 0,03 7,0 4,0 – + + – – + ± – 7 Krakmolas 1,0 7,0 3,5 – + + – – ± + – 8 LPT

paga-

minimo

diena

Be priedų 8,0 5,5 – + + + + + – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,5 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 5,3 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,0 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 5,3 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,3 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +

Rezultatai: + inhibitorių rasta, – inhibitorių nerasta, ± įtariama, kad yra inhibitorių.

P2–Penicilinas 2 g/l, P3–Penicilinas 3 g/l, E10–Eritromicinas 10 g/l, N30 –Neomicinas 30 g/l, D2–Dapsonas 2 g/l, O100–Oksitetraciklinas 100 g/l,

S400–Sulfametazinas 400 g/l

28

4.3.2 lentelė. Modifikuotų preparatų LPT ir LPT2 terpės jautrumo antibiotikams įvertinimas

(preparatų laikymo trukmė po pagaminimo – 3 dienos nuo 0 ºC iki +5 ºC temperatūroje)

Eil.

Nr.

Preparatas,

laikymo

trukmė,

dienos

Terpės priedas

Terpės

pH

Inkubavimo

laikas, h

Tiriamasis mėginys

Pavadinimas

Kon-

centra-

cija,

Neigiama


1 LPT2

3 dienos

Be priedų - 7,0 3,5 – + + – – ± ± –

2

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0 7,0 3,5 – + + – – + ± –

3 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 7,0 4,0 – + + – – ± ± ±

4 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 7,0 4,0 – + + – – – ± ±

5 Gliukozė 0,2 7,0 4,0 – + + – – – ± ±

6 NaNO2 0,03 7,0 4,0 – + + – – ± ± – 7 Krakmolas 1,0 7,0 3,5 – + + – – ± + – 8 LPT

3 dienos

Be priedų - 8,0 5,5 – + + + + + – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,5 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 5,3 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,0 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 5,3 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,3 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +




29



Eil.

Nr.

Preparatas,

laikymo

trukmė,

dienos

Terpės priedas

Terpės

pH

Inkubavimo

laikas, h

Tiriamasis mėginys

Pavadinimas

Kon-

centra-

cija,

Neigiama


1 LPT2

7 dienos

Be priedų - 7,0 4,2 – ± ± – – - + –

2

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0 7,0 4,2 – + + – – ± ± –

3 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 7,0 4,35 – – + – – ± ± ±

4 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 7,0 4,35 – + + – – – ± ±

5 Gliukozė 0,2 7,0 4,35 – + + – – – ± ±

6 NaNO2 0,03 7,0 4,35 – + + – – ± ± -

7 Krakmolas 1,0 7,0 3,5 – + + – – ± + -

8 LPT

7 dienos

Be priedų - 8,0 6,0 – + + ± ± ± – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,3 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 6,0 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,0 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 6,0 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,3 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +




30


(preparatų laikymo trukmė po pagaminimo – 14 dienų nuo 0 ºC iki +5 ºC temperatūroje)

Eil.

Nr.

Preparatas,

laikymo

trukmė,

dienos

Terpės priedas

Terpės

pH

Inkubavimo

laikas, h

Tiriamasis mėginys

Pavadinimas

Kon-

centra-

cija,

Neigiama


1 LPT2

14 dienų

Be priedų - 7,0 4,3 – ± + – – ± ± –

2

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0 7,0 4,3 – + + – – + ± –

3 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 7,0 4,3 – ± + – – ± ± ±

4 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 7,0 4,3 – ± + – – – ± ±

5 Gliukozė 0,2 7,0 4,3 – + + – – – ± ±


14 dienų

Be priedų - 8,0 6,0 – + + + + + – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,5 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 5,3 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,3 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 5,3 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,3 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +




31



Eil.

Nr.

Preparatas,

laikymo

trukmė,

dienos

Terpės priedas

Terpės

pH

Inkubavimo

laikas, h

Tiriamasis mėginys

Pavadinimas

Kon-

centra-

cija,

Neigiama


1 LPT2

22 dienos

Be priedų - 7,0 4,3 – ± + – – ± ± –

2

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0 7,0 4,3 – ± + – – + ± –

3 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 7,0 4,3 – + + – – ± ± ±

4 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 7,0 4,3 – + + – – – ± ±

5 Gliukozė 0,2 7,0 4,3 – + + – – – ± ±


22 dienos

Be priedų - 8,0 5,5 – + + + + + – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,5 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 5,5 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,0 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 5,5 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,5 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +




32


(preparatų laikymo trukmė po pagaminimo – 30 dienų nuo 0 ºC iki +5 ºC temperatūroje)

Eil.

Nr.

Preparatas,

laikymo

trukmė,

dienos

Terpės priedas

Terpės

pH

Inkubavimo

laikas, h

Tiriamasis mėginys

Pavadinimas

Kon-

centra-

cija,

Neigiama


1 LPT2

30 dienų

Be priedų - 7,0 4,3 – ± + – – ± ± –

2

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0 7,0 4,5 – + + – – + ± –

3 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 7,0 4,3 – + + – – ± ± ±

4 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 7,0 4,3 – + + – – – ± ±

5 Gliukozė 0,2 7,0 4,3 – + + – – – ± ±


30 dienų

Be priedų - 8,0 5,5 – + + + + + – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,5 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 5,5 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,0 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 5,3 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,4 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +




33

Siekiant įvertinti 1 tirpaus krakmolo priedo įtaką modifikuoto preparato LPT2 jautrumui

ir 0,03 natrio nitrito priedo įtaką modifikuoto preparato LPT jautrumui, atlikti palyginamieji

preparatų tyrimai KTU MI mikrobiologijos mokslo laboratorijoje ir VĮ „Pieno tyrimai“ (tyrimų

planas – 2 priedas).

Siekiant ištirti terpės pH paderinimo temperatūros įtaką preparato jautrumui, preparatų

gamybos metu viename iš preparatų terpės variantų terpės pH derintas ne 63 C temperatūroje, o

53 C temperatūroje, nes pastebėta, jog paderinus terpės pH 63 C temperatūroje, sporų supylimo į

preparato terpę metu (kai terpės temperatūra būna nukritus iki 53 C temperatūros), terpės pH būna

padidėjęs. Pavyzdžiui, suderinus terpės pH 63 C temperatūroje iki 8,0, pilant į terpę sporų

suspensiją, esant 53 C temperatūrai terpės pH jau būna 8,21.

Trimetoprimas į terpę dedamas tam, kad būtų padidintas G. stearothermophilus jautrumas

sulfonamidams [16; 38]. Trimetoprimo kiekis terpėje gali turėti įtakos preparato jautrumui, nes

literatūros duomenimis [16] mažesni trimetoprimo kiekiai G. stearothermophilus jautrumą

sulfonamidams didina, o 0,05 g/ml ir didesni kiekiai – inhibuoja. Todėl vienu iš terpės gamybos

variantu pasirinktas pagal standartą nurodyto 6 ml/l trimetoprimo kiekio terpėje, kurios pH 8,

sumažinimas iki 4 ml/l.

Palyginamiesiems tyrimams pagamintos 8 skirtingos preparato terpės.

4.3.7 lentelė. Palyginamiesiems tyrimams ruoštų preparatų terpės sudėtis ir ruošimo būdas

Eil.

Nr.

Preparato

kodas

G. stearother-

mophilus

ATCC 10149

(6,0x106

KSV/ml)

kiekis terpėje,

Sporų

stimulia-

torius

Terpės

pH

pH

paregulia-

vimo

tempera-

tūra, C

Terpės priedas

Terpės

priedo

kiekis,

ml/l

1 LPT2m1 2 1 tirpaus

krakmolo 7 63

Chloramfenikolio

tirpalas 15

2 LPT2m2 2 1 tirpaus

krakmolo 7 53

Chloramfenikolio

tirpalas 15

3 LPT2 2 nedėta 7 63 Chloramfenikolio

tirpalas 15

4 LPTm1 2,5 0,03

NaNO2 8 63

Trimetoprimo

tirpalas 6

5 LPTm2 2,5 0,03

NaNO2 8 63

Trimetoprimo

tirpalas 4

6 LPTm3 2,5 0,03

NaNO2 8 53

Trimetoprimo

tirpalas 6

7 LPTm4 2,5 0,03

NaNO2 8 53

Trimetoprimo

tirpalas 4

8 LPT 2 nedėta 8 63 Trimetoprimo

tirpalas 6

34

Terpės, kurių sudėtis pateikta 4.3.7 lentelėje, ruoštos pagal tokį planą:

1. 1a) pH 7 terpė su 1 tirpaus krakmolo priedu. pH 7 paderintas 63 C temperatūroje,

lašinant į terpę 2N NaOH. Terpė ruošta pagal standartą, pridedant 2 G. stearothermophilus

ATCC 10149 sporų suspensijos. Sporų suspensijos supylimo į terpę metu terpės temperatūra

53 C, terpės pH 7,17.

2. 2a) pH 7 terpė su 1 tirpaus krakmolo priedu. pH 7 paderintas 53 C temperatūroje,

lašinant į terpę 2N NaOH. Terpė ruošta pagal standartą, pridedant 2 G. stearothermophilus

ATCC 10149 sporų suspensijos. Sporų suspensijos supylimo į terpę metu terpės temperatūra

53 C, terpės pH 7,0.

3. 3a) pH 7 terpė be priedo. pH 7 paderintas 63 C temperatūroje, lašinant į terpę 2N NaOH.

Terpė ruošta pagal standartą, pridedant 2 G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų

suspensijos. Sporų suspensijos supylimo į terpę metu terpės temperatūra 53 C, terpės pH 7,17.

4. 1b) pH 8 terpė su 0,03 NaNO2 priedu. pH 8 paderintas 63 C temperatūroje, lašinant į

terpę 2N NaOH. Terpė ruošta pagal standartą, pridedant į 100 ml terpės 0,6 ml trimetoprimo ir

2,5 G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensijos (kadangi toks sporų suspensijos

kiekis rekomenduotas sporų suspensijos kokybės sertifikate). Sporų suspensijos supylimo į terpę

metu terpės temperatūra 53 C, terpės pH 8,21.


terpę 2N NaOH. Terpė ruošta sumažinus standarte nurodytą trimetoprimo kiekį, pilant į 100 ml

terpės 0,4 ml trimetoprimo ir pridedant 2,5 G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų



terpę 2N NaOH. Terpė ruošta pagal standartą, pridedant į 100 ml terpės 0,6 ml trimetoprimo ir

2,5 G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensijos (kadangi toks sporų suspensijos

kiekis rekomenduotas sporų suspensijos kokybės sertifikate). Sporų suspensijos supylimo į terpę

metu terpės temperatūra 53 C, terpės pH 8,0.


terpę 2N NaOH. Terpė ruošta, sumažinus standarte nurodytą trimetoprimo kiekį, pilant į 100 ml

terpės 0,4 ml trimetoprimo ir pridedant 2,5 G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų


8. 5b) pH 8 terpė be priedo. pH 8 paderintas 63 C temperatūroje, lašinant į terpę 2N NaOH.

Terpė ruošta pagal standartą, pridedant į 100 ml terpės 0,6 ml trimetoprimo ir 2,0

35

G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensijos. Sporų suspensijos supylimo į terpę metu

terpės temperatūra 53 C, terpės pH 8,21.

Paruošta terpė išpilstyta į preparato plokštelių duobutes po 165 l ir į kiuvetes po 300 l.

Paruošti preparatai laikyti nuo 0 iki +5 C temperatūroje. Tyrimai atlikti lygiagrečiai KTU Maisto

instituto Mikrobiologijos mokslo laboratorijoje (MI) ir VĮ „Pieno tyrimai“ Mikrobiologijos

laboratorijoje (PT) pagal grafiką:

1 dieną po pagaminimo (plokštelės (P) ir kiuvetės (K)),

4 dienos po pagaminimo (plokštelės (P)),

7 dienos po pagaminimo (plokštelės (P) ir kiuvetės (K)),

15 dienų po pagaminimo (plokštelės (P) ir kiuvetės (K)),

30 dienų po pagaminimo (kiuvetės (K)).

Preparatų jautrumas tikrintas su standartiniais antibiotikų tirpalais: sulfadiazino 100 g/kg,

150 g/kg, 200 g/kg; neomicino 30 g/kg, eritromicino 10 g/kg, oksitetraciklino 100 g/kg,

150 g/kg, penicilino 1 g/kg, 2 g/kg, 3 g/kg.

36

4.3.8 lentelė. Plokštelių formos preparatų tyrimai dviejose laboratorijose

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Preparato terpės

variantas, tyrimo

vieta (MI, PT)

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Tiriamasis mėginys

Neigiama

kontrolė S100 S150 S200 N30 E10 O100 O150 O200 P1 P2 P3

1 1 diena 1A) LPT2m1-P1 MI

2 4,2 ± ± ± + + + +

2 1A) LPT2m1-P PT3

4,2 ± + + + +

3 2A) LPT2m2-P MI 4,2 ± ± ± + + + +

4 2A) LPT2m2-P PT 4,1 ± + + + +

5 3A) LPT2-P MI 4,2 ± ± ± + + + +

6 3A) LPT2-P PT 4,2 ± + + + +

7 1B) LPTm1-P MI 6,0 + + ± + + +

8 1B) LPTm1-P PT 6,0 + + ± + +

9 2B) LPTm2-P MI 5,25 + + ± + + +

10 2B) LPTm2-P PT 5,25 + + ± + +

11 3B) LPTm3-P MI 5,3 + + ± + + +

12 3B) LPTm3-P PT 5,4 + + ± + +

13 4B) LPTm4-P MI 5,0 + + ± + + +

14 4B) LPTm4-P PT 4,5 + + ± + +

15 5B) LPT-P MI 5,4 + + ± + + +

16 5B) LPT-P PT 5,4 + + ± + +

17 4 diena 1A) LPT2m1-P MI 4,2 + + + + +

18 1A) LPT2m1-P PT 4,15 + + + + +

19 2A) LPT2m2-P MI 4,1 + + + + +

20 2A) LPT2m2-P PT 4,1 ± + + + +

21 3A) LPT2-P MI 4,1 + + + ± +

22 3A) LPT2-P PT 4,1 ± + + ± +

23 1B) LPTm1-P MI 5,4 + + ± + +

24 1B) LPTm1-P PT 5,4 ± + ± + +

25 2B) LPTm2-P MI 5,25 ± + ± + +

26 2B) LPTm2-P PT 5,25 ± + ± + +

27 3B) LPTm3-P MI 5,3 + + ± + +

28 3B) LPTm3-P PT 5,25 + + ± + +

29 4B) LPTm4-P MI 4,25 ± + + ± + +

30 4B) LPTm4-P PT 4,25 ± + + ± + +

37

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Preparato terpės

variantas, tyrimo

vieta (MI, PT)

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Tiriamasis mėginys

Neigiama


31 5B) LPT-P MI 5,3 + ± +

32 5B) LPT-P PT 5,25 + ± +

33 7 diena 1A) LPT2m1-P MI 4,2 + + + + +

34 1A) LPT2m1-P PT 4,2 ± + + + +

35 2A) LPT2m2-P MI 4,1 + + + + +

36 2A) LPT2m2-P PT 4,1 + + + + +

37 3A) LPT2-P MI 4,2 ± + + ± +

38 3A) LPT2-P PT 4,2 ± + + ± +

39 1B) LPTm1-P MI 5,4 ± ± ± ± +

40 1B) LPTm1-P PT 5,4 ± ± ± ± +

41 2B) LPTm2-P MI 5,2 ± ± ± ± +

42 2B) LPTm2-P PT 5,2 ± ± ± ± +

43 3B) LPTm3-P MI 5,1 ± ± ± ± +

44 3B) LPTm3-P PT 5,1 ± ± ± ± +

45 4B) LPTm4-P MI 4,3 ± ± ± ± + +

46 4B) LPTm4-P PT 4,3 ± ± ± ± + +

47 5B) LPT-P MI 5,2 + ± + +

48 5B) LPT-P PT 5,1 + ± + +

49 15 diena 1A) LPT2m1-P MI 4,25 ± + + + +

50 1A) LPT2m1-P PT 4,25 ± + + + +

51 2A) LPT2m2-P MI 4,2 ± + + + +

52 2A) LPT2m2-P PT 4,2 ± + + + +

53 3A) LPT2-P MI 4,5 ± +

54 3A) LPT2-P PT 4,5 ± +

55 1B) LPTm1-P MI 5,4 ± +

56 1B) LPTm1-P PT 5,4 ± +

57 2B) LPTm2-P MI 5,0 ± +

58 2B) LPTm2-P PT 5,0 ± +

59 3B) LPTm3-P MI 5,2 ± ± ± ± +

60 3B) LPTm3-P PT 5,15 ± ± ± ± +

61 4B) LPTm4-P MI 4,4 ± +

38

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Preparato terpės

variantas, tyrimo

vieta (MI, PT)

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Tiriamasis mėginys

Neigiama


62 4B) LPTm4-P PT 4,3 ± +

63 5B) LPT-P MI 5,15 ± +

64 5B) LPT-P PT 5,15 ± +

S100–Sulfadiazinas 100 g/kg, S150–Sulfadiazinas 150 g/kg, S200–Sulfadiazinas 200 g/kg; N30 –Neomicinas 30 g/kg, E10–Eritromicinas 10 g/kg, O100–Oksitetraciklinas 100 g/kg,

O150–Oksitetraciklinas 150 g/kg, P1–Penicilinas 1 g/kg, P2–Penicilinas 2 g/kg, P3–Penicilinas 3 g/kg.

Žymėjimas:

1 – K (kiuvetė) kiuvečių formos preparatas;

2 – MI (Maisto institutas) tyrimai atlikti KTU Maisto instituto mikrobiologijos mokslo laboratorijoje;

3 – PT (Pieno tyrimai) tyrimai atlikti VĮ „Pieno tyrimai“ mikrobiologijos laboratorijoje.


Lentelėje pilka spalva paryškinti kontroliniai preparatai LPT ir LPT2, į kurių terpę nepridėta priedų.

39

4.3.9 lentelė. Kiuvečių formos preparatų tyrimai dviejose laboratorijose

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Preparato terpės

variantas, tyrimo

vieta (MI, PT)

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Tiriamasis mėginys

Neigiama


1 1 diena 1A) LPT2m1-K1 MI

2 4,4 ± ± + + + + +

2 1A) LPT2m1-K PT3 4,5 + + + + +

3 2A) LPT2m2-K MI 4,3 ± ± + + + + +

4 2A) LPT2m2-K PT 4,4 + + + + +

5 3A) LPT2-K MI 4,5 ± ± + + + + +

6 3A) LPT2-K PT 4,5 + + + + +

7 1B) LPTm1-K MI 5,4 ± + + + + + +

8 1B) LPTm1-K PT 6,0 ± + + + + +

9 2B) LPTm2-K MI 5,2 ± + + + + + +

10 2B) LPTm2-K PT 5,3 ± + + + + +

11 3B) LPTm3-K MI 5,4 ± + + + + + +

12 3B) LPTm3-K PT 5,4 ± + + + + +

13 4B) LPTm4-K MI 5,0 ± + + + + + +

14 4B) LPTm4-K PT 5,0 ± + + + + +

15 5B) LPT-K MI 5,4 ± + + + + + +

16 5B) LPT-K PT 5,4 ± + + + + +

17 7 diena 1A) LPT2m1-K MI 4,2 + + + + +

18 1A) LPT2m1-K PT 4,2 + + + + +

19 2A) LPT2m2-K MI 4,2 + + + + +

20 2A) LPT2m2-K PT 4,2 + + + + +

21 3A) LPT2-K MI 4,2 + + + + +

22 3A) LPT2-K PT 4,2 + + + + +

23 1B) LPTm1-K MI 5,0 + + + + + +

24 1B) LPTm1-K PT 5,0 + + + + + +

25 2B) LPTm2-K MI 4,3 + + + + + +

26 2B) LPTm2-K PT 4,3 + + + + + +

27 3B) LPTm3-K MI 4,3 + + + + + +

28 3B) LPTm3-K PT 4,3 + + + + + +

29 4B) LPTm4-K MI 4,3 + + + + + +

30 4B) LPTm4-K PT 4,3 + + + + + +

40

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Preparato terpės

variantas, tyrimo

vieta (MI, PT)

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Tiriamasis mėginys

Neigiama


31 5B) LPT-K MI 5,4 + + + + + +

32 5B) LPT-K PT 5,4 + + + + + +

33 15 diena 1A) LPT2m1-K MI 4,5 + + + + +

34 1A) LPT2m1-K PT 4,5 + + + + +

35 2A) LPT2m2-K MI 4,4 + + + + +

36 2A) LPT2m2-K PT 4,4 + + + + +

37 3A) LPT2-K MI 4,5 + + + + +

38 3A) LPT2-K PT 4,5 + + + + +

39 1B) LPTm1-K MI 5,0 + + + + + +

40 1B) LPTm1-K PT 5,0 + + + + + +

41 2B) LPTm2-K MI 4,3 + + + + + +

42 2B) LPTm2-K PT 4,3 + + + + + +

43 3B) LPTm3-K MI 4,3 + + + + + +

44 3B) LPTm3-K PT 4,3 + + + + + +

45 4B) LPTm4-K MI 4,3 + + + + + +

46 4B) LPTm4-K PT 4,3 + + + + + +

47 5B) LPT-K MI 5,4 + + + + + +

48 5B) LPT-K PT 5,4 + + + + + +

49 30 diena 1A) LPT2m1-K MI 4,5 + + + + +

50 1A) LPT2m1-K PT 4,5 + + + + +

51 2A) LPT2m2-K MI 4,4 + + + + +

52 2A) LPT2m2-K PT 4,4 + + + + +

53 3A) LPT2-K MI 4,5 + + + + +

54 3A) LPT2-K PT 4,5 + + + + +

55 1B) LPTm1-K MI 5,0 + + + + + +

56 1B) LPTm1-K PT 5,0 + + + + + +

57 2B) LPTm2-K MI 4,3 + + + + + +

58 2B) LPTm2-K PT 4,3 + + + + + +

59 3B) LPTm3-K MI 4,3 + + + + + +

60 3B) LPTm3-K PT 4,3 + + + + + +

61 4B) LPTm4-K MI 4,3 + + + + + +

41

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Preparato terpės

variantas, tyrimo

vieta (MI, PT)

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Tiriamasis mėginys

Neigiama


62 4B) LPTm4-K PT 4,3 + + + + + +

63 5B) LPT-K MI 5,4 + + + + + +

64 5B) LPT-K PT 5,4 + + + + + +



Žymėjimas:


2 – MI (Maisto institutas) tyrimai atlikti KTU Maisto instituto mikrobiologijos mokslo laboratorijoje;

3 – PT (Pieno tyrimai) tyrimai atlikti VĮ „Pieno tyrimai“ mikrobiologijos laboratorijoje.


Lentelėje pilka spalva paryškinti kontroliniai preparatai LPT ir LPT2, į kurių terpę nepridėta priedų.

42

Gautų tyrimo rezultatų palyginimas atliktas naudojant MacNemar testą, lyginant

modifikuotus preparatus su kontroliniais preparatais LPT ir LPT2.

4.3.10 lentelė. Modifikuotų preparatų LPT ir LPT2 palyginimo rezultatai

Testai McNemar testas

2(p-reikšmė)

Sutapimo

koeficientas,

Jautrumas (95% CI) Specifiškumas (95% CI)

LPT2 – LPT2m1 1,333 (0,25*) 0,937 1,0 (0,96;1,0) 0,91 (0,78;0,97)

LPT2 – LPT2m2 1,333 (0,25*) 0,937 1,0 (0,96;1,0) 0,91 (0,78;0,97) LPT – LPTm1 1,333 (0,25*) 0,933 0,99 (0,93;1,0) 0,91 (0,76;0,98) LPT – LPTm2 1,333 (0,25*) 0,933 0,99 (0,93;1,0) 0,91 (0,76;0,98) LPT – LPTm3 2,25 (0,125*) 0,910 1,0 (0,95;1,0) 0,88 (0,72;0,95) LPT – LPTm4 0,8 (0,375*) 0,889 0,99 (0,93;1,0) 0,88 (0,72;0,95)

*Skirtumas statistiškai nereikšmingas, lyginant su pasirinktu reikšmingumo lygmeniu α=0,05

Palyginamieji LPT ir LPT2 preparatų bei modifikuotų preparatų LPTm1, LPTm2, LPTm3,

LPTm4 ir LPT2m1, LPT2m2 įvertinimai parodė, kad modifikuoti preparatai yra tinkami inhibitorių

likučiams žaliame piene nustatyti. Preparato LPT2 papildymui tiko 1 tirpaus krakmolo priedas,

kuriuo papildžius modifikuoto preparato terpę, jis buvo jautrus penicilinui 2 g/kg ir

oksitetraciklinui 100 g/kg. Preparato LPT2 jautrumą lyginant su modifikuotų preparatų LPT2m1 ir

LPT2m2 jautrumu statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, sutapimo koeficiento kappa

reikšmė gauta 0,937 (4.3.10 lent).

Preparato LPT papildymui tiko 0,03 natrio nitrito priedas, kuriuo papildžius preparato

terpę, jis buvo jautrus penicilinui 2 g/kg, sulfadiazinui 100 g/kg, neomicinui 30 g/kg,

eritromicinui 10 g/kg. Atlikus palyginamuosius tyrimus dviejose laboratorijose, statistiškai

reikšmingų skirtumų nenustatyta ir lyginant preparato LPT jautrumą su modifikuotų preparatų

LPTm1, LPTm2, LPTm3 ir LPTm4 jautrumu. Didžiausias sutapimo koeficientas gautas tarp LPT ir

LPTm1, LPT ir LPTm2 bei LPT ir LPTm3 preparatų (4.3.10 lent).

Modifikuotų testų metodika pateikta 4 priede.

4.4. Projekto rezultatų sklaida

Publikacijos

1. Straipsnio „Mikrobiologinių preparatų antibiotikų likučių piene nustatymui terpės sudėties

tobulinimas“ projektas į žurnalą „Maisto chemija ir technologija“ (žr. 3 priedą).

2. Žvirdauskienė R., Šalomskienė J. Mikrobiologinių preparatų inhibitoriams piene nustatyti

sudėties tobulinimas. Lietuvos nacionalinės programos „Saugus ir sveikas maistas“ indėlis,

gerinant žaliavų kokybę ir didinant maisto produktų konkurencingumą: konferencijos

43

pranešimų medžiaga, Kaunas, 2013 m. spalio 25. Kauno technologijos universitetas. Maisto

institutas. Kaunas: Technologija, 2013. P. 44-45.

3. Šalomskienė J., Mačionienė I., Žvirdauskienė R., Sederevičius A. Biologinių ir cheminių

veiksnių įtaka antimikrobinių medžiagų tyrimams piene. Lietuvos nacionalinės programos

„Saugus ir sveikas maistas“ indėlis, gerinant žaliavų kokybę ir didinant maisto produktų

konkurencingumą: konferencijos pranešimų medžiaga, Kaunas, 2013 m. spalio 25. Kauno

technologijos universitetas. Maisto institutas. Kaunas: Technologija, 2013. P. 36.

Pranešimai

1. R. Žvirdauskienės pranešimas 2013-10-25 “Mikrobiologinių preparatų inhibitoriams piene

nustatyti sudėties tobulinimas“ KTU MI konferencijoje;

2. Numatomas J. Šalomskienės pranešimas „Metodikos inhibitorinėms medžiagoms žaliame

piene nustatyti modifikuotais LPT ir LPT2 testais parengimas“ Lietuvos Pienininkystės

Nacionalinio komiteto posėdyje š. m. gruodžio mėn.

5. Išvados ir rekomendacijos

5.1. Išvados

1. Geobacillus stearothermophilus DSM 6790, įsigytos iš DSMZ (Vokietijos mikroorganizmų

kolekcijos), jautrumas neatitiko LST ISO/TS 26844:2010 ir tuo pačiu ES reikalavimų.

2. Preparatų LPT ir LPT2 modifikavimo esmė – terpės sudėties papildymas: LPT2 (terpės pH 7) –

1,0 % tirpaus krakmolo priedu, LPT (terpės pH 8) – 0,03 NaNO2 priedu.

3. Modifikuotų LPT ir LPT2 preparatų palyginamasis įvertinimas su LPT ir LPT2 preparatais

parodė, kad modifikuoti preparatai jautrūs pagrindinių antimikrobinių medžiagų DLK piene

(pagal ES reikalavimus): modifikuotas LPT preparatas jautrus penicilinui 2 g/kg, sulfadiazinui

100 g/kg, neomicinui 30 g/kg, eritromicinui 10 g/kg, modifikuotas LPT2 preparatas jautrus

penicilinui 2 g/kg ir oksitetraciklinui 100 g/kg.

4. Nustatyta modifikuotos sudėties preparatų vartojimo trukmė, laikant juos nuo 0 C iki

+5C temperatūroje: plokštelių tipo preparato – 7 dienas, kiuvečių tipo preparato – 21 diena.

5. Patikslinta metodika inhibitorinių medžiagų nustatymui žaliame karvių piene modifikuotais

LPT ir LPT2 testais.

44

5.2. Rekomendacijos

1. Rekomenduojama taikyti modifikuotus LPT ir LPT2 testus inhibitorių likučių nustatymui

žaliame piene.

2. Laikant kiuvečių tipo preparatus ilgiau kaip 21 dieną 0 – 5 ºC temperatūroje, pailgėja tyrimo

trukmė. Jeigu tenka vartoti preparatus iki 30 dienų po pagaminimo, laikant 0-5 ºC temperatūroje,

apie analizės pabaigą sprendžiama pagal neigiamą kontrolę.

3. Preparato LPT inkubavimo trukmei įtakos turi trimetoprimo kiekis terpėje. Sumažinus į terpę

pilamo trimetoprimo kiekį nuo 6 ml/1000 ml, kaip nurodyta standarte, iki 4 ml/1000 ml – preparato

LPT inkubavimo trukmė sutrumpėja 0,5 h, nesikeičiant preparato jautrumui.

SUDERINTA: ………………………

Žemės ūkio ministerijos

Maisto ūkio tyrimų priežiūros komisijos

pirmininkė

Lilija Tepelienė

2013 m. …………………… mėn. ….. d.

45

6. Literatūra

1. Ando Y. Mechanism of nitrite-induced germination of Clostridium perfringens spores // J. of

Applied Microbiology. 1980. No 49. P. 527-535.

2. Bentler W., Klemm W., Mehlich A. Ist die Beurteilung von Schlachttierkorpern nach dem

negativenergebnis der allgemeinen Hemmstofftests in der muskulatur noch vertretbar //

Fleischwirtschaft, 1994. 74 (10). S. 1093-1095.

3. Boison J.O. Committee on drugs and related topics. Drug residues in foods, diagnostics and test kits

// J. AOAC. Int. 2001. N. 84. P. 190-191.

4. Botsoglou N.A., Fletouris D.J. Drug Residues in Foods, Pharmacology, Food Safety, and Analysis.

Marcel Dekker, New York. 2001.

5. Braham R., Black W. D., Claxton J., Yee A.J. A rapid assay for detecting sulfonamides in tissues of

slaughtered animals // J. Food Prot. 2001. N. 64. P. 1565-1573.

6. Bugyei K., Black W., McEwen S. and Meek A.H. Detecting oxytetracycline residues in chicken

tissues using the Delvotest P system // J. Food Prot. 1994. N. 57. P. 141-145.

7. Burgess S.A., Lindsay D., Flint S.H. Thermophilic bacili and their importance in dairy processing //

Int. J. of Food Microbiology. 2010. N. 144. P. 215-225.

8. Commission decision of 14 February 1991 laying down certain methods of analysis and testing of

raw milk and heat-treated milk (91/180/EEC) // Official Journal of the European Communities.

1993. No 1.

9. Davis W.W., Stout T.R. Disc plate method of microbiological antibiotic assay, I. Factors

influencing variability and error // Appl. Microbiol. 1971. N. 22. P. 659-665.

10. Dixit A., Imteyaz S. et al. Sporulation and heat resistance of spores from Clostridium / Food

microbiology and safety. 2005, Vol. 70, Nr. 7. p. 367-372.

11. Ellerbroek L., Schramm G., Weise E., Reuter G. Mikrobiologischer Hemmstoffnachweis in Fleisch

// Fleischwirtschaft. 1994. N. 74 (4). S. 413-416.

12. Fields M.L., Finely N. Effects of carbohydrates in phosphate buffer on germination of Bacillus

stearothermophilus spores // J. of Applied Microbiology. 1963. Vol.11. P. 453-457. 13. Foerster H.F. Activation and Germination Charasteristics Observed in Endospores of Thermophilic Strains

of Bacillus // Arch Microbiol. 1983. 134(3). P. 175-181.

14. Fugate H.G. Determination of antibiotic residues in animal tissues // Microbiology Laboratory

Guidebook. Food Safety and Inspection Service, 1974.

15. Goudin V., Maris P. Development of a biosensor-based immunoassay for screening of

chloramphenicol residues in milk // Food and Agricultural Immunology. 2001. N. 13(2). P. 77-86.

16. Haapoja A., Korkeala H. Antimicrobial residues in milk. Comparison of different agar diffusion

methods // Acta vet. Scand. 1984. N. 25. P. 250-259.

17. Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.5500 Bacterial DNA Damage or Repair Tests. US,

1998. P. 1-5.

18. Yasuda Y., Kanda K., Nishioka S., Tanimoto Y., Kato C., Saito A., Fukuchi S., Nakanishi Y.,

Tochikubo K. Regulationo of L-alanine-initiated germination of Bacillus subtilis spores by planine

rasemase // Amino Acids. Springer-Verlag. 1993. N. 4. P. 89-99.

19. Yokota A., Sasajima K. Derepressed syntheses of sporulation marker enzymes in a Bacillus species

mutant. Agric. Biol. Chem. 1981. Vol. 45. N. 11. P. 2417-2423.

20. Kaul A., Singh R.S. Production of stable Bacillus stearothermophilus spores // J. Food Protect.

1982. Vol. 45. N. 9. P. 795-796.

21. Кощеев, В. Антимикробные материалы в медицине Москва, 1987.

22. Kumar N., Raghu H.V., Kumar A., Haldar L., Khan A., Rane Sh., Malik R.K. Spore germination

based assay for monitoring antibiotic residues in milk at dairy farm // World J. Mikrobiol

Biotechnol. 2012. N. 28. P. 2559-2566.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6615124


46

23. Lasiskaitė A. Čerkašina, A. Pavilonis, V. Vaičiuvėnas. Medicinos mikrobiologija ir virusologija.

Kaunas, 2003. p. 77 – 84.

24. Lee W. H., John Ordal Z. Reversible activation for germination and subsequent changes in bacterial

spores / Department of food Technology, 1982. p. 207-215.

25. Magdoub M.N.I., Shehata A.E., El-Samragy Y.A., Hassan A.A. Interaction of heat shock,

manganese, L-alanine, -alanine and nisine in spore germination of some psychrotrophic Bacillus

strains in milk // Milchwissenshaft. 1984. Vol. 39. N. 3. S. 159-162.

26. Mallidis C.G., Scholefield I. Evaluation of recovery media for heated sopores of Bacillus

stearothermophilus // J. of Applied Bacteriology. 1986. Vol. 61, No 6. P. 517-523.

27. McCracken A., O’Brien J. J., Campbell N. Antibiotic residues and their recovery from animal

tissues // J. Appl. Bacteriol. 1976. N. 41. P. 129-135.

28. Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах

животноводства, утв. 29. 06. 1984. Nr. 3049. C. 84.

29. Moir A. Spore germination. In Biology of Bacilli: Applications to Industry ed. Doi R.H. and

McGloughlin. Boston: Butterworth-Heinemann, 1992, P. 23-38.

30. Okerman L., Croubels S., Cherlet M., De Wasch K., De Backer P., van Hoof J. Evaluation and

establishing the performance of different screening tests for tetracycline residues in animal tissues //

Food Addit. Contam. 2004. N. 21. P. 145-153.

31. Okerman L., Croubles, S., De Baere S., van Hoof J., De Backer P., De Brabander, H. Inhibition

tests for detection and presumptive identification of tetracyclines, beta-lactam antibiotics and

quinolones in poultry meat // Food Addit. Contam. 2001. N. 18. P. 385-393.

32. Renard L., Moulin G., Sanders P. Using experimental design to optimize a microbial diffusion

assay. J. AOAC. Int. 1992. N. 75. P. 1045-1048.

33. Rózanska H. Fałszywie dodatnie lub ujemne winiki w wykrywaniu pozostałości antibiotików //

Medycyna Wet. 1996. N. 52 (3). S. 167-169.

34. Santis E.P., Mazzette R. Determination of antibiotic chemicals using microbiological tests:

evaluation of the limits of sensitivity // Bollettino Della Societa Italiana di Biologia Sperimentale.

1991. N. 67(6). P. 561-568.

35. Setlow B. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and

chemicals. J Appl Microbiol. 2006. 101, 3. P. 514-25.

36. Setlow B., Melly E., Setlow P. Properties of Spores of Bacillus subtilis Blocked at an Intermediate

Stage in Spore Germination. Journal of Bacteriology, 2001, Vol. 183, No. 16. P. 4894-4899.

37. Setlow P., Johnson E. A. Spores and their significance. Food microbiology fundamentals and

frontiers. Edited by M. P. Doyle, L. R. Beuchat, Waschington, 2005. P. 30-49.

38. Taylor R.B., Zhu Z.Y. Mechanism for synergism between sulphonamides and trimethoprim

clarified // J Pharm Pharmacol. 1996. N. 48 (9). P. 981-984.

39. Tang J.S., Gillevet P.M. Reclassification of ATCC 9341 from Micrococcus luteus to Kocuria

rhizophila. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003, 53. P. 995-997.

40. Tingting Z., Dong Zh., Setlow P., Li Y. Kinetics of Germination of individual spores of Geobacillus

stearothermophilus as measured by Raman spectroscopy and differential interference contrast

microscopy // Plos one. Vol. 8 (9). P. 1-11.

http://europepmc.org/search;jsessionid=C0scCzw1shzHnGdWlwZB.48?page=1&query=AUTH:%22De+Santis+EP%22

http://europepmc.org/search;jsessionid=C0scCzw1shzHnGdWlwZB.48?page=1&query=AUTH:%22Mazzette+R%22

http://europepmc.org/search?page=1&query=ISSN:%220037-8771%22&restrict=All+results

47

PRIEDAI

48

1 PRIEDAS. Mikrobiologinių metodų inhibitorinių medžiagų nustatymui aptikimo ribos

Antibiotikų ir kitų

kenksmingų medžiagų

pavadinimas

MRL

(leistina

maksimali

riba, ES)

Įmonių naudojami

testai VĮ Pieno tyrimai testai

β - Laktamai Delvotest®SP-NT

(laboratorijose) LPT LPT2

Aptikimo ribos

Penicilinas (benzinpencilinas) 4 1-2 2 2

Ampicilinas 4 4 - -

Amoksicilinas 4 2-3 3 3

Kloksacilinas 30 20 15 30

Dikloksacilinas 30 10 - -

Oksacilinas 30 10 - -

Cefacetrinas 125 20 - -

Cefaleksinas 100 50 80 80

Cefaloniumas 20 5-10 - -

Cefoperazonas 50 40 - -

Ceftiofurai 100 25-50 - -

Cefapirinas 60 5 - -

Cefazolinas 50 25 - -

Tetraciklinai

Chlortetraciklinas (sum) 100 200 >1800 150

Doksiciklinas 0 100-150 - 100

Oksitetraciklinas (sum) 100 250-500 700 100

Tetraciklinas (sum) 100 250-500 700 50

Sulfonamidai

Sulfametazinas 100 50 400 -

Sulfadiazinas 100 25-50 150 -

Dapsonas 0 0,5-1 1 -

Makrolidai

Eritromicinas 40 40-80 5 -

Spiramicinas 200 400-600 - -

Tilozinas 50 30 - -

Aminoglikozidai

Gentamicinas 100 50 4 100

Kanamicinas 150 5000 - -

Neomicinas 1500 100-200 30 100

DH Steptomicinas 200 > 1000 30 400

Įvairūs chinolonai

Bacitracinas 100 1000-2000 - -

Chloramfenikolis 0 250 - -

Kolistinas 50 1000-5000 - -

Linkomicinas 150 200 - -

Novobiocinas 50 1000 - -

Rifaksiminas 60 >25 - -

Pirlimicinas 100 20-100 - -

Tiamfenikolis 50 > 1000 - -

Trimetoprimas 50 50-100 - -

49

2 PRIEDAS. Tyrimų planas

Patikslintos sudėties preparatų LPT ir LPT2 išbandymas

VĮ “Pieno tyrimai” ir KTU MI

Preparatų gamybos vieta ir data: KTU MI, 2013-09-24, 14.30-15.30 h.

LPT ir LPT2 pagaminti plokštelėse ir kiuvetėse.

Numatoma LPT ir LPT2 plokštelių galiojimo trukmė – 7 dienos;

Numatoma LPT ir LPT2 kiuvečių galiojimo trukmė – 30 dienų.

Siūloma atlikti bandymą, ištiriant preparatus plokštelėse ir kiuvetėse lentelėje pateiktu grafiku:

Bandymo data

LPT ir LPT2 plokštelės LPT ir LPT2

kiuvetės

Kontrolė Bandymas Bandymas

Po pagaminimo 1 d.

2013-09-25 x x x

Po 3 d. 2013-09-27 x x

Po 5 d. 2013-09-29 x x

Po 7 d. 2013-10-01 x x

Po 10 d. 2013-10-04 x

Po 20 d. 2013-10-14 x

Po 30 d. 2013-10-24 x

Parengė:

KTU MI Mikrob. mokslo lab. vedėja Joana Šalomskienė

50

3 PRIEDAS. Straipsnio projektas

Mikrobiologinių preparatų antibiotikų likučių piene nustatymui

terpės sudėties tobulinimas

Joana Šalomskienė, Renata Žvirdauskienė

KTU Maisto institutas, Taikos pr. 92, LT-51180 Kaunas,

Tel.: 8-37 312141, el. paštas [email protected]

Santrauka. Ištirta galimybė prailginti mikrobiologinių preparatų, skirtų antibiotikų likučiams

žaliame piene nustatyti, vartojimo trukmę. Atrinkti sporų išaugimo aktyvatoriai ir ištirta jų įtaka

Geobacillus stearothermophilus sporų išaugimui. Nustatyta, kad 0,03 natrio nitrito priedas turi

teigiamos įtakos preparatų vartojimo trukmės pailginimui. Preparatas, kuriuo terpės pH 8, buvo

jautrus penicilinui 2 g/kg, sulfadiazinui 100 g/kg, neomicinui 30 g/kg, eritromicinui 10 g/kg.

Atlikus palyginamuosius tyrimus dviejose laboratorijose nustatyta, kad tyrimų rezultatai, gauti

tiriant pieno mėginius su standartiniais antibiotikų tirpalais modifikuotais ir nemodifikuotais

preparatais, sutampa. Preparatų galiojimo laikas pailgėjo nuo 3 dienų iki 7 dienų (plokštelių formos

preparato) ir iki 21 dienos (kiuvečių formos preparato).

Raktažodžiai: preparatas, Geobacillus stearothermophilus, sporos, natrio nitritas, jautrumas,

palyginimas.

Įvadas

Pieno rūšiavimui daugelyje pasaulio šalių naudojamas mikrobiologinis difuzijos į agarą

metodas su jautria Geobacillus stearothermophilus kultūra, įteisintas tarptautiniu standartu ISO/TS

26844:2006 (Pienas ir pieno produktai. Antimikrobinių medžiagų likučių nustatymas. Difuzijos

mėgintuvėliuose metodas). Šio metodo jautrumas atitinka ES reikalavimus.

Mikrobiologinių metodų antimikrobinėms medžiagoms nustatyti jautrumui įtakos turi tokie

veiksniai: bakterijų kultūros jautrumas inhibuojančioms medžiagoms, sporų susidarymas bei sporų

augimo intensyvumas, jautrios kultūros kiekis terpėje. Ne mažiau svarbūs veiksniai yra ir mėginio

paruošimas tyrimui, naudojamų terpių savybės, nes atskirų antibiotikų išskyrimui naudojamos

skirtingų pH terpės [Bentler W. ir kt. (1994); Fugate H.G. (1974); Ellerbroek L. ir kt. (1994)].

Kiekybiniuose mikrobiologiniuose metoduose jautri kultūra ir terpės pH parenkami

atsižvelgiant į tyrimo tikslą. Tiriant penicilino likučius, optimalia kultūra laikoma

G. stearothermophilus ir mažesnio rūgštingumo terpė, kurios pH 8,0, tetraciklino B. cereus ir

terpė, kurios pH 5,7 5,9, aminoglikozidus – B. subtilis ir terpė, kurios pH 8,0 [McCracken A. ir kt.

51

1976; Bugyei K. ir kt. (1994); Braham R. ir kt. (2001); Okerman L. ir kt. (2001); Okerman L. ir kt.

(2004)]. Tinkamas terpės pH parinkimas sudaro galimybę geresniam antibiotiko difundavimui iš

tiriamos medžiagos [Boison J.O. (2001)].

Svarbu ne tik parinkti jautrią kultūrą, bet ir nustatyti tinkamą tos kultūros kiekį terpėje.

Paprastai jis svyruoja nuo 104

iki 106 KSV/ml terpės. Priimta, kad norint gauti didesnį testo

jautrumą, būtina parinkti mažiausią optimalią jautrios kultūros koncentraciją terpėje [Rózanska H.

(1996); Renard L. ir kt. (1992)]. Testo jautrumas sumažėja, kai sporų koncentracija per maža, nes

tuomet neužtikrinamas reikiamas kultūros augimas duotu laiko momentu, ir per didelė, nes tuomet

pastebimas per didelis bakterijų augimas ir augimo sustabdymo zonos tampa neaiškiomis

[Davis W.W. ir kt. (1971)].

Sporas sudarančioms bakterijoms sporų susidarymas natūralus fiziologinis procesas,

tačiau jis nėra būtinas gyvybės ciklo etapas. Esant palankioms mitybos sąlygoms, šios bakterijos

gali ilgai vystytis, nesudarydamos sporų. Optimali sporų susidarymui temperatūra ir pH tokie pat,

kaip ir bakterijų vystymuisi. Daug kartų pastebėta, kad daugelis organinių medžiagų ir mineralinių

jonų sustiprina sporų susidarymą [Foerster H.F. (1983)].

Žinoma, kad sporų sudygimą skatina daugelis veiksnių: pH, temperatūra, terminis

apdorojimas, sporų koncentracija ir terpės sudėtis [Moir A. (1992)]. Kaip vyksta skatinimo procesas

nėra aišku, tik žinoma, kad kai kurioms bakterijų rūšims šis procesas yra grįžtamas. Vienu iš

charakteringų procesų, lydinčių sporų susidarymą, yra piridino-2,6-dikarbolinės rūgšties (dipikolinė

rūgštis, angl. DPA) [Setlow P. ir kt. (2005)] ir kalcio jonų susikaupimas jose ekvimoliariniais

kiekiais.

Bakterijų sporoms augimo procesas susideda iš kelių etapų: aktyvavimo, inicijavimo ir

išaugimo. Bendras aktyvavimo faktorius terminis sporų suspensijos apdorojimas. Įvairūs autoriai

siūlo skirtingus terminio apdorojimo režimus: 65-85 C be išlaikymo [Magdoub M.N.I. ir kt.

(1984)], 80 C per 10 min [Kaul A. ir kt. (1982)], 115 C per 1 s [Yokota A ir kt. (1981)]. Suteikus

sporoms atitinkamą stimulą, jos sudygsta ir suaktyvėja jų metabolinės reakcijos. Tada sporų

populiacijoje sudygimas yra inicijuojamas žymiai greičiau. Sporų sudygimo aktyvacija įvairioms

bakterijų rūšims šiek tiek skiriasi [Setlow P. ir kt. (2005)]. Sporos suaktyvinimas įvyksta tada, kai ji

gauna atitinkamą cheminį signalą. Tam tikros sporogeniškųjų bakterijų rūšys turi specialius

receptorius, kurie praneša apie aplinkoje esančius energijos šaltinius: L-alaniną, adenoziną ir kt.

Jungtį su aktyvatoriais aktyvina sporoje esantis autolizinas, pvz., lizocimas, kuris greitai suardo

kortekso peptidoglikaną [Lasiskaitė A. ir kt. (2003)].

52

Po aktyvavimo sporos įgyja gebėjimą sudygti. Sporų sudygimo skatinimas daugeliui rūšių

gali būti sukeltas, panaudojus tam tikrus junginius, pvz., nukleozidus, amino rūgštis, cukrus,

druskas, dipikolinę rūgštį ir ilgų grandinių alkilaminus. Kai kurių bakterijų rūšių sporos sudygti gali

būti skatinamos neorganinėmis druskomis – mangano, geležies, magnio. Tikslus mechanizmas,

kodėl šie junginiai skatina sporų sudygimą, nėra aiškus [Setlow P. ir kt. (2005)]. Efektyviausi sporų

sudygimo stimuliatoriai – angliavandeniai, amino rūgštys ir neorganiniai jonai. Iš angliavandenių

sporų išaugimui būtiniausia gliukozė. Tikslus angliavandenių poveikio mechanizmas iki šio laiko

nėra tiksliai nustatytas, neaiškus ir dabar. Angliavandenių priedai 0,0083 mol/l fosfatiniame

buferyje (pH 7,1) stimuliuoja Bacillus stearothermophilus NCA 1518 sporų sudygimą:

monosacharidai – 0,001 mol/l ir 0,1 mol/l gliukozės, 0,01 mol/l fruktozės koncentracija;

disacharidai – 0,1 mol/l sacharozės koncentracija; polisacharidai – 2 % dekstrino ir 2 % krakmolo

koncentracija [Fields M.L. ir kt. (1963)]. Kaip vienas iš būdų aktyvuoti G. stearothermophilus

sporų sudygimą gali būti jų inkubavimas 0,2 M natrio nitrito tirpale (pH 8,0) 30 ºC temperatūroje

17 h [Tingting Z. ir kt. (2013)]. Sporų aktyvavimo nitritais mechanizmas niekada nebuvo tirtas

detaliai, tačiau manoma, kad jis susijęs su sporų kortekso kovalentine modifikacija dėl azoto

rūgšties poveikio [Ando Y. (1980)]. Teigiama tirpaus krakmolo įtaka nustatyta ir anksčiau [Mallidis

C.G. (1986)].

Termofilinių bakterijų sporų sudygimui reikalingas kritinis kalcio dipikolinato kiekis.

Intensyvus G. stearothermophilus sporų susidarymas pastebimas pridedant į mitybos terpę 0,1 K, Na

nitratų [Lasiskaitė A. ir kt. (2003)].

Reikiamu momentu panaudojant vieną ar keletą galimų sporų sudygimo stimuliatorių ir

suderinus kitus veiksnius – optimalią temperatūrą, terpės pH ir kt., galima tikėtis ne tik padidinti

preparatų inhibitorių piene nustatymui jautrumą vienai ar kitai antibiotikų grupei, sutrumpinti tyrimo

laiką, bet ir prailginti preparatų vartojimo trukmę. Preparatų vartojimo trukmės prailginimas šiuo metu

yra aktuali problema, kadangi jų galiojimo trukmė yra 3 paros, laikant juos nuo 0 ºC iki +5 ºC

temperatūroje.

Darbo tikslas – parinkus tinkamus stimuliatorius G. stearothermophilus kultūros augimui

preparato terpėje, prailginti preparatų galiojimo trukmę.

Medžiagos ir metodai.

Preparatms gaminti naudota jautrios antibiotikams Geobacillus stearothermophilus kultūra

ATCC 10149, įsigyta iš Centrinės pieno tyrimų stoties (Nyderlandai) sporų suspensijos, užšaldytos

minus 20 C temperatūroje, pavidale.

Tyrimų metu naudoti antibiotikų standartiniai tirpalai: penicilino (penicillin G potasium salt),

sulfametazino, sulfadiazino, neomicino (neomycin sulfate), eritromicino, oksitetraciklino

53

(oxytetracycline dihidrate) - ICN Biomedicals Inc. (Ohio, JAV), dapsono (4-aminophenyl sulfone) –

Sigma Aldrich Chemie Gmbh. (Vokietija).

Standartiniai antibiotikų tirpalai buvo ruošiami: pirmieji skiediniai – steriliame vandenyje,

pora paskutiniųjų skiedinių piene be inhibitorių. Kadangi ne visi antibiotikai tirpūs vandenyje,

dapsonas, sulfametazinas ir eritromicinas tirpinti 96 etanolyje, oksitetraciklinas –

0,1 mol/l druskos rūgštyje (HCl), neomicinas – fosfatiniame buferiniame tirpale.

Visų tyrimų metu naudota neigiama kontrolė – žalias pienas be inhibitorių.

Preparatų terpės ruošimui naudoti: trimetoprimas Sigma Aldrich Chemie Gmbh. (Vokietija),

bromkrezolis Merck (JAV).

Modifikuojant terpę, jos sudėčiai papildyti naudoti atrinkti sporų sudygimo stimuliatoriai:

angliavandeniai (tirpus krakmolas, sacharozė, papildomas gliukozės kiekis), amino rūgštis L-

alaninas, natrio nitritas.

Naudotos mitybos terpės:

Mitybos agaras („Plate count agar“ – PCA), kurios sudėtis: kazeino triptonas 5,0 g; mielių

ekstraktas 2,5 g; bevandenė gliukozė 1,0 g; agaras 10-15 g; vanduo 1000 ml.

Mitybos terpė preparatų plokštelių ir kiuvečių užpildymui gaminta pagal LST ISO/TS

26844:2010 reikalavimus.


ištirpinama 1000 ml distiliuoto vandens. Į terpę, laikomą (65±1) °C vandens vonelėje, įpilama

20 ml bromkrezolio purpurinio (2,5 mg/ml) tirpalo ir 6 ml trimetoprimo (25 g/ml) tirpalo. Terpės

turinys gerai išmaišomas ir 2 N NaOH tirplu paderinamas terpės pH iki 8. Terpė atvėsinama iki

50 °C temperatūros ir, laikant terpę 50 °C temperatūros vandens vonelėje, įpilama 20 ml sporų

suspensijos. Tokia terpė išpilstoma į plokšteles po 165 l arba į kiuvetes po 300 l

Į kiekvieną plokštelės duobutę dozuota po 50 µl kontrolinio ar tiriamojo pieno mėginio, o į

kiuvetę – po 100 µl mėginio. Po vieną duobučių eilutę plokštelėje palikta tuščią, antra eilutė skirta

kontroliniams pieno be inhibitorių mėginiams. Likusios plokštelės duobučių eilutės užpildytos

pieno mėginiais su antibiotikų tirpalais (antibiotikų koncentracija parinkta pagal ES reikalavimus

metodo jautrumui patikrinti).

Preparatai su tiriamaisiais mėginiais inkubuoti 63±1 C temperatūroje termostate 5,0-6,0 h.

Rezultatai vertinti pagal terpės spalvą plokštelių duobutėse arba kiuvetėse. Tinkama inkubavimo

trukmė nustatyta pagal neigiamą kontrolę – duobutės arba kiuvetės su kontroliniu mėginiu terpės

spalva turi būti pasikeitusi iš violetinės į geltoną.

54

Tyrimų duomenys skaičiuoti EXCEL (Microsoft, JAV) programa. Palyginamieji tyrimų

duomenys apdoroti naudojant SPSS programinį paketą (SPSS Inc., Il, JAV).

55

Tyrimo rezultatai

Modifikuojant preparatų terpę, jos sudėtis papildyta ankstesnių tyrimų metu atrinktais sporų

sudygimo stimuliatoriais. Pagamintos skirtingos preparatų terpės, naudojant jautrios kultūros

G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensiją ir pridedant į terpę skirtingus priedus,

atrinktus tyrimų metu ir remiantis literatūros duomenimis [Magdoub M.N.I. ir kt. (1984);

Yasuda Y. ir kt. (1993); Kumar N. ir kt. (2012); Tingting Z. (2013)]: tirpų krakmolą, gliukozės,

išrūgų miltelių ir lieso pieno miltelių mišinį, gliukozę, sacharozės ir L-alanino mišinį, krakmolo ir

gliukozės mišinį, NaNO2.

Paruošti 7 skirtingi variantai terpės:

8) terpė be priedo (kontrolinis preparatas);

9) terpė su 0,2 gliukozės, 0,8 išrūgų miltelių ir 2,0 lieso pieno miltelių priedu;

10) terpė su 1,0 sacharozės ir 0,2 L-alanino priedu;

11) terpė su 1,0 tirpaus kramolo ir 0,2 gliukozės priedu;

12) terpė su 0,2 gliukozės priedu;

13) terpė su 1,0 tirpaus krakmolo priedu;

14) terpė su 0,03 NaNO2 priedu.

Preparatų terpės pH 63 C temperatūroje paderintas iki pH 8, įpilta 0,2

G. stearothermophilus ATCC 10149 sporų suspensijos ir išpilstyta į mikroplokštelių duobutes po

165 l bei į kiuvetes po 300 l.

Pagamintų preparatų (plokštelių ir kiuvečių) jautrumas tikrintas gamybos dieną, 3 dienas po

pagaminimo, 7 dienas po pagaminimo, 14 dienų po pagaminimo. Kiuvečių preparatų jautrumas dar

tikrintas 22 dienas po pagaminimo ir 30 dienų po pagaminimo.

Tyrimai parodė, kad preparatų terpės sudėčiai papildyti labiausiai tiko 0,03 NaNO2 priedas,

nes preparatai su šiuo priedu buvo jautrūs standarte nurodytoms antibiotikų koncentracijoms visų

tyrimų metu (1 –3 lent.). Jų jautrumas labiausiai sutapo su kontrolinių preparatų, kurių terpė nebuvo

papildyta jokiais priedais, jautrumu. Plokštelių formos preparatai išlaikė savo jautrumą 7 dienas,

nesikeičiant tyrimo trukmei (2 lent.). Kiuvečių formos preparatai buvo jautrūs 21 dieną, nuo 22

dienos tyrimo trukmė pailgėjo (3 lent.).

Preparatai, kurių terpė buvo papildyta kitais sporų sudygimą skatinančiais priedais –

gliukozės, išrūgų miltelių ir lieso pieno miltelių mišiniu, gliukoze, sacharozės ir L-alanino mišiniu,

krakmolo ir gliukozės mišiniu arba nebuvo pakankamai jautrūs tiriamų antibiotikų tirpalams, arba

jų jautrumas neišilaikė ilgiau nei 3 paras laikant preparatus nuo 0 C iki +5 C temperatūroje.

56

1 lentelė. Modifikuotų preparatų terpės jautrumo antibiotikams įvertinimas (pagaminimo dieną ir 7 dienos po pagaminimo, laikant nuo 0 ºC iki +5 ºC

temperatūroje)

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Terpės priedas

Terpės

pH

Inkubavimo

trukmė, h

Kontrolinis tirpalas

Pavadinimas

Kon-

centra-

cija,

Neigiama


8 paga-

minimo

diena

Be priedų 8,0 5,5 – + + + + + – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,5 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 5,3 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,0 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 5,3 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,3 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +

8 3 dienos Be priedų - 8,0 5,5 – + + + + + – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,5 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 5,3 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,0 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 5,3 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,3 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +




57

2 lentelė. Modifikuotų preparatų terpės jautrumo antibiotikams įvertinimas (preparatų laikymo trukmė po pagaminimo – 7, 14 dienų nuo 0 ºC iki +5 ºC

temperatūroje)

Eil.

Nr.

Preparatas,

laikymo

trukmė,

dienos

Terpės priedas

Terpės

pH

Inkubavimo

laikas, h


Pavadinimas

Kon-

centra-

cija,

Žalias

pienas P2 P3 E10 N30 D2 O100 S400

8 7 dienos Be priedų - 8,0 6,0 – + + ± ± ± – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,3 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 6,0 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,0 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 6,0 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,3 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +

6 NaNO2 0,03 7,0 4,3 – + + – – + ± – 8 14 dienų Be priedų - 8,0 6,0 – + + + + + – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,5 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 5,3 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,3 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 5,3 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,3 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +




58

3 lentelė. Modifikuotų preparatų terpės jautrumo antibiotikams įvertinimas (preparatų laikymo trukmė po pagaminimo – 22, 30 dienų nuo 0 ºC iki +5 ºC

temperatūroje)

Eil.

Nr.

Preparatas,

laikymo

trukmė,

dienos

Terpės priedas

Terpės

pH

Inkubavimo

laikas, h


Pavadinimas

Kon-

centra-

cija,

Žalias

pienas P2 P3 E10 N30 D2 O100 S400

8 22 dienos Be priedų - 8,0 5,5 – + + + + + – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,5 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 5,5 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,0 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 5,5 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,5 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +

8 30 dienų Be priedų - 8,0 5,5 – + + + + + – +

9

Gliukozė

Išrūgų milteliai


0,2

0,8

2,0

8,0 5,5 – + + – ± + – +

10 Sacharozė

L-alaninas

1,0

0,2 8,0 5,5 – + + – – + – +

11 Krakmolas

Gliukozė

1

0,2 8,0 6,0 – + + ± ± + ± ±

12 Gliukozė 0,2 8,0 5,3 – + + ± – + – +

13 NaNO2 0,03 8,0 5,4 – + + + + + – +

14 Krakmolas 1,0 8,0 7,0 + + + + + + + +




59

Siekiant įvertinti 0,03 natrio nitrito priedo įtaka modifikuotų preparatų jautrumui, atlikti

palyginamieji preparatų tyrimai dviejose mikrobiologijos laboratorijoje.

Tyrimų metu buvo ištirta terpės pH koregavimo temperatūros įtaka preparato jautrumui.

Preparatų gamybos metu pastebėta, kad, pakoregavus terpės pH 63 C temperatūroje, sporų

supylimo į preparato terpę metu, kai terpės temperatūra būna nukritus iki 53 C, terpės pH būna

padidėjęs 0,2 pH vienetais. Pavyzdžiui, suderinus terpės pH 63 C temperatūroje iki 8,0, pilant į

terpę sporų suspensiją, esant 53 C temperatūrai terpės pH jau būna 8,21.

Trimetoprimas į terpę dedamas tam, kad būtų padidintas G. stearothermophilus jautrumas

sulfonamidams [Taylor R.B. (1996); Haapoja A. (1984)]. Trimetoprimo kiekis terpėje gali turėti

įtakos preparato jautrumui, nes literatūros duomenimis [Haapoja A. (1984)] mažesni trimetoprimo

kiekiai G. stearothermophilus jautrumą sulfonamidams didina, o 0,05 g/ml ir didesni kiekiai –

inhibuoja. Todėl vienu iš terpės gamybos variantu pasirinktas pagal standartą nurodyto 6 ml/l

trimetoprimo kiekio terpėje, kurios pH 8, sumažinimas iki 4 ml/l.

Palyginamiesiems tyrimams pagamintos 8 skirtingos preparato terpės:

4 lentelė. Palyginamiesiems tyrimams ruoštų preparatų terpės sudėtis ir ruošimo būdas

Eil.

Nr.

Preparato

kodas

G. stearother-

mophilus

ATCC 10149

(6,0x106

KSV/ml)

kiekis terpėje,

Sporų

stimulia-

torius

Terpės

pH

pH

pakorega-

vimo

tempera-

tūra, C

Terpės priedas

Terpės

priedo

kiekis,

ml/l

1 M1 2,5 0,03

NaNO2 8 63

Trimetoprimo

tirpalas 6

2 M2 2,5 0,03

NaNO2 8 63

Trimetoprimo

tirpalas 4

3 M3 2,5 0,03

NaNO2 8 53

Trimetoprimo

tirpalas 6

4 M4 2,5 0,03

NaNO2 8 53

Trimetoprimo

tirpalas 4

5 Kontrolė 2 nedėta 8 63 Trimetoprimo

tirpalas 6

Preparatų jautrumas tikrintas su standartiniais antibiotikų tirpalais: sulfadiazino 100 g/kg,

150 g/kg, 200 g/kg; neomicino 30 g/kg, eritromicino 10 g/kg, 150 g/kg, penicilino 2 g/kg,

3 g/kg.

60

5 lentelė. Plokštelių formos preparatų tyrimai dviejose laboratorijose

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Preparato terpės

variantas, tyrimo

vieta (A, B)

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Tiriamasis mėginys

Neigiama


1 1 diena 1B) M1-P1 A

2 6,0 + + ± + + +

2 1B) M1-P B3

6,0 + + ± + +

3 2B) M2-P A 5,25 + + ± + + +

4 2B) M2-P B 5,25 + + ± + +

5 3B) M3-P A 5,3 + + ± + + +

6 3B) M3-P B 5,4 + + ± + +

7 4B) M4-P A 5,0 + + ± + + +

8 4B) M4-P B 4,5 + + ± + +

9 5B) K-P A 5,4 + + ± + + +

10 5B) K-P B 5,4 + + ± + +

11 4 diena 1B) M1-P A 5,4 + + ± + +

12 1B) M1-P B 5,4 ± + ± + +

13 2B) M2-P A 5,25 ± + ± + +

14 2B) M2-P B 5,25 ± + ± + +

15 3B) M3-P A 5,3 + + ± + +

16 3B) M3-P B 5,25 + + ± + +

17 4B) M4-P A 4,25 ± + + ± + +

18 4B) M4-P B 4,25 ± + + ± + +

19 5B) K-P A 5,3 + ± +

20 5B) K-P B 5,25 + ± +

21 7 diena 1B) M1-P A 5,4 ± ± ± ± +

22 1B) M1-P B 5,4 ± ± ± ± +

23 2B) M2-P A 5,2 ± ± ± ± +

24 2B) M2-P B 5,2 ± ± ± ± +

25 3B) M3-P A 5,1 ± ± ± ± +

26 3B) M3-P B 5,1 ± ± ± ± +

27 4B) M4-P A 4,3 ± ± ± ± + +

28 4B) M4-P B 4,3 ± ± ± ± + +

29 5B) K-P A 5,2 + ± + +

30 5B) K-P B 5,1 + ± + +

61

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Preparato terpės

variantas, tyrimo

vieta (A, B)

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Tiriamasis mėginys

Neigiama


31 15 diena 1B) M1-P A 5,4 ± +

32 1B) M1-P B 5,4 ± +

33 2B) M2-P A 5,0 ± +

34 2B) M2-P B 5,0 ± +

35 3B) M3-P A 5,2 ± ± ± ± +

36 3B) M3-P B 5,15 ± ± ± ± +

37 4B) M4-P A 4,4 ± +

38 4B) M4-P B 4,3 ± +

39 5B) K-P A 5,15 ± +

40 5B) K-P B 5,15 ± +



Žymėjimas:


2 – A mikrobiologijos laboratorija;

3 – B mikrobiologijos laboratorija.


Lentelėje pilka spalva paryškinti kontroliniai preparatai K, į kurių terpę nepridėta priedų.

62

6 lentelė. Kiuvečių formos preparatų tyrimai dviejose laboratorijose

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Preparato terpės

variantas, tyrimo

vieta (A, B)

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Tiriamasis mėginys

Neigiama


1 1 diena 1B) M1-K1 A

2 5,4 ± + + + + + +

2 1B) M1-K B3

6,0 ± + + + + +

3 2B) M2-K A 5,2 ± + + + + + +

4 2B) M2-K B 5,3 ± + + + + +

5 3B) M3-K A 5,4 ± + + + + + +

6 3B) M3-K B 5,4 ± + + + + +

7 4B) M4-K A 5,0 ± + + + + + +

8 4B) M4-K B 5,0 ± + + + + +

9 5B) K-K A 5,4 ± + + + + + +

10 5B) K-K B 5,4 ± + + + + +

11 7 diena 1B) M1-K A 5,0 + + + + + +

12 1B) M1-K B 5,0 + + + + + +

13 2B) M2-K A 4,3 + + + + + +

14 2B) M2-K B 4,3 + + + + + +

15 3B) M3-K A 4,3 + + + + + +

16 3B) M3-K B 4,3 + + + + + +

17 4B) M4-K A 4,3 + + + + + +

18 4B) M4-K B 4,3 + + + + + +

19 5B) K-K A 5,4 + + + + + +

20 5B) K-K B 5,4 + + + + + +

21 15 diena 1B) M1-K A 5,0 + + + + + +

22 1B) M1-K B 5,0 + + + + + +

23 2B) M2-K A 4,3 + + + + + +

24 2B) M2-K B 4,3 + + + + + +

25 3B) M3-K A 4,3 + + + + + +

26 3B) M3-K B 4,3 + + + + + +

27 4B) M4-K A 4,3 + + + + + +

28 4B) M4-K B 4,3 + + + + + +

29 5B) K-K A 5,4 + + + + + +

30 5B) K-K B 5,4 + + + + + +

63

Eil.

Nr.

Preparato

laikymo

trukmė,

dienos

Preparato terpės

variantas, tyrimo

vieta (A, B)

Inkuba-

vimo

trukmė,

h

Tiriamasis mėginys

Neigiama


31 30 diena 1B) M1-K A 5,0 + + + + + +

32 1B) M1-K B 5,0 + + + + + +

33 2B) M2-K A 4,3 + + + + + +

34 2B) M2-K B 4,3 + + + + + +

35 3B) M3-K A 4,3 + + + + + +

36 3B) M3-K B 4,3 + + + + + +

37 4B) M4-K A 4,3 + + + + + +

38 4B) M4-K B 4,3 + + + + + +

39 5B) K-K A 5,4 + + + + + +

40 5B) K-K B 5,4 + + + + + +



Žymėjimas:


2 – A mikrobiologijos laboratorija;

3 – B mikrobiologijos laboratorija.


Lentelėje pilka spalva paryškinti kontroliniai preparatai K, į kurių terpę nepridėta priedų.

64

Gautų tyrimo rezultatų palyginimas atliktas naudojant MacNemar testą, lyginant

modifikuotus preparatus M1, M2, M3, M4 su kontroliniais preparatais K.

7 lentelė. Modifikuotų preparatų palyginimo rezultatai

Testai McNemar testas

2(p-reikšmė)

Sutapimo

koeficientas,

Jautrumas (95% CI) Specifiškumas (95% CI)

K – M1 1,333 (0,25*) 0,933 0,99 (0,93;1,0) 0,91 (0,76;0,98) K – M2 1,333 (0,25*) 0,933 0,99 (0,93;1,0) 0,91 (0,76;0,98) K – M3 2,25 (0,125*) 0,910 1,0 (0,95;1,0) 0,88 (0,72;0,95) K – M4 0,8 (0,375*) 0,889 0,99 (0,93;1,0) 0,88 (0,72;0,95)

*Skirtumas statistiškai nereikšmingas, lyginant su pasirinktu reikšmingumo lygmeniu α=0,05

Statistinis rezultatų apdorojimas parodė, kad modifikuotų ir kontrolinių preparatų jautrumas

inhibitorių likučiams analogiškas. Preparato papildymui tiko 0,03 natrio nitrito priedas, kuriuo

papildžius preparato terpę, jis buvo jautrus penicilinui 2 g/kg, sulfadiazinui 100 g/kg, neomicinui

30 g/kg, eritromicinui 10 g/kg. Atlikus palyginamuosius tyrimus dviejose laboratorijose, lyginant

kontrolinių preparatų jautrumą su modifikuotų preparatų M1, M2, M3 ir M4 jautrumu statistiškai

reikšmingų skirtumų nenustatyta. Didžiausias sutapimo koeficientas gautas tarp K ir M1, K ir M2

bei K ir M3 preparatų (7 lent).

Išvados

1. Preparatų modifikavimo esmė – jų terpės sudėties papildymas 0,03 NaNO2. Atlikus

kontrolinių preparatų ir modifikuotų preparatų palyginamąjį įvertinimą nustatyta, kad

modifikuoti preparatai yra jautrūs pagrindinių antimikrobinių medžiagų DLK piene (pagal

ES reikalavimus): modifikuoti preparatai jautrūs penicilinui 2 g/kg, sulfadiazinui

100 g/kg, neomicinui 30 g/kg, eritromicinui 10 g/kg.

2. Nustatyta modifikuotos sudėties preparatų vartojimo trukmė, laikant juos nuo 0 C iki

+5C temperatūroje: plokštelių tipo preparato – 7 dienos, kiuvečių tipo preparato – 21 diena.

Literatūra

1. Ando Y. Mechanism of nitrite-induced germination of Clostridium perfringens spores // J. of

Applied Microbiology. 1980. No 49. P. 527-535.

2. Bentler W., Klemm W., Mehlich A. Ist die Beurteilung von Schlachttierkorpern nach dem

negativenergebnis der allgemeinen Hemmstofftests in der muskulatur noch vertretbar //

Fleischwirtschaft, 1994. 74 (10). S. 1093-1095.

3. Boison J.O. Committee on drugs and related topics. Drug residues in foods, diagnostics and test

kits // J. AOAC. Int. 2001. N. 84. P. 190-191.

4. Braham R., Black W. D., Claxton J., Yee A.J. A rapid assay for detecting sulfonamides in

tissues of slaughtered animals // J. Food Prot. 2001. N. 64. P. 1565-1573.

5. Bugyei K., Black W., McEwen S. and Meek A.H. Detecting oxytetracycline residues in

chicken tissues using the Delvotest P system // J. Food Prot. 1994. N. 57. P. 141-145.

65

6. Davis W.W., Stout T.R. Disc plate method of microbiological antibiotic assay, I. Factors

influencing variability and error // Appl. Microbiol. 1971. N. 22. P. 659-665.

7. Ellerbroek L., Schramm G., Weise E., Reuter G. Mikrobiologischer Hemmstoffnachweis in

Fleisch // Fleischwirtschaft. 1994. N. 74 (4). S. 413-416.

8. Fields M.L., Finely N. Effects of carbohydrates in phosphate buffer on germination of Bacillus

stearothermophilus spores // J. of Applied Microbiology. 1963. Vol.11. P. 453-457. 9. Foerster H.F. Activation and Germination Charasteristics Observed in Endospores of Thermophilic

Strains of Bacillus // Arch Microbiol. 1983. 134(3). P. 175-181.

10. Fugate H.G. Determination of antibiotic residues in animal tissues // Microbiology Laboratory

Guidebook. Food Safety and Inspection Service, 1974.

11. Haapoja A., Korkeala H. Antimicrobial residues in milk. Comparison of different agar

diffusion methods // Acta vet. Scand. 1984. N. 25. P. 250-259.

12. Yokota A., Sasajima K. Derepressed syntheses of sporulation marker enzymes in a Bacillus

species mutant. Agric. Biol. Chem. 1981. Vol. 45. N. 11. P. 2417-2423.

13. Kaul A., Singh R.S. Production of stable Bacillus stearothermophilus spores // J. Food Protect.

1982. Vol. 45. N. 9. P. 795-796.

14. Lasiskaitė A. Čerkašina, A. Pavilonis, V. Vaičiuvėnas. Medicinos mikrobiologija ir

virusologija. Kaunas, 2003. p. 77 – 84.

15. Magdoub M.N.I., Shehata A.E., El-Samragy Y.A., Hassan A.A. Interaction of heat shock,

manganese, L-alanine, -alanine and nisine in spore germination of some psychrotrophic

Bacillus strains in milk // Milchwissenshaft. 1984. Vol. 39. N. 3. S. 159-162.

16. Mallidis C.G., Scholefield I. Evaluation of recovery media for heated sopores of Bacillus

stearothermophilus // J. of Applied Bacteriology. 1986. Vol. 61, No 6. P. 517-523.

17. McCracken A., O’Brien J. J., Campbell N. Antibiotic residues and their recovery from animal

tissues // J. Appl. Bacteriol. 1976. N. 41. P. 129-135.

18. Moir A. Spore germination. In Biology of Bacilli: Applications to Industry ed. Doi R.H. and

McGloughlin. Boston: Butterworth-Heinemann, 1992, P. 23-38.

19. Okerman L., Croubels S., Cherlet M., De Wasch K., De Backer P., van Hoof J. Evaluation and

establishing the performance of different screening tests for tetracycline residues in animal

tissues // Food Addit. Contam. 2004. N. 21. P. 145-153.

20. Okerman L., Croubles, S., De Baere S., van Hoof J., De Backer P., De Brabander, H. Inhibition

tests for detection and presumptive identification of tetracyclines, beta-lactam antibiotics and

quinolones in poultry meat // Food Addit. Contam. 2001. N. 18. P. 385-393.

21. Renard L., Moulin G., Sanders P. Using experimental design to optimize a microbial diffusion

assay. J. AOAC. Int. 1992. N. 75. P. 1045-1048.

22. Rózanska H. Fałszywie dodatnie lub ujemne winiki w wykrywaniu pozostałości antibiotików //

Medycyna Wet. 1996. N. 52 (3). S. 167-169.

23. Setlow P., Johnson E. A. Spores and their significance. Food microbiology fundamentals and

frontiers. Edited by M. P. Doyle, L. R. Beuchat, Waschington, 2005. P. 30-49.

24. Tingting Z., Dong Zh., Setlow P., Li Y. Kinetics of Germination of individual spores of

Geobacillus stearothermophilus as measured by Raman spectroscopy and differential

interference contrast microscopy // Plos one. Vol. 8 (9). P. 1-11.



66

4 PRIEDAS. Inhibitorių likučių nustatymas piene modifikuotais LPT ir LPT2 testais

1. TAIKYMO SRITIS

Šiame metode aprašomas mikrobiologinis inhibitorių testas, skirtas plataus spektro

antimikrobinių medžiagų aptikimui žaliame piene. Testas ruošiamas pagal LST ISO/TS 26844

reikalavimus, vietoj mėgintuvėlių naudojant mikroplokšteles kiuvetes.

2. NORMINĖS NUORODOS

Šiame skyriuje nurodyti dokumentai yra privalomi, taikant šį dokumentą. Datuotosioms

nuorodoms taikomi tik nurodyti leidimai. Nedatuotosioms nuorodoms taikomi nurodytų dokumentų

naujausi leidimai (įskaitant bet kuriuos keitinius).

LST ISO/TS 26844 Pienas ir pieno produktai. Antimikrobinių medžiagų likučių nustatymas.

Difuzijos mėgintuvėliuose metodas.

LST EN ISO 707 Pienas ir pieno gaminiai. Mėginių ėmimo nurodymai.

LST EN ISO 4833 Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis metodas. Kolonijų

skaičiavimo 30 0C temperatūroje metodas.

LST EN ISO 7218 Maisto ir pašarų mikrobiologija. Mikrobiologinių tyrimų bendrieji

reikalavimai ir rekomendacijos.

LST EN ISO 13969 Pienas ir pieno produktai. Nurodymai, kaip rengti inhibitorių nustatymo

mikrobiologinių metodų standartizuotus aprašymus.

LST EN ISO 18330 Pienas ir pieno produktai. Imuninio tyrimo arba receptorių tyrimo

antimikrobinių medžiagų likučiams aptikti standartizuoto aprašymo nurodymai.

Pieno supirkimo taisyklės, patvirtintos LR žemės ūkio ministro 2001 m. gegužės 9 d.

įsakymu Nr.146 (Žin., 2001, Nr.40-1406) ir šių taisyklių galiojantys keitiniai, paskelbti Valstybės

žiniose.

3. TERMINAI IR APIBRĖŽTYS

Inhibitorinės medžiagos – įvairios biologinės ar cheminės prigimties medžiagos,

slopinančios mikroorganizmų augimą.

Testas inhibitoriams – tai polimerinės medžiagos plokštelė, kurios duobutės užpildytos

standžia violetinės spalvos mitybos terpe su jautrios antibiotikams ir sulfamidams kultūros

Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 sporomis ir kiuvetes, užpildytas šia terpe.

Aptikimo riba – koncentracijos lygis, kuriame yra aptinkama 95% teigiamų mėginių.

67

4. METODO ESMĖ

Metodas pagrįstas tuo, kad dauginantis terpėje esančioms jautrioms antibiotikams ir

sulfamidams kultūros Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 sporoms susidaro rūgštis,

pakeičianti terpės spalvą iš violetinės į geltoną. LPT ir LPT2 testai skiriasi vienas nuo kito terpės

pH, naudojamais priedais ir jautrumu antibiotikams.

5. REAGENTAI

5.1. Terpė bendram bakterijų skaičiui nustatyti Difco Plate count agar.

5.2. Bromkrezolio purpurinis

5.3. Trimetoprimas.

5.4. Chloramfenikolis.

5.5. Sporų suspensija (Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149).

5.6. Penicilinas G (benzilpenicilinas).

5.7. Sulfadiazinas.

5.8. Oksitetraciklinas.

5.9. Neomicinas.

5.10. Eritromicinas.

5.11. Pienas be inhibitorinių medžiagų.

5.12. Dejonizuotas vanduo.

5.13. Etanolis.

5.14. Metanolis.

5.15. 0,1 N HCl.

5.16. 2 N NaOH.

5.17. Tirpus krakmolas.

5.18. Natrio nitritas.

6. ĮRENGINIAI

Naudojami įprastiniai ir toliau nurodyti specialieji mikrobiologijos laboratorijos įrenginiai.

6.1. Analitinės svarstyklės, kurių tikslumas ±0,1 mg.

6.2. pH-metras su automatine temperatūros kompensacija, ±0,01 pH vieneto tikslumo ir

elektrodais, tinkamais skysčių matavimui 63 ºC temperatūroje.

6.3. Autoklavas su nustatomu temperatūrų diapazonu nuo 105 ºC iki 121 ºC ir laiko

diapazonu nuo 1 min. iki 180 min.

6.4. Aštuonių kanalų dozavimo pipetė, kurios dozavimo ribos nuo 50 µl iki 1 200 µl.

68

6.5. Mikrotestų plokštelės (PS-polystyrene) 96-U P.S., kurių akučių tūris 300 µl.

6.6. iEMS inkubatorius, kuriame palaikoma 63,5 ºC ± 0,5 ºC temperatūra.

6.7. Kiuvetės plokščiais dugneliais, 2 ml talpos, netoksiškos, bespalvės, polimerinės

medžiagos su tokios pat medžiagos kamšteliais arba analogiškų kiuvečių plokštelės, uždengiamos

specialia lipnia juosta užsandarinimui.

6.8. Kiuvečių stovas, kuriame galima laikyti kiuvetes.

7. MĖGINIŲ ĖMIMAS

Į laboratoriją turi būti atsiųstas reprezentatyvus žalio pieno (toliau – pieno) mėginys. Jis

neturi būti pažeistas ar pakitęs gabenant ar laikant. Rekomenduojamas mėginių ėmimo metodas

pateikiamas LST EN ISO 707 ir Pieno supirkimo taisyklių 1 priede.

8. TIRIAMOJO MĖGINIO PARUOŠIMAS

Pieno mėginiai turi būti ištiriami kaip galima greičiau ir pageidautina per 24 valandas nuo

jų gavimo. Jei negalima mėginių ištirti per 24 valandas, jie turi būti laikomi užšaldyti ne aukštesnėje

kaip minus 18 ºC temperatūroje, kad būtų mažesnė penicilino inaktyvacija.

9. TYRIMO PROCEDŪRA

9.1. TERPĖS, REAGENTŲ IR SPORŲ SUSPENSIJOS RUOŠIMAS

9.1.1. Terpė bendram bakterijų skaičiui nustatyti “Plate count agar” ruošiama pagal gamintojo

instrukciją ir sterilizuojama autoklave 121 ºC ±1 ºC temperatūroje 15 minučių.

9.1.2. Bromkrezolio purpurinio tirpalas (žr. LST ISO/TS 26844:1010 5.2.2 p.).

9.1.3. Trimetoprimo tirpalas (žr. LST ISO/TS 26844:1010 5.2.4 p.).

9.1.4. Chloramfenikolio tirpalas (žr. LST ISO/TS 26844:1010 5.2.3 p.).

9.1.5. Sporų suspensija (Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149) (žr. LST ISO/TS

26844:2010 B priedą).

Naudojamos sporų suspensijos koncentracija turi būti apytikriai 5106

KSV/ml. Tikrinama

kiekvienos naujos sporų suspensijos partijos jautrumas standartiniams tirpalams. Naudojant testą

LPT2 (pH7), nustatomas sporų jautrumas benzilpenicilinui (2 µg/kg) ir oksitetraciklinui (100

µg/kg), o jautrumas sulfadiazinui (150 µg/kg), neomicinui (30 µg/kg) ir eritromicinui (10 µg/kg),

naudojant testą LPT(pH 8).

69

9.2. LPT IR LPT2 TESTŲ RUOŠIMAS

9.2.1. LPT (pH8) testas

Ištirpinama terpė (9.1.1). Į 1000 ml terpės suberiama 0,3 g natrio nitrito (5.18) ir išmaišoma, pilama

6 ml trimetoprimo (9.1.3) ir 20 ml bromkrezolio purpurinio (9.1.2) tirpalo. Sumaišoma, 63 ºC

temperatūroje paderinama, kad terpės pH būtų 8,00 ±0,02. Vėliau į 1000 ml terpės pilama apytikriai

20 ml sporų suspensijos (5106

KSV/ml). Sumaišoma ir dozuojama po 165 l terpės į kiekvieną

testo plokštelės duobutę arba po 300 l terpės į kiekvieną kiuvetę.

9.2.2. LPT2 (pH7) testas

Ištirpinama terpė (9.1.1). Į 1000 ml terpės suberiama 10 g tirpaus krakmolo (5.17), pilama 15 ml

chloramfenikolio (9.1.4) ir 20 ml bromkrezolio purpurinio (9.1.2) tirpalo. Sumaišoma, 63 ºC

temperatūroje paderinama, kad terpės pH būtų 7,0 ±0,1.Vėliau į 1000 ml terpės pilama apytikriai

20 ml sporų suspensijos (5106

KSV/ml). Sumaišoma ir dozuojama po 165 l terpės į kiekvieną

testo plokštelės duobutę arba po 300 l terpės į kiekvieną kiuvetę.

9.2.3. Laikymas

Testai turi būti laikomi nuo 0 ºC iki +5 ºC temperatūroje. Jų galiojimo trukmė: plokštelių – 7

dienos, kiuvečių – 21 diena.

9.3. STANDARTINIŲ TIRPALŲ IR KONTROLINIŲ MĖGINIŲ RUOŠIMAS

Pagal LST ISO/TS 26844:2010.

9.4. LPT IR LPT2 TESTŲ JAUTRUMO PATIKRA

Tikrinamas LPT testo jautrumas sulfadiazino, neomicino, eritromicino ir penicilino, o

LPT2 testo – penicilino ir oksitetraciklino įvairioms koncentracijoms.

9.4.1. LPT testo jautrumo tikrinimui į plokštelės pirmos eilutės duobutes nepilami jokie

mėginiai. Į antros eilutės duobutes dozuojama po 50 l kontrolinio žalio pieno be inhibitorių, į

trečios eilutės duobutes – po 50 l kontrolinio pieno mėginio su 100 g/l sulfadiazino, į ketvirtos

eilutės duobutes – po 50 l kontrolinio pieno mėginio su 150 g/l sulfadiazino, į penktos eilutės

duobutes – po 50 l kontrolinio pieno mėginio su 200 g/l sulfadiazino, į šeštos eilutės duobutes –

po 50 l kontrolinio pieno mėginio su 30 g/l neomicino, į septintos eilutės duobutes – po 50 l

kontrolinio pieno mėginio su 10 g/l eritromicino, į aštuntos eilutės duobutes - po 50 l kontrolinio

pieno mėginio su 3 g/l penicilino.

LPT kiuvečių testo jautrumo tikrinimui į pirmąją kiuvetę pilama 100 l kontrolinio žalio

pieno be inhibitorių, į antrą kiuvetę – 100 l kontrolinio pieno mėginio su 100 g/l sulfadiazino, į

70

trečią kiuvetę – 100 l kontrolinio pieno mėginio su 150 g/l sulfadiazino, į ketvirtą kiuvetę –

100 l kontrolinio pieno mėginio su 200 g/l sulfadiazino, į penktą kiuvetę – 100 l kontrolinio

pieno mėginio su 30 g/l neomicino, į šeštą kiuvetę – 100 l kontrolinio pieno mėginio su 10 g/l

eritromicino, į septintą kiuvetę – 100 l kontrolinio pieno mėginio su 3 g/l penicilino.

9.4.2. LPT2 testo jautrumo tikrinimui į plokštelės pirmos eilutės duobutes nepilami jokie

mėginiai. Į antros eilutės duobutes dozuojama po 50 l kontrolinio žalio pieno be inhibitorių, į

trečios eilutės duobutes – po 50 l kontrolinio pieno mėginio su 100 g/l oksitetraciklino, į

ketvirtos eilutės duobutes – po 50 l kontrolinio pieno mėginio su 150 g/l oksitetraciklino, į

penktos eilutės duobutes – po 50 l kontrolinio pieno mėginio su 200 g/l oksitetraciklino, į šeštos

eilutės duobutes – po 50 l kontrolinio pieno mėginio su 1 g/l penicilino, į septintos eilutės

duobutes – po 50 l kontrolinio pieno mėginio su 2 g/l penicilino, į aštuntos eilutės duobutes – po

50 l kontrolinio pieno mėginio su 3 g/l penicilino.

LPT2 kiuvečių testo jautrumo tikrinimui į pirmąją kiuvetę pilama 100 l kontrolinio žalio

pieno be inhibitorių, į antrą kiuvetę – 100 l kontrolinio pieno mėginio su 100 g/l oksitetraciklino,

į trečią kiuvetę – 100 l kontrolinio pieno mėginio su 150 g/l oksitetraciklino, į ketvirtą kiuvetę –

100 l kontrolinio pieno mėginio su 200 g/l oksitetraciklino, į penktą kiuvetę – 100 l kontrolinio

pieno mėginio su 1 g/l penicilino, į šeštą kiuvetę – 100 l kontrolinio pieno mėginio su 2 g/l

penicilino, į septintą kiuvetę – 100 l kontrolinio pieno mėginio su 3 g/l penicilino.

9.5. LPT ir LPT2 TESTŲ INHIBITORIAMS PIENE NUSTATYTI NAUDOJIMO

NURODYMAI

9.5.1. Pasiruošimas tyrimui

Į kiekvieną plokštelės duobutę dozuojama po 50 l kontrolinio ar tiriamojo pieno mėginio.

Į kiekvieną kiuvetę dozuojama po 100 l kontrolinio ar tiriamojo pieno mėginio.

Po vieną duobutę plokštelėje ir po vieną kiuvetę vieno tyrimo metu, skiriama

kontroliniams mėginiams:

a) LPT testui - penicilino kontrolinis mėginys, kurio koncentracija 3 g/kg;

b) LPT testui - neigiamos kontrolės mėginys;

c) LPT2 testui - oksitetraciklino kontrolinis mėginys, kurio koncentracija 100 g/kg;

d) LPT2 testui - neigiamos kontrolės mėginys.

Plokštelė paliekama 1 h kambario temperatūroje ant lygaus paviršiaus. Po 1 h plokštelė

apverčiama, nesusigėręs į duobutėse esančią terpę pienas nupilamas, plokštelės paviršius

71

nusausinamas popierine servetėle ir užsandarinamas lipnia juosta. LPT ir LPT2 testų plokštelės

inkubuojamos 4 h 15 min. ± 30 min. 63,5 ºC ± 0,5 ºC temperatūroje termostate. LPT ir LPT2 testų

kiuvetės uždengiamos kamšteliais ir inkubuojamos, nenupylus kontrolinio ar tiriamojo pieno

mėginių 4 h 15 min. ± 30 min. 63,5 ºC ± 0,5 ºC temperatūroje termostate.

9.5.2. Rezultatų vertinimas

Rezultatai vertinami pagal terpės spalvą duobutėse arba kiuvetėse. Tinkama inkubavimo

trukmė nustatoma pagal neigiamą kontrolę – duobutės arba kiuvetės su kontroliniu mėginiu terpės

spalva turi būti pasikeitusi iš violetinės į geltoną. Kontrolinių mėginių su antibiotikais terpės spalva

turi būti violetinė ar šviesiai violetinės spalvos. Tiriamajame piene yra inhibitorių ir inhibitorinės

medžiagos vertinamos „Rasta“, jeigu terpės spalva duobutėje arba kiuvetėje yra violetinė arba

teigiamos kontrolės mėginio spalvos. Tiriamajame piene inhibitorių nėra ir inhibitorinės medžiagos

vertinamos „Nerasta“, jeigu terpės spalva duobutėje arba kiuvetėje yra geltona.

10. REZULTATŲ IŠRAIŠKA

Tyrimo rezultatai išreiškiami atitinkamai rasta arba nerasta inhibitorinių medžiagų.

Documents

MOKSLINIŲ TYRIMŲ IR TAIKOMOSIOS VEIKLOS PROGRAMOS · 4 1. Įvadas Lietuvai integruojantis į ES, Rusijos ir kitų šalių rinką, būtina nuolat gerinti pieno produktų kokybę,