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生体画像イメージング
先進理工学科 生体機能システムコース
化学生物学研究室
准教授 瀧 真清
第12週
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Figure 9-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
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Figure 9-3b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
① 顕微鏡は生物学の実験には欠かせない
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Figure 9-42 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
光学顕微鏡 透過型電子顕微鏡
電子銃光源
集光レンズ
試料
対物レンズ
接眼レンズ 投影レンズ
眼（またはモニター） モニター
レンズはガラス製
レンズは磁気コイル製
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Figure 9-49 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
透過型電子顕微鏡
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Figure 9-45 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
透過型電子顕微鏡
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細胞壁
ゴルジ体
核（この中にDNAが詰まっている）
ミトコンドリア
リボソーム（蛋白質合成装置）
Figure 9-13 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
短い波長の光を反射し、長い波長の光を透過する
ある波長領域の光だけを透過する
蛍光顕微鏡
励起光蛍光
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Figure 9-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
励起光（吸収）
蛍光（発光）
SN
S1
S0
励起状態
基底状態
吸収のエネルギー＞発光のエネルギー
蛍光の原理
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蛍光色素の名前↓
★なぜ蛍光顕微鏡か？例：「抗体」蛋白質に蛍光基を結合させておけば、あらゆる生体物質を特異的に蛍光染色できる。
例：細胞分裂中の紡錘体蛋白質
←紡錘体蛋白質だけに結合する抗体
←緑色蛍光基
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結合→
Figure 25-37 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
40x25x6=6000種類の組み合わせ！
残り2本の可変領域は、約1000通りの組み合わせが可能
→ 6000 x 1000 = 600万種類 もの組み合わせが可能
転写
RNAスプライシング
Vl Dm Jn
第8週の復習：「抗体」蛋白質は、あらゆる物質に結合できる
抗体
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Figure 9-15 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
紡錘体微少管：緑色蛍光抗体セントロメア：赤色蛍光抗体染色体DNA：青色蛍光低分子色素
Figure 9-1411
http://optipedia.info/microscopy/clsm/clsm-principle/principle/を改変
よりハッキリした蛍光画像を！共焦点蛍光顕微鏡の原理
結像レンズ
焦点（ピント）があったときだけ、像が見える。
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Figure 9-21 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
ハエの腸（発生初期）中の、アクチン（筋肉蛋白質）染色
従来の蛍光顕微鏡 共焦点蛍光顕微鏡13
Figure 9-22 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
共焦点蛍光顕微鏡による花粉の３D画像作製
花粉自体に、天然の蛍光化合物が含まれている。
焦点深度を変えて撮影したもの（代表的な写真3枚/30枚中）
30枚の別々の写真を全て重ね合わせて再構築したもの
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Figure 9-24 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
蛍光蛋白質（GFP）を使った生細胞イメージング：
GFPのDNA－興味がある蛋白質のDNA
下村先生：ノーベル化学賞(2008年)
GFP蛋白質（蛍光！）－興味がある蛋白質
細胞内に上記融合DNAを入れると転写・翻訳反応がおこる
興味がある蛋白質に目印（蛍光）を付けて生細胞内での挙動を顕微鏡観察できる。
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GFP内で発色団(蛍光基)を形成する様子：３つのアミノ酸同士が絶妙な空間配置にいるため、酸素さえあれば、翻訳後にひとりでに起きるミラクルな反応！
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Figure 8-48 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
例：糖尿病関連蛋白質（インスリン）をコードするDNA
インスリン蛋白質↑
原理：第11週（遺伝子組み換え）の復習から
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Figure 8-48 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
「蛍光蛋白質（GFP）＋インスリン蛋白質」をコードする融合DNA
光るインスリン蛋白質↑18
現在では、人工的に改変された様々な蛍光蛋白質をコードする遺伝子が市販されている。
Figure 9-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
ナズナの葉表面の毛（電子顕微鏡）
ナズナに遺伝子導入して作製した、GFP融合型のアクチン結合蛋白質（共焦点蛍光顕微鏡）
GFP meets 共焦点顕微鏡
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緑：破壊したいものに目印を付ける酵素(GFP-Perkin)
赤：ミトコンドリア外膜
元気な細胞
福永研究員 未発表データ(2012年)
ミトコンドリアを損傷させた細胞
酵素が、損傷したミトコンドリアに目印をつけ、ミトコンドリアを破壊する準備をしている。
酵素は細胞質にいて、何もしていない。
GFP meets 共焦点顕微鏡
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Figure 9-32 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
GFPの親戚蛋白質：エクオリン発光蛋白質であるエクオリン（カルシウム存在下で発光する；カルシウムイオン検出）を、メダカの卵に注入して拡散させておく。
受精と同時に、カルシウム濃度が上昇して酵素が働き、卵細胞に2つ目の精子が入らないように、バリアを作る。
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21.3 Calcium Wave During Fertilization
When a sperm cell fuses with this sea urchin egg cell, calcium ions begin rushing
into the cell at the site of fusion.
In these experiments, calcium concentrations are visualized and measured
with a fluorescent dye that becomes increasingly brighter the more calcium is
present.
Brightness is then translated into a color scale, and, in this three-dimensional
display, into peak heights, where red and high peaks represent the highest
calcium concentrations.
A second rise of the calcium concentration can be observed after fertilization.
It occurs during the movement
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本学ではS専攻 白川英樹先生がご専門
Figure 9-33 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
カルシウム感応性低分子蛍光試薬fura-2による、脳神経細胞内のカルシウム濃度測定
赤が最高濃度青が最低濃度（擬似カラー）
他のニューロンから来るinput信号：樹状突起（10万個以上のアンテナ；シナプスと言う）で受ける。
信号のoutput：根本の軸索（1個）から送る。
Tsien, R.Y.ら (1985年). "A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties*". J. Biol. Chem. 260 (6): 3440–3450.
アンテナが作用するためには、カルシウムが重要であることが分かる。
酸素原子がCa2+と配位結合→芳香環の電子状態が変わり励起波長が変化する。
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金属イオンのような、見えないものが見えてくる
Ca2+
↓ in
↓ out
25.3 T Cell Activation
In this video we can see a T cell that becomes activated when it interacts with a
dendritic cell. The T cell is labeled with a dye that fluoresces when it binds calcium
ions. At the moment the T cell is not activated. Its intracellular calcium
concentrations are low, and so little green fluorescence is visible.
As the T cell contacts the surface of the dendritic cell, we can see it suddenly
fluoresce bright green as it becomes activated. However, it still continues to
move, crawling over the surface of the dendritic cell, perhaps to sample the cell’s
display of peptide:MHC complexes.
Eventually the T cell loses interest. While it is still contacting the dendritic
cell you can see the fluoresence start to fade. The T cell will eventually migrates
away from the dendritic cell.
T細胞（仕事人）が怪しい細胞を見つけ、興奮しながら細胞表面をボディーチェックし、ホシはシロと判断して立ち去る様子。
皆さんの体内で起こっている凄い駆け引き興奮するとカルシウム濃度が上がることに注目。
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T細胞
容疑者
蛍光化合物ライブラリー合成とiPS細胞染色試薬の探索
探索
シントン群 1
蛍光化合物ライブラリー 23（iPS細胞だけを蛍光染色する）
出典： C. N. Im et al., Angew. Chem. Int. Ed., 49, 7497 (2010).
低分子蛍光イメージング試薬－最新の話題１
iPS細胞だけを蛍光染色する意味：iPS細胞を用いた手法では、拒絶反応が起こらない臓器を試験管の中で作り出すことが可能。（患者由来の細胞から多能性のiPS細胞を作り、それを分化させることで臓器を作製）この時少しでも未分化の細胞が残っていると癌化の危険性が高まる。蛍光染色にて未分化のiPS細胞を識別できれば、癌化の危険性を持つ未熟な臓器を見分けられる。
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癌細胞だけを光らせるプローブ
癌の酵素がここを加水分解
1無蛍光（スピロ環構造） 2強い緑色蛍光（開環構造）
低分子蛍光イメージング試薬－最新の話題２
外科手術の際に癌細胞だけを特異的に光らせる：微小癌の摘出もれによる癌の再発防止に貢献できる。これら化合物の発光特性は、分子軌道計算によって論理的に精密に設計されたもの。
癌細胞表面にはペプチド分解酵素が多量に存在することを利用している。
出典： Y. Urano et al., Sci. Ttansl. Med., 3, 110ra119 (2011).
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MRI（核磁気共鳴画像法）の原理
• プロトン（H+）は生体内のどこにでもある微小磁石。
• H+は組織や空気が占める所には少なく、血液や脂肪のあるところには多い。
• H+に外部磁場（エネルギー）を与えると励起される。
• 磁場をかけるのをやめると、 H+が電磁波を発しながら元に戻る。
これを観察（イメージング）する
②
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脳のMRI
意欲を感じる側坐核（そくざかく）の血流が活発になる。
出典：中日新聞（2012.06.08）
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Table 9-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
③ 放射線を用いたイメージング：
18F 1 hour
半減期が短いものはPET診断に有用。
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PETX-ray
癌の超早期発見
来週の「癌イメージング」にて詳しく勉強します。
Figure 9-39 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
市販されている放射性試薬の例：
試験管内で核酸を放射性標識することにも利用できる。
同一分子内の異なる原子が生体内で生体反応によってそれぞれどの経路をたどるかを追跡できる。
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本日のまとめ
様々な生体イメージング法：
① 顕微鏡法・電子顕微鏡・蛍光顕微鏡
② 核磁気共鳴画像（MRI）法③ 陽電子放射画像撮影（PET）法
微小なものを見る
個体を丸ごと見る
★時間が余れば、以下のイメージングギャラリーを紹介する。http://ja.invitrogen.com/site/jp/ja/home/support/Research-Tools/
Image-Gallery.html（画面の下：「言語選択」をEnglishにすること）最近では、カラフルな生体画像イメージをart（芸術）と捉える動きがある。
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