Moleküler Modelleme Yöntemiyle Tasarlanan Yeni Monoamin Oksidaz-A Enzim İnhibitörü

Selektif 2-pirazolin Türevlerinin Antidepresan Aktivitelerinin Tayini

Telli G1, Salgın-Gökşen U2, Yalovaç A3, Çiftçi-Yabanoğlu S3,Uçar G3, Gökhan-Kelekçi N2, Tel BC1

1 Farmakoloji Anabilim Dalı, 2 Farmasötik Kimya Anabilim Dalı, 3 Biyokimya Anabilim Dalı, Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Ankara.

GİRİŞ

Major Depresif Bozukluk

• En sık görülen duygudurum bozukluğu

• Gelişmiş ülkelerde nüfusun yaklaşık %15’i

• EMOSYONEL SEMPTOMLAR => Mutsuzluk, kötümserlik, kendine saygıda azalma, motivasyon kaybı, intihar eğilimi

• BİYOLOJİK SEMPTOMLAR => Düşünce ve hareketlerde retardasyon, libido kaybı, uyku bozuklukları, iştah kaybı/artışı

Antidepresanlar

• Trisiklik Antidepresanlar

• Selektif Serotonin Re-Uptake İnhibitörleri(SSRİ)

• Monoamin Oksidaz İnhibitörleri

• Atipik Antidepresanlar (Tradazon, Mirtazepin..)

Monoamin-Oksidaz İnhibitörleri

• Antidepresan olarak tedaviye sunulan ilk ilaç gruplarından

• Monoamin Oksidaz (MAO) enzimi;

Noradrenerjik, dopaminerjik ve serotonerjik sinir uçları

Karaciğer, akciğerler ve barsak çeperi

• MAO-A: Serotonin (5-HT), Noradrenalin (NA )ve Triptamine daha selektif

• MAO-B: Feniletilamin ve benzilamin

•

Monoamin Oksidaz İnhibitörleri (MAOİ)

Selektif MAO-A İnhibitörleri:

• Moklobemid aktif olarak kullanılan tek ilaç

• Atipik belirtiler gösteren majör depresyonluların ve sosyal fobinin tedavisinde

Selektif olmayan, Geri Dönüşsüz MAO İnhibitörleri:

• Fenelzin, iproniazid vs.

• Yan etkileri ve önemli ilaç etkileşimlerine yol açabilmeleri nedeniyle günümüzde sık kullanılan bir ilaç grubu değildir

YÖNTEM

• Moleküler Modelleme Çalışmaları

• In Vitro Biyokimyasal Analiz

• In Vivo Farmakolojik Analiz

• Ex Vivo Biyokimyasal Analiz

Moleküler Modelleme Çalışmaları

• AutoDock 4.02 kullanılarak yapılan moleküler modelleme çalışmalarında sentezlenmesi öngörülen bileşiklerin, insan MAO-A ve MAO-B enzimleri ile olan etkileşimleri ve bu iki izoenzime olan seçicilikleri değerlendirilmiştir.

• «İnhibisyon Sabiti (Ki)» ve

• «Selektivite İndeksi (SI) (Ki(MAO-A)/Ki(MAO-B)) »

değerleri daha düşük; MAO-A’ya daha selektif ve inhibisyon gücü yüksek olan bileşikler belirlenmiştir.

In Vitro Biyokimyasal Analiz

• Moleküler modelleme çalışmaları sonucu etkin bulunan 51 adet bileşik sentezlendikten sonra biyokimyasal yöntemlerle;

Bileşiklerin hMAO-A ve hMAO-B üzerindeki inhibitör

etkinlikleri

MAO inhibisyonunun geri dönüşebilirliği ölçülmüştür.

• Moleküler modelleme çalışmaları ile uyumlu olarak in vitro biyokimyasal analizlerde SI ve Ki değerleri daha küçük olan; geri dönüşebilir 4 adet pirazolin yapısı taşıyan ve 1 adet hidrazon yapısı içeren toplam 5 bileşik in vivo analizler yapılmak üzere seçilmiştir.

In Vivo Analiz Porsolt’un Zorlu Yüzdürme Testi

• Depresyon modeli değildir !

• Antidepresan aktivitenin değerlendirilmesinde önemli çıkarımlar sağlayan en çok kullanılan in vivo deneylerden

biri (West, A.P. ve ark.,1990)

• «Depresyon benzeri davranış» ya da «Davranış umutsuzluğu»nun değerlendirilmesi

• Monoaminerjik manipülasyonlara hassas (Holmes, PV. ve ark. 2003)

• Antidepresan ilaç tedavisinin araştırılmasında varolan en güvenilir yöntemlerden

• Düşük maliyetli, uygulaması kolay, tekrarlanabilirliği

yüksek (Borsini, F. Ve ark.,1988)

Porsolt’un Zorlu Yüzdürme Testi

Hareketsiz kalış süresindeki artış,

adaptif bir yanıt ?

Klinikte tedavi süresinin belirlenmesine katkısı?

Porsolt’un Zorlu Yüzdürme Testi

• Güvenilirliği ve antidepresan etkiyi değerlendirmedeki başarısı yüksek

• Klinikte kullanım süresinin değerlendirilmesinde düşük

• Antidepresan etki mekanizmasının anlaşılmasını sağlamada zayıf

Porsolt’un Zorlu Yüzdürme Testi

• CD-1 farelere (Petit-Demouliere, B. Ve ark., 2005)

%0.5’lik CMC içinde intragastrik uygulama

• Maddeler 30 mg/kg/gün

• Moklobemid 20 mg/kg/gün

• Akut uygulama => i.g. uygulamadan 1 saat sonra

• Sub-kronik uygulama => 7 günlük i.g. uygulamadan

1 saat sonra

Porsolt’un Zorlu Yüzdürme Testi • 19 x 12 cm cam beher

• 15±1 cm kadar 25±1°C su

• İlk 2 dk suya alışmaları beklenip, takip eden 6 dk hareketsiz kaldığı süre (sn) değerlendirilmiştir (Porsolt RD. Ve ark. ,1977.) .

• Deneyler haftanın aynı gününde ve aynı saatler arasında, ilaçların uygulanmasından 1 saat sonra yapılmıştır.

• Her bir fareden sonra beherdeki su değiştirilmiştir.

• Farmakolojik deneyleri takiben, ex vivo biyokimyasal deneyler için giyotin ile ötenazi edilen farelerin beyinleri izole edilmiştir*.

* H.Ü. Yerel Etik Kurulu Karar No: 2012/39-7

Ex Vivo Biyokimyasal Analiz

• Total MAO aktivitesi spektrofotometrik olarak ölçülmüştür.

• MAO-A ve MAO-B seviyeleri ayrı ayrı değerlendirilmiştir.

• 5-HT, Dopamin(DA) ve metabolitleri 5-Hidroksiindolasetikasit (5-HIAA) ve Dihidroksifenilasetikasit (DOPAC) YBSK kullanılarak ölçülmüştür.

BULGULAR

Akut Uygulama-Farmakolojik Analiz

İstatiksel analiz tek-yönlü ANOVA; post-hoc olarak Dunnet testi ile yapılmıştır. Veriler ortalama ± ortalamanın standart hatası şeklinde gösterilmiş olup her bir bileşik için n=8 adet fare kullanılmıştır.

Kontrol

Moklobemid

Bileşik 4

Bileşik 6

Bileşik 14

Bileşik 25

Bileşik 51

0

20

40

60

80

Akut Uygulama

Orta

lama h

arek

etsiz

kalm

a sür

esi (

sn)

Akut Uygulama-Biyokimyasal Analiz

Akut çalışma gruplarının beyin dokusunda 5-HT, dopamin, 5-HIAA ve DOPAC düzeyleri (*** p<0.001 – kontrole göre; ** p<0.01 -kontrole göre; * p<0.05 –kontrole göre kontrol; (ψψψ p<0.001 –moklobemide göre; ψψ p<0.01 – moklobemide göre; ψ p<0.05- moklobemide göre) n=8’dir.

Kontrol Moklobemid Bileşik 4 Bileşik 6 Bileşik 14 Bileşik 25 Bileşik 510.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

5-HT

DOPAMİN

5-HIAA

DOPAC

7.0

8.5

10.0

****

******

***

* ***** ** ***

** * * **

**** *** *** ***

***

Do

ku

dü

zeyle

ri (

µg

/g d

oku

)

Akut Uygulama Farmakolojik Analiz / Biyokimyasal Analiz

Akut çalışma gruplarının Porsolt testine göre hareketsiz kalma süreleri ve beyin dokusu MAO-A aktiviteleri. İstatiksel analiz tek yönlü ANOVA ardından post –hoc Dunnett testiyle yapılmıştır. (*** p<0.001- kontrole göre; ** p<0.01 –kontrole göre; * p<0.05- kontrole göre; (ψψψ p<0.001 –moklobemide göre; ψψ p<0.01 –moklobemide göre; ψ p<0.05 – moklobemide göre), n=8.

Kontrol

Moklo

bemid

Bileşik

4

Bileşik

6

Bileşik

14

Bileşik

25

Bileşik

51

0

20

40

60

80

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Kontrol

Moklobemid

Bileşik 4

Bileşik 6

Bileşik 14

Bileşik 25

Bileşik 51

**

****** ***

******

Har

eket

siz

kalm

a sü

resi

(sn

)

MA

O-A

Aktivitesi (nm

ol/dk/mg)

Sub-kronik Uygulama-Farmakolojik Analiz

*p <0,05 kontrolden anlamlı olarak farklı olduğunu göstermektedir. İstatiksel analiz tek-yönlü ANOVA ardından post-hoc olarak Dunnet testi ile yapılmıştır. Veriler ortalama ± ortalamanın standart hatası şeklinde gösterilmiş olup her bir bileşik için n=8 adet fare kullanılmıştır.

Kontrol

Moklobem

id

Bileşik 4

Bileşik 6

Bileşik 14

Bileşik 25

Bileşik 51

0

20

40

60

80

* * * * * *

Sub-Kronik Uygulama

Ort

alam

a ha

reke

tsiz

kal

ma

süre

si (s

n)

--

---

Sub-kronik Uygulama-Biyokimyasal Analiz

Kronik çalışma gruplarının doku 5-HT, dopamin, 5-HIAA ve DOPAC düzeyleri (*** p<0.001 vs. kontrol; ** p<0.01 vs. kontrol; * p<0.05 vs. kontrol; (ψψψ p<0.001 vs. moklobemid; ψψ p<0.01 vs. moklobemid; ψ p<0.05 vs. moklobemid), n=8.

Kontrol Moklobemid Bileşik 4 Bileşik 6 Bileşik 14 Bileşik 25 Bileşik 510.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

5-HT

DOPAMIN

5-HIAA

DOPAC

7.5

8.5

9.5

10.5

****** *** *** ***

***

**** ***

*** *** ***

*************

*********

*********

Do

ku

dü

zeyle

ri (

µg

/g d

oku

)

Sub-kronik Uygulama Farmakolojik Analiz / Biyokimyasal Analiz

Kronik çalışma gruplarının Porsolt testine göre hareketsiz kalma süreleri ve beyin dokusu MAO-A aktiviteleri (*** p<0.001 vs. kontrol; ** p<0.01 vs. kontrol; * p<0.05 vs. kontrol; (ψψψ p<0.001 vs. moklobemid; ψψ p<0.01 vs. moklobemid; ψ p<0.05 vs. moklobemid) n=8.

Kontrol

Moklo

bemid

Bileşik

4

Bileşik

6

Bileşik

14

Bileşik

25

Bileşik

51

0

10

20

30

40

50

60

70

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Kontrol

Moklobemid

Bileşik 4

Bileşik 6

Bileşik 14

Bileşik 25

Bileşik 51

******

********

**

**

* *

Har

eket

siz

kalm

a sü

resi

(sn)

MAO

-A Aktivitesi

(nmol/dk/m

g)

Akut(sn) Sub-Kronik(sn)

Bileşik 4 59±14,53 21,2±5,66*

Bileşik 6 51,75±13,72 28,18±4,68*

Bileşik 14 23,65±8,18 24,86±6,84*

Bileşik 25 21±8,36 20,2±6,08*

Bileşik 51 24,5±11,85 21±8,18*

Moklobemid 18,88±5,76 18,33±4,91*

Kontrol 44±12,47 55,23±9,77

*p <0,05 kontrolden anlamlı olarak farklı olduğunu göstermektedir. İstatiksel analiz tek-yönlü ANOVA takiben post hoc olarak Dunnet testi ile yapılmıştır. Veriler ortalama ± ortalamanın standart sapması şeklinde gösterilmiş olup her bir bileşik için n=8 adet fare kullanılmıştır.

SONUÇ ve TARTIŞMA

SONUÇ ve TARTIŞMA

• Akut uygulama sonrasında ortalama hareketsiz kalış süresinde moklobemid ve bileşiklerde istatiksel olarak anlamlı bir azalma meydana gelmedi. Ancak bileşik 14, 25 ve 51 bu süreyi kontrole göre önemli ölçüde azalttılar.

• Bileşik 14,25 ve 51 başta olmak üzere bütün bileşikler 5-HT ve DA düzeylerini mokobemide göre anlamlı olarak ↑; metabolitlerini ↓

ve MAO-A aktivitesini ↓

Bu bileşiklerin akut uygulama sonrasında biyokimyasal olarak monoamin düzeylerini moklobemide oranla anlamlı olarak değiştirmiş olmaları => Daha hızlı etki?

SONUÇ ve TARTIŞMA

• Sub-kronik tedavi sonrasında yapılan deneylerde bileşikler, ortalama hareketsiz kalım süresini moklobemidle benzer oranda, kontrole göre anlamlı ölçüde azalttılar.

• Bileşik 51 ve 25 başta olmak üzere bütün bileşikler 5-HT ve DA düzeylerini hem kontrole hem de moklobemide göre anlamlı olarak ↑; metabolitlerini ↓ ve MAO-A aktivitesini ↓ azaltmışlardır.

• Moleküler modelleme çalışmaları ve in vitro biyokimyasal analizlerde MAO-A’ya selektivitesi daha yüksek olan bileşik 25 ve 51 in vivo ve ex vivo analizlerde daha anlamlı sonuçlar vermişlerdir.

SONUÇ ve TARTIŞMA

• MAO-A selektiflikleri daha az olan bileşik 4 ve 6 akut olarak uygulandıklarında oldukça etkisizken, sub-kronik uygulamada moklobemid kadar etkilidirler.

Kronik uygulama sonrası bileşiklerin aktivitelerinde artış gözlenebilir.

• Bileşikler rasemik olarak ayrılmış değil bileşik 6’nın daha selektif olan ve yine MAO-A aktivitesi güçlü olan enantiyomerinin ayrılması ile daha da etkili bir bileşik elde edilebilir.

• Sub-kronik kullanımda (7 gün) moklobemide benzer oranlarda antidepresan aktivite görülmesine dayanarak; moklobemide alternatif, yan etkileri daha az, daha hızlı etkili ve kullanımı daha rahat yeni kimyasal bileşiklerin tedaviye girmesi mümkün olabilir.

Destek: • TÜBİTAK: Proje No «112T746» • HUBAP: Proje No «012D06301001»

TEŞEKKÜRLER

Moleküler modelleme ve In vitro Biyokimyasal Analiz Çalışmaları Sonucu En Yüksek Aktivite Gösteren 5

Bileşik: • Pirazolin Yapısı Taşıyanlar:

• Moklobemid: MAO-A:

• Enzimi

NN

O

N

O

CH2C O

OCH3

NN

O

N

O

CH2C O

OCH3

OCH3

NN

O

N

O

CH2C O

CH3O

Cl

NN

O

N

O

CH2C O

CH3O

OCH3

CH3

CH3O

N

O

CH2 C NH

O

O

ClN C

CH

CH

OCH3

OCH3

OCH3