„Molekulare Biophysik“ NMR-Spektroskopie (Teil 3)schmieder.fmp-berlin.info/.../pdf/molekulare_biophysik_schmieder_teil3.pdf · Peter Schmieder FMP 4/90 Vorlesung "Molekulare Biophysik":

„Molekulare Biophysik“

NMR-Spektroskopie

(Teil 3)

DasNMR-Spektrometer

Peter SchmiederFMP

3/90

Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie

Das NMR-Spektrometer

Magnet

Hardware-SchrankProbenkopf

Probenwechsler

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Magnet

B0 [Tesla] 0 [MHz]

1.4 60

5.9 250

9.4 400

14.1 600

21.2 900

Das Erdmagnetfeld hat eine Stärke

von 30-60 T (0.3 –0.6 Gauss)

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Magnet

flüssiger Stickstoff

Supraleitende Spule

Bohrung des Magneten:54 mm „narrow bore“89 mm „wide bore“

flüssiges Helium

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Magneten sind faszinierend aber auch gefährlich

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7/90



Peter SchmiederFMP

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RT-Probenkopf

Cryo-Probenkopf

ATM-Probenkopf

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Der Probenkopf

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Die Probe im Probenkopf

Helmholtz-Spule

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Der Shim, das Problem der Homogenität

abcd

a,b,c,d

a,b,c,da,b,c,d

a,b,c,d

a

b

c

d

d

c

b

a

t

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Die Hardware, d.h. die Elektronik

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13/90



Hardware

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14/90



Hardware

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;zgdc;avance-version (03/04/17);1D sequence with decoupling

#include <Avance.incl>

"d11=30m"

1 zed11 pl12:f2

2 30m do:f2d11 cpd2:f2d1p1 ph1go=2 ph3130m do:f2 mc #0 to 2 F0(zd)

exit

ph1=0 2 2 0 1 3 3 1ph31=0 2 2 0 1 3 3 1

Software

Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie

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17/90



Ein Problem der eindimensionalen NMR-Spektroskopie ist, dass selbst recht einfach

Moleküle oft nicht oder nur mit hohem Aufwand eindeutig zugeordnet werden können

Zimtsäureethylester

Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (IUPAC)

O

O

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18/90



Ein Zuordnung mit Datenbanken ist oft nicht sicher genug

O

OH

H

7.21

7.14

7.21

7.30

7.30 4.19

1.30

7.64

6.39

01234567PPM

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm

3.0

2

2.0

7

1.0

0

2.9

9

3.1

2

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Mit 13C oft noch besser als mit 1H

O

O

128.7

128.0

128.7

126.4

135.2

126.4 145.2

116.3

166.561.4

14.2

020406080100120140160180PPM

160 140 120 100 80 60 40 20 ppm

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Der entscheidende Vorteil dermehrdimensionalen NMR-Spektroskopie ist:

MagnetisierungstransferEs entstehen Signale, die auf eine Wechselwirkung zwischen den Kernen hinweisen. Das können WW

durch die Bindung (via J-Kopplung) oder durch den Raum (via NOE) sein.

Diese Signale werden auf einer Fläche oder in einem mehrdimensionalen Raum verteilt, was eine gute

Auflösung ermöglicht.

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1D-NMR2 Achsen:

Intensität vs. Frequenz

2D-NMR3 Achsen:

Intensität vs. Frequenz (1)vs. Frequenz (2)

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22/90



1D-NMR schematisch

Preparation Detektion

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23/90



1D-1H-Spektrum

C11H13N2O3Br

N

NHBr

O

O

O

OH

OH

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2D-NMR Sequenzen enthaltenzwei neue Elemente:

Evolutionszeit und Mischzeit

Preparation Evolution Mischung Detektion

Evolution:Erzeugen einer weiterenFrequenzachse durch indirekte Detektion

Mischung:Transfer von Magnetisierung von

Spin zu Spin über Wechsel-Wirkungen zwischen Spins

(t1) (t2)

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25/90



Mit der Evolutionszeit wird

eine indirekte Dimension

erzeugt, man bewerkstelligt

das durch die systematische

Veränderung einer

Zeitspanne in einer Sequenz

von Pulsen, man braucht also

mindestens zwei Pulse.

Die Evolutionszeit

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26/90



Die Aufzeichnung des FIDs

haben wir uns schon im Detail

angeschaut, sie wird jetzt für

jeden neuen Zeitwert

wiederholt. Auch in der

indirekten Dimension müssen die

Zeiten ganzzahlige Vielfache

eines Intervalls t sein

Die Evolutionszeit

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27/90



Das schauen wir uns wieder näher an und nutzen die gleichen

drei Linien wie beim 1D

z

x

y 90°-x

z

x

y 2000 Hz-500 Hz

-1500 Hz

90Y90-x

kt1kt2

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Man erkennt dass die Anfangsintensität in t2

von der Frequenz abhängt

(kt1 = t1)

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3000 2000 1000 0 -1000 -2000 -3000

10 8.33 6.66 5 3.33 1.66 0

[Hz]

[ppm]

x

y

t1 = 166 sec

x

y

x

y

t1 = 0 sec

x

y

t1 = 332 sec t1 = 498 sec

t1 = 0 sec

t1 = 166 sec

t1 = 332 sec

t1 = 498 sec

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30/90



3000 2000 1000 0 -1000 -2000 -3000

10 8.33 6.66 5 3.33 1.66 0

[Hz]

[ppm]

t1 = 0 sec

t1 = 166 sec

t1 = 332 sec

t1 = 498 sec

t [msec]

0.1

0.2 0.3

0.4

0.5Iy0

1

-1

Entlang der indirekten Zeitachse entsteht das gleiche Bild wie entlang der direkten

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31/90



Insgesamt also ein zweidimensionaler FID

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32/90



Eine erste FT ergibt ein „Interferogram“.

Peter SchmiederFMP

33/90



Eine zweite FT ergibt ein zweidimensionales Spektrum.

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34/90



Zur Auswertung

betrachtet man

Contour-Plots, die

Peakintensität als

Höhenlinien

darstellen.

Peter SchmiederFMP

35/90



In mehrdimensionalen Experimenten wird gute Auflösung

durch mehr Werte für kt1 erreicht.

Daher ist in mehrdimensionalen Experimenten die

Auflösung in den indirekten Dimensionen immer begrenzt.

Die Zeit für die Messung ist

aber der Anzahl der

aufgezeichneten FIDs direkt

proportional, gute Auflösung

bedeutet also lange Messzeit.

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Gäbe es nur Evolution und Detektion dann würde in

beiden Zeitdimensionen immer die gleichen Frequenzen

detektiert, ganz entscheidend ist also die Mischzeit, in

der es zur Übertragung von Magnetisierung von einem

Kern zum nächsten kommt.


(t1) (t2)

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37/90



Diese Übertragung von Magnetisierung während der Mischzeit kann durch verschiedene Mechanismen

geschehen. Der am meisten verwendete Mechanismus ist die J-Kopplung, von großer Bedeutung ist aber auch

der NOE-Effekt, die Übertragung durch den Raum.

Peter SchmiederFMP

38/90



Wichtig ist auch ob die Übertragung zwischen gleichen Spins der gleichen Kernsorte oder

andersartigen Spins erfolgt.Man unterscheidet daher homonukleare und

heteronukleare Experimente.

Peter SchmiederFMP

39/90



homonukleare Experimente Transfer von Magnetisierung findet zwischen gleichartigen Kernen statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen des gleichen Kerns. Findet Transfer statt, ergibt sich in beiden Dimensionen eine unterschiedliche Verschiebung: KreuzsignalFindet kein Transfer statt, dann ergibt sich in beiden Dimensionen die gleiche Verschiebung:Diagonalsignal

Peter SchmiederFMP

40/90



heteronukleare Experimente Transfer von Magnetisierung findet zwischen unterschiedlichen Kernsorten statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen unterschiedlicher Kerne. Findet Transfer statt, ergibt sich ein Signal am Schnittpunkt der chemischen Verschiebungen der involvierten Kerne. Findet kein Transfer statt, dann ergibt sich kein Signal.

Peter SchmiederFMP

41/90



3D-NMR

Preparation

Preparation

Evolution

Evolution

Mischung

Mischung

Detektion

Detektion

Preparation Evolution (1) Mischung (1) Evolution (2) Mischung (2) Detektion

Ein dreidimensionales Experiment entsteht formal durch

Kombination von zwei zweidimensionalen Experimenten,

solche Experimente sind vor allem bei Proteinen wichtig.

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42/90



Das Spektrum ist dann keine Fläche mit

Signalen mehr sondern ein Würfel, mit drei

Achsen mit chemischer Verschiebung.

Intensität zeigt sich als „vierte Dimension“

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43/90



Mit einem Satz homo- und heteronuklearer 2D-Experimente sollte eine Zuordnung aller Resonanzen von kleinen Molekülen möglich sein, oft braucht man

nur ein COSY, ein HMQC und ein HMBC

Zimtsäureethylester

Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (IUPAC)

O

O

Das COSY-Experiment

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45/90


COSY

Die einfachste denkbare zweidimensionale

Sequenz besteht aus zwei Pulsen, das ist das

homonukleare COSY:

90Y90x

t1


t2

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46/90


COSY

Wir haben mit derEvolutionszeit eine zweiteDimension erzeugt aber

das 2D Spektrumhat nur eine Diagonale.

Wenn wir nur die Evolution betrachten haben wir aber auf beiden Achsen die gleiche Information.

1 2

1

2

H1 H2H (ppm)

H (ppm)

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47/90


COSY

Wenn wir in der Mischzeit aber Transfer haben dann

ist etwas neues entstanden:

Es gibt Signale, die in den

beiden Dimensionen mit

unterschiedlichen

chemischen Verschiebungen

„markiert“ worden sind:

die Kreuzsignale. 1 2

1

2

H1 H2H (ppm)

H (ppm)

Transfer

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48/90


COSY

Ein Anwendungsbeispiel:

H H H H

?J12 J34

J12 ~ J34

Eine Zuordnung ist im 1Dnicht möglich...

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49/90


COSY

....aber im 2D ganz leicht.

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50/90



Im COSY ist die Ethylgruppe leicht, Aromat und Olefin nicht komplett zuzuordnen

O

O

ppm

8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

8

7

6

5

4

3

2

1

ppm

7.07.5 ppm

7.0

7.5

H

HH

H

H

H

H

O

OH

H

7.21

7.14

7.21

7.30

7.30 4.19

1.30

7.64

6.39

Das HMQC/HMBC-Experiment

Peter SchmiederFMP

52/90


HMQC/HMBC

Bislang haben wir ein homonukleares Experiment betrachtet, man kann aber auch in natürlicher

Häufigkeit heteronuklearen Experimente machen, entweder basierend auf der direkten 1H-X-

Kopplung (HMQC) oder der Weitbereichskopplungen (HMBC).

X nX

1H

nX X X

1H HMQCHMBC

X

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53/90


HMQC/HMBC

Ob ein Transfer stattfindet hängt von der Größe

der Kopplungskonstanten ab und kann auch durch die

Pulssequenz beeinflusst werden.

Mit Kopplungen < 1 Hz ist kein Transfer möglich.

Kopplungen über eine Bindung sind größer als über

mehrere Bindungen.

1JHH = 276 Hz

2JHH = 0 .. 30 Hz3JHH = 0 .. 20 Hz4JHH = 0 .. 3 Hz

1JHC = 125 .. 200 Hz

2JHC = 0 .. 20 Hz3JHC = 0 .. 15 Hz4JHC = 0 .. 2 Hz

1JHN = 60 .. 100 Hz

2JHN = 0 .. 15 Hz3JHN = 0 .. 8 Hz4JHN = 0 .. 1 Hz

Peter SchmiederFMP

54/90


HMQC/HMBC

Man kann sich zwei Varianten von heteronuklearen

zweidimensionalen Experimenten überlegen, je

nachdem welchen Kern man detektiert und welchen

man in der indirekten Dimension hält.

Das hat Einfluss auf die Auflösung, die erreichbar

ist, und auf die Empfindlichkeit der Messung.

In der indirekten Dimension erfordert doppelte

Auflösung doppelte Zeit, in der direkten Dimension

ist das kein Problem.

Peter SchmiederFMP

55/90


HMQC/HMBC

Die Empfindlichkeit der Messung hängt von mehreren Faktoren ab:

MagneticMoment

Spin AngularMomentum

Bd 0S/N ~ (pB0) (d)( )

H ~ 4 C, die Detektion auf Protonen bringtalso einen Faktor 8 !!

Peter SchmiederFMP

56/90


HMQC/HMBC

X

H

HMQC = Heteronuclear MultipleQuantum Correlation

Ein Signal zeigt die direkte Bindung

zwischen H und X an.

Die Kopplung zwischen H und X ist nicht zu sehen, während der Evolution

und der Acquisition wird „entkoppelt“.

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57/90



O

O

Im HMQC unseres kleinen Moleküls bekommen wir 5 Korrelationen von Wasserstoffen zu Kohlenstoff im Aromaten / Olefin-Bereich

ppm

8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

140

120

100

80

60

40

20

ppm

7.07.58.0 ppm

130

140

H

HH

H

H

H

H

O

O

128.7

128.0

128.7

126.4

135.2

126.4 145.2

116.3

166.561.4

14.2

100% Zuordnung haben wir aber noch nicht

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58/90


HMQC/HMBC

Um die Spektren ganz zweifelsfrei zuzuordnen brauchen wir dann das HMBC in dem Signale durch die

kleinen, über mehrere Bindungen reichenden Kopplungen erzeugt werden.

Im allgemeinen sind 2J und 3J Kopplungen groß genug um eine Korrelation zu ergeben, in bestimmten Situationen können aber auch Kopplungen über mehrere Bindungen

Signal ergeben.Signale durch direkte Kopplung versucht man zu unterdrücken um das Spektrum zu vereinfachen.

Peter SchmiederFMP

59/90


HMQC/HMBC

= via 1JHX

Transfer via 1JHX Transfer via nJHXX

H H

HMBC = Heteronuclear MultipleBond Correlation

HMQC HMBC

Es bleiben nicht unterdrückte Signale von den 1JHC übrig als kleine Doubletts, andere Signale zeigen

Weitbereichskopplung an.

Peter SchmiederFMP

60/90



Im HMBC sind die Signale der Ethylgruppe wieder eindeutig und man findet auch leicht das CO der Säuregruppe

O

O

128.7

128.0

128.7

126.4

135.2

126.4 145.2

116.3

166.561.4

14.2

O

OH

HH

H

H

H

H

CH3

H Hppm

8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

40

60

80

100

120

140

160

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61/90



O

O

Um mit Aromaten und Olefinen klar zu kommen muss man sehr genau hinschauen

O

O

128.7

128.0

128.7

126.4

135.2

126.4 145.2

116.3

166.561.4

14.2

H

HH

H

H

H

H

CH3

H H

grün = HMQC, rot = nicht unterdrückte Signale

ppm

6.66.87.07.27.47.67.88.0 ppm

120

125

130

135

140

145

Ein Beispiel

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63/90


Ein Beispiel: Brivudin

C11H13N2O3Br Desoxythymidin

Das Molekül: Brivudin

Brivudin wird bei Herpes zoster angewendet

N

NHBr

O

O

O

OH

OH

N

NHCH3

O

O

O

OH

OH

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64/90



Die Experimente

1D-1H 1 min

1D-13C 1 h

DEPT 10 min

COSY 10 min

13C-HMQC 10 min

13C-HMBC 50 min

15N-HMQC 3 h

15N-HMBC 35 h

Peter SchmiederFMP

65/90



1D-1H-Spektrum

C11H13N2O3Br

DMSO

H/D

H/D

H2O

1 1 11 1 1 1 1 1 2 2

N

NHBr

O

O

O

OH

OH

1

1'

2'3'

4'

5'

2

34 5

6

7

8

Peter SchmiederFMP

66/90



C11H13N2O3Br

1D-13C-Spektrum

N

NHBr

O

O

O

OH

OH

Peter SchmiederFMP

67/90



C11H13N2O3Br

DEPT-Spektrum

1D-13C-Spektrum

N

NHBr

O

O

O

OH

OH

Peter SchmiederFMP

68/90



Zuckerbereich

Korrelation von Frequenzen via 1H-1H-Kopplung, i.a. nur zwei oder drei Bindungen.

COSY

6

3

7 oder 8,nicht unterscheidbar

N

NHBr

O

O

O

OH

OH

1

1'

2'3'

4'

5'

2

34 5

6

7

8

Peter SchmiederFMP

69/90



DMSO

H2O

H/D

COSY

3‘OH

5‘OH

1‘

2‘

4‘5‘

3‘

1'

2'3'

4'

5' O

OH

OH

Peter SchmiederFMP

70/90



13C-HMQCZuckerbereich

Basenbereich

1‘

2‘

4‘

5‘3‘

6Korrelation von Frequenzen

via 1H-13C-Kopplung, man korreliert nur direkt

aneinander gebundene Kerne.

7/8

N

NHBr

O

O

O

OH

OH

1

1'

2'3'

4'

5'

2

34 5

6

7

8

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71/90



2‘

1‘4‘ 5‘3‘6 7/8 7/8

1D-13C-Spektrum

Peter SchmiederFMP

72/90



13C-HMBC

1‘

Zuckerbereich

Basenbereich

Korrelation von Frequenzen via 1H-13C-Kopplung, man korreliert über bis zu 4

Bindungen (2JHC bis 4JHC), 1JHC gibt ein Dublett.

N

NHBr

O

O

O

OH

OH

1

1'

2'3'

4'

5'

2

34 5

6

7

8

Peter SchmiederFMP

73/90



13C-HMBC(Basenbereich)

1‘

6

4‘

2

5

Korrelation ausgehend von H1‘ Korrelation zu 5 ist

schwach und 5 ist von 7/8 aus zu sehen.

= via 1JHC

6

7/8

7/8 N

NHBr

O

O

H

HH

H

1

1'

2

34 5

6

7

8

Peter SchmiederFMP

74/90




6

3

1‘

2

5

Korrelation ausgehend von H3

C2 fehlt !!

7

4

Hier muss 7 sein N

NHBr

O

O

H

HH

H

1

1'

2

34 5

6

7

8

6 1‘

Peter SchmiederFMP

75/90




6

7

5

Korrelation ausgehend von H7, das via H3 zugeordnet ist.

4

8

N

NHBr

O

O

H

HH

H

1

1'

2

34 5

6

7

8

Peter SchmiederFMP

76/90




6

8

5

Korrelation ausgehend von H8, das via H3/H7 zugeordnet ist.

7 N

NHBr

O

O

H

HH

H

1

1'

2

34 5

6

7

8

Peter SchmiederFMP

77/90




6

61‘

2

5

Korrelation ausgehend von H6, alles ist zu sehen, das hilft nicht beim Zuordnen,

es passt aber alles.

7

4

8

N

NHBr

O

O

H

HH

H

1

1'

2

34 5

6

7

8

Peter SchmiederFMP

78/90



ppm

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

142

144

146

148

150

152

154

156

158

160

162

164

166

168

170

15N-HMQC

3 N

NHBr

O

O

H

HH

H

1

1'

2

34 5

6

7

8

Peter SchmiederFMP

79/90



ppm

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

142

144

146

148

150

152

154

156

158

160

162

164

166

168

170

15N-HMBC

3

1

3 6 1‘ 2‘

N

NHBr

O

O

H

HH

H

1

1'

2

34 5

6

7

8

Peter SchmiederFMP

80/90



Zuordnung1H [ppm] 13C [ppm] 15N [ppm]

1' 6,16 84,5 -

2' 2,17 39,8 -

3' 4,27 69,9 -

4' 3,79 87,5 -

5' 3,62 61 -

1 - - 149,7

2 - 149,2 -

3 11,92 - 157,7

4 - 161,6 -

5 - 109,7 -

6 8,09 139,4 -

7 6,87 129,9 -

8 7,25 106,5 -

13C [ppm] 13C [ppm] 15N [ppm]

predicted dT dT

1' 77,8 ± 8,2 85,1 -

2' 39,9 ± 5,1 40,4 -

3' 68,7 ± 1,6 71,7 -

4' 74,8 ± 9,2 88,4 -

5' 63,8 ± 0,3 62,4 -

1 - - 142,7

2 156,8 ± 10,6 151,6 -

3 - - 153,5

4 135,7 ± 6,9 137,3 -

5 117,5 ± 3,1 110,5 -

6 135,7 ± 11,4 164,9 -

7 132,6 ± 6,9 - -

8 89,4 ± 15,8 - -

DOSY

Peter SchmiederFMP

82/90


DOSY

Das DOSY (Diffusion Ordered SpectrocopY) ist eine besondere Art von Spektroskopie, da es zweidimensionale

Spektren erzeugt, die auf einer Achse die Diffusionrate des Moleküls anzeigen.

Die Diffusionsrate kann für unterschiedliche Untersuchungen von Bedeutung sein, z.B. für eine Bestimmung von Größe oder

Aggregation. Sie kann aber auch zur Untersuchung von Stoffgemischen eingesetzt werden, wobei die Spektren der im Gemisch enthaltenen Stoff nach deren Größe getrennt

aufgetragen werden.Das Experiment nutzt die Tatsache dass die Diffusion die

Moleküle durch das Probenvolumen bewegt, dessen Magnetfeld durch Gradienten beeinflusst werden kann.

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DOSY

Ohne Diffusion können zwei Gradienten durch einen 180°-Puls aufgehoben werden. Den 180°-Puls kann man auch in zwei Hälften teilen und dazwischen einfach warten das Diffusion passiert, z-

Magnetisierung ist langlebiger als x,y-Magnetisierung

180 18090 90 90

G z

H1

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DOSYDas Experiment wird nun mehrfach durchgeführt und dabei die Gradientenstärke zwischen 0 und maximal variiert. Man erzeugt also eine indirekte Dimension mit Gradientenstärke statt Zeit.

Die Zeit für die Diffusion bleibt dabei konstant.

180 18090 90 90

G z

H1

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DOSY

I

g [T/m]

Die zu erwartenden Intensitäten ergeben sich aus den

Diffusionsgleichungen: I = Io exp [- D 2 g2 2 ( - /3 - /2)]

Das ist eine Gauss-Kurve: I = Io exp – x g2

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DOSY

Die kann linearisiert werden: I = Io exp [- D 2 g2 2 ( - /3 - /2)]

T = 2 ( - /3 - /2) - ln (I/Io) = D 2 T * g2

g2 [T2/m2]

- ln (I/Io)

y = -0,0051203 + 14,129x R= 0,99998

Damit kann die

Diffusionskonstante

aus der Steigung

ermittelt werden

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DOSY

% Gradient

0

100

80

60

40

20

Ein praktisches Beispiel ist die Untersuchung zweier

Komplexbildner in D2O, es sollte festgestellt werden ob die beiden

eine Komplex miteinander bilden

1H-1D-Spektrum

pseudo-2D-Spektrum

Gauss-Kurve

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DOSY

Zur Auswertung wurde neben der linearisierten Gausskurve….

auch eine andere Art der Darstellung gewählt

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DOSY

Man kann die Gausskurven durch eine inverse Laplace-

Transformation in ein Spektrum mit Diffusionskonstante auf der

indirekten Achse verwandeln.

HDO

CB6CS

log(m2/s)

log(m2/s)

Diffusionskonstante

Diffusionskonstante

Fragen: [email protected]

Scripte: schmieder.fmp-berlin.info/teaching/vorlesung_mbph.htm

Documents

„Molekulare Biophysik“ NMR-Spektroskopie (Teil 3)schmieder.fmp-berlin.info/.../pdf/molekulare_biophysik_schmieder_teil3.pdf · Peter Schmieder FMP 4/90 Vorlesung "Molekulare Biophysik":