Molekulare Verfahren im Kontext mitklinischer Praxis und Bestandsbetreuung beim Schwein

Labortechniken (1)

• DNA-Extraktion

• Photometrie

• Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

• Restriktionsanalyse

• Agarose-Gelelektrophorese

• Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Labortechniken (1)

DNA-Extraktion

In-house MethodenPhenol/Chloroform-ExtraktionNaJ-MethodeGuSCN-Methodeu.s.w.

Kommerziell erhältliche KitsBloodTissueVirale RNAPlantu.s.w.

Kombination aus Kit- und in-house Methode

Eigenschaften der Probe

ProbenartBlut, Plasma, Serum, Sputum, UrinKot, Tupfer, Organteile, etc.

Probenvolumen

Anteil an ‘fremder’ Nukleinsäurez. B. Schweine-DNA

Physikalische Eigenschaften der ProbeTupfer, Gewebe, Flüssigkeit, etc.

Inhibitoren für die DNA-Polymerase

Labortechniken (1)

Labortechniken (1)

DNA-Extraktion mit dem Viralen RNA Minikit

DNA-bindende Membran

Probenvolumen max. 630 µl

Zentrifugationssäule1. Lysieren der Probe mit AVL-Pufferzum Freisetzen der DNA/RNA

2. Binden der Proben-DNA/RNA an dieMembran der Zentrifugationssäule

3. Zentrifugation

4. Waschen der gebundenen DNA/RNA mitWaschpuffer 1

5. Zentrifugation

6. Waschen der gebundenen DNA/RNA mitWaschpuffer 2

7. Eluieren der DNA/RNA mit Elutionspuffer

Dauer der DNA/RNA-Extraktion: ca. 20 min

Labortechniken (1)

Photometrie

Lambert-Beersches Gesetz: E = ε • c • d

E Extinktion (E = -log(I0/I ) = -log T)ε molare Absorptionskoeffizient [l • mol-1 • cm-1]d Schichtdicke der Küvette [cm]c Konzentration [mol • l-1]

Konzentration: c = E / (ε • d)

Extinktionswerte optimal zwischen 0,1 und 1 (linearer Bereich)

Konzentration von Nukleinsäuren (E260 = 1):

dsDNA: 50 ng/µlssRNA: 40 ng/µl

Qualität von Nukleinsäuren:

dsDNA: E260/E280 ≥ 1,8

220 260 300Wellenlänge in nm

Abs

orpt

ion

Ultrospec 1100 pro

Polymerase-Kettenreaktion

Polymerase Chain Reaction

P C R

Labortechniken (1)

PCR-Reaktionskomponenten

Reaktionspuffer

DNA-Polymerase (thermostabil)

4 Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) A, G, C und T

2 Oligonukleotide (Primer): Länge 20 – 30 Basen

Magnesiumchlorid

DNA- bzw. RNA-haltige Probe

Labortechniken (1)

PCR-Zyklus

1. Schritt: Denaturierung der Ziel-DNA

2. Schritt: Annealing (Anheften) der Primer

3. Schritt: Extension (Verlängerung) der Primer

1. + 2. + 3. Schritt = ein Zyklus

Labortechniken (1)

PCR-Reaktionsablauf

Film ab!

Pcr.exe

Labortechniken (1)

Labortechniken (1)

Thermocycler

PCR-Qualitätskontrolle (1)

Separate Räume oder Bereiche für jeden Schritt der PCR

Vermeiden von direkten Verbindungen zwischen den Räumen

Keine Luftzirkulation von Post-PCR-Räumen zu Prä-PCR-Räumen

Zugangsregelung

Labortechniken (1)

PCR-Qualitätskontrolle (2)

feste Ausstattung für jeden Raum

Handschuhe tragen und regelmäßig wechseln

zum Pipettieren der Probe (DNA/RNA)gestopfte Spitzen benutzen

PCR-‘Master-Mix’ ansetzen undaliquotieren

Negativkontrollen und Positivkontrollen mitführen

Interne Kontrollen mitführen (Inhibitorkontrollen)

Labortechniken (1)

PCR-Techniken

Heiß-Start (Hot-Start)-PCR

Nested-PCR

Touchdown-PCR

Multiplex-PCR

RT-PCR (Reverse Transkriptase-PCR)

Labortechniken (1)

Nested PCR

Labortechniken (1)

Labortechniken (1)

Touch-Down PCR

Aktivierung der DNA-Polymerase 95°C, 15 min(Hot-Start)

Denaturierung 95°C, 30 sAnnealing 65°C, 90 sExtension 72°C, 60 s

Denaturierung 95°C, 30 sAnnealing 55°C, 90 sExtension 72°C, 60 s

10 x (- 1°Cpro Zyklus)

30 x

Labortechniken (1)

Multiplex-PCR

Beispiel: Gleichzeitiger Nachweis von B. hyodysenteriaeund L. intracellularis

In dem PCR-Ansatz befinden sich zwei spezifische Primerpaare fürB. hyodysenteriae undL. intracellularis

Voraussetzung: beide Primerpaare haben ähnliche Annealingtemperaturen

Labortechniken (1)

(Reverse Transkriptase) RT-PCR

Ausgangs-Nukleinsäure: RNA

1. Schritt: Umschreiben der RNA in DNA(Reverse Transkription)Bezeichnung der umgeschriebenen DNA: cDNA (copy DNA)

2. Schritt: PCR mit der umgeschriebenen DNA als Ziel-DNA

1. und 2. Schritt kombiniert: One-Step RT-PCR

Labortechniken (1)

Restriktionsanalyse

Restriktionsenzym (Restriktionsendonuklease) = Enzyme, die die DNA an

spezifischen Erkennungssequenzen schneiden

Enzym Quelle Erkennungssequenz Schnitt Enden

XbaI Xanthomonas badrii 5‘-TCTAGA-3‘ 5‘-T CTAGA-3‘ 5‘-Überhang3‘-AGATCT-5‘ 3‘-AGATC T-5‘

SmaI Serratia marcescens 5‘-CCCGGG-3‘ 5‘-CCC GGG-3‘ kein Überhang3‘-GGGCCC-5‘ 3‘-GGG CCC-5‘

PvuI Proteus vulgaris 5‘-CGATCG-3‘ 5‘-CGAT CG-3‘ 3‘-Überhang3‘-GCTAGC-5‘ 3‘-GC TAGC-5‘

Labortechniken (1)

5‘-GGCTGTGGCCTTTATTACAAAGTTGTCATCTAGAATGATAGCACTGG-3‘3‘-CCGACACCGGAAATAATGTTTCAACAGTAGATCTTACTATCGTGACC-5‘

Beispiel: Restriktionsverdau mit XbaI

5‘-GGCTGTGGCCTTTATTACAAAGTTGTCAT-3‘3‘-CCGACACCGGAAATAATGTTTCAACAGTAGATC-5‘

+

5‘-CTAGAATGATAGCACTGG-3‘3‘-TTACTATCGTGACC-5‘

XbaI,37°C,1 h

Agarose-GelElektrophorese (AGE)(Submarine Gelelektophorese)

Labortechniken (1)

Elektrophoresekammer

Labortechniken (1)

Kamm

Zähne

Schlitten

Endbegrenzer

Labortechniken (1)

Größentrennung von DNA-Fragmenten bei verschiedenen Agarosekonzentrationen

Agarosekonzentration (in %) Auftrennungsbereich linearer, dsDNA in Bp0,3 5.000 – 60.0000,6 1.000 – 20.0000,7 800 – 10.0000,9 500 – 7.0001,2 400 – 6.0001,5 200 – 3.0002,0 100 – 2.000

Elektrophoresepuffer: TAE (Tris/Acetat/EDTA)- oder TBE (Tris/Borat/EDTA) –Puffer

Spannung: 1 - 10 V/cmLaufzeit: 10 – 60 minFärbung: Ethidiumbromid (kanzerogen!)

Labortechniken (1)

Bildanalyse

Multiplex-PCR- B. hyodysenteriae (Bhyo) - L. intracellularis (Li)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

IK*

Bhyo

Li

B. pilosicoli

+ -+ -

Labortechniken (1)

* Interne Kontrolle

Labortechniken (1)

PolyAcrylamid-GelElektrophorese (PAGE)

Reagenzien

- Harnstoff (denaturierend)

- Acrylamid (lineares Polymer)

- Bisacrylamid (Vernetzer)

- Puffer

- Ammoniumperoxodisulfat (APS)

- Tetramethylethylendiamin (TEMED)

Labortechniken (1)

Auftrennung von Oligonukleotiden in denaturierenden Polyacrylamidgelen

Acrylamidkonzentration (in %) Auftrennungsbereich (Nukleotide)20 -30 2 – 815 - 20 8 – 2513,5 - 15 25 – 3510 – 13,5 35 – 458 – 10 45 – 706 - 8 70 – 300

Elektrophoresepuffer: TBE (Tris/Borat/EDTA) – PufferSpannung: 1500 VStromstärke: 40 mALeistung: 40 WLaufzeit: 1 – 2 h