Molekulárně biologická analýza klonální přestavby IgH B-buněk a TCR T-

buněk metodou PCR

Michaela Šváchová

Ústav patologie FN Olomouc

Klonalita

detekce klonality – diagnostika a klasifikace lymfoproliferativních onemocnění

polyklonalita – normální stav organizmu (benigní), přítomnost velkého počtu klonů s odlišnými přestavbami, schopné reagovat na velké množství antigenů

monoklonalita – patologický proces (maligní), nádorové proliferace odvozené od jedné transformované buňky, stejná genetická výbava

B- a T-lymfomy – populace s monoklonální přestavbou IgH B-buněk a TCR T-buněk

B- a T-lymfocyty

Lymfocyty – vznikají v kostní dřeni z pluripotentních kmenových buněk (lymfoidní linie)

Vývoj a diferenciace – B-lymfocyty – v embryonálních játrech

v kostní dřeni T-lymfocyty – v thymu

Jeden lymfocyt – jediná protilátka

B-lymfocyty – humorální imunitní reakce (produkují imunoglobuliny)

T-lymfocyty – buněčná imunita (vytvářejí antigen-specifické receptory na povrchu buňky)

Detekce klonální přestavby IgH B-buněk a TCR T-buněk u maligních lymfomů IgH B-buněk a TCR T-buněk genové

segmenty (subgeny) přeskupení subgenů (VDJ rekombinace) funkční strukturní gen funkční polypeptidové řetězce IgH a TCR

VDJ rekombinace – unikátní klonální marker

PCR – k detekci klonální přestavby u lymfoproliferativních onemocnění

Struktura imunoglobulinu Ig – 2 těžké (H) a 2 lehké (L) polypeptidové řetězce o stejné primární struktuře Spojeny disulfidovými vazbami Konstantní oblasti (C) – relativně neměnná sekvence AA Variabilní oblasti (V) – jednotlivé imunoglobuliny příslušného typu těžkého nebo

lehkého řetězce se navzájem liší sekvencí AA Variabilní oblast – FR I-IV tzv. úseky struktury základní (framework) CDR I-III hypervariabilní úseky, (complementarity determining region), oblasti

určující komplementaritu, vazebná místa pro antigen

T buněčný receptor TCR – heterodimer, spojuje disulfidovou vazbou glykoproteinové

řetězce αβ nebo γδ Většina T lymfocytů exprimuje na svém povrchu αβ řetězce, buňky

exprimující γδ tvoří asi 5% T buněčné populace Jednotlivé buňky exprimují buď αβ nebo γδ heterodimery Řetězce tvořeny V a C doménami

(kódované přeskupenými subgeny)

B-lymfocyt

IgH

Igκ exprese IgH/Igκ

delece Igκ

Igλ exprese IgH/Igλ

Izotypická exkluze

T-lymfocyt

TCRD

TCRG exprese TCRγδ

delece TCRD

TCRB

TCRA exprese TCRαβ

Imunoglobulin a přeskupení subgenů

Ig subgeny – lokalizovány na chromozomech 2, 22, 14

TCR subgeny – 14, 7 V – subgeny kódují variabilní oblast C – subgeny kódují konstantní oblast J – subgeny kódují 12-21 koncových

AA variabilní oblasti D – subgeny – každý kóduje asi 5 AA

CDRIII úseku VJ somatická rekombinace –

– κ a λ Ig řetězce

– α a γ TCR VDJ somatická rekombinace –

– IgH

– β a δ TCR

VDJ rekombinace Přeskupení TCR β

Rekombinace subgenů V, D a J řízena RAG1 a RAG2 rekombinázovými enzymy

RAG1 a RAG2 rozpoznávají specifické DNA sekvence RSS (rekombinační signální sekvence), lokalizované po obou stranách přeskupujících se subgenů

RSS obsahují heptamery a nonamery, oddělené od sebe 12 nebo 23 páry bazí, kde dochází ke štěpení DNA a k ligaci vytvořených kódujících spojů

Vytvoření funkčního Ig nebo TCR genového produktu

Zpracování bioptických vzorků, izolace DNA

Biopsie, tkáň fixovaná formalínem a zalitá do parafínu Odparafínování xylenem, promytí a odstranění xylenu etanolem Izolace DNA pomocí Puregene DNA Purification Kit Lýza buněk – lyzační pufr a proteináza K, inkubace přes noc při

56°C Odstranění RNA inkubací lyzátu s RNázou při 37°C Odstranění (vysrážení) proteinů přidáním precipitačního roztoku Vysrážení DNA izopropanolem Promytí DNA 70% etanolem, odpaření etanolu Hydratace DNA hydratačním pufrem Kontrola kvality a množství DNA měřením na spektrofotometru při

260 a 280 nm Kontrolní PCR k ověření integrity a amplifikovatelnosti vyšetřované

DNA

Kontrolní PCR -zjištění integrity a amplifikovatelnosti

vyšetřované DNA

DN

A M

AR

KE

R

DN

A M

AR

KE

R

100 bp

200 bp

300 bp

400 bp

100 bp

200 bp

300 bp

400 bp

Polymerázová řetězová reakce PCR

Metoda pro mnohonásobnou amplifikaci specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace

Reakční směs obsahuje: - templátovou DNA - primery (oligonukleotidy) - dNTP (směs nukleotidů) - PCR vodu - PCR pufr - roztok MgCl2 - enzym – termostabilní DNA

polymerázu, vyznačující se 5´→3´polymerázovou a

3´→5´exonukleázovou aktivitou

PCR-Polymerázová řetězová reakce Amplifikace hypervariabilních oblastí VDJ Primery – specifické ke konzervovaným oblastem FR1 – FR3, JH Multiplex PCR – použití více párů primerů, nutná optimalizace

z důvodu možné kompetice mezi primery Nested PCR – odstupňovaná PCR, vyšší specifita, primární produkt

získaný pomocí 1. sady vnějších primerů je amplifikován pomocí 2. sady vnitřních primerů

Seminested PCR – jeden z párů primerů je použit v 1. i 2. kole PCR

VH

FR1 CDR1

DH JH

FR2

JH2

FR3

JH1

JH primers

N NFR1 FR2 FR3 FR4CDR1 CDR2

CDR3FR1

Stanovení klonality T-buněk

75 bp

100 bp

200 bp

+ + +---

- - - DN

A M

AR

KE

R

Vγ11-Jγ11 TβD1-TβJ2 TβD2-TβJ2

monoklonální band

Stanovení klonality B-buněk

+ ++ ++++

+

FR1 FR2 FR3

- - -

100 bp

200 bp

300 bp

DN

A M

AR

KE

R

500 bp

monoklonální band

Interpretace a limitace výsledků PCR Polyklonalita – smear Monoklonalita – band Monoklonalita na polyklonálním pozadí – příměs reaktivních

buněk Bialelické přeskupení – obě alely – dva bandy Klonalita nemusí znamenat malignitu „Lineage infidelity“ – fenomén nevěry k příslušné buněčné

linii (prekurzorová B-ALL, AML) Pseudoklonalita (vysoká senzitivita PCR může způsobit

amplifikaci několika málo přeskupení, což může být chybně interpretováno jako klonální přeskupení)

Falešně negativní výsledky – chybné nasedání primerů např. v důsledku mutací vyšetřované DNA

Falešně pozitivní výsledky – využití heteroduplexní analýzy

Heteroduplexní analýza PCR produktu denaturace 5 min při 94°C

rychlá náhodná renaturace 1 hod při 4°C indukce homo nebo heteroduplexních formací heteroduplexy – různá migrační rychlost – polyklonální lymfoproliferace homoduplexy – identická migrační rychlost – monoklonální proliferace

před

po

Srovnání barvení EtBr × GelRed

EtBr

GelRed

Závěr Záchytnost metody – 60-100% odhalených skutečně klonálních

lymfoproliferací (závisí na vlastnostech analyzované tkáně)

Vysoký záchyt – B-chronická lymfatická leukémie, leukémie z vlasatých buněk, lymfom z plášťových buněk Nižší záchyt – folikulární lymfom, difuzní velkobuněčný B-lymfom (důsledek somatických hypermutací u germinálních a postgerminálních lymfomů) Citlivost metody – odhalení klonality v případě výskytu alespoň 5%

buněk s klonální přestavbou ve vyšetřovaném vzorku

Kvalita vyšetřované tkáně – způsob zpracování (fixace formalínem – degradace DNA, cross reakce mezi vlákny DNA, sekvenční alterace atd. – selhání PCR)

vhodnější tkáň nativní, mražená, příp. fixovaná fixativy na bázi etanolu

Fixace tkáně /nekropsie/

100 bp

200 bp

100 bp

200 bp

300 bp 400 bp

VAKUUM

FFPE

sval

uzlin

a

játr

a

myo

kard

ledv

ina

plíc

e

pros

tata

uzlin

a

D

NA

mar

ker