Molekulárna anatómia génu a chromozómu

Gény a genómy Typy sekvencií v genóme. Molekulárna definícia génu. Porovnanie prokaryotických a eukaryotických génov. Prokaryotický a eukaryotický chromozóm Chromatín. Históny a histónom podobné proteíny. Nukleozómy. Euchromatín a heterochromatín. Jadro eukaryotickej bunky

•  množstvo DNA v haploidnom genóme je charakteristickou vlastnosťou druhu ale nezodpovedá jeho morfologickej komplexite

•  v genóme je viac DNA než je potrebné na kódovanie proteínov •  veľká variabilita C-value medzi blízko príbuznými druhmi

C-value paradox

Species Mbp počet génov (ORF pre proteíny)

Nasuia deltocephalinicola Bacteria 0.11 137 Tremblaya princeps Bacteria 0.14 110 Carsonella ruddii Bacteria 0.16 182 Mycoplasma genitalium Bacteria 0.58 540 Haemophilus influenzae Bacteria 1.83 1740 Escherichia coli Bacteria 4.7 4288 Methanococcus jannaschii Archaea 1.66 1682 Saccharomyces cerevisiae Eukarya 13 6183 Caenorhabditis elegans Eukarya 97 ~ 19000 Drosophila melanogaster Eukarya 180 ~ 13000 Arabidopsis thaliana Eukarya 100 ~ 25000 Oryza sativa Eukarya 394 ~ 37000 Homo sapiens Eukarya 3000 ~ 22000

G-value paradox

Typy sekvencií v eukaryotickom genóme

8

Unikátne vs. repetitívne sekvencie v ľudskom genóme Ľudský genóm: 3x 109 bp (23 (párov) chromozómov)

~ 22.000 génov ~ 19.000 pseudogénov

< 2 % kódujúce sekvencie (exóny) pre proteíny > 50% repetitívne sekvencie

> 97% nekódujúce sekvencie ALE až cca 80% sekvencií genómu môže mať funkciu

Wilhelm Ludwig Johannsen

GÉN - 1909

Gene is an entire sequence of nucleic acid (DNA or RNA) required for the synthesis of a product (RNA or protein).

Molekulárna definícia génu

prokaryoty

eukaryoty

-35 -10 +1

RBS RBS RBS

ORF1 ORF2 ORF3

UAS/URS +1

RBS poly(A) signál

STOP

STOP

"Typický gén"

exón1 exón2

intrón

Hypotéza 1 gén = 1 enzým (Beadle & Tatum, 1941)

Ako získať viac než 1 produkt?

Alternatívny splicing

Trans-splicing

Nilsen & Graveley (2010) Nature 463:457-463.

alternative 5′ splice-site selection

alternative 3′ splice-site selection

exon inclusion or skipping

intron retention

Typy alternatívneho splicingu

Nilsen & Graveley (2010) Nature 463:457-463.

38,016 rôznych mRNA (alternatívny splicing)

poly(A)

Alternatívny splicing a trans-splicing generujú rozsiahly repertoár mRNA

> 500 izoforiem mRNA (alternatívny splicing)

28 rôznych mRNA (trans-splicing)

DNA mRNA proteín 1

proteín 2

Alternatívny ŠTART - translácia

ATG ATG

AUG AUG

Alternatívny ŠTART - transkripcia

DNA mRNA 1 proteín 1

mRNA 2 proteín 2

ATG ATG

AUG

AUG

+

DNA mRNA

ATG

AUG

proteín

inteín

INTEIN = 'proteínový intrón'

Iné alternatívy (Recoding)

•  Zaradenie novej AMK (selenocysteín, pyrolyzín) na mieste STOP kodónu •  Predefinovanie nonsense (STOP) kodónu na sense kodón •  Stop codon read-through – pokračovanie translácie za stop kodónom •  Ribosomal Frameshifting (+1, -1) – posun čítacieho rámca (napr. GAG-POL) •  Translational Bypassing (jumping) – preskočenie (ignorovanie) časti sekvencie

(ca 50-nt) a pokračovanie v novom ORF

Biologická komplexita génov v genómoch

Gerstein et al. (2007) What is a gene, post-ENCODE? History and updated definition. Genome Research 17: 669-681.

Novšia definícia génu:

1.  A gene is a genomic sequence (DNA or RNA) directly encoding functional product molecules (RNA or protein).

2.  In the case that there are several functional products sharing overlapping regions, one takes the union of all overlapping genomic sequences coding for them.

3.  This union must be coherent - i.e., done separately for final protein and RNA products - but does not require that all products necessarily share a common subsequence.

The gene is a union of genomic sequences encoding a coherent set of potentially overlapping functional products.

Gerstein et al. (2007) What is a gene, post-ENCODE? History and updated definition. Genome Research 17: 669-681.

Gerstein et al. (2007) What is a gene, post-ENCODE? History and updated definition. Genome Research 17: 669-681.

Ešte novšia definícia génu:

The transcript can be considered as the basic atomic unit of inheritance. Concomitantly, the term gene would then denote a higher-order concept intended to capture all those transcripts (eventually divorced from their genomic locations) that contribute to a given phenotypic trait.

Djebali et al. (2012) Landscape of transcription in human cells. Nature 489: 101-108.

The ENCODE Project: ENCyclopedia Of DNA Elements Cieľ: identifikovať všetky funkčné elementy v sekvencii ľudského genómu 2003: začiatok projektu 2007: výsledky pilotnej fázy - 1% ľudského genómu (30 Mbp) (Nature & Genome Research) 2012: > 20% nekódujúcej DNA má funkcie (napr. v regulácii expresie génov) a ďalších 60% je transkribovaných (30 publikácií: Nature, Genome Biology, Genome Research) Základné metódy: ChIP, qPCR (v pilotnej fáze) ChIP-seq, hypersenzitivita k DNáze I, RNA-seq, metylácia DNA, …

Jadro

26

Jadrová membrána a cytoskelet jadra

- kompartment jadra je v bunke definovaný membránami - dve membrány, vonkajšia časť prechádza do ER - vnútorná membrána je v styku s jadrovou laminou - komunikáciu s cytosolom zabezpečujú póry v membráne - u väčšiny eukaryotov sa membrána rozpadá počas mitózy

Jadrová lamina

- sieť intermediárnych filamentov - pozostáva z rôznych typov lamínov (A, B1, B2, C) - rozpad a skladanie obalu jadra sú kontrolované posttranslačnou modifikáciou lamínov (fosforyláciou / defosforyláciou) - mutácie v lamínoch (laminopatie) - mutácia v LMNA géne (kóduje lamín A a lamín C) progerín je mutantná forma lamínu A - morfologické abnormality jadra - dezorganizácia heterochromatínu - poruchy reparácie DNA a nestabilita genómu - poruchy kontroly kmeňových buniek spojené s predčasným starnutím

28

Jadrový pór

- nukleoporíny (NUP) tvoria komplex jadrového póru - častice (molekuly a komplexy) do 30 kDa prechádzajú cez pór pasívnou difúziou - väčšie komplexy vyžadujú ďalšie proteíny: - karyoferíny - importíny - exportíny

Chromozómové teritóriá - chromozómy sa vyskytujú v diskrétnych oblastiach jadra - obsah génov koreluje s ich polohou v teritóriu (napr. sekvencie s nízkym počtom génov sú v perinukleárnej oblasti) - poloha v teritóriu súvisí s časom replikácie a transkripciou génov

Text

Duan et al. (2010) Nature 465: 363–367

Dekker et al. (2002) Science 295: 1306-1311

Priestorová rekonštrukcia usporiadania chromozómov v jadre kvasinkovej bunky

Nucleolus

- špecifická subnukleárna štruktúra - nie je obklopená membránou - pozostáva z komplexov nukleových kyselín a proteínov - v sekvencii genómu sú oblasti NOR (nucleolar organizing regions), ktoré korešpondujú repetíciami génov pre ribozomálne RNA - miesto transkripcie, úprav a asemblácie ribozomálnych RNA

Cajalove telieska (Cajal bodies)

PML telieska PML (promyelocytic leukemia) bodies

- subnukleárne štruktúry v proliferujúcich a metabolicky aktívnych bunkách - miesta úprav a maturácie snRNP (spliceozóm) a snoRNP

- subnukleárne proteínové štruktúry - neznáma funkcia - obsahujú proteíny zúčastnené v apoptóze, regulácie transkripcie, degradácie proteínov proteazómom - zmeny v lokalizácii počas infekcie vírusom alebo pri nádorovej transformácii bunky

Počas mitózy chromatín kondenzuje

"Molekulárna pitva"

Ako študovať eukaryotický chromozóm?