Molnár Mária JuditA gének és betegségek kapcsolata

Molnár Mária Judit

Klinikai Genetika – Genomikai Medicina• A gének és betegségek kapcsolata• Molekuláris biológiai metodikák• Onkogenetika (solid tumorok, onkohaematológia)• Kromoszóma rendellenességek, veleszületett rendellenességek és

dysmorphiás syndromák • Monogénes betegségek klinikai manifesztációja

– Neurogenetikai betegségek– Belgyógyászati betegségek – Haematológiai betegségek – Cardiológiai betegségek – Szemészeti betegségek– Bőrgyógyászati betegségek

• Polygénes, multifaktoriális betegségek genetikája• Személyre szabott orvoslás• Közvetlenül a fogyasztók által rendelhető genetikai vizsgálatok• A genetikai betegségek megelőzése: szűrés, genetikai tanácsadás • A genetikai betegségek kezelési lehetőségei• A genetikai orvoslás etikai és jogi aspektusai

1953

Év Nobel-díjasok Felfedezés1953 F. Crick, J. Watson, M. Wilkins DNS molekula szerkezete

1965 F.Jacob, J. Monod, A. Lwoff Genetikai szabályozás

1966 P. Rous Onkogén vírusok

1968 R. Holley, G. Khorana, M. Nireberg A genetikai kód megfejtése

1975 D. Baltimore, R. Dulbecco, H. Temin Interakció a tumor vírusok és a nuclearis DNS között

1978 W. Arber, D. Nathans, H. Smith Restrictios endonuclease

1980 B. Benacerraf, J. Dausset, G. Snell Immunológiai válaszok genetikai kontrollja

1983 B. McClintock Mobil gének (transposonok)

1985 M. Brown, J. Goldstein Sejt receptorok familiáris hypercholesterinaemiában

1987 S. Tonegawa Antitestek genetikai aspektusa

1989 M. Bishop, H. Varmus Onkogének tanulmányozása

1993 R. Roberts, P. Sharp ‘Split gének’

1995 E. Lewis, C. Nüsslein-Volhard, E. Wieschaus Homeostasis és egyéb fejlődéstani gének

1997 S. Prusiner Prionok

1999 G. Blobel Fehérje transzport signaling

2000 A. Carlsson, P. Greengard, E. Kandel Signal transductio az idegrendszerben

2001 L. Hartwell, T. Hunt, P. Nurse Sejtciklus regulátorok

2002 S. Brenner, R. Horritz, J. Sulston Genetikai szabályozás a fejlkődésben és programozott sejtahalál (apoptosis)

2006 A. Fire, C. Mello RNS interferencia

Mi a genomika ?

DNS szintű variációk és a gén expressziós

mintázatok összességénekbioinformatikailag értékelt

biológiai összhangzattana

Genom-Alapú Biológia

„systems biology”= rendszer-szemléletű biológia

genomikai adatbázisok „high-throughput” technológiák bioinformatika

NFkB

HumánGenom

Program1990-20031990-2003

“Welcome to the Genomic Era”Guttmacher and Collins, NEJM 2003;349:996

DNA 50DNA 50thth Anniversary Anniversary

Human Genome SequenceHuman Genome Sequence

““DNA Changed the World: Now What?”DNA Changed the World: Now What?”NY Times, February 25, 2003NY Times, February 25, 2003

Három „törvényHárom „törvény”” The amount of available DNA sequence

data will double every 18 months The number of available genomes will

double every 18 months The cost of sequence will drop by a factor

of 2 every 18 months.

A modern biológia fejlődése

populációk (Darwin)

egyedek (Mendel)

tervezett élőlényeksejtek (szintetikus biológia)

kromoszómák modellek (rendszerbiológia)

egyedi gének, fehérjék, molekulák egyszerre sok gén, molekula(molekuláris biológia) (genomika, proteomika, stb.)

1850

1900

1950

2050

2000

Pósfai György ábrája

A DNS-ben lévő információtömeg hatalmas

2 m DNS

1014 sejt– 5.9 fénynap

(22 + 1) pár kromoszóma

3.2 milliárd nukleotid bázis

~26.000 gén (genom 1.4%)

Egy gén DNS szekvenciájának megváltozása megváltoztathatja a kódolt fehérjét

Class of variation Rules for assigning allele to class Example Frequency

Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

Single base substitution involving A,T,C, or G

A/T 5,692,700(~93%)

Deletion/Insertion Polymorphisms (DIPs)

Designated using the full sequence of the insertion as one allele, and either a fully defined string for the variant allele or a “-” character to specify thedeleted allele .

T/-CCTA/G 431,319(~7%)

Microsatellite or short tandem repeat (STR)

Alleles are designated by providing the repeat motif and the copy number for each allele .

gatagatagatagata 2,440 (0.04%)

Named variant Applies to insertion/deletion polymorphisms of longer sequence features, such as retroposon dimorphism for Alu or line elements.

(alu) / - 1,859(0.03%)

Az emberi sokféleség genetikai alapja

Derived from dbSNP release 119http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

Az STR olyan mintázat, ahol 2 vagy több nt ismétlődik és az ismétlődő sequenciák közvetlenül egymás mellett vannak

Hosszuk 2-50 bp és introni régióban vannak.STR polymorphismus azt jelenti, amikor a homolog STR locusok

repeat száma az egyedek között különbözik. Egy adott elhelyezkedésű adott sequencia a genomben meghatározza az

egyén genetikai profilját .

Combined DNA Index System (CODIS) DNA database funded by the FBI

1 aatttttgta ttttttttag agacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg actatggagt 61 tattttaagg ttaatatata taaagggtat gatagaacac ttgtcatagt ttagaacgaa

121 ctaacgatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagacagat 181 tgatagtttt tttttatctc actaaatagt ctatagtaaa catttaatta ccaatatttg 241 gtgcaattct gtcaatgagg ataaatgtgg aatcgttata attcttaaga atatatattc 301 cctctgagtt tttgatacct cagattttaa

Transposon- jumping gene

Class I – Retrotransposon2 lépésben iródik át: 1. DNSből RNS transcriptióval ,

majd RNS ből DNS reverse transcriptióval .Ezt követően a DNS kópia az genomban új helyre

ékelődik be .

Class II - DNS transposonItt az RNS nem iktatódik közbe, tarnsposonase

katalizál. „Cut and paste”- a retrovirus ezzel a módszerrel integrálódik.

A transposonok mutagének-Ha funkcionális génbe insertálódik tönkreteszi -annak a funkcióját

-Ha elhagyja a gént a fennmaradó „lukat” nem tudja javitani a sejt

-Alu elementek gátolják a mitosis and meiosis alatt a chromosomák párosodását így egyenőtlen crossovert

eredményeznek és ez okozza leggyakrabban a chromosomák duplikációját.

Az Alu elemek a DNS erősen repetitiv szekvenciái CpG szigetekben gazdagak, max 300 bp hosszúak, melyek a human genom legmobilisabb

elemei (transposon). Tartalmaz funkcionális RNS polymerase III promotert, intermedier nem-codoló elementeket, és RNS-szerű poly(A) farkat.

A kis 7SL cytoplasmikus RNS-ből származikAz Alu inserciókat több human betegséggel és rosszindulatú daganattal is

kapcsolatba hozták. Pl. ha kódoló régióba insertálódik: neurofibromatosis, haemophilia, agammaglobulinaemia, leukemia, emlőrák, ovárium tu

alakulhat ki

Centralis dogma: egy gén, egy protein

A DNS-től a Proteomig

Genom Mi történhetne?Transcriptom Mi történhet?Proteom Mi történik

AcAc

Ac AcAc

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

Ub

UbUb

Ub

SUMO

Me

MicroRNA

P

AAA

Me

A génszabályozás ma ismert epigenetikai tényezői

Methylation

Ubiquination Sumoylation

Acetylation

Phosphorylation

Me

Histone proteins

Lehetséges epigenetikus hatással rendelkező viselkedéses és társas tényezők

• Szülői magatartás

• Krónikus stressz

• Életmód

• Metiláció = gyengítés

• Acetiláció= erősítés

Mi történik a „rossz” patkányanya kölykeivel?

• Glukokortikoid receptor gén („fő stresszreceptor”) metilációja a stresszre adott válasz egyik központi meghatározója

stresszelhetőség nő 1,2

• ERα ösztrogénreceptor metilációja nőihormon receptor, mely az anyai viselkedést is meghatározza

fogamzóképesség és anyai magatartás csökken

• IV BDNF metilációja általános regeneráló és öregedést gátló vegyület gyengébb ellenállóképesség, rosszabb hangulat, gyorsabb

öregedés1Weaver et al (2004). Nat Neurosci 7(8): 847-54 2Szyf et al (2005). Front Neuroendocrinol 26(3-4): 139-423,4Champagne et al (2003, 2006) Physioll Behav, 79(3), 359–371. Biol Psychiat, 59(12), 1227–12355Roth et al (2009). Biol Psychiat, 65(9), 760–769.

98.7% -a az emberi genomnak nem kódol fehérjét („junk”?!?)

98%

A főbb genom technológiák• DNS Sequencia

• Sequencia változások• Kópiaszám változás• SNP variációk

• Messenger RNS (gén expresszió)• Micro RNS• Protein-DNS kötődés (transcription factor binding)• Specifikus proteinek szintje (mass. Spec)• Protein conformatiós változások (mass. Spec)• Protein-protein interactiok (mass. Spec/2-hybrid)• Protein elhylezkedés• Genetikai interakciók

GCAATCGATCTGGTACAGTAGCTAGCAATTGATCGGGTACATTAGCTA

Hap-Map/ 20 millió pontmutáció

EXPRESSZIÓS MICROARRAY/CHIPNANOTECHNOLÓGIA, NANOTECHNOLÓGIA, Szilárd Fázisú KÉMIASzilárd Fázisú KÉMIA

FEHÉRJE FIZIKAI TECFIZIKAI TECHHNIKÁKNIKÁKBiofizika, nanofizikaBiofizika, nanofizika

METODIKAI REPERTOIRE

TELJES GENOMVIZSGÁLAT

ADATBÁZISOK

BIOINFORMATIKABIOINFORMATIKAGÉNHÁLÓZATOK- ÚTVONAL ANALÍZISGÉNHÁLÓZATOK- ÚTVONAL ANALÍZIS

NYELVÉSZET ELJÁRÁSOKNYELVÉSZET ELJÁRÁSOK

SNP

Genotyping• Hybridization based methods

– Eg. SNP microarrays

• Enzyme based methods– RFLP– PCR based methods

• Other postamplification methods based on the physical properties of the DNA– SSCP– DHPLC

Illumina SNP Tipizálás

• Single Nucleotide Polymorphisms• 1 every ~1200 bp (~5M/person)• > 6,200,000 validated SNPs

Genomic DNA [ T/C ]‘T’ Allele Primer A

G‘C’ Allele Primer

23&Me 399 USD 1.000.000 SNP meghatározását kínálja

Microarray metodika

Mintából RNS izolálás

RNS minőség ellenőrzése

Amplifikáció és jelölés

Hibridizáció

ScannelésAdatnormalizálásFeature Extraction

Bioinformatikai kiértékelés

Whole Human Genom Microarray Kit4x44K – G4112F

AGILENT

Az összes (44.000) gén expressziójának

kumulált ábrázolása

Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH)

• Delivering decisions from DNA

• to investigate genomic imbalance at a much higher resolution than is possible by traditional metaphase cytogenetic techniques (FISH)

Reference sample Test sample

DNA DNA

DNA isolation

DNA labelling

Hybridization to microarray

slides

Scanning

Microarray image

Bioinformatical analysis

Deletion

Bioinformatical analysis

DeletionDeletionDeletion

Bioinformatical analysis

Deletion

1

3

2

45

Sanger sequencingChain termination method

The key principle of the Sanger method was the use of dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) as DNA chain terminators

Next Generation SequencingHigh Throughput Techniques

• Lynx• Pyrosequencing• Illumina• Solid• Etc.

Allele frequency determination in pooled samples derived from amplicon resequencing with Illumina

Orvosi Genomika– Milyen gének vesznek részt a kóros fenotípus

kialakításában

– A genom • hogyan befolyásolja az egyes betegségekre való

hajlamot• a gyógyszer reaktivitást és mellékhatást –

farmakogenomika

– Hogyan befolyásolhatjuk a genom működését: • génterápia

– Mi a genom-környezet kölcsönhatásának szerepe a betegségek kialakulásában - epigenetika

Molekuláris genetikai diagnosztika• Infektológiai diagnosztika (pl. HPV)• Genetikai azonosítás

– apaság, – igazságyügyi orvostan

• Genetikai diagnosztika– Somatikus átrendeződés tumorokban– Tumorokban megváltozó génexpressziók– Genetikai rizikótényezők– Farmakogenomika– Monogénes beteségek

“Except for being hit by a car when crossing the street, all human disease is genetic.”

Reed Pyeritz, MDNewsweek, 1981

Monogénes vs Complex Betegségek

Monogénes Betegségek: Sikertörténet

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Hyperlipidaemia

Rheumatoid Arthritis

Schizophrenia

Huntington-kór

gének

környezet

A genetikai faktorok milyen arányban vesznek részt a betegség kialakításában

Heritabilitás

Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)A catalog of human genes and genetic disorders

Genetic diseases

http://www.blc.arizona.edu/courses/181gh/rick/human_genetics/jpegs/cells.jpg

gén 1

gén 2 környezet

Kevés gén a környezeti faktorokkal együtt magas rizikót

okozhat

gén 1

környezet

gén 5

gén 4

gén 2

gén 3

Sok gén a környezeti faktorokkal együtt alacsonyabb rizikóval jár

Komplex fenotípusok Mit várhatunk?

Complex polygénes betegségek génjeinek azonosítása nagy kihívás

• A gén variánsok hatása kicsi (gyenge genotypus-phenotypus asszociáció)

• A környezet, a diéta, az életstílus befolyásolja a betegségek génjeinek expresszióját – epigenetika

• A GWAS vizsgálatok leginkább a gyakori és nem a ritka variánsokat vizsgálták

• Nagy populációk szükségesek, ahhoz hogy a GWAS vizsgálatoknak statisztikai ereje legyen

• A klinikai vizsgálatokban sokszor rossz volt a vizsgálati terv, a populáció struktúrája, az etnikai összeállítása (az SNPk frequenciája az egyes etnikai csoportokban különböző)

• Sok kezdeti asszociáció nem reprodukálódott a későbbi vizsgálatokban a klinikai validálás hibája

A genetikai rendellenességek típusai

I. A nukleáris genom rendellenessége(23 pár kromoszóma, 3 milliárd bázis, 22-25 ezer gén)

1. Kromoszóma-rendellenességek2. Monogénes betegségek3. Oligo- és poligénes betegségek4. Epigenetikai módosulások

II. Mitokondriális genom rendellenessége (17 ezer bázis, 37 gén)

Öröklődésmódok

• Mendeli öröklődés (AD, AR, XR, XD, Y)• Multiplex allélek, komplex öröklődés- vércsoport• Uniparentalis disomia (meiosis hiba) pl. Angelman sy.

• Genomialis imprinting– 80 imprinted humán gén– (pl Prader Willi sy.)

• Mitochondrialis öröklődés

Epigenetika

Angelman szindróma

Súlyos mentális retardáció, ataxia, „vidám” megjelenés, epilepszia

Prader-Willi szindróma

Mentális retardáció, obesitas, hypogonadismus

Genetikai ok: a 15q11-q13 deléciója

Anyai kromoszóma deléció (UBE3A gén) Apai kromoszóma deléció

Ubiquitin-protein ligase E3A methilációs probléma – sex specifikus imprinting.

Mitochondriális öröklődésA mitochondriális DNS: 17.000 bázis, 37 gén: 13 protein (légzési lánc),

22 tRNS, 2 rRNS.

De: a mitochondriális fehérjék száma ~1500. Döntő részüket a nukleáris genom kódolja!

A petesejt 100.000 – 1.000.000 kópia mitokondriális DNS-t tartalmaz (polyplasmia).

• 500-2000 mitochondrium/sejt

• Minden mitochondriumnak saját DNS-e van

• Az mtDNS kis, kerek, polyplasmikus, maternálisan öröklődik

• Nincs repair rendszere

mtDNS sequenciamtDNS sequencia

Mitochondrialis Mitochondrialis medicinamedicina

DiagnostikaDiagnostikamtDNS betegségek

Populáció genetikaPopuláció genetika

Antropologiai markerAntropologiai marker

Az mtDNS populációgenetikai jelentőségeAz mtDNS populációgenetikai jelentősége

• Maternalis öröklődés, nincs recombináció• mtDNS variációk = haplotypusok (a D-loop alapján 27

haplotypus)• Filogeographia

Human mtDNS morbiditási térképe

Genetikai tesztek

• Biokémiai genetika• Cytogenetika• Molekuláris genetika

Biokémiai genetika

• Metabolitok: pl. hosszú szénláncú zsírsavak gázkromatográfiája

• Fehérje szerkezet: pl. dystrophin Western blot dystrophinopathiak esetében

• Enzimaktivitás: pl. foszforiláz aktivitás McArdle betegség, alpha glucosidase Pompe kór

Cytogenetika(kromoszóma rendellenességek detektálása)

• Klasszikus kromoszóma analízis: karyotipus • Kromoszoma átrendeződések vizsgálata: speciális

festési technikák• Mikrodeléció szindróma, duplikációk detektálása: pl.

FISH

Monogénes betegségek mutációs profiljai

• Átrendeződések

• Pontmutációk

• Nukleotid repeat expansiok

Gén átrendeződés

Átrendeződések

– Deléció • Intragénikus (in frame, out of frame) pl. Duchenne

MD, HNPP• Nem egy génhez köthető (sokféle hatás) pl. FSH

– Duplikáció pl. CMT1a (PMP22)

Átrendeződések detektálása

– Southern blot– Real Time PCR– MLPA– Quantitativ fluorescens fragment hossz elemzés

Deléció típusok eat the big mac – vad típus

In frame delécióeat the big maceat the mac– in frame deléció

Out of frame delécióeat the big maceah ebi gma – out of frame deléció

Pontmutációk – nem synonym egyes nukleotid polymorphizmusok

• Pontmutáció– Nonsense– Missense– Splice site mutáció

• Pontmutáció detektálása– PCR – RFLP, – Real-Time PCR– Szekvencia analízis

Nukleotid repeatek

• Ismétlődő szekvenciák (CAG, CGG, GAA, CTG, CCTG, ATTCT) a genomban

• Ismétlődő egységek: 3, 4, 5 nukleotid

Trinukleotid repeat betegségekI. típus II. típus

Betegség Huntigton kór, SCA,

FRAXA, dystrophia myotonica,

Friedreich ataxia

Ismétlődő egység CAG CGG, CTG, GAA

Instabilitás foka közepesen stabil nem stabil

Repeat lefordítódik-e proteinre igen nem

Patológia speciális neuronok károsodása

multiszisztémás betegségek

Patomechanizmus toxikus proteinek hatásahypermetiláció,

transkipciós interferencia, toxikus mRNS

Charting a course for genomic medicine from base pairs to bedsideGreen ED and Guyer MS: Nature 2011; 470, 204–213

A genetikai markerek szerepe a betegellátásban