Monitoreo del proceso de purificación

Determinación de la concentración de proteínas

Método de Bradford

Purificación de la enzimaLDH

Extracción y precipitación

PurificaciónDeterminación de la concentración

• Conocer la concentración de proteínas en unamuestra, permite evaluar el proceso depurificación.

• Rendimiento: Porcentaje de actividad biológica de la proteína de interés a cada paso de la purificación. Actividad del extracto original =100%

• Grado de Pureza: Incremento en pureza a lo largo del proceso.

P=𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑋

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙

• Lo que se puede hacer con una proteína super pura.

Actividad totalActividad especifica

Act

ivid

ad e

spec

ific

a

1 2 3 4 5 6

Superdex (Exclusion molecular)

Mono Q (intercambio Aniónico)

CARRILES Fracciones1. 412. 423. 434. 44 5. 456. 46

CARRILES1. PaBADH wt2. E124S (fracciones 27+28 A y B utilizadas para cristalización)

3. Fracción 26 A4. Fracción 29 A

5. Fracción 26 B6. Fracción 26 B

1 2 3 4 5 6

Purificación de la mutante E124S de Betaína aldehído deshidrogenasa de Pseudomonas aeruginosa

La pureza no era buena solo utilizando cromatografías de intercambio iónico y afinidad.

Máximo grado de pureza alcanzado

Métodos para monitorear el proceso de purificación

Los métodos más usuales son:

- Absorción en el ultravioleta.

- Reacción del Biuret.

- Método de Lowry.

- Método de Bradford.

Principio

• En condiciones ácidas, el colorante Coomassie Brillant Blue G-250 se une a las proteínas por los aminoácidos básicos (Arg, Lys, His) y con los residuos aromáticos (Trp, Tyr y Phe).

• El colorante tiene tres formas:

• Forma catiónica (470 nm)

• Forma neutral (650 nm)

• Forma aniónica (595 nm)Ganske, BMG LABTECH,2008.

•El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estándar).

Método de Bradford

Actividadespecífica

Dadoen:𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠/

𝑚𝑔 𝑑𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎

Necesitamos:

a) Determinación de la cantidad de proteína de interés (LDH).I. Propiedades espectroscópicas.II. Detección por fluorescencia.III. Unión a fluoróforosIV. Ensayo enzimático.

b) Determinación de cantidad total deproteína.

Determinación de la cantidad deproteína

Absorbancia a 280mn Bradford

Ventajas • Simple y rápido

• No destructivo

• Muy sensible 1µg/mLa

1.5 mg/mL

• Complejo colorante-

proteína tiene un altoε

Desventajas • Pocoexacto • Afectado por algunos

detergentes.

• Depende de la

presencia de residuos:

Tyr y Trp.

• El colorante se une a las

celdas de cuarzo.

Determinación • Concentración𝐴𝑏𝑠280𝑛𝑚

(µg/µL)=( )*10ε (%)

• Curva patrón

Determinación de concentración de

proteínas

Curva patrón Muestras

Orden de adición de reactivos para la determinación de proteínas del estándar BSA

[BSA]= 0.1 mg/mL

Determinación de concentración de

proteínas

Curva patrón

Muestras

[BSA]= 0.1 mg/mL

Diluciones LDH

Cálculo

• 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜𝑑𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 µ𝑔 =𝐴𝑏𝑠595𝑛𝑚−𝑏

∗𝐹

b= ordenada al origen

m= pendiente

F= Factor de dilución (número de veces que diluyeron)

Paso de

purificación

Vol de fracción

(mL)

Proteína total

(mg)

Actividad (U) Actividad específica

(U/mg)

Extracto crudo

F1

1,400 10,000 100,000 10

Precipitación con

(NH4)2SO4 F2

280 3000 96000 32

Cromatografía

exclusión de

tamaño F4

Desalado

90 400 80,000 200

Cromatografía

intercambio

iónico

FIA,FIB,FIC

80 100 60,000 600

Cromatografía

de afinidad

FPA,FPB,FPC

6 3 45,000 15,000

Purificación de un enzima hipotético x