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Monografía clorofilas Javier Cea Nº de palabras: 3820

Monografía Clorofila

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Trabajo de extracción de clorofilas

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Monografía clorofilas

Javier Cea

Nº de palabras: 3820

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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En agradecimiento a Isabel,

por su dedicación y apoyo.

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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Resumen

A lo largo de la monografía, he estudiado la concentración de clorofilas a y b presentes en las espinacas y su degradación en feofitinas, utilizando técnicas clásicas de laboratorio y espectrofotométricas, para dar respuesta a la investigación planteada.

El primer paso fue separar las clorofilas mediante dilución con solventes orgánicos de distinta polaridad, para localizar en sus espectros los máximos de absorción característicos. Después, calculé por espectrofotometría las concentraciones de cada clorofila en diversos extractos de hojas de espinaca en acetona al 80% y la concentración de clorofila total por gramo de espinacas.

Para conocer en qué condiciones y que clorofila se degrada más rápidamente, realicé un estudio cinético de la reacción de las clorofilas con HCl y analicé extractos de muestras tratadas distintamente para saber si tenían inicialmente feofitinas. Dada la gran pérdida de peso en las espinacas deshidratadas, calculé su % inicial de contenido en agua. Finalmente, estudié la evolución de un extracto almacenado.

Conclusiones:

- La concentración de clorofila a en espinacas, es mayor que la b, y la gran concentración de ambas frente a la de carotenoides confiere el color verde a este vegetal.

- La estructura de las clorofilas es fácilmente alterable ante la presencia de ácidos fuertes. La cinética es de primer orden, y la clorofila a se degrada con una constante de velocidad mayor.

- Los tratamientos por calor, transforman muchas de las clorofilas en feofitinas de color verde pardo.

La limitación de este trabajo ha sido no disponer de clorofilas puras, por lo que algunos resultados son estimativos. No obstante, el análisis e interpretación de los espectros ha sido mucho más profundo.

Como continuación de este trabajo, podría estudiar la acción de ácidos débiles y bases en las clorofilas y su conservación en distintos medios de almacenaje.

Número de palabras: 295

Índice________________________________________________________________Páginas

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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1. Introducción…………………………………………………………………... 5

2. Fundamentos teóricos ……………………………………………………... 7

2.1. Características químicas de la clorofila …………………………………. 7

2.2. Técnicas de extracción y separación de los pigmentos …………………. 9

2.3. Espectrofotometría. Ecuación derivada de la ley de Lambert-Beer ……… 10

2.4. Cinética de la reacción ..…………………………………………………. 12

3. Fase experimental …………………………………………………………... 13

3.1. Extracción y separación de las clorofilas a y b …..………...……………. 14

3.1.1. Procedimiento experimental ……………….…………………………….. 14

3.1.2. Análisis de la técnica en cuánto a la polaridad de los disolventes ……… 15

3.2 .Identificación de los máximos de absorción de las clorofilas a y b …….... 17

3.3. Aplicación de la Ley de Lambert-Beer para el cálculo de concentraciones 183.3.1. Selección de los coeficientes de extinción específicos …………………… 183.3.2. Deducción de las ecuaciones para el cálculo de las concentraciones .......... 19

3.3.3. Obtención de espectros y cálculo de las concentraciones de clorofilas a y b 20

3.3.4. Obtención de la masa de clorofila total por g de tejido vegetal …………..... 22

3.3.5. Relación entre concentraciones de clorofilas a y b y carotenoides…………. 23

3.3.6. Cálculo de errores ……………..………………………..………………….. 24

3.4. Estudio cinético de la degradación de clorofilas en presencia de un ácido 25

3.4.1. Procedimiento experimental ….…………………………………………….. 25

3.4.2. Resultados de la cinética …………………………………………………. 26

3.4.3. Cálculo de errores. Variables ……………………………………………... 29

3.5. Degradación de las clorofilas en función de la temperatura …………….. 32

3.6. Cálculo del contenido en agua en las espinacas………………………….. 35

4. Consideraciones en el método empleado ………………………………….….. 36

5. Material utilizado …………………………...……………………………….... 37

6. Conclusiones ...…………………………………………………………….….. 38

7. Referencias bibliográficas……………………………………………….…….. 39

8. Apéndices ………………………………………………………………..……. 41

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1. Introducción

Actualmente, la abundancia de marcas de alimentos que proponen sus productos a los consumidores hace cada vez más difícil la elección del artículo. El género está cada vez mejor cuidado y tratado y llega a los supermercados en las mejores condiciones con el fin de atraer a los compradores mediante características como el color y un buen aspecto del producto.

No obstante, a pesar de los avances en tecnología alimentaria, mantener el alimento en las mejores condiciones no siempre es fácil. Por ejemplo, las frutas y las verduras frescas son muy difíciles de conservar y mantener su color, ya que uno de sus principales componentes, la clorofila, se degrada muy fácilmente mediante la luz, la temperatura o incluso el tratamiento previo de conservación, cambiando su color verde intenso a un verde parduzco.

La clorofila ha sido continuo objeto de estudio por su vital importancia en la Naturaleza, pues interviene de forma fundamental en el proceso de la fotosíntesis y en la salud, porque es una sustancia antioxidante, antimutagénica y antibacteriana. Cuando este compuesto se degrada, estas propiedades desaparecen, por lo que se deben consumir los vegetales cuando todavía tienen altas cantidades de clorofila.

La mayor parte de las investigaciones se centran en las clorofilas a y b, por ser los pigmentos fotosintéticos más abundantes en la Naturaleza y por su fácil extracción. En este trabajo, la planta utilizada para extraer la clorofila será la espinaca (Spinacia oleracea), verdura muy rica en dicho compuesto.

Con este trabajo de investigación pretendo conocer cómo aceleran algunos de los factores antes mencionados el proceso de degradación de las clorofilas en feofitinas, cuyo color es verde parduzco. El cambio de coloración en el proceso de feofitinación es claro, ya que el extracto de clorofila es verde intenso. Sin embargo, un simple cambio de color no es suficiente para estudiar en profundidad la degeneración clorofílica.

He realizado un trabajo de carácter experimental basado fundamentalmente en técnicas espectrofotométricas, estudiando las concentraciones de las clorofilas a y b en distintas muestras de extractos de espinaca en acetona al 80%, así como el contenido total de clorofila en espinacas y comprobando la proporcionalidad entre absorbancias y concentraciones.

Para conocer qué clorofila degenera más rápidamente, he estudiado sus degradaciones en medio ácido a través de sus cinéticas correspondientes, calculando las constantes de velocidad y comprobando que siguen una cinética de primer orden.

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Para estudiar la acción del calor sobre estos pigmentos me he basado en la observación de los espectros iniciales de las clorofilas en extractos de espinaca fresca, deshidratada en microondas, a temperatura ambiente, a 40º y 80º C y posteriormente los he comparado con los espectros de la misma muestra ya acidificada.

Otro factor que influye en el aspecto de las espinacas es su hidratación, por lo que he calculado el contenido de agua en varias muestras de espinacas.

Finalmente, la observación del color del extracto me ha proporcionado información cualitativa sobre las zonas en las que absorbe luz y, por lo tanto, en qué longitudes de onda me tenía que basar para realizar este estudio.

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2. Fundamentos teóricos

2.1. Características químicas de la clorofila

La clorofila está formada por 4 anillos de pirrol unidos por puentes metilénicos que constituyen un anillo más grande llamado porfirina, en cuyo centro se encuentra un átomo de magnesio. A todo este complejo se une una cadena hidrocarbonada, el fitol.

Ilustración 1: Estructura química de la clorofila a y b

Dependiendo de los radicales que se unan a la porfirina (estructura común en las clorofilas), existen diferentes tipos de clorofila: clorofila a, cuyo radical es un metilo, es el tipo más frecuente; clorofila b, presente en casi todos los vegetales, cuyo radical es un aldehído; y las clorofilas c y d, muy poco abundantes, presentes únicamente en algunas cianobacterias y algas. La ilustración 2 muestra estructuras derivadas de las clorofilas1.

1 Universidad Nacional Abierta y a Distancia (UNAD). Química de los alimentos [en línea]. Disponible en web: http://datateca.unad.edu.co/contenidos/301203/301203/leccin_33_pigmentos.html

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Ilustración 2: Transformaciones de las clorofilas

El estudio tratará sobre el cálculo de la concentración de clorofila en espinacas frescas envasadas en plástico transparente y su degradación en feofitinas, compuestos derivados de las clorofilas, que carecen del átomo de magnesio presente en ellas2.

Ilustración 3: Degradación de la clorofila a en feofitina a

2.2. Técnicas de extracción y separación de los pigmentos

2 MAIOCCHI, M. G. ; AVANZA, J. R. Degradación de clorofilas y feofitinas a diferentes temperaturas enIlex dumosa e Ilex paraguariensis [en línea]. Universidad Nacional del Nordeste (Argentina): [s.n] 2004. Disponible en web: http://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/com2004/8-Exactas/E-085.pdf

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Una de las técnicas más empleadas para extraer las clorofilas de las espinacas se basa en transferirlas a una fase líquida, utilizando normalmente un disolvente orgánico. La muestra debe ser previamente molida, macerada o triturada, para favorecer mayor superficie de contacto entre el sólido y el solvente y se debe procurar un movimiento continuo, para que la operación sea eficaz. Se realiza preferiblemente a temperatura y presión ambientes. La elección del disolvente es muy importante ya que la mayor o menor extracción de los pigmentos dependerá de la polaridad del disolvente.

Tabla 1: Polaridad de disolventes

POLARIDAD CRECIENTE

Eter de petróleoHexanoToluenoBenceno

Éter etílicoTetracloruro de

carbonoCloroformo

DiclorometanoAcetato de etilo

AcetonaEtanol

MetanolAgua

Una vez extraídos los pigmentos de las espinacas, para separarlos se utiliza la técnica de separación por solventes. Se basa en la disolución de los pigmentos en dos disolventes no miscibles entre sí, con distinto grado de solubilidad y polaridad. Esta operación se suele realizar entre una disolución acuosa y otro disolvente inmiscible con el agua con la ayuda de un embudo de decantación. La posición de las fases depende de las densidades de los disolventes.

Tabla 2: Polaridad de los pigmentos

Grado de polaridad de los pigmentos: Carotenos < Clorofila a < Xantofilas < Clorofila b

Los pigmentos de los vegetales tienen carácter apolar, aunque su grado de polaridad varía en función de su composición química. La clorofila a se diferencia de la clorofila b en tener un grupo metilo mientras que la clorofila b tiene un grupo aldehído que le confiere mayor polaridad.

Si se separan los pigmentos mediante estas técnicas se pueden obtener sus espectros y localizar los máximos característicos. Gracias a la combinación de la espectrofotometría con la ley de Lambert-Beer, se calculará la concentración de las

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clorofilas a partir de distintas muestras de extractos de espinaca por disolución de los pigmentos en acetona al 80 % a través de las absorbancias.

La observación del color de los extractos y de su evolución puede aportar información sobre las longitudes de onda de la región visible donde absorben o reflejan más luz.

Tabla 3: Relación entre λ y colores de la luz observados

Longitud de onda aproximada (nm)

Color de la luz absorbida Color de la luz reflejada

390 – 435435 – 490490 – 580580 – 595595 – 650650 – 780

VioletaAzul

VerdeAmarilloNaranja

Rojo

Amarillo verdosoAmarillo

RojoAzul

Azul verdosoVerde azulado

2.3. Espectrofotometría. Ecuación derivada de la ley de Lambert Beer

La espectrofotometría es una técnica que permite analizar los espectros de cualquier sustancia, y averiguar sus componentes. Un espectro de absorción representa todas las longitudes de onda que absorbe la muestra, y se obtiene a través de un espectrofotómetro, cuyo esquema se representa en la Ilustración 4.

Ilustración 4: Esquema del espectrofotómetro (elaboración propia)

La ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia de una disolución es directamente proporcional a su concentración, a la distancia recorrida por la luz y a una constante de proporcionalidad llamada coeficiente de extinción molar o específico (ε), que depende

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de las unidades de la concentración y es específica para cada longitud de onda y cada sustancia. Para que ε sea constante y se cumpla esta ley, las disoluciones han de ser diluidas.

En general, localizado el máximo de absorción de una sustancia, se prepara una curva de calibración a partir de distintas concentraciones de dicha sustancia, para obtener las absorbancias a esa λ. Al representar la absorbancia frente a la concentración, la pendiente nos proporciona el coeficiente de extinción. Así, podremos determinar cualquier concentración desconocida de una muestra a partir de su absorbancia.

Ilustración 5: Curva de calibración

A = ε.c.d

A = Absorbancia (adimensional)c = Concentración de la sustancia (g.l-1)ε = Coeficiente de extinción específico (g-1.l.cm-1)d = ancho de la cubeta (cm)

Pero cuando la concentración de las clorofilas a y b se determina a partir de un extracto que contiene ambas clorofilas y otros pigmentos, como es este caso, la ecuación derivada de la ley de Lambert-Beer es más compleja y la absorbancia en una longitud de onda determinada es la suma de las absorbancias de cada pigmento.

Aλ = Aclorofila a + Aclorofila b + Acarotenoides (1)

Para simplificar el cálculo de las concentraciones, se puede seleccionar una zona del espectro donde no interfieran los carotenoides y sólo absorban luz las clorofilas, aunque los máximos de absorción de ambas clorofilas estarán muy próximos y se solaparán. La absorbancia en una determinada λ de esta zona será:

Aλ = Aclorofila a + Aclorofila b (2)

2.4. Cinética de la reacción

Cuando la clorofila a se acidifica, el ión magnesio se pierde del anillo porfirínico, produciéndose feofitina a. El color cambia a un tono verde oliva2:

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C55H72MgN4O5 + 2 HCl C55H74N4O5 + MgCl2

La obtención de feofitina b a partir de la clorofila b es similar.

C55H70MgN4O6 + 2 HCl C55H72N4O6 + MgCl2

La degradación de ambos pigmentos se estudiará en este trabajo a partir de la evolución de sus espectros y de las concentraciones de clorofilas en presencia de HCl, con el tiempo. Para interpretar los datos cinéticos se puede utilizar el método de integración que se basa en la suposición previa del orden de la reacción y luego se comprueba si ese orden responde a los resultados experimentales. Si la reacción es de primer orden:

v = velocidad de desaparición de la clorofila a o bC = concentración de clorofila a o b en un tiempo t; C0 = concentración inicial de clorofila a o b;k = constante de velocidad de primer orden (s-1);t = tiempo (s)

v=−d [C ]dt

=K⋅[C ]

−∫ c0

c d [C ][C ]

=K⋅∫ 0

tdt

−ln [C ] c0

c =K⋅[t ] 0 t

ln (C / C0) = - kt (3) C = C0 . e-kt (4)

Por tanto, la concentración C disminuye exponencialmente con el tiempo. Una forma de comprobar si la ecuación propuesta se ajusta a los datos experimentales es la representación de ln (C / C0) frente al tiempo, que será lineal, y la pendiente k se denomina constante de velocidad de la reacción.3

3 PETRUCCI R. HARWOOD W. HERRING F. Química general. 8ª edición. Madrid: Ed. Pearson Education S.A, 2003. ISBN: 9788420535333.

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3. FASE EXPERIMENTAL3. FASE EXPERIMENTAL

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20 ml de extracto + 30 ml de éter de petróleo + 35 ml de agua

30 ml de pigmentos en éter de petróleo+ 55 ml de agua y acetona Desechar agua y acetona

30 ml de pigmentos en éter de petróleo + 25 ml de metanol al 92 %

Clorofila a en 25 ml de éter de petróleo+ CHLB en 20 ml de metanol

Desechar 10 ml de la interfase

20 ml de clorofila b en metanol + 20 ml de éter dietílico

+ 13 ml de agua desionizada

Almacenar clorofila a y carotenos en éter de petróleo

33 ml de metanol y agua + 20 ml de clorofila b en éter dietílico.

Desechar 33 ml de metanol

Almacenar clorofila b y xantofilas en éter dietílico

Extracción mediante diferentes solventes orgánicos

6 g de hojas de espinaca trituradas + 25 ml de acetona al 80%Volumen final filtrado del extracto = 20 ml

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3.1 Extracción y separación de las clorofilas a y b.

3.1.1. Procedimiento experimental

Se muestra un esquema del procedimiento en la Ilustración 6:

Ilustración 6: Esquema del procedimiento (elaboración propia)

3.1.2. Análisis de la técnica en cuanto a la polaridad de los disolventes

La acetona es un solvente de polaridad intermedia que sirve para extraer conjuntamente sustancias con distinto grado de polaridad, como es el caso de las clorofilas a y b. Se

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trituró la muestra de hojas de espinacas sin tallos y nervios en acetona al 80 % con una pizca de CaCO3 para prevenir la acidificación y la pérdida parcial de magnesio de las clorofilas. La muestra homogeneizada, se filtró y centrifugó durante 5 minutos a 10000 r.p.m. para evitar turbidez en el extracto. El volumen del extracto final era de 20 ml. Después se separaron las clorofilas por disolución del extracto en diferentes disolventes orgánicos.

El extracto fue introducido en un embudo de decantación añadiendo éter de petróleo, para transferir los pigmentos más afines a este disolvente que es más apolar que la acetona. Se añadió agua desionizada destapando el embudo cada cierto tiempo para expulsar los gases formados. Se formó una fase superior de color verde menos densa, donde se encontraban todos los pigmentos disueltos en el éter de petróleo, y la capa inferior con la mezcla de agua y acetona, demasiado polar para los pigmentos, que deseché.

La separación de xantofilas y clorofila b del resto de pigmentos se realizó añadiendo en el embudo limpio metanol al 92 %, más polar y denso que el éter de petróleo, ya que ambos disolventes son inmiscibles entre sí. La clorofila a, debido a su menor polaridad, es mucho más soluble en éter de petróleo que en metanol, al contrario que la clorofila b, que debido a su radical aldehído es más polar. Se formaron dos capas: la superior con los pigmentos más apolares, clorofila a y carotenos, disueltos en el éter de petróleo y la inferior con la clorofila b y xantofilas, más polares, en el metanol. Se almacenaron en frascos aparte.

Ya separadas las clorofilas, transferí la clorofila b y xantofilas en metanol a éter etílico, de menor polaridad, preferido por estos pigmentos. Para ello, mezclé volúmenes iguales de la muestra de clorofila b en metanol, y de éter etílico, en un embudo de decantación, añadiendo lentamente agua desionizada. Se formaron dos fases, la superior con la clorofila b y el éter dietílico, y la inferior con agua y metanol, que deseché4.

Tabla 4: Relación de pigmentos y disolventes en los que se encuentran

Pigmentos Clorofila a y carotenos Clorofila b y xantofilasDisolventes Eter de petróleo Eter dietílicoVolumen final y color 25 ml verde azulado 20 ml verde amarillento

4 Prácticas de Fisiología vegetal. Extracción de pigmentos fotosintéticos mediante disolventes químicos [en línea]. Universidad de Jaén. Disponible en web:http://www4.ujaen.es/~amocana/F.V/separacion%20de%20pigmentos%20mediante%20disolventes.pdf

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________Ilustración 7: clorofilas b y a

3.2. Identificación de los máximos de absorción de las clorofilas a y b en éter de petróleo y éter dietílico

Para identificar los máximos de absorción, obtuve los espectros del extracto inicial con todos los pigmentos de las espinacas en acetona, y los de los extractos de las muestras obtenidas de clorofilas a y b con pigmentos acompañantes en éter de petróleo y éter dietílico, respectivamente.

Ilustración 8: Comparación entre espectros de la mezcla de pigmentos y de los grupos de pigmentos separados

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Tabla 5: Localización de máximos de absorción de clorofila a y clorofila b

Longitudes de onda (nm) en máximos de absorciónClorofila a 422 526 576 615 661Clorofila b 453 592 644

Los carotenoides absorben luz visible de 380 a 520 nm5 mientras que las clorofilas a y b absorben luz en las regiones de color naranja-rojo y azul-violeta del espectro visible, de ahí su color verde. Por tanto, el estudio se centró en los máximos de absorción de 644 nm y 661 nm de las clorofilas b y a, respectivamente, si bien en acetona al 80 %, disolvente más polar, los máximos están desplazados a 646,6 nm y 663,3 nm. Podemos observar que la contribución de los pigmentos acompañantes en la región azul ensanchan las bandas.

5 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA. Espectro de absorción de carotenos [en línea]. Bogotá: [s.n]. Disponible en web: http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000051/lecciones/cap02/anexo_27.htm

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3.3. Aplicación de la ley de Lambert-Beer para el cálculo de concentraciones

3.3.1. Selección de los coeficientes de extinción específicos

He centrado el cálculo de las concentraciones en las longitudes de onda a 646,6 nm y 663,5 nm, valores correspondientes a los máximos de absorción obtenidos de la clorofila b, seleccionada a partir del pequeño hombro que presenta la curva, y el máximo de la a, respectivamente (Ilustración 9). Consultando las referencias bibliográficas6,7,8, decidí utilizar los valores de coeficientes de extinción de Lichtenthaler7 por su similitud en los valores de las λ de los máximos de las clorofilas obtenidos.

Tabla 6: Coeficientes de extinción específicos de clorofilas a y b en acetona al 80 % (g-1.l.cm-1)

Longitud de onda (nm) 646,6 663,3Clorofila a

20,49

(ε 646 ,6a )

86,30

(ε 663 ,3a )

Clorofila b

49,18

(ε 646 ,6b )

11,20

(ε 663 ,3b )

3.3.2. Deducción de las ecuaciones para el cálculo de las concentraciones de clorofilas a y b

A partir de la ecuación (2) tenemos para las λ seleccionadas:

A646,6 =ε646 , 6b . cb . ℓ+ε646,6

a . ca . ℓ (5)

A663,3 =ε663 ,3b . cb . ℓ+ε663 ,3

a . ca . ℓ (6)

6 MCKINNEY, G. Chlorophyll solutions absorption of light by chlorophyll solutions [en línea]. Universidad de California, Berkeley (EEUU): American Society for Biochemestry and Molecular Biology, 13/03/1941. Disponible en web:http://www.jbc.org/content/140/2/315.full.pdf+html7 PORRA, Robert J. The chequered history of the development and use of simultaneous equations for the accurate determination of chlorophylls a and b. Países Bajos: 07/2001, 14/10/2001. Disponible en web:http://www.life.illinois.edu/govindjee/Part1/Part1_Porra.pdf8 BUSCHMANN, Claus et al. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Oregon State University, Oregon (EEUU). Inc.Chlorophylls and Carotenoids: Measurement and Characterization by UV-VIS Spectroscopy . (2001) John Wiley & Sons

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Como ℓ=1 cm

, y sustituyendo los coeficientes de la Tabla 6:

A646,6 =ε646 ,6b . cb+ε646,6

a . ca=49 ,18 . cb+20 , 49 . ca

A663,3 =ε663 , 3b . cb+ε663 , 3

a . ca=11 ,20 .cb+86 ,30 .ca

Despejamos cb en (5)

cb=A646,6 −ε 646,6

a . ca

ε646 ,6b

y sustituimos en (6)

A663 ,3=¿ ε 663 ,3b ¿

A646,6 −ε646,6a . ca

ε646 ,6b +¿ ε663 , 3

a .ca ¿¿

ca=49,18⋅A663,3−11 , 20⋅A646,6

86,30⋅49 ,18−11 , 20⋅20 , 49

Despejando ca en (6), obtenemos:

cb=86 ,30⋅A646,9 −20 ,49 . A663,3

86,30⋅49 , 18−11 ,20⋅20 , 49

Y finalmente obtenemos las ecuaciones para el cálculo de concentraciones

(7)

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Ca=ε646,6

b ∙ A663,3−ε663.3b ∙ A646,6

ε663,3a ∙ ε646,6

b −ε663,3b ∙ ε 646,6

a

Ca( gL )=0,01225 ∙ A663,3−0,00279 ∙ A646,6

Cb=ε663,3

a ∙ A646.6−ε646,6a ∙ A663,3

ε663,3a ∙ ε646,6

b −ε663,3b ∙ ε 646,6

a

Cb( gL )=0,0215 ∙ A646,6−0,0051 ∙ A663,3

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(8)

3.3.3. Obtención de espectros y cálculo de las concentraciones de clorofilas a y b

He preparado extractos con distintas muestras de espinacas en acetona al 80 %. Una vez obtenido los espectros de cada extracto, registré las absorbancias a 663,3 y 646,6 nm. Los valores de las absorbancias correspondientes se sustituyen en las ecuaciones (7) y (8) para obtener las concentraciones de las clorofilas a y b, y de la clorofila total (Tabla 7).

Ilustración 9: Espectros de pigmentos de las hojas de espinaca en acetona al 80% a distintas concentraciones

Tabla 7: Concentraciones obtenidas a partir de las ecuaciones (4) y (5)

masa de espinacas

(g)m=±0.01

volumen acetona 80 %

(ml)V =±0.1

Absorbancia (UA)A=±0.001

Concentración (µg/ml)C=±0.02

Concentración (µg/ml)C=±0.03

Concentración (µg/ml)C=±0.03

λ = 663.3 nm λ = 646.6 nm Clorofila a Clorofila b Clorofila total

20

Page 21: Monografía Clorofila

Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________

0.80 25.0 0.837 0.450 9.00 5.41 14.40

0.65 25.0 0.716 0.387 7.69 4.67 12.36

0.55 25.0 0.623 0.325 6.73 3.81 10.54

0.50 25.0 0.560 0.292 6.05 3.42 9.47

0.45 25.0 0.499 0.265 5.37 3.15 8.53

0.40 25.0 0.461 0.240 4.98 2.81 7.79

0.35 25.0 0.428 0.222 4.62 2.59 7.21

0.30 25.0 0.351 0.176 3.81 1.99 5.80

Las representaciones gráficas de las absorbancias frente a las concentraciones obtenidas de cada clorofila demuestran una relación lineal y que se cumple la ley de Lambert-Beer. Los coeficientes de correlación dan una alta fiabilidad.

Ilustración 10: Representación de absorbancias frente a concentraciones de las clorofilas a y b

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.000

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

f(x) = 0.0936109688614386 x − 0.00513096996388729R² = 0.999969652258632

Clorofila "a"

Concentración clorofila a (mg/ml)

Abso

rbanc

ia (U

A)

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.000

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

f(x) = 0.0803446021400401 x + 0.0148952245741829R² = 0.999252443329525

Clorofila "b"

Concentracion clorofila b (mg/ml)

Abso

rbanc

ia (U

A)

3.3.4. Obtención de la masa de clorofila total por g de tejido vegetal

A partir de las concentraciones obtenidas (Tabla 8), calculamos la masa de clorofila a, b y total en µg para cada muestra, que hay por g de hoja sustituyendo en la ecuación:

21

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________

masa clorofila (µg/g de hoja )=concentración clorofila (µg/ml )g de hoja

×ml de acetona

(7)

Tabla 8: Masa de clorofila por gramo de tejido vegetal

masa de espinacas

(g)m=±0.01

volumen acetona 80 %

(ml)V =±0.1

Concentración espinaca fresca en

acetona 80% (g.ml-1)

Concentraciónclorofila a

(µg/g de hoja)Ca=±0.02

Concentraciónclorofila b

(µg/g de hoja)Cb=±0.03

ConcentraciónClorofila total (µg/g de hoja)CT=±0.03

0.80 25.0 0.032 281.18 168.95 450.130.65 25.0 0.026 295.82 179.57 475.390.55 25.0 0.022 305.68 173.19 478.870.50 25.0 0.020 302.27 171.10 473.370.45 25.0 0.018 298.52 175.14 473.670.40 25.0 0.016 311.10 175.56 486.660.35 25.0 0.014 330.26 185.01 515.270.30 25.0 0.012 317.39 166.16 483.55

Ilustración 11: Contenido de clorofila en la espinaca

0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.0350.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

f(x) = 471.487562785388 xR² = 0.998765826952813

concentración espinacas en acetona al 80% (g/ml)

conc

entr

ació

n cl

orof

ila to

tal (

mg/

ml)

3.3.5.Relación entre concentraciones de clorofilas a y b y carotenoides

22

1 g de la muestra de espinaca contiene (0,47 ± 0,03) mg de clorofila a y b

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________

A partir de las ecuaciones (5) y (6) y la de Lichtenthaler9 para el cálculo de la concentración de carotenoides, se lee la absorbancia a 470 nm por ser donde más luz absorben y se calcula la relación entre la clorofila total y dichos pigmentos (Tabla 9).

cx+c (µg/ml) = (1000 A470 - 1.82 ca - 85.02 cb) /198 (7)

Tabla 9: Relaciones entre las concentraciones de los pigmentos

Absorbancia (UA)A=±0.001 Concentración (µg/ml) Relación entre

clorofilas a y b

Relación entre

Clorofilas y carotenoides

663.3 nm 646.6 nm 470.0 nm Clorofila aCa=±0.02

Clorofila bCb=±0.03

Xantofilas y CarotenoidesCx+c=±0.01

ca/cb

R1±R1

(ca+cb)/(cx+c)R2±R2

0.837 0.450 1.139 9.00 5.41 3.35 1.67 ± 0.01 4.31 ± 0.02

0.716 0.387 1.021 7.69 4.67 3.08 1.65 ± 0.01 4.02 ± 0.02

0.623 0.325 0.916 6.73 3.81 2.93 1.77 ± 0.02 3.60 ± 0.02

0.560 0.292 0.853 6.05 3.42 2.78 1.77 ± 0.02 3.40 ± 0.02

0.499 0.265 0.784 5.37 3.15 2.56 1.70 ± 0.02 3.34 ± 0.03

0.461 0.240 0.722 4.98 2.81 2.39 1.77 ± 0.03 3.25 ± 0.03

0.428 0.222 0.669 4.62 2.59 2.22 1.79 ± 0.04 3.24 ± 0.03

Ilustración 12 : Relaciones entre concentraciones de pigmentos

clorofila a/clorofila b

clorofila total/

carotenoides

00.5

11.5

22.5

33.5

4

La baja relación ca/cb indica que la espinaca es una planta que no necesita mucha luz para crecer y la alta relación entre clorofila y carotenoides indica su fuerte color verde y que las clorofilas se degradan más rápidamente que los otros pigmentos8.

3.3.6. Cálculo de errores de las concentraciones y de sus relaciones. Variables

x = a.b x ± x = a.b ± a b

9 BUSCHMANN, Claus. Op. cit.

23

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________

ca = 12.25 x A663.3 - 2.79 x A646.6

cb = 21.50 x A646.6 – 5.10 x A663.3

cT = ca + cb = 7.15 x A663.3 + 18.71 x A646.6

cx+c = (1000 x A470 - 1.82 x ca - 85.02 x cb) /198

ca = 12.25 x A663.3 + 2.79 x A646.6 = 12.25 x 0.001 + 2.79 x 0.001 = 0.015 ±0.02

cb = 21.50 x A646.6 + 5.10 x A663.3 = 21.50 x 0.001 + 5.10 x 0.001 = 0.027 ±0.03

cT = 7.15 x A663.3 + 18.71 x A646.6 = ±0.026 ±0.03

cx+c= (1000 x A470 + 1.82 x ca + 85.02 x cb)/198 = = (1000 x 0.001 + 1.82 x 0.02 + 85.02 x 0.02)/198 = ±0.014 ±0.01

x = a/b x/x = (a/a) ± (b/b)

R1 = ca/cb R1 = (ca/cb) x (ca/ca + cb/cb)

ΔR1=12.25 ×A663.3−2 .79×A646 .6

21.5 ×A646. 6−5.10×A663. 3 [ 0 . 0212 .25 ×A663. 3−2.79×A646. 6

+ 0.0321.5 ×A646 .6−5 .10×A663 .3 ]

R2 = (ca + cb)/(cx+c) = cT/cx+c R2 = (cT/cx+c) x (cT/cT + cx+c/cx+c)

ΔR2=7 . 15 × A663. 3+ 18 . 71 × A646. 6

(1000 × A470 - 1 . 82 × ca - 85 .02 × cb ) /198 [ 0 . 037 .15 × A 663 .3+ 18 .71 × A646.6

+ 0 .01(1000 × A 470 - 1 . 82 × ca - 85 . 02 × cb ) /198 ]

3.4. Degradación de las clorofilas en presencia de un ácido fuerte. Cinética de las clorofilas a y b

3.4.1. Procedimiento experimental

La clorofilas a y b se transforman en sus feofitinas a y b, por adición de HCl.

Ilustración 13: reacción de la clorofila a con HCl para dar feofitina a

24

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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Después de triturar una muestra de 3 g de espinacas en 95 ml de acetona al 80 % mediante el método ya explicado anteriormente, calibré el espectrofotómetro con el blanco. Al no disponer de cubetas de flujo, introduje 3,5 ml del extracto en la cubeta, y añadí 2 gotas de HCl 0.05 M. Agité la cubeta introduciéndola inmediatamente en el espectrofotómetro para medir la variación de las absorbancias a λ = 663.3 nm con el tiempo, cada 15 s. Repetí el procedimiento a λ = 646.6 nm. Volví a realizar la cinética recogiendo los espectros completos frente a las longitudes de onda para cada tiempo con 2 gotas y 3 gotas del ácido10.

Finalmente recogí espectros de la muestra inicial, y de la muestra acidificada con 3 y 6 gotas de HCl para estudiar los cambios observados en los máximos durante la feofitinización. Para el cálculo de concentraciones utilicé las ecuaciones (7) y (8):

ca (µg/ml) = 12.25 A663.3 - 2.79 A646.6 (7)

cb (µg/ml) = 21.5 A646.6 - 5.10 A663.3 (8)

La representación gráfica de ln (C/Co) frente al tiempo resultó ser lineal. Por tanto, el proceso de degradación de las clorofilas a y b responde a una cinética de primer orden respecto a la concentración de clorofila, y se cumple la ecuación (3):

ln (C / C0) = - kt (3)

Ilustración 14: Feofitina y Clorofila

10 JENWAY. Spectrophotometry of chlorophylls a and b [en línea]. Disponible en web: http://www.jenway.com/adminimages/A09_001A_Spectrophotometry_of_chlorophyll_a_and_b.pdf

25

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________

3.4.2. Resultados de la cinética

Tabla 10: Degradación de las clorofilas a y b en presencia de HCl

tiempo (s)

Absorbanciaλ = 663.3 nmA = ±0.001

Absorbanciaλ = 646.6 nmA = ±0.001

Concentración Clorofila a

(µg/ml)Ca=±0.02

Concentración Clorofila b

(µg/ml)Cb=±0.03

ConcentraciónClorofila total

(µg/ml)CT=±0.03

Ln (C/Co)Clorofila a

Ln (C/Co) Clorofila b

0 0.873 0.504 9.29 6.37 15.66 00.002 00.005

15 0.808 0.476 8.57 6.11 14.68 -0.0810.002 -0.0420.005

30 0.771 0.461 8.16 5.99 14.15 -0.1290.002 -0.0620.005

45 0.738 0.448 7.79 5.87 13.66 -0.1760.003 -0.0810.005

60 0.713 0.439 7.51 5.80 13.31 -0.2120.003 -0.0930.005

75 0.691 0.432 7.26 5.75 13.02 -0.2460.003 -0.1000.005

90 0.660 0.421 6.91 5.69 12.60 -0.2940.003 -0.1120.005

105 0.663 0.421 6.95 5.68 12.63 -0.2890.003 -0.1140.005

Ilustración 15: Degradación de las clorofilas a y b en presencia de HCl

26

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________

0 15 30 45 60 75 90 1055.00

7.00

9.00

11.00

Degradación de la clorofila "a"

tiempo (s)

Con

cent

raci

ón c

loro

fila

a (µ

g/m

l)

0 15 30 45 60 75 90 1055.20

5.40

5.60

5.80

6.00

6.20

6.40

6.60

Degradación de la clorofila "b"

tiempo (s)

Con

cent

raci

ón c

loro

fila

b (µ

g/m

l)

Ilustración 16: Comparación entre las cinéticas de las clorofilas a y b

0 15 30 45 60 75 90 1050.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

Degradación de las clorofilas

clorofila b

clorofila a

tiempo (s)

Con

cent

raci

ón (µ

g/m

l)

Ilustración 17: Cinética de las clorofilas a y b

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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Tabla 11: Ecuaciones de regresión, constantes de velocidad y coeficientes de correlaciónde las reacciones de degradación de la clorofila a y b

Pigmentos Ecuación de regresión Constante de velocidad (K) (s-1)

Coeficientes de correlación

Clorofila a -0.0031x-0.0238 0.0031 0.0002 0.9903

Clorofila b -0.0012x-0.0182 0.0012 0.0002 0.9589

Los valores obtenidos para las constantes de velocidad han sido:

kclorofila a = (0,0031 0,0002) s-1

kclorofila b = (0,0012 0,0002) s-1

La clorofila a se degrada en medio ácido más rápidamente que la clorofila b. Los coeficientes de correlación indican una confiabilidad del 98,08% y 92,03% respectivamente.

Se puede observar durante la feofitinización, la desaparición y/o el desplazamiento de los máximos característicos de ambas clorofilas (Ilustración 19). En la primera

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________

acidificación se aprecia como el máximo de 663.3 nm de la clorofila a disminuye rápidamente y se desplaza hacia el rojo, 664.3 nm, máximo característico de la feofitina a. En cambio, el hombro de la clorofila b a 646,6 nm permanece, por lo que se deduce que se degrada más lentamente. En la segunda acidificación, la feofitinización es inmediata apareciendo los máximos característicos de la feofitina a. Más difícil de detectar son los máximos de la feofitina b, apreciando un ensanchamiento de banda en torno a 654 nm.

Finalmente, a medida que avanza la reacción, tanto la clorofila a como la feofitina a que se está formando contribuyen al máximo de 663,3 nm. Por ello, la concentración de clorofila a disminuirá más rápidamente y su constante de velocidad será posiblemente mayor que el valor obtenido.

3.4.3. Cálculo de errores. Variables

ln (C/C0) = C/C

ln (C/C0)a = 0.02/Ca

ln (C/C0)b = 0.03/Ca

Variables

Descripción de las variables

Variable independiente Variables dependientes Variable controlada

Concentración y Absorbancia Velocidad de la reacción Longitud de onda observada y tiempo

Tabla 12

Ilustración 18: Transformación de clorofilas en feofitinasen presencia de un ácido fuerte

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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Ilustración 19: Espectro de la feofitina a11

11Imagen extraída de la página web: http://epic.awi.de/28856/1/Jef1997al.pdf

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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Ilustración 20: Acidificación con 2 gotas y 3 gotas de HCl

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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Longitud de onda (nm)

3.5. Degradación de las clorofilas en función de la temperatura

32

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________

Los extractos fueron obtenidos a partir de muestras de espinacas frescas o previamente deshidratadas a distintas temperaturas y empleando métodos comunes, como la ebullición o deshidratación en microondas comercial, y otros como la deshidratación en horno de cultivo (Tabla 12). Después, recogí espectros de las muestras antes y después de la acidificación, añadiendo 3 gotas de HCl 0.05 M. Esperé hasta que la absorbancia permanecía prácticamente constante.

Calculé en cada caso, la relación entre las absorbancias a 663.3 nm donde la clorofila a presenta un máximo y la feofitina a a 664.3 nm, para obtener un patrón de medida del deterioro de las clorofilas. Cuando el resultado es 1.7, no hay feofitinas y se puede considerar que la espinaca se encuentra en un estado fisiológico excelente, pero si la relación inicial es 1, la presencia de feofitina a es máxima12

Hay que tener en cuenta la presencia de las dos clorofilas en las muestras trabajadas. La degradación de la clorofila b es más lenta, y si bien es muy posible la ausencia de feofitina b, la clorofila b contribuirá en el máximo de 663.3 nm. Aún así, la relación entre ambas absorbancias puede dar una idea de la mayor o menor presencia de feofitinas en las muestras.

Tabla 13: Presencia de feofitinas en las espinacas (extractante: acetona al 80 %)

espinaca cocida

(3 minutos)

espinaca deshidratada horno 80ºC

(3 días)

espinaca deshidratada horno 40ºC

(3 días)

espinaca seca a temp.

ambiente (8 días)

espinaca seca microondas

(950 w, 8 min)

espinaca fresca

muestra 1

espinaca fresca

muestra 2

Absorbanciaλ = 663.3 nm 1.007 1.207 1.093 1.081 1.070 0.815 1.581

Absorbanciaλ = 664.3 nm 0.749 0.878 0.778 0.765 0.650 0.503 0.958

A663,3nm/A664,3nm 1.344 1.375 1.405 1.413 1.646* 1.620 1.650

Ilustración 21: Degradación de la clorofila en presencia de calor

12 LORENZEN, Carl J. Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations [en línea]. Universidad de California: 1967. Disponible en web: http://www.aslo.org/lo/toc/vol_12/issue_2/0343.pdf

33

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________

espinaca cocida

espinaca deshidratada

80ºC

espinaca deshidratada

40ºC

espinaca seca a temperatura

ambiente

espinaca seca en microondas

950 w

espinaca fresca muestra

1

espinaca fresca muestra

2(3 minutos) (3 días) (3 días) (8 días) (8 min) mercado mercado

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

1.800

Abs

. ant

es a

cidi

ficac

ión/

Abs

. des

pués

aci

dific

ació

n

La presencia de feofitinas aumenta con la temperatura y con los tratamientos de calor prolongados, si bien parece que la acción directa de las ondas microondas sobre las moléculas de agua no influye apenas en su degradación. Pero los espectros de las espinacas deshidratadas a 80ºC y en microondas, son muy similares a excepción del máximo a 663.3 nm (Ilustración 23), por lo que es posible que en el último caso, haya formación de clorofilida a que absorbe en la misma λ, y se solape su absorbancia con la de la clorofila a.

Ilustración 22: Espectros de los extractos en acetona al 80% antes y después de la acidificaciónEspinaca cocida Espinaca deshidratada a 80ºC

34

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

__________________________________________________________________________________________________________

Longitud de onda (nm) Longitud de onda (nm)

Espinaca deshidratada a 40ºC

Longitud de onda (nm)

Espinaca seca a temperatura ambiente

Longitud de onda (nm)

Espinaca deshidratada en Microondas

Longitud de onda (nm)

Espinaca fresca muestra 1

Longitud de onda (nm)

35

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Determinación espectrofotométrica de la concentración de clorofilas a y b en espinacas y su

degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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3.6. Cálculo del contenido en agua en las espinacas

Se ha determinado el % en peso de cada muestra de espinaca y su % de contenido en agua (10). Para ello pesé las masas iniciales antes de desecarlas a distintas temperaturas y las masas finales, y por diferentes métodos.

% en peso de lamuestra=Masafinal

Masainicial (9)

Tabla 14: % en peso y en contenido de agua en las muestras de espinacas

Espinaca secaa T ambiente

Espinaca en microondas

Espinaca deshidratada a

40º C

Espinaca deshidratada a

80º Cmasa inicial de

espinaca (g)40,00 0,01 40,00 0,01 50,00 0,01 50,00 0,01

masa final (g) 2,92 0,01 3,00 0,01 3,50 0,01 3,22 0,01

% en peso de espinaca

7,3 0,3 7,5 0,3 7 0,2 6,44 0,2

% de agua 92,7 0,3 92,5 0,3 93,0 0,2 93,56 0,2

La precisión de la balanza utilizada es de ±0,01 g

Las espinacas tienen un alto contenido en agua (>92%) y por este motivo, se marchitan rápidamente.

Cálculo de errores

∆ ( %en peso )=∆ masafinal

masainicial×100+

masafinal × ∆ masaincial

masainicial2 ×100

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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4. Consideraciones en el método empleado

En cuánto a las muestras analizadas en el espectrofotómetro:

- Si el extracto estaba muy concentrado, la absorbancia era muy elevada, ya que el detector recibía una intensidad muy baja de luz. Cualquier variación en la absorbancia no se detectaba y no se reflejaba en el espectro. Por el contrario, si estaba muy diluido, el detector recibía mucha luz, y tampoco se apreciaban pequeños cambios. Estos errores pude corregirlos utilizando muestras con concentraciones cuyos valores de absorbancia fueran entre 0,3 y 1,2 en la zona estudiada para asegurar máxima precisión.

- El extracto de espinacas contiene clorofilas, y carotenoides, por lo que su espectro muestra una combinación de todos los espectros característicos de cada pigmento y por ello, la aplicación de la ley de Lambert-Beer es más compleja. El estudio se limitó entre 600 y 700 nm, donde solo las clorofilas presentan máximos de absorción.

Ilustración 23: espectros de la clorofila a, b y carotenoides13 Ilustración 24: espectros de caroteno y xantofila14

En cuanto al disolvente utilizado como extractante:

- Otro problema fue elegir el tipo de disolvente utilizado como extractante, pues su polaridad incide en la capacidad extractora de los pigmentos. La clorofila a es más apolar que la b y por tanto su extracción es mayor en disolventes apolares. Además, se observa un ligero desplazamiento de los máximos hacia el rojo cuanto más polar es el disolvente.

13 Imagen extraída de la página web: http://naturalmenteciencias.files.wordpress.com/2011/11/absorption-spectrum.jpg14 Imagen extraída de la página web:http://kordonnier.fr/spip.php?article140&artsuite=0#sommaire_1

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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Ilustración 25: clorofila a en metanol15 Ilustración 26: clorofila a en éter etílico16

- He utilizado como disolventes el éter de petróleo y el éter etílico para separar las clorofilas a y b respectivamente y localizar sus máximos de absorción, pero la inmiscibilidad con HCl impedía la acidificación de las muestras. Por ello, usé para el resto del trabajo, un disolvente más polar como la acetona al 80%, con una pizca de CaCO3. Aunque la hidratación de este disolvente proporciona menos capacidad extractora de la clorofila a, previene la conversión de clorofilas a clorofilidas, su nivel de toxididad es menor, es un disolvente económico y hay referencias bibliográficas para calcular las concentraciones de las clorofilas. La adición de la sal previene la formación de feofitinas, proporcionando estabilidad a los pigmentos17.

5. Conclusiones15 Imagen extraída de: Oregon Medical Laser Center. Disponible en web: http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/122.html 16 Íbid, disponible en web: http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/123.html17 LORENZO, Tina V ; SCHWARTZ, Steven J. Chlorophylls in foods. Food Science and Nutricion [en línea]. Taylor and Francis Group: [s.n], 29/09/2009. Disponible en web: http://www.fcfar.un esp.br/arquivos/470859.pdf

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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Como conclusiones, quisiera resaltar varios puntos:

- En presencia de un ácido, las clorofilas se transforman en feofitinas y la clorofila a se degrada más que la b. Probablemente esto se deba a la mayor concentración de clorofila a, por lo que hay más facilidad de choque entre las moléculas de clorofila a y el ácido, y en consecuencia, aumenta la velocidad de degradación.

- La representación gráfica del logaritmo neperiano de la concentración frente al tiempo es lineal y proporcionó un alto coeficiente de correlación tanto para la clorofila a como para la b. Por lo tanto, ambas clorofilas siguen una reacción de primer orden.

- La clorofila sometida a un aumento de la temperatura en microondas no se degradó, al contrario que todas las demás clorofilas que fueron sometidas a diferentes métodos de aumento de la temperatura. Esto se puede deber a que las ondas que interactuaron con las hojas de espinacas no tenían suficiente energía para poder extraer el átomo de magnesio o romper los enlaces del anillo de la porfirina. Otra hipótesis, es que se formen clorofilidas que absorben a la misma longitud de onda y al solaparse no se pueda observar la presencia de feofitinas.

- Todos los extractos que fueron sometidos a altas temperaturas se degradaron en mayor grado. La clorofila procedente de las hojas de espinacas cocidas fue la que más se degradó. La clorofila procedente de la espinaca deshidratada a los 80ºC fue la segunda que más se degradó, seguida por la deshidratada a los 40ºC y, por último, la deshidratada a temperatura ambiente. Por lo tanto, hay una proporcionalidad directa entre la degradación y la temperatura. Las espinacas frescas son las que menos feofitinas contienen.

Este tema, que surgió al preguntarme qué ocurre cuando las verduras que comemos reaccionan con el ácido clorhídrico que segregamos en nuestro estómago, me ha gustado mucho, pues me ha permitido descubrir por qué cambian de color y por qué pierden sus buenas propiedades las verduras cuando se cocinan.

Quisiera también investigar cómo afecta un medio básico a la clorofila y averiguar si los demás pigmentos presentes en las verduras, como los carotenoides, también sufren la degradación que se ha estudiado en la clorofila tanto en medio básico como en medio ácido.

6. Referencias bibliográficas

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Referencias en web

JENWAY. Spectrophotometry of chlorophylls a and b [en línea]. Disponible en web: http://www.jenway.com/adminimages/A09_001A_Spectrophotometry_of_chlorophyll_a_and_b.pdf

LORENZEN, Carl J. Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations [en línea]. Universidad de California: 1967. Disponible en web: http://www.aslo.org/lo/toc/vol_12/issue_2/0343.pdf

LORENZO, Tina V ; SCHWARTZ, Steven J. Chlorophylls in foods. Food Science and Nutricion [en línea]. Taylor and Francis Group: [s.n], 29/09/2009. Disponible en web: http://www.fcfar.unesp.br/arquivos/470859.pdf

MAIOCCHI, M. G. ; AVANZA, J. R. Degradación de clorofilas y feofitinas a diferentes temperaturas enIlex dumosa e Ilex paraguariensis [en línea]. Universidad Nacional del Nordeste (Argentina): [s.n] 2004. Disponible en web: http://www.unne.edu.ar/unnevieja/Web/cyt/com2004/8-Exactas/E-085.pdf

MCKINNEY, G. Chlorophyll solutions absorption of light by chlorophyll solutions [en línea]. Universidad de California, Berkeley (EEUU): American Society for Biochemestry and Molecular Biology, 13/03/1941. Disponible en web: http://www.jbc.org/content/140/2/315.full.pdf+html

PORRA, Robert J. The chequered history of the development and use of simultaneous equations for the accurate determination of chlorophylls a and b [en línea]. Países Bajos: 14/10/2001, [ref. 2002]. Disponible en web: http://www.life.illinois.edu/govindjee/Part1/Part1_Porra.pdf

Prácticas de Fisiología vegetal. Extracción de pigmentos fotosintéticos mediante disolventes químicos [en línea]. Universidad de Jaén. Disponible en web:http://www4.ujaen.es/~amocana/F.V/separacion%20de%20pigmentos%20mediante%20disolventes.pdf

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA (UNAD). Química de los alimentos [en línea]. Disponible en web: http://datateca.unad.edu.co/contenidos/301203/301203/leccin_33_pigmentos.html

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA. Espectro de absorción de carotenos [en línea]. Bogotá: [s.n] [22/12/2013]. Disponible en web: http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000051/lecciones/cap02/anexo_27.htm

Referencias escritas

BUSCHMANN, Claus; LICHTENHALER, Hartmut K. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Inc.Chlorophylls and Carotenoids: Measurement and Characterization by UV-VIS Spectroscopy . (2001) John Wiley & Sons

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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PETRUCCI R. HARWOOD W. HERRING F. Química general. 8ª edición. Madrid: Ed. Pearson Education S.A, 2003. ISBN: 9788420535333.

7. Apéndices

APÉNDICE 1: Material utilizado

- Espinaca (Spinacia oleracea)

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- Ácido clorhídrico (HCl)

- Carbonato de calcio (CaCO3)

- Éter de petróleo

- Éter etílico ( (C2H5)2º )

- Acetona (C3H6O)

- Metanol (CH4O)

- Agua desionizada

- Vasos de precipitados

- Mortero

- Cubeta

- Vidrio de reloj

- Espectrofotómetro “SpectroVis Plus” (Vernier) de un solo haz.

- Balanza analítica

- Centrifugadora

- Embudo de decantación

- Placa de sílica gel

- Programas Logger Pro 3 y Microsoft Excel

APÉNDICE 2: Espectros de clorofilas y derivados

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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APENDICE 3: Realización de la cromatografía

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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Consistió en preparar un extracto de los pigmentos en metanol, filtrarlo y centrifugarlo. A continuación, introduje 15 ml de éter de petróleo en un recipiente y lo cerré para que el vapor se distribuyera. Preparé una placa, marcando con un lápiz una línea paralela a 1 cm del borde inferior, y con una pipeta Pasteur deposité unas estrechas bandas del extracto de vegetal. Se introdujo la placa en el recipiente, se cerró y se mantuvo en lugar oscuro durante media hora. Las xantofilas se separaron muy bien, pero las clorofilas quedaron tan próximas que era imposible aislarlas.

APÉNDICE 4: Degradación de las clorofilas en el almacenado

También realicé una cromatografía en placa fina, para separar los pigmentos según su polaridad, pero las clorofilas quedaron demasiado próximas por lo que desestimé el procedimiento.

Ilustración 8: Placa cromatográfica

Almacené una muestra de extracto de clorofila en frasco topacio para evitar la oxidación de las clorofilas en presencia de luz, durante tres semanas, obteniendo espectros en el momento inicial, a los 6, 12 y 21 días.

Degradación de clorofilas durante el almacenaje

tiempo (días)

Absorbanciaλ = 663.3 nm

Absorbanciaλ = 646.6 nm

Clorofila a (µg/ml)

Clorofila b (µg/ml)

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degradación en presencia de un ácido fuerte y en función de la temperatura.

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A=±0.001 A=±0.001 Ca=±0.02 Cb=±0.020 0.620 0.289 6.79 3.05

6 0.602 0.283 6.58 3.02

12 0.553 0.262 6.04 2.81

21 0.515 0.220 5.69 2.10

Degradación de las clorofilas durante el almacenado

0 6 12 18 240

1

2

3

4

5

6

7

8

Clorofila a

Clorofila b

tiempo (días)

Con

cent

raci

ón (µ

g/m

l)

Durante el almacenamiento, las clorofilas se degradaron lentamente durante los primeros 6 días, si bien algo más la clorofila a que la b, proceso que se acelera entre los 6 y los 12 días. A los 21 días, se evidencia la formación de feofitinas.

Espectros de las clorofilas durante el almacenamiento

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